人碳酸酐酶2组合物和用于可调调节的方法与流程

人碳酸酐酶2组合物和用于可调调节的方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年3月8日提交的美国临时申请第62/815,399号；2019年3月8日提交的美国临时申请第62/815,402号；2019年3月29日提交的美国临时申请第62/826,487号；2019年3月29日提交的美国临时申请第62/826,443号；2019年4月18日提交的美国临时申请第62/835,548号；2019年4月18日提交的美国临时申请第62/835,552号；和2019年6月12日提交的美国临时申请第62/860,388号的优先权益。将前述申请的全部内容通过引用整体并入本文。
3.对序列表的引用
4.本技术包括已经以代替打印的纸质副本的cd-r提交并且通过引用整体并入本文的“长”序列表。创建并记录于2020年3月6日的所述cd-r分别标有“crf”、“副本1”、“副本2”、“副本3”和“副本4”，它们各自都仅包含一个名称为268052-462540_sl.txt的完全相同的699,270,904字节(在ms-windows中测量)的文件。每个cd-r的机器可读格式是ibm-pc，并且每张光盘的操作系统是ms-windows。
技术领域
5.本公开涉及可以针对至少一种有效负载来调节蛋白质稳定性的来源于人碳酸酐酶2(ca2)的去稳定结构域(dd)，以及其组合物和使用方法。在本公开中提供的包括用于癌症免疫疗法的ca2生物回路系统的多肽、ca2效应子模块、刺激响应元件(sre)、编码它们的多核苷酸、包含所述多肽和/或多核苷酸的载体和细胞。

背景技术：

6.基因和细胞疗法正在彻底改变医学，为治疗以前难治的病症提供了新的希望。然而，大多数当前的技术不允许滴定靶蛋白诱导时间或水平。这使得许多潜在的基因和细胞疗法的应用难以或不可能安全有效地部署。
7.外源和/或内源基因调控不足是许多基因和细胞疗法环境中的关键问题。这种可调性的缺乏也使得难以安全地表达具有狭窄或不确定治疗窗的蛋白质或需要进一步滴定或瞬时表达的蛋白质。
8.调节蛋白质表达或功能的一种方法是使用去稳定结构域(dd)。去稳定结构域是可以附加到感兴趣的靶蛋白上的小蛋白质结构域。在不存在dd结合配体的情况下，dd使附加的感兴趣的蛋白质不稳定，并且感兴趣的蛋白质被细胞的泛素-蛋白酶体系统迅速降解。然而，当特定的小分子dd结合配体与dd结合时，所附接的感兴趣的蛋白质被稳定化，并且蛋白质功能得以实现。
9.dd技术形成了一类新的细胞和基因疗法的基础，所述疗法可以对基因表达和功能进行可调的时间控制，扩大了可以安全有效地掺入到细胞和基因治疗模式中的蛋白质治疗剂的范围。

技术实现要素：

10.本公开提供了新的来源于人碳酸酐酶2(ca2)的显示小分子依赖性稳定性的蛋白质结构域。这样的蛋白质结构域被称为去稳定结构域(dd)。在不存在其结合配体的情况下，dd是去稳定的，并且引起与dd融合的有效负载(例如，感兴趣的蛋白质(poi))降解，而在存在其结合配体的情况下，融合的dd和有效负载可以被稳定化，并且其稳定性是剂量依赖性的。
11.在第一方面，本公开提供了包含效应子模块的组合物。效应子模块包含刺激响应元件(sre)和与sre可操作连接的至少一个有效负载。在各种实施方案中，sre包含去稳定结构域(dd)，其中dd包含人碳酸酐酶2(ca2；seq id no.11717)的区域或整体，并且还包含在seq id no.11717的第122位氨基酸(h122)的h122y突变。
12.在第二方面，本公开提供了包含效应子模块的组合物。效应子模块包含刺激响应元件(sre)和与sre可操作连接的至少一个有效负载。在各种实施方案中，sre包含去稳定结构域(dd)，其中dd包含人碳酸酐酶2(ca2；seq id no.11717)的区域或整体，并且还包含在seq id no.11717的第106位氨基酸(e106)的e106d突变。
13.在本公开的第三方面，提供了包含效应子模块的组合物。效应子模块包含刺激响应元件(sre)和与sre可操作连接的至少一个有效负载。在各种实施方案中，sre包含去稳定结构域(dd)，其中dd包含人碳酸酐酶2(ca2；seq id no.11717)的区域或整体，并且还包含在seq id no.11717的第208位氨基酸(w208)的w208s突变。
14.在本公开的第四方面，提供了包含效应子模块的组合物。效应子模块包含刺激响应元件(sre)和与sre可操作连接的至少一个有效负载。在各种实施方案中，sre包含去稳定结构域(dd)，其中dd包含人碳酸酐酶2(ca2；seq id no.11717)的区域或整体，并且还包含在seq id no.11717的第59位氨基酸(159)的i59n突变。
15.在本公开的第五方面，提供了包含效应子模块的组合物。效应子模块包含刺激响应元件(sre)和与sre可操作连接的至少一个有效负载。在各种实施方案中，sre包含去稳定结构域(dd)，其中dd包含人碳酸酐酶2(ca2；seq id no.11717)的区域或整体，并且还包含在seq id no.11717的第156位氨基酸(l156)的l156h突变。在与第五方面相关的实施方案中，dd还包含：(i)在seq id no.11717的第4位氨基酸(w4)的w4y突变；(ii)在seq id no.11717的第225位氨基酸(f225)的f225l突变；(iii)在seq id no.11717的第257-260位的氨基酸的缺失；(iv)在seq id no.11717的第1-5位的氨基酸的缺失；或(v)seq id no.11717的氨基酸g234、e235和p236的缺失；或者dd包含相对于seq id no.11717的四个突变，包括对应于：(i)l156h、s172c、f178y和e186d；或(ii)d70n、d74n、d100n和l156h的突变。
16.在第六方面，本公开提供了包含效应子模块的组合物。效应子模块包含刺激响应元件(sre)和与sre可操作连接的至少一个有效负载。在各种实施方案中，sre包含去稳定结构域(dd)，所述去稳定结构域包含人碳酸酐酶2(ca2；seq id no.11717)的区域或整体，并且还包含相对于seq id no.11717的第一突变和第二突变，其中：(i)第一突变是在seq id no.11717的第73位氨基酸(s73)的s73n突变；并且(ii)第二突变是在seq id no.11717的第89位氨基酸(r89)的f或y的取代。
17.在第七方面，提供了包含效应子模块的组合物。效应子模块包含刺激响应元件(sre)和与sre可操作连接的至少一个有效负载。在各种实施方案中，sre包含去稳定结构域
(dd)，所述去稳定结构域包含人碳酸酐酶2(ca2；seq id no.11717)的区域或整体，并且还包含在seq id no.11717的第56位氨基酸(s56)的n或f的取代。
18.在第八方面，提供了包含效应子模块的组合物。效应子模块包含刺激响应元件(sre)和与sre可操作连接的至少一个有效负载。在各种实施方案中，sre包含去稳定结构域(dd)，所述去稳定结构域包含人碳酸酐酶2(ca2；seq id no.11717)的区域或整体，并且还包含相对于seq id no.11717的一个或多个取代，其中至少一个取代是在seq id no.11717的第63位氨基酸(g63)的d或n的取代，并且其中所述一个或多个取代对应于：g63d；g63d和m240l；g63d、e69v和n23ii；或t55k、g63n和q248n。
19.在第九方面，提供了包含效应子模块的组合物。效应子模块包含刺激响应元件(sre)和与sre可操作连接的至少一个有效负载。在各种实施方案中，sre包含去稳定结构域(dd)，所述去稳定结构域包含人碳酸酐酶2(ca2；seq id no.11717)的区域或整体，并且还包含相对于seq id no.11717的两个或更多个取代，其中所述两个或更多个取代中的一个是在seq id no.11717的第71位氨基酸(d71)的l或k的取代。在各种实施方案中，两个或更多个取代对应于：d71l和t87n；d71l和l250r；d71l、t87n和l250r；或d71k和t192f。
20.在第十方面，提供了包含效应子模块的组合物。效应子模块包含刺激响应元件(sre)和与sre可操作连接的至少一个有效负载。在各种实施方案中，sre包含去稳定结构域(dd)，所述去稳定结构域包含人碳酸酐酶2(ca2；seq id no.11717)的区域或整体，并且还包含相对于seq id no.11717的两个或更多个取代。两个或更多个取代中的至少一个是：(i)在seq id no.11717的第241位氨基酸(v241)的f的取代；或(ii)在seq id no.11717的第249位氨基酸(p249)的f或l的取代；并且其中所述两个或更多个取代对应于：d72f和v241f；d72f和p249l；d72f和p249f；d72f、v241f和p249l；a77i和p249f；或v241f和p249l。
21.在第十一方面，本公开提供了包含效应子模块的组合物。效应子模块包含刺激响应元件(sre)和与sre可操作连接的至少一个有效负载。sre包含去稳定结构域(dd)，所述去稳定结构域包含人碳酸酐酶2(ca2；seq id no.11717)的区域或整体，并且还包括相对于seq id no.11717的一个或多个取代，所述取代选自y51t、l183s、y193i、l197p以及v134f和l228f的组合。
22.在以上提供的所有示例性方面的相关实施方案中，sre对一种或多种刺激有响应。在各种实施方案中，刺激是选自乙酰唑胺、塞来昔布、伐地昔布、罗非昔布、醋甲唑胺、多佐胺、布林佐胺、双氯非那胺、依索唑胺、唑尼沙胺、丹磺酰胺或二氯苯磺胺的小分子。此外，本文描述和举例说明的组合物包含在dd中具有至少一个突变或取代的dd，所述突变或取代在不存在刺激的情况下使dd和至少一个有效负载去稳定，并且其中在存在刺激的情况下使所述dd和有效负载稳定。
23.在第十二方面，本公开提供了：包含方面1-10中描述的任何一种或多种组合物的生物回路系统；包含方面1-10中描述的组合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物；编码方面1-10中描述的组合物的多核苷酸；包含编码方面1-10中描述的组合物的多核苷酸的载体；包含编码方面1-10中描述的组合物的多核苷酸的细胞；包含细胞和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中所述细胞包含编码方面1-10中描述的组合物的多核苷酸。
24.在第十三方面，本公开提供了治疗有需要的受试者中的疾病的方法。所述方法包括：(a)向受试者施用治疗有效量的方面11的细胞，其中所述细胞包含治疗疾病的有效负
载；和(b)向受试者施用治疗有效量的刺激，其中sre对刺激有响应，并且其中有效负载的表达对刺激作出响应而受到调节，从而治疗疾病。
25.在一些实施方案中，本公开提供了刺激响应元件(sre)，其可包含来源于人碳酸酐酶2(ca2；seq id no.11717)的整体或部分的去稳定结构域(dd)。在一个实施方案中，dd可包括整个ca2(seq id no.11717)。
