一种间充质干细胞的培养方法及其应用

专利主权项内容

1.一种间充质干细胞的培养方法，其特征在于包括以下步骤：(1) 脐带的分离；(2) 组织块的冻存；(3) 组织块的复苏；(4) 原代培养；(5) 传代培养；所述步骤(1)的脐带的分离方法，包括以下步骤：(11) 胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐截取脐带，用生理盐水冲洗脐带，再用医用酒精消毒，用含有1wt%双抗和250 μg/mL两性霉素的D-Hank’s液浸泡2 min并充分冲洗脐带，用20 mL注射器冲洗脐静脉和脐动脉内的残存积血；(12) 使用高温灭菌并冷却的眼科剪沿脐带结扎内侧剪断，加入适量的生理盐水清洗至表面无血渍后将脐带剪成2-3 cm的小段，小心去除两条动脉和一条静脉，然后剪碎至1mm大小的组织块；3所述步骤(2)的组织块的冻存方法，包括以下步骤：(21) 将步骤(12)所得组织块浸入2-8℃的冻存保护液中5-10 min后分装到2 mL的冻存管中；(22) 将步骤(21)所述冻存管置于程序降温盒中，放入-80℃冰箱，8-20 h后将冻存管转移至液氮罐内保存；步骤(21)所述冻存保护液包括基础液、渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂；所述基础液、渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂的用量比为3 mL : 7 mL : 1 g；所述基础液为磷酸盐缓冲液PBS和生理盐水按照1 : 1的体积比混合均匀而成；所述渗透性冷冻保护剂包括二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇、甘油中的一种或几种组合；所述非渗透性冷冻保护剂包括蔗糖、甘露醇、海藻糖中的一种或几种的组合；所述步骤(3)的组织块的复苏方法，包括以下步骤：(31) 将步骤(22)所述装有冻存的脐带组织块的冻存管于37℃水浴锅中解冻2-5 min，将脐带组织块经复苏缓冲液洗涤1-5次后获得复苏的组织块；所述复苏缓冲液包括磷酸盐缓冲液PBS、生理盐水、蔗糖、海藻糖、甘露醇中的一种或几种的组合；所述步骤(4)的原代培养方法，包括以下步骤：(41) 将步骤(31)所得复苏的组织块接种到10 cm的培养皿中，每个皿0.5-1 g组织，放置于5% CO、37℃培养箱内，静置1-2 h后每皿添加12 mL完全培养基，轻晃培养皿使细胞及组织块分布均匀，37℃、5% CO培养箱进行培养；22(42) 72 h后，每皿补加3 mL完全培养基，之后每72 h进行换液，去除旧培养基，保留组织块，添加10 mL新鲜培养基，晃动使组织块均匀分布于皿内，此后每天晃动一次培养基和组织块，使爬出的细胞均匀分布皿内，第12-14天，弃去旧培养基和组织块，旧皿中添加10mL新鲜培养基，得到P0代脐带间充质干细胞；所述步骤(5)的传代培养方法，包括以下步骤：(51) 待P0代脐带间充质干细胞长至细胞融合80%-90%后，去除旧培养基，使用室温的PBS洗去皿内残留的培养基，PBS的量为0.04 mL/cm，弃去PBS，加入0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA，加入量为0.02 mL/cm，轻轻晃动培养皿使消化酶均匀覆盖皿底，置于培养箱内消化90-100 s，得到细胞消化液；22(52) 用8倍于步骤(51)所述0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA体积的完全培养基终止消化，转移到离心管内，配平后室温300 g离心5min，弃上清，加入完全培养基重悬细胞，5 mL吸管混匀，得到细胞混悬液；(53) 采用细胞计数仪对步骤(52)所得细胞混悬液进行细胞计数，根据细胞计数进行接种，传代密度为6000-8000 cells/cm，得到P1代脐带间充质干细胞，待P1代脐带间充质干细胞长至细胞融合80%-90%后可继续传代，P1代细胞传代可得P2代细胞，依次扩增；2(54) 传代后标记细胞类型、代数、传代日期，以十字方向轻柔滑动培养皿，重复4-6次，以使细胞分布均匀，将培养皿小心转移到37℃，5% CO的培养箱内培养。2