26.在一些实施方案中，本公开提供了包含人碳酸酐酶2(ca2；seq id no.11717)的区域或整体并且还包含相对于seq id no.11717的突变的dd，所述突变选自a115l、a116q、a116v、a133l、a133t、a141p、a152d、a152l、a152r、a173c、a173g、a173l、a173t、a23p、a247l、a247s、a257l、a257s、a38p、a38v、a54q、a54v、a54x、a65l、a65n、a65v、a77i、a77p、a77q、c205m、c205r、c205v、c205w、c205y、d101g、d101m、d110i、d129i、d138g、d138m、d138n、d161*、d161m、d161v、d164g、d164i、d174*、d174t、d179e、d179i、d179r、d189g、d189i、d19t、d19v、d242g、d242t、d32t、d34t、d41t、d52i、d52l、d71f、d71g、d71k、d71m、d71s、d71y、d72i、d72s、d72t、d72x、d75t、d75v、d85m、e106d、e106g、e106s、e117*、e117n、e14n、e186*、e186n、e204a、e204d、e204g、e204n、e213*、e213g、e213n、e220k、e220r、e220s、e233d、e233g、e233r、e235*、e235g、e235n、e237k、e237r、e238*、e238n、e238r、e26s、e69d、e69k、e69s、f130l、f146v、f175i、f175l、f175s、f178l、f178s、f20l、f20s、f225i、f225l、f225s、f225y、f230i、f230l、f230s、f259l、f259s、f66s、f70i、f70l、f95y、g102d、g104r、g104v、g128r、g12d、g12e、g131e、g131r、g131w、g139d、g144d、g144v、g150a、g150s、g150w、g155a、g155c、g155d、g155s、g170a、g170d、g182a、g182w、g195a、g195r、g232r、g232w、g234l、g234v、g25e、g63d、g63v、g81e、g81v、g82d、g86a、g86d、g98v、h107i、h107q、h119t、h119y、h122t、h122y、h15l、h15t、h15y、h17d、h17i、h36i、h36q、h64m、h94t、h96t、i145f、i145m、i166h、i166l、i209d、i209l、i215h、i215s、i22l、i255n、i255s、i33s、i59f、i59n、i59s、i91f、k111e、k111n、k112r、k113i、k113n、k126n、k132e、k132r、k148e、k148r、k153*、k153n、k158e、k158n、k167*、k169n、k169r、k171q、k171r、k18r、k212n、k212q、k212r、k212w、k224e、k224n、k227*、k227n、k24r、k251e、k251r、k256q、k260f、k260l、k260q、k39s、k45n、k45s、k80m、k80r、l118f、l120w、l140v、l140w、l143*、l147*、l147f、l156f、l156h、l156p、l156q、l163a、l163w、l183p、l183s、l184f、l184p、l188p、l188w、l197*、l197m、l197p、l197r、l197t、l202f、l202h、l202i、l202p、l202r、l202s、l203p、l203s、l203w、l211*、l211a、l211s、l223*、l223i、l223v、l228f、l228h、l228t、l239*、l239f、l239t、l250*、l250p、l250t、l44*、l44m、l47c、l47v、l57*、l57x、l60s、l79f、l79s、l84w、l90*、l90v、m240d、m240l、m240r、m240w、n11d、n11k、n124t、n177*、n177t、n229*、n229t、n231d、n231f、n231k、n231l、n231m、n231q、n231t、n243q、n243t、n252e、n252t、n61r、n61t、n61y、n62k、n62m、n67d、n67t、p137l、p13a、p13h、p13l、p13s、p154l、p154r、p154t、p180l、p180s、p185l、p185s、p185v、p194q、p200a、p200l、p200s、p200t、p201a、p201l、p201r、p201s、p214t、p236l、p236t、p246l、p246q、p249a、p249f、p249h、p249i、p249x、p30l、p30s、p42l、p83a、q103k、q135s、q136n、q157r、q157s、q221a、q221r、q248f、q248l、q248s、q254a、q254k、q28s、q53h、q53k、q53n、q74r、q92h、q92s、r181h、r181s、r181v、r226h、r226p、r226v、r245a、r253g、r253q、r27a、r58g、r89d、r89f、r89i、r89x、r89y、s105l、s105q、s151a、s151i、s151q、s165f、s165p、s172e、s172v、s187i、s187p、s196h、s196l、s216a、s216q、s218a、s218q、s219a、s219q、
s258f、s258p、s29c、s29p、s43p、s43t、s48l、s50p、s56f、s56n、s56p、s56x、s73l、s73n、s73x、s99h、t108l、t125i、t125p、t168k、t168n、t168q、t176h、t176l、t192d、t192f、t192i、t192n、t192p、t192x、t198d、t198i、t198p、t199a、t199h、t199p、t207d、t207i、t207p、t207s、t35i、t35l、t37q、t55l、t87l、v109m、v109w、v121f、v134c、v134f、v142f、v149g、v149l、v159l、v159s、v160c、v160l、v162a、v162c、v206*、v206c、v206m、v210c、v217l、v217r、v217s、v222a、v222c、v222g、v241g、v241w、v241x、v31l、v49f、v68l、v68w、v78c、w123g、w123r、w16g、w191*、w191g、w191l、w208g、w208l、w208s、w244*、w244g、w244l、w97c、w97g、y114h、y114m、y127m、y190*、y190l、y190t、y193c、y193f、y193i、y193l、y193t、y193v、y193x、y40m、y51f、y51m、y51t、y51x、y88t、k9n和s29a。
27.在一些实施方案中，本公开提供了包含人碳酸酐酶2(ca2；seq id no.11717)的区域或整体并且还包含相对于seq id no.11717的突变的dd，所述突变选自e106d、g63d、h122y、i59n、l156h、l183s、l197p、s56f、s56n、w208s、y193i和y51t。
28.在一些实施方案中，本公开提供了包含人碳酸酐酶2(ca2；seq id no.11717)的区域或整体并且还包含相对于seq id no.11717的两个或更多个突变的dd。在一些实施方案中，dd可包含ca2(wt的氨基酸2-260，r27l，h122y)、ca2(wt的氨基酸2-260，t87i，h122y)、ca2(wt的氨基酸2-260，h122y，n252d)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，v241f)、ca2(wt的氨基酸2-260，v241f，p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71l，l250r)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，p249f)、ca2(wt的氨基酸2-260，t55k，g63n，q248n)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，a257del，s258del，f259del，k260del)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，s2del，h3del，h4del，w5del)、ca2(wt的氨基酸2-260，w4y，l156h)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，g234del，e235del，p236del)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，f225l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d70n，d74n，d100n，l156h)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n，g102r)(seq id no.210598)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，e69v，n231i)(seq id no.210748)、ca2(wt的氨基酸2-260，r27l，t87i，h122y，n252d)(seq id no.210702)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，v241f，p249l)(seq id no.210503)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71l，t87n，l250r)(seq id no.210510)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，s172c，f178y，e186d)(seq id no.210756)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71f，n231f)(seq id no.210505)、ca2(wt的氨基酸2-260，a77i，p249f)(seq id no.210514)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k，p249h)(seq id no.210516)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，p249h)(seq id no.210518)、ca2(wt的氨基酸2-260，q53n，n61y)(seq id no.210521)、ca2(wt的氨基酸2-260，e106d，c205s)(seq id no.210523)、ca2(wt的氨基酸2-260，c205s，w208s)(seq id no.210525)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73n，r89y)(seq id no.210532)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k，t192f)(seq id no.210534)、ca2(wt的氨基酸2-260，y193l，k260l)(seq id no.210540)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71f，v241f，p249l)(seq id no.210544)、ca2(wt的氨基酸2-260，l147f，q248f)(seq id no.210548)、ca2(wt的氨基酸2-260，d52i，s258p)(seq id no.210550)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72s，t192n)(seq id no.210552)、ca2(wt的氨基酸2-260，d179e，t192i)(seq id no.210554)、ca2(wt的氨基酸2-260，s56n，q103k)(seq id no.210558)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71y，q248l)(seq id no.210560)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73n，r89f)(seq id no.210562)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k，n231l，e235g，l239f)
(seq id no210564)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，p249i)(seq id no.210568)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72x，v241x，p249x)(seq id no.210572)、ca2(wt的氨基酸2-260，a54x，s56x，l57x，t192x)(seq id no.210574)、ca2(wt的氨基酸2-260，y193v，k260f)(seq id no.210576)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，m240l)(seq id no.210578)、ca2(wt的氨基酸2-260，v134f，l228f)(seq id no.210580)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71g，n231k)(seq id no.210582)、ca2(wt的氨基酸2-260，s56f，d71s)(seq id no.210584)、ca2(wt的氨基酸2-260，d52l，g128r，q248f)(seq id no.210586)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73x，r89x)(seq id no.210588)、ca2(wt的氨基酸2-260，y51x，d72x，v241x，p249x)(seq id no.210592)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72i，w97c)(seq id no.210594)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k，t192f，n231f)(seq id no.210596)、ca2(wt的氨基酸2-260，h36q，s43t，y51f，n67d，g131w，r226h)(seq id no.210698)、ca2(wt的氨基酸2-260，f70i，f146v)(seq id no.210700)、ca2(wt的氨基酸2-260，k45n，v68l，h119y，k169r，d179e)(seq id no.210704)、ca2(wt的氨基酸2-260，h15l，a54v，ki he，e220k，f225i)(seq id no.210706)、ca2(wt的氨基酸2-260，p13s，p83a，d101g，k111n，f230i)(seq id no.210708)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，w123r，e220k)(seq id no.210712)、ca2(wt的氨基酸2-260，n11d，e69k，g86d，v109m，k113i，t125i，d138g，g155s)(seq id no.210714)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n，g102r，a173t)(seq id no.210716)、ca2(wt的氨基酸2-260，l79f，p180s)(seq id no.210718)、ca2(wt的氨基酸2-260，a77p，g102r，d138n)(seq id no.210724)、ca2(wt的氨基酸2-260，f20l，k45n，g63d，e69v，n231i)(seq id no.210726)、ca2(wt的氨基酸2-260，t199n，l202p，l228f)(seq id no.210728)、ca2(wt的氨基酸2-260，k9n，h122y，t168k)(seq id no.210730)、ca2(wt的氨基酸2-260，q53h，l90v，q92h，g131e)(seq id no.210732)、ca2(wt的氨基酸2-260，l44m，l47v，n62k，e69d)(seq id no.210734)、ca2(wt的氨基酸2-260，d75v，k169n，f259l)(seq id no.210738)、ca2(wt的氨基酸2-260，t207s，v222a，n231d)(seq id no.210740)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59f，v206m，g232r)(seq id no.210742)、ca2(wt的氨基酸2-260，p13a，a133t)(seq id no.210744)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n，r89i)(seq id no.210750)、ca2(wt的氨基酸2-260，a65n，g86d，g131r，g155d，k158n，v162a，g170d，p236l)(seq id no.210752)、ca2(wt的氨基酸2-260，g12r，h15y，d19v)(seq id no.210754)、ca2(wt的氨基酸2-260，a65v，f95y，e106g，h107q，i145m，f175i)(seq id no.210758)和/或ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，e69v，n231i)(seq id no.210851或210847)。
29.在一些实施方案中，dd可包含ca2(wt的氨基酸2-260，r27l，h122y)、ca2(wt的氨基酸2-260，t87i，h122y)、ca2(wt的氨基酸2-260，h122y，n252d)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，v241f)、ca2(wt的氨基酸2-260，v241f，p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71l，l250r)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，p249f)、ca2(wt的氨基酸2-260，t55k，g63n，q248n)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，a257del，s258del，f259del，k260del)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，s2del，h3del，h4del，w5del)、ca2(wt的氨基酸2-260，w4y，l156h)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，g234del，e235del，p236del)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，f225l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d70n，d74n，d100n，l156h)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n，g102r)(seq id no.210598)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，e69v，n231i)
(seq id no.210748)、ca2(wt的氨基酸2-260，r27l，t87i，h122y，n252d)(seq id no.210702)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，v241f，p249l)(seq id no.210503)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71l，t87n，l250r)(seq id no.210510)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，s172c，f178y，e186d)(seq id no.210756)、ca2(wt的氨基酸2-260，a77i，p249f)(seq id no.210514)、ca2(wt的氨基酸2-260，e106d，c205s)(seq id no.210523)、ca2(wt的氨基酸2-260，c205s，w208s)(seq id no.210525)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73n，r89y)(seq id no.210532)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k，t192f)(seq id no.210534)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73n，r89f)(seq id no.210562)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，m240l)(seq id no.210578)、ca2(wt的氨基酸2-260，v134f，l228f)(seq id no.210580)和/或ca2(wt的氨基酸2-260，s56f，d71s)(seq id no.210584)。
30.本文所述的sre可以对一种或多种刺激有响应。这样的刺激可以是小分子，例如但不限于乙酰唑胺、塞来昔布、伐地昔布、罗非昔布、醋甲唑胺、多佐胺、布林佐胺、双氯非那胺、依索唑胺、唑尼沙胺、丹磺酰胺或二氯苯磺胺。在实施方案中，小分子可以是乙酰唑胺。在一些方面，刺激可以是塞来昔布。
31.本公开提供了包括至少一个效应子模块的ca2生物回路系统。这样的效应子模块可包括刺激响应元件(sre)。本文提供了具有包含人碳酸酐酶2(ca2；seq id no.11717)的区域或整体的sre的生物回路。
32.包括在ca2生物回路系统中的有效负载可以是治疗剂、天然蛋白质、融合多肽、抗体或其变体或片段。
33.在一些实施方案中，有效负载可以是治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂可以是细胞因子、嵌合抗原受体、细胞因子或细胞因子-细胞因子受体融合蛋白。
34.ca2生物回路系统可以对一种或多种刺激有响应。在一个方面，刺激可以是小分子，例如但不限于乙酰唑胺、塞来昔布、伐地昔布、罗非昔布、醋甲唑胺、多佐胺、布林佐胺、双氯非那胺、依索唑胺、唑尼沙胺、丹磺酰胺或二氯苯磺胺。在一个实施方案中，小分子可以是乙酰唑胺。另一方面，小分子可以是塞来昔布。
35.本文还提供了编码本文所述的sre、生物回路系统和/或组合物的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的载体。本公开还描述了包含本文所述的ca2生物回路和/或组合物以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
36.附图简要说明
37.如附图中展示的，根据本公开的特定实施方案的以下描述，前述和其他目的、特征和优点将是显而易见的。这些附图中的部件不一定必须按比例；而重点在于解释本公开的各种实施方案的原理。
38.图1显示了ca2嵌合抗原受体的配体依赖性调节。
39.图2显示了ca2生物回路对不同剂量乙酰唑胺的响应。
40.图3显示了针对ot-002347(标记为ca2-070)和ot-001978(标记为ca2-026)的乙酰唑胺响应。
具体实施方式
41.在以下伴随说明书中阐述本公开的一个或多个实施方案的详情。虽然可以在本公
开的实践或测试中使用类似于或等同于本文所述那些的任何材料和方法，但现在描述了优选的材料和方法。根据描述，本公开的其他特征、目的和优点将是显而易见的。在说明书中，除非上下文另外明确规定，否则单数形式也包括复数含义。除非另外定义，否则本文使用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在发生冲突的情况下，将以本说明书为准。
42.1.组合物
43.生物回路或生物回路系统
44.根据本公开，提供了在其核心处包含至少一个效应子模块的生物回路系统。这样的效应子模块独立地与一个或多个刺激响应元件关联或集成。一般而言，刺激响应元件(sre)可与有效负载可操作连接，所述有效负载可以是任何感兴趣的蛋白质(poi)(例如，免疫治疗剂)，从而形成效应子模块。当被特定刺激(例如，小分子)活化时，sre可以产生这样的信号或结果，从而通过持续使信号稳定或使信号去稳定或任何其他类型的调节来上调或下调连接的有效负载的转录和/或蛋白质水平。在2016年4月11日提交的共同拥有的美国临时专利申请第62/320,864号、2017年3月3日提交的第62/466,596号和国际公开wo2017/180587中教导了生物回路系统的非常详细的描述(将各自的内容通过引用整体并入本文)。根据本公开，提供了调节用于免疫疗法的任何剂的表达水平和活性的生物回路系统、效应子模块、sre和组件。
45.如本文所用的，“生物回路”或“生物回路系统”被定义为生物系统内的或在生物系统中有用的回路，其包括刺激和至少一个对刺激有响应的效应子模块，其中对刺激的响应产生了在生物系统内、之间、作为生物系统的指示物或在生物系统上的至少一个信号或结果。生物系统通常被理解为任何细胞、组织、器官、器官系统或生物体，无论是动物、植物、真菌、细菌还是病毒。还应当理解，生物回路可以是人工回路，其采用本公开教导的刺激或效应子模块，并且例如利用诊断、报告系统、装置、测定法或试剂盒，在无细胞环境中产生信号或结果。人工回路可以与一个或多个电子、磁性或放射性组件或部件关联。
46.根据本公开，生物回路系统可以是去稳定结构域(dd)生物回路系统、嵌合抗原受体(car)生物回路系统(例如，i/o生物回路系统)、二聚化生物回路系统、受体生物回路系统和细胞生物回路系统。这些系统中的任何一者都可以用作这些生物回路系统中的任何其他系统的信号。
47.效应子模块
48.本公开的生物回路包括至少一个效应子模块。如本文所用的，“效应子模块”是单组分或多组分构建体或复合物，其至少包含(a)一个或多个刺激响应元件(sre)和(b)一种或多种有效负载(例如，感兴趣的蛋白质(poi))。
49.效应子模块可以设计成包括一个或多个有效负载、一个或多个sre、一个或多个切割位点、一个或多个信号序列和一个或多个附加特征(包括一个或多个接头的存在或不存在)。在国际公开号wo2017/180587的图2-6中示出了本公开的代表性效应子模块实施方案，将其内容通过引用整体并入本文。国际公开号wo2017/180587中的图7-12给出了利用这样的效应子模块的生物回路和组件，将其内容通过引用整体并入本文。
50.正如国际公开号wo2017/180587中的图2所示，展示了包含一个有效负载(即，一种免疫治疗剂)的代表性效应子模块实施方案。可以按照各种安排将效应子模块的每个组件
100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。
59.去稳定结构域
60.去稳定结构域(dd)是可以附加到感兴趣的靶蛋白上的小蛋白质结构域。术语去稳定结构域(dd)可与术语药物响应结构域(drd)互换。在不存在dd结合配体的情况下，dd使附接的感兴趣的蛋白质不稳定，使得所述蛋白质被细胞的泛素-蛋白酶体系统迅速降解(stankunas，k.等人，mol.cell，2003，12：1615-1624；banaszynski等人，cell；2006，126(5)：995-1004；综述见于banaszynski，l.a.，andwandless，t.j.chem.biol：，2006，13：11-21和rakhit r等人，chem biol.2014；21(9)：1238-1252)。然而，当特定的小分子配体结合其预期的作为配体结合配偶体的dd时，不稳定性被逆转，蛋白质功能被恢复。dd稳定性的条件性质允许从稳定的蛋白质到不稳定的底物的快速无扰动的转换，以便于降解。而且，对其配体浓度的依赖性进一步提供了降解速率的可调控制。
61.在一个实施方案中，sre是去稳定结构域(dd)。与dd结合或相互作用的小分子配体的存在、缺失或数量，可以在这样的结合或相互作用时调节有效负载的稳定性，从而调节有效负载的功能。取决于结合和/或相互作用的程度，改变的有效负载的功能可以变化，因此提供了有效负载功能的“调节”。
62.在一些实施方案中，dd的期望特征可以包括但不限于，在不存在dd配体的情况下的低蛋白质水平(例如，低基础稳定性)、大的动态范围、稳健和可预测的剂量响应行为以及快速降解动力学。与期望配体结合但不与内源性分子结合的dd可以是优选的。
63.在一些实施方案中，可以从本文称为亲本蛋白的已知蛋白开发本公开的dd。在一些实施方案中，本文所述或本领域已知的ca2去稳定结构域可用作本公开的生物回路系统中的sre，所述sre与本文教导的任何有效负载(例如，感兴趣的蛋白质或免疫治疗剂)关联。
64.野生型蛋白质(例如ca2)的区域或部分或结构域可以全部或部分用作sre/dd。可以将它们组合或重排以产生新的肽、蛋白质、区域或结构域，其中的任何一者都可以用作sre/dd或用于设计进一步的sre和/或dd的起点。
65.在一个实施方案中，sre来源于亲本蛋白(例如ca2)的区域或来自突变蛋白。亲本蛋白的区域的长度可以为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、
273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450个或多于450个氨基酸。亲本蛋白的区域的长度可以为5-50、25-75、50-100、75-125、100-150、125-175、150-200、175-225、200-250、225-275、250-300、275-325、300-350、325-375、350-400、375-425个或400-450个氨基酸。作为非限制性实例，亲本蛋白的区域的长度可以为250-270个氨基酸。作为非限制性实例，亲本蛋白的区域的长度可以为225-250个氨基酸。作为非限制性实例，亲本蛋白的区域的长度可以为225-260个氨基酸。
66.在一个实施方案中，sre来源于亲本蛋白(例如ca2)或来自突变蛋白，并且包括亲本蛋白的区域。sre可包括亲本蛋白的区域，所述区域为亲本蛋白或突变蛋白的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-100％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、10-30％、20-40％、30-50％、40-60％、50-70％、60-80％、70-90％、80-100％、10-40％、20-50％、30-60％、40-70％、50-80％、60-90％、70-100％、10-50％、20-60％、30-70％、40-80％、50-90％、60-100％、10-60％、20-70％、30-80％、40-90％、50-100％、10-70％、20-80％、30-90％、40-100％、10-80％、20-90％、30-100％、10-90％、20-100％、25-50％、50-75％或75-100％。
67.在一个实施方案中，sre来源于亲本蛋白(例如，ca2)或来自突变蛋白，并且与亲本蛋白或突变蛋白可以具有1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-100％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、10-30％、20-40％、30-50％、40-60％、50-70％、60-80％、70-90％、80-100％、10-40％、20-50％、30-60％、40-70％、50-80％、60-90％、70-100％、10-50％、20-60％、30-70％、40-80％、50-90％、60-100％、10-60％、20-70％、30-80％、40-90％、50-100％、10-70％、20-80％、30-90％、40-100％、10-80％、20-90％、30-100％、10-90％、20-100％、25-50％、50-75％或75-100％的同一性。
68.可以使从亲本蛋白的蛋白质结构域鉴定的候选去稳定结构域序列(作为模板)突变，从而生成基于模板候选结构域序列的突变体的文库。用于生成dd文库的诱变策略可包
括定点诱变，例如通过使用结构引导信息；或随机诱变，例如使用易错pcr，或两者的组合。在一些实施方案中，对于使用随机诱变鉴定的去稳定结构域，其可用于鉴定对于去稳定化可能需要的候选dd的结构特性，然后可用于使用定点诱变进一步生成突变文库。
69.在一些实施方案中，可以筛选dd突变体文库的相比于野生型蛋白质与配体具有改变的、优选更高的结合亲和力的突变。还可以使用两种或更多种配体来筛选dd文库，并且可以优先选择被一些配体稳定化但不被其他配体稳定化的dd突变。还可以选择与天然存在的蛋白质相比优先与配体结合的dd突变。这样的方法可用于优化dd的配体选择和配体结合亲和力。另外，这样的方法可用于使由脱靶配体结合引起的有害影响最小化。
70.在一些实施方案中，通过使用条形码筛选突变体文库，可以鉴定适合的dd。这样的方法可用于检测、鉴定和量化异质突变体文库中的单个突变体克隆。文库中的每个dd突变体可具有不同的条形码序列(就彼此而言)。在其他情况下，多核苷酸还可以具有关于2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核酸碱基的不同的条形码序列。文库中的每个dd突变体也可以包含多个条形码序列。当使用多个时，可以这样使用，使得每个条形码对于任何其他条形码都是独特的。可替代地，使用的每个条形码可以不是独特的，但是使用的条形码的组合可以创建可被单独追踪的独特序列。条形码序列可以置于sre的上游、sre的下游，或者，在一些情况下可以置于sre内。dd突变体可以通过使用测序方法比如sanger测序和下一代测序的条形码来鉴定，但也可以通过聚合酶链反应和定量聚合酶链反应来鉴定。在一些实施方案中，可以使用扩增每个条形码的不同大小的产物的聚合酶链反应引物来鉴定琼脂糖凝胶上的每个条形码。在其他情况下，每个条形码可具有独特的定量聚合酶链反应探针序列，使得每个条形码的靶向扩增成为可能。
71.在一个实施方案中，本公开的效应子模块和/或sre可包括至少一个去稳定结构域(dd)。效应子模块和/或sre可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个的dd。当有多于一个的dd时，每个dd可以来源于相同的亲本蛋白，来自不同的亲本蛋白，可以是两个不同的亲本蛋白的融合，或者可以是人工的。
72.在一个实施方案中，本公开的效应子模块和/或sre可包括2个dd。在一个实施方案中，本公开的效应子模块和/或sre可包括3个dd。在一个实施方案中，本公开的效应子模块和/或sre可包括4个dd。在一个实施方案中，本公开的效应子模块和/或sre可包括5个dd。在一个实施方案中，本公开的效应子模块和/或sre可包括6个dd。在一个实施方案中，本公开的效应子模块和/或sre可包括7个dd。在一个实施方案中，本公开的效应子模块和/或sre可包括8个dd。在一个实施方案中，本公开的效应子模块和/或sre可包括9个dd。在一个实施方案中，本公开的效应子模块和/或sre可包括10个dd。dd可来源于本领域已知和/或本文所述的任何亲本蛋白。在一些实施方案中，dd来源于相同的亲本蛋白。在一些实施方案中，dd来源于同一个亲本蛋白的不同区域。在一些实施方案中，dd来源于不同的亲本蛋白。
73.ca2去稳定结构域
74.在一些实施方案中，本公开的dd可以来源于人碳酸酐酶2ca2，其为碳酸酐酶(ca，ec 4.2.1.1)的成员，碳酸酐酶是存在于所有生物界的金属酶的超家族。ca平衡三个化学种类之间的反应：co2、碳酸氢盐和质子。ca的进化趋同，有七个在细菌、古细菌和真核生物中独立进化的遗传上不同的ca家族，即α-、β-、γ-、δ-、ζ-、η-和θ-ca。在一些实施方案中，本文所述的dd可以来源于至少一种亲本蛋白，所述亲本蛋白选自但不限于碳酸酐酶2(ca2)、碳
酸酐酶1(ca1)、碳酸酐酶3(ca3)、碳酸酐酶4(ca4)、碳酸酐酶5a(ca5a)、碳酸酐酶5b(ca5b)、碳酸酐酶6(ca6)、碳酸酐酶7(ca7)、碳酸酐酶8(ca8)、碳酸酐酶9(ca9)、碳酸酐酶10(ca10)、碳酸酐酶11(ca11)、碳酸酐酶12(ca12)、碳酸酐酶13(ca13)和碳酸酐酶14(ca14)。
75.在一个实施方案中，dd可来源于细胞溶质ca，例如但不限于碳酸酐酶2(ca2)、碳酸酐酶1(ca1)、碳酸酐酶3(ca3)、碳酸酐酶7(ca7)和碳酸酐酶13(ca13)。在一个实施方案中，dd可来源于线粒体ca，例如但不限于碳酸酐酶5a(ca5a)和碳酸酐酶5b(ca5b)。在一个实施方案中，dd可来源于分泌型ca，例如但不限于碳酸酐酶6(ca6)。在一个实施方案中，dd可来源于膜结合ca，例如但不限于碳酸酐酶4(ca4)、碳酸酐酶9(ca9)、碳酸酐酶12(ca12)和碳酸酐酶14(ca14)。在一个实施方案中，dd来源于ca2。在另一方面，dd可来源于ca9。
76.在一些实施方案中，本公开的dd可来源于ca2(seq id no.11717；uniprot id：p00918)，其可以被配体比如ca2的小分子抑制剂稳定化。如本文所用的，术语“ca2 wt”是指人野生型ca2蛋白序列，其被定义为seq id no.11717，genbank登录号p00918，具有以下氨基酸序列：mshhwgygkhngpehwhkdfpiakgerqs pvdidthtakydpslkplsvsydqatslrilnnghafnvefddsqdkavlkggpldgtyrliqfhfhwgsldgqgsehtvdkkkyaaelhlvhwntkygdfgkavqqpdglavlg iflkvgsakpglqkvvdvldsiktkgksadftnfdprgllpesldywtypgslttppllecvtwivlkepisvsseqvlkfrklnfngegepeelmvdnwrpaqplknrqikasfk.在一些方面，dd可来源于seq id no.11718(具有氨基酸序列：mshhwgygkhngpehwhkdfpiakgerqspvdidthtakydpslkplsvsydqatslrilnnghafnvefdds qdkaaslgslehqiwgfwescaat)或seq id no.11719(具有氨基酸序列：mshhwgygkhngpehwhkdfpiakgerqspvdidthtakydpslkplsvsydqatslrilnnghafnvefddsqdkaekgismlrkkdvknihspdnacee)的ca2。在一些实施方案中，可以通过利用ca2抑制剂的混合物来鉴定本公开的dd。在其他情况下，可以通过首先用一种ca2抑制剂筛选，随后用第二种ca2抑制剂筛选来鉴定适合的dd。
77.本公开中涵盖的去稳定结构域的氨基酸序列与其中列出的氨基酸序列具有至少约40％、50％或60％的同一性，进一步具有至少约70％的同一性，优选至少约75％或80％的同一性，更优选至少约85％、86％、87％、88％、89％或90％的同一性，并且进一步优选至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。例如，可以通过使用先进的blast计算机程序(包括可从national institutes of health获得的magic-blast 1.2.0版本)比较序列信息来确定同一性百分比。blast程序的根据是在karl和altschul(1990)proc.natl.acad.sci usa，87：2264-68(将其内容通过引用整体并入本文)中讨论的比对方法。
78.在一些实施方案中，来源于ca2的dd可包含亲本ca2序列的氨基酸2-260。这在本文中称为m1del突变。在一个实施方案中，来源于ca2的dd可包含亲本ca2序列的氨基酸2-237。
79.本文表1、表2、表3、表4和表6提供了通过诱变鉴定的ca2突变体，所述诱变比如随机诱变筛选，其使用核苷酸类似物诱变和易错pcr的组合，以生成突变体文库；或饱和诱变。ca2去稳定突变体还可以通过结构引导诱变来鉴定，并且将其提供在表1中。表1、表2、表3、表4、表5和表6中列出的突变氨基酸的位置是相对于seq id no.11717的全长ca2而言。
80.表1：ca2 dd
81.82.83.84.85.86.87.88.89.90.91.92.93.94.[0095][0096]
表2中提供了另外的ca2去稳定结构域。
[0097]
表2：ca2dd
[0098]
[0099]
[0100]
[0101]
[0102]
[0103]
[0104]
[0105]
[0106]
[0107][0108]
在一些实施方案中，本文所述的ca2 dd可以包括表3中提供的任何序列。在表3中，“*”代表终止密码子的翻译。当表3中的氨基酸序列含有一个或多个终止密码子时，以它们在氨基酸序列中出现的顺序，“aa seq id”列提供了在终止密码子之前和之后的单独组分的seq id no.。
[0109]
表3：ca2dd
[0110]
[0111]
[0112]
[0113]
[0114]
[0115]
[0116]
[0117]
[0118]
[0119][0120]
表4中提供了另外的ca2去稳定结构域。表3b中提供了ca2去稳定突变体如上所述
(例如通过结构引导诱变或通过将单突变体组合)鉴定。
[0121]
表4：ca2dd
[0122]
[0123]
[0124]
[0125]
[0126]
[0127]
[0128]
[0129]
[0130]
[0131][0132]
在一些实施方案中，ca2 wt的区域或部分可以用作生成ca2dd的模板。在一些实施方案中，ca2 dd可以排除seq id no.11717的第260位赖氨酸。在一些方面，ca2区域可以包括但不限于表5中描述的那些。
[0133]
表5：ca2区域
[0134]
[0135]
[0136][0137]
可以利用本文所述的任何ca2区域都来生成ca2 dd。表6提供了来源于ca2区域的ca2 dd。
[0138]
表6：来源于ca2区域的ca2 dd
[0139]
[0140]
[0141]
[0142][0143]
在一些实施方案中，来源于ca2的dd可包括前面表格中描述的一个、两个、三个、四个、五个或更多个突变。
[0144]
在一些实施方案中，突变可以是保守的(与突变位点处的氨基酸具有相似物理化学性质)、半保守的(例如带负电荷到正电荷的氨基酸)或非保守的(与突变位点的氨基酸具有不同物理化学性质的氨基酸)。在一些实施方案中，氨基酸赖氨酸可以突变为谷氨酸或精氨酸；氨基酸苯丙氨酸可以突变为亮氨酸；氨基酸亮氨酸可以突变为苯丙氨酸；或者氨基酸天冬酰胺可以突变为丝氨酸。野生型蛋白质的区域或部分或结构域可以全部或部分用作sre/dd。可以将它们组合或重排以产生新的肽、蛋白质、区域或结构域，其中的任何一者都可以用作sre/dd或用于设计进一步的sre和/或dd的起点。
[0145]
本文所述的去稳定结构域也可包括不影响稳定性的氨基酸和核苷酸取代，包括保守、非保守取代和/或多态性。在一些实施方案中，本文所述的ca2 dd也可以是上述去稳定结构域的片段，包括含有变体氨基酸序列的片段。优选的片段在不存在刺激的情况下是不稳定的，在加入刺激后变得稳定。优选的片段保留与刺激相互作用的能力，具有与本文所述的dd相似的效率。
[0146]
在一个实施方案中，sre包含ca2蛋白的区域。ca2蛋白的区域的长度可以为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260个或多于260个氨基酸。亲本蛋白的区域的长度可以为5-50、25-75、50-100、75-125、100-150、
125-175、150-200、175-225、200-250、225-260个氨基酸。
[0147]
在一些实施方案中，本文所述的ca2 dd可包括一个或多个相对于uniprot id：p00918(seq id no.11717)的突变。这些突变可包括但不限于，a115l、a116q、a116v、a133l、a133t、a141p、a152d、a152l、a152r、a173c、a173g、a173l、a173t、a23p、a247l、a247s、a257l、a257s、a38p、a38v、a54q、a54v、a54x、a65l、a65n、a65v、a77i、a77p、a77q、c205m、c205r、c205v、c205w、c205y、d101g、d101m、d110i、d129i、d138g、d138m、d138n、d161*、d161m、d161v、d164g、d164i、d174*、d174t、d179e、d179i、d179r、d189g、d189i、d19t、d19v、d242g、d242t、d32t、d34t、d41t、d52i、d52l、d71f、d71g、d71k、d71m、d71s、d71y、d72i、d72s、d72t、d72x、d75t、d75v、d85m、e106d、e106g、e106s、e117*、e117n、e14n、e186*、e186n、e204a、e204d、e204g、e204n、e213*、e213g、e213n、e220k、e220r、e220s、e233d、e233g、e233r、e235*、e235g、e235n、e237k、e237r、e238*、e238n、e238r、e26s、e69d、e69k、e69s、f130l、f146v、f175i、f175l、f175s、f178l、f178s、f20l、f20s、f225i、f225l、f225s、f225y、f230i、f230l、f230s、f259l、f259s、f66s、f70i、f70l、f95y、g102d、g104r、g104v、g128r、g12d、g12e、g131e、g131r、g131w、g139d、g144d、g144v、g150a、g150s、g150w、g155a、g155c、g155d、g155s、g170a、g170d、g182a、g182w、g195a、g195r、g232r、g232w、g234l、g234v、g25e、g63d、g63v、g81e、g81v、g82d、g86a、g86d、g98v、h107i、h107q、h119t、h119y、h122t、h122y、h15l、h15t、h15y、h17d、h17i、h36i、h36q、h64m、h94t、h96t、i145f、i145m、i166h、i166l、i209d、i209l、i215h、i215s、i22l、i255n、i255s、i33s、i59f、i59n、i59s、i91f、k111e、k111n、k112r、k113i、k113n、k126n、k132e、k132r、k148e、k148r、k153*、k153n、k158e、k158n、k167*、k169n、k169r、k171q、k171r、k18r、k212n、k212q、k212r、k212w、k224e、k224n、k227*、k227n、k24r、k251e、k251r、k256q、k260f、k260l、k260q、k39s、k45n、k45s、k80m、k80r、l118f、l120w、l140v、l140w、l143*、l147*、l147f、l156f、l156h、l156p、l156q、l163a、l163w、l183p、l183s、l184f、l184p、l188p、l188w、l197*、l197m、l197p、l197r、l197t、l202f、l202h、l202i、l202p、l202r、l202s、l203p、l203s、l203w、l211*、l211a、l211s、l223*、l223i、l223v、l228f、l228h、l228t、l239*、l239f、l239t、l250*、l250p、l250t、l44*、l44m、l47c、l47v、l57*、l57x、l60s、l79f、l79s、l84w、l90*、l90v、m240d、m240l、m240r、m240w、n11d、n11k、n124t、n177*、n177t、n229*、n229t、n231d、n231f、n231k、n231l、n231m、n231q、n231t、n243q、n243t、n252e、n252t、n61r、n61t、n61y、n62k、n62m、n67d、n67t、p137l、p13a、p13h、p13l、p13s、p154l、p154r、p154t、p180l、p180s、p185l、p185s、p185v、p194q、p200a、p200l、p200s、p200t、p201a、p201l、p201r、p201s、p214t、p236l、p236t、p246l、p246q、p249a、p249f、p249h、p249i、p249x、p30l、p30s、p42l、p83a、q103k、q135s、q136n、q157r、q157s、q221a、q221r、q248f、q248l、q248s、q254a、q254k、q28s、q53h、q53k、q53n、q74r、q92h、q92s、r181h、r181s、r181v、r226h、r226p、r226v、r245a、r253g、r253q、r27a、r58g、r89d、r89f、r89i、r89x、r89y、s105l、s105q、s151a、s151i、s151q、s165f、s165p、s172e、s172v、s187i、s187p、s196h、s196l、s216a、s216q、s218a、s218q、s219a、s219q、s258f、s258p、s29c、s29p、s43p、s43t、s48l、s50p、s56f、s56n、s56p、s56x、s73l、s73n、s73x、s99h、t108l、t125i、t125p、t168k、t168n、t168q、t176h、t176l、t192d、t192f、t192i、t192n、t192p、t192x、t198d、t198i、t198p、t199a、t199h、t199p、t207d、t207i、t207p、t207s、t35i、t35l、t37q、t55l、t87l、v109m、v109w、v121f、v134c、v134f、v142f、v149g、v149l、v159l、
260，v134f，l228f)(seq id no.210580)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71g，n231k)(seq id no.210582)、ca2(wt的氨基酸2-260，s56f，d71s)(seq id no.210584)、ca2(wt的氨基酸2-260，d52l，g128r，q248f)(seq id no.210586)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73x，r89x)(seq id no.210588)、ca2(wt的氨基酸2-260，y51x，d72x，v241x，p249x)(seq id no.210592)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72i，w97c)(seq id no.210594)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k，t192f，n231f)(seq id no.210596)、ca2(wt的氨基酸2-260，h36q，s43t，y51f，n67d，g131w，r226h)(seq id no.210698)、ca2(wt的氨基酸2-260，f70i，f146v)(seq id no.210700)、ca2(wt的氨基酸2-260，k45n，v68l，h119y，k169r，d179e)(seq id no.210704)、ca2(wt的氨基酸2-260，h15l，a54v，k111e，e220k，f225i)(seq id no.210706)、ca2(wt的氨基酸2-260，pbs，p83a，d101g，k111n，f230i)(seq id no.210708)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，w123r，e220k)(seq id no.210712)、ca2(wt的氨基酸2-260，n11d，e69k，g86d，v109m，k113i，t125i，d138g，g155s)(seq id no.210714)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n，g102r，a173t)(seq id no.210716)、ca2(wt的氨基酸2-260，l79f，pl 80s)(seq id no.210718)、ca2(wt的氨基酸2-260，a77p，g102r，d138n)(seq id no.210724)、ca2(wt的氨基酸2-260，f20l，k45n，g63d，e69v，n231i)(seq id no.210726)、ca2(wt的氨基酸2-260，t199n，l202p，l228f)(seq id no.210728)、ca2(wt的氨基酸2-260，k9n，h122y，t168k)(seq id no.210730)、ca2(wt的氨基酸2-260，q53h，l90v，q92h，g131e)(seq id no.210732)、ca2(wt的氨基酸2-260，l44m，l47v，n62k，e69d)(seq id no.210734)、ca2(wt的氨基酸2-260，d75v，k169n，f259l)(seq id no.210738)、ca2(wt的氨基酸2-260，t207s，v222a，n231d)(seq id no.210740)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59f，v206m，g232r)(seq id no.210742)、ca2(wt的氨基酸2-260，p13a，a133t)(seq id no.210744)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n，r89i)(seq id no.210750)、ca2(wt的氨基酸2-260，a65n，g86d，g131r，g155d，k158n，v162a，g170d，p236l)(seq id no.210752)、ca2(wt的氨基酸2-260，g12r，h15y，d19v)(seq id no.210754)、ca2(wt的氨基酸2-260，a65v，f95y，e106g，h107q，i145m，f175i)(seq id no.210758)和/或ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，e69v，n231i)(seq id no.210851或210847)。
[0150]
在一个实施方案中，本文所述的ca2 dd包含相对于uniprot id：p00918(seq id no.11717)的多个突变，所述突变选自ca2(wt的氨基酸2-260，r27l，h122y)、ca2(wt的氨基酸2-260，t87i，h122y)、ca2(wt的氨基酸2-260，h122y，n252d)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，v241f)、ca2(wt的氨基酸2-260，v241f，p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71l，l250r)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，p249f)、ca2(wt的氨基酸2-260，t55k，g63n，q248n)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，a257del，s258del，f259del，k260del)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，s2del，h3del，h4del，w5del)、ca2(wt的氨基酸2-260，w4y，l156h)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，g234del，e235del，p236del)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，f225l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d70n，d74n，d100n，l156h)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n，g102r)(seq id no.210598)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，e69v，n231i)(seq id no.210748)、ca2(wt的氨基酸2-260，r27l，t87i，h122y，n252d)(seq id no.210702)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，v241f，p249l)(seq id no.210503)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71l，t87n，l250r)(seq id no.210510)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，s172c，
paniscus)、黑猩猩(pan troglodytes)、金钱豹(panthera pardus)、东北虎(panthera tigris altaica)、东非狒狒(papio anubis)、抹香鲸(physeter catodon)、乌干达红疣猴(piliocolobus tephrosceles)、苏门答腊猩猩(pongo abelii)、克氏冕狐猴(propithecus coquereli)、美洲狮(puma concolor)、滇金丝猴(rhinopithecus bieti)、川金丝猴(rhinopithecus roxellana)、亚马逊松鼠猴(saimiri boliviensis)、野猪(sus scrofa)、狮尾狒(theropithecus gelada)、佛罗里达海牛(trichechus manatus latirostris)、中国树鼩(tupaia chinensis)、宽吻海豚(tursiops truncatus)、北极地松鼠(urocitellus parryii)、灰熊(ursus arctos horribilis)、北极熊(ursus maritimus)、狐狸(vulpes)和/或加州海狮(zalophus californianus)。
[0153]
本文所述的sre可包含包括但不限于一个、二个、三个或更多个突变的ca2 dd，所述突变例如但不限于a115l、a116q、a116v、a133l、a133t、a141p、a152d、a152l、a152r、a173c、a173g、a173l、a173t、a23p、a247l、a247s、a257l、a257s、a38p、a38v、a54q、a54v、a54x、a65l、a65n、a65v、a77i、a77p、a77q、c205m、c205r、c205v、c205w、c205y、d101g、d101m、d110i、d129i、d138g、d138m、d138n、d161*、d161m、d161v、d164g、d164i、d174*、d174t、d179e、d179i、d179r、d189g、d189i、d19t、d19v、d242g、d242t、d32t、d34t、d41t、d52i、d52l、d71f、d71g、d71k、d71m、d71s、d71y、d72i、d72s、d72t、d72x、d75t、d75v、d85m、e106d、e106g、e106s、e117*、e117n、e14n、e186*、e186n、e204a、e204d、e204g、e204n、e213*、e213g、e213n、e220k、e220r、e220s、e233d、e233g、e233r、e235*、e235g、e235n、e237k、e237r、e238*、e238n、e238r、e26s、e69d、e69k、e69s、f130l、f146v、f175i、f175l、f175s、f178l、f178s、f20l、f20s、f225i、f225l、f225s、f225y、f230i、f230l、f230s、f259l、f259s、f66s、f70i、f70l、f95y、g102d、g104r、g104v、g128r、g12d、g12e、g131e、g131r、g131w、g139d、g144d、g144v、g150a、g150s、g150w、g155a、g155c、g155d、g155s、g170a、g170d、g182a、g182w、g195a、g195r、g232r、g232w、g234l、g234v、g25e、g63d、g63v、g81e、g81v、g82d、g86a、g86d、g98v、h107i、h107q、h119t、h119y、h122t、h122y、h15l、h15t、h15y、h17d、h17i、h36i、h36q、h64m、h94t、h96t、i145f、i145m、i166h、i166l、i209d、i209l、i215h、i215s、i22l、i255n、i255s、i33s、i59f、i59n、i59s、i91f、k111e、k111n、k112r、k113i、k113n、k126n、k132e、k132r、k148e、k148r、k153*、k153n、k158e、k158n、k167*、k169n、k169r、k171q、k171r、k18r、k212n、k212q、k212r、k212w、k224e、k224n、k227*、k227n、k24r、k251e、k251r、k256q、k260f、k260l、k260q、k39s、k45n、k45s、k80m、k80r、l118f、l120w、l140v、l140w、l143*、l147*、l147f、l156f、l156h、l156p、l156q、l163a、l163w、l183p、l183s、l184f、l184p、l188p、l188w、l197*、l197m、l197p、l197r、l197t、l202f、l202h、l202i、l202p、l202r、l202s、l203p、l203s、l203w、l211*、l211a、l211s、l223*、l223i、l223v、l228f、l228h、l228t、l239*、l239f、l239t、l250*、l250p、l250t、l44*、l44m、l47c、l47v、l57*、l57x、l60s、l79f、l79s、l84w、l90*、l90v、m240d、m240l、m240r、m240w、n11d、n11k、n124t、n177*、n177t、n229*、n229t、n231d、n231f、n231k、n231l、n231m、n231q、n231t、n243q、n243t、n252e、n252t、n61r、n61t、n61y、n62k、n62m、n67d、n67t、p137l、p13a、p13h、p13l、p13s、p154l、p154r、p154t、p180l、p180s、p185l、p185s、p185v、p194q、p200a、p200l、p200s、p200t、p201a、p201l、p201r、p201s、p214t、p236l、p236t、p246l、p246q、p249a、p249f、p249h、p249i、p249x、p30l、p30s、p42l、p83a、q103k、q135s、q136n、q157r、q157s、q221a、q221r、
260，d70n，d74n，d100n，l156h)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n，g102r)(seq id no.210598)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，e69v，n231i)(seqid no.210748)、ca2(wt的氨基酸2-260，r27l，t87i，h122y，n252d)(seq id no.210702)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，v241f，p249l)(seq id no.210503)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71l，t87n，l250r)(seq id no.210510)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，s172c，f178y，e186d)(seq id no.210756)、ca2(wt的氨基酸2-260，a77i，p249f)(seq id no.210514)、ca2(wt的氨基酸2-260，e106d，c205s)(seq id no.210523)、ca2(wt的氨基酸2-260，c205s，w208s)(seq id no.
[0157]
210525)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73n，r89y)(seq id no.210532)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k，t192f)(seq id no.210534)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73n，r89f)(seq id no.210562)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，m240l)(seq id no.210578)、ca2(wt的氨基酸2-260，v134f，l228f)(seq id no.210580)和/或ca2(wt的氨基酸2-260，s56f，d71s)(seq id no.210584)。
[0158]
本文还提供了包括至少一个效应子模块的生物回路系统。生物回路的效应子模块可包括全部或部分地包括人碳酸酐酶2(ca2；seq id no.11717)的刺激响应元件(sre)。生物回路还可包括至少一个可与sre附接、附加或关联的有效负载。
[0159]
全部或部分地包括人碳酸酐酶2(ca2；seq id no.11717)的生物回路系统的sre可包括一个、两个、三个或更多个突变，例如但不限于，a115l、a116q、a116v、a133l、a133t、a141p、a152d、a152l、a152r、a173c、a173g、a173l、a173t、a23p、a247l、a247s、a257l、a257s、a38p、a38v、a54q、a54v、a54x、a65l、a65n、a65v、a77i、a77p、a77q、c205m、c205r、c205v、c205w、c205y、d101g、d101m、d110i、d129i、d138g、d138m、d138n、d161*、d161m、d161v、d164g、d164i、d174*、d174t、d179e、d179i、d179r、d189g、d189i、d19t、d19v、d242g、d242t、d32t、d34t、d41t、d52i、d52l、d71f、d71g、d71k、d71m、d71s、d71y、d72i、d72s、d72t、d72x、d75t、d75v、d85m、e106d、e106g、e106s、e117*、e117n、e14n、e186*、e186n、e204a、e204d、e204g、e204n、e213*、e213g、e213n、e220k、e220r、e220s、e233d、e233g、e233r、e235*、e235g、e235n、e237k、e237r、e238*、e238n、e238r、e26s、e69d、e69k、e69s、f130l、f146v、f175i、f175l、f175s、f178l、f178s、f20l、f20s、f225i、f225l、f225s、f225y、f230i、f230l、f230s、f259l、f259s、f66s、f70i、f70l、f95y、g102d、g104r、g104v、g128r、g12d、g12e、g131e、g131r、g131w、g139d、g144d、g144v、g150a、g150s、g150w、g155a、g155c、g155d、g155s、g170a、g170d、g182a、g182w、g195a、g195r、g232r、g232w、g234l、g234v、g25e、g63d、g63v、g81e、g81v、g82d、g86a、g86d、g98v、h107i、h107q、h119t、h119y、h122t、h122y、h15l、h15t、h15y、h17d、h17i、h36i、h36q、h64m、h94t、h96t、i145f、i145m、i166h、i166l、i209d、i209l、i215h、i2i5s、i22l、i255n、i255s、i33s、i59f、i59n、i59s、i91f、k111e、k111n、k112r、k113i、k113n、k126n、k132e、k132r、k148e、k148r、k153*、k153n、k158e、k158n、k167*、k169n、k169r、k171q、k171r、k18r、k212n、k212q、k212r、k212w、k224e、k224n、k227*、k227n、k24r、k251e、k251r、k256q、k260f、k260l、k260q、k39s、k45n、k45s、k80m、k80r、l118f、l120w、l140v、l140w、l143*、l147*、l147f、l156f、l156h、l156p、l156q、l163a、l163w、l183p、l183s、l184f、l184p、l188p、l188w、l197*、l197m、l197p、l197r、l197t、l202f、l202h、l202i、l202p、l202r、l202s、l203p、l203s、l203w、l211*、l211a、l211s、l223*、l223i、l223v、l228f、l228h、l228t、l239*、l239f、l239t、l250*、l250p、l250t、l44*、
260，e106d，c205s)(seq id no.210523)、ca2(wt的氨基酸2-260，c205s，w208s)(seq id no.210525)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73n，r89y)(seq id no.210532)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k，t192f)(seq id no.210534)、ca2(wt的氨基酸2-260，y193l，k260l)(seq id no.210540)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71f，v241f，p249l)(seq id no.210544)、ca2(wt的氨基酸2-260，l147f，q248f)(seq id no.210548)、ca2(wt的氨基酸2-260，d52i，s258p)(seq id no.210550)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72s，t192n)(seq id no.210552)、ca2(wt的氨基酸2-260，d179e，t192i)(seq id no.210554)、ca2(wt的氨基酸2-260，s56n，q103k)(seq id no.210558)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71y，q248l)(seq id no.210560)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73n，r89f)(seq id no.210562)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k，n231l，e235g，l239f)(seq id no.210564)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，p249i)(seq id no.210568)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72x，v241x，p249x)(seq id no.210572)、ca2(wt的氨基酸2-260，a54x，s56x，l57x，t192x)(seq id no.210574)、ca2(wt的氨基酸2-260，y193v，k260f)(seq id no.210576)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，m240l)(seq id no.210578)、ca2(wt的氨基酸2-260，v134f，l228f)(seq id no.210580)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71g，n231k)(seq id no.210582)、ca2(wt的氨基酸2-260，s56f，d71s)(seq id no.210584)、ca2(wt的氨基酸2-260，d52l，g128r，q248f)(seq id no.210586)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73x，r89x)(seq id no.210588)、ca2(wt的氨基酸2-260，y51x，d72x，v241x，p249x)(seq id no.210592)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72i，w97c)(seq id no.210594)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k，t192f，n231f)(seq id no.210596)、ca2(wt的氨基酸2-260，h36q，s43t，y51f，n67d，g131w，r226h)(seq id no.210698)、ca2(wt的氨基酸2-260，f70i，f146v)(seq id no.210700)、ca2(wt的氨基酸2-260，k45n，v68l，h119y，k169r，d179e)(seq id no.210704)、ca2(wt的氨基酸2-260，h15l，a54v，k111e，e220k，f225i)(seq id no.210706)、ca2(wt的氨基酸2-260，p13s，p83a，d101g，k111n，f230i)(seq id no.210708)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，w123r，e220k)(seq id no.210712)、ca2(wt的氨基酸2-260，n11d，e69k，g86d，v109m，k113i，t125i，d138g，g155s)(seq id no.210714)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n，g102r，a173t)(seq id no.210716)、ca2(wt的氨基酸2-260，l79f，pl80s)(seq id no.210718)、ca2(wt的氨基酸2-260，a77p，g102r，d138n)(seq id no.210724)、ca2(wt的氨基酸2-260，f20l，k45n，g63d，e69v，n231i)(seq id no.210726)、ca2(wt的氨基酸2-260，t199n，l202p，l228f)(seq id no.210728)、ca2(wt的氨基酸2-260，k9n，h122y，t168k)(seq id no.210730)、ca2(wt的氨基酸2-260，q53h，l90v，q92h，g131e)(seq id no.210732)、ca2(wt的氨基酸2-260，l44m，l47v，n62k，e69d)(seq id no.210734)、ca2(wt的氨基酸2-260，d75v，k169n，f259l)(seq id no.210738)、ca2(wt的氨基酸2-260，t207s，v222a，n231d)(seq id no.210740)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59f，v206m，g232r)(seq id no.210742)、ca2(wt的氨基酸2-260，p13a，a133t)(seq id no.210744)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n，r89i)(seq id no.210750)、ca2(wt的氨基酸2-260，a65n，g86d，g131r，g155d，k158n，v162a，g170d，p236l)(seq id no.210752)、ca2(wt的氨基酸2-260，g12r，h15y，d19v)(seq id no.210754)、ca2(wt的氨基酸2-260，a65v，f95y，e106g，h107q，i145m，f175i)(seq id no.210758)和/或ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，e69v，n231i)(seq id no.210851或210847)。
[0162]
在一个实施方案中，全部或部分地包括人碳酸酐酶2(ca2；seq id no.11717)的生物回路系统的sre可包括多个突变，所述突变选自ca2(wt的氨基酸2-260，r27l，h122y)、ca2(wt的氨基酸2-260，t87i，h122y)、ca2(wt的氨基酸2-260，h122y，n252d)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，v241f)、ca2(wt的氨基酸2-260，v241f，p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71l，l250r)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，p249f)、ca2(wt的氨基酸2-260，t55k，g63n，q248n)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，a257del，s258del，f259del，k260del)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，s2del，h3del，h4del，w5del)、ca2(wt的氨基酸2-260，w4y，l156h)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，g234del，e235del，p236del)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，f225l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d70n，d74n，d100n，l156h)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n，g102r)(seq id no.210598)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，e69v，n231i)(seq id no.210748)、ca2(wt的氨基酸2-260，r27l，t87i，h122y，n252d)(seq id no.210702)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，v241f，p249l)(seq id no.210503)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71l，t87n，l250r)(seq id no.210510)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，s172c，f178y，e186d)(seq id no.210756)、ca2(wt的氨基酸2-260，a77i，p249f)(seq id no.210514)、ca2(wt的氨基酸2-260，e106d，c205s)(seq id no.210523)、ca2(wt的氨基酸2-260，c205s，w208s)(seq id no.210525)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73n，r89y)(seq id no.210532)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k，t192f)(seq id no.210534)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73n，r89f)(seq id no.210562)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，m240l)(seq id no.210578)、ca2(wt的氨基酸2-260，v134f，l228f)(seq id no.210580)和/或ca2(wt的氨基酸2-260，s56f，d71s)(seq id no.210584)。
[0163]
sre的稳定和去稳定比
[0164]
在一些实施方案中，本公开提供了通过测量稳定比和去稳定比来调节蛋白质、表达、功能或水平的方法。如本文所用的，稳定比可定义为，感兴趣的蛋白质对刺激作出响应的表达、功能或水平与感兴趣的蛋白质在不存在对sre特异的刺激的情况下的表达、功能或水平的比率。在一些方面，稳定比至少为1，例如至少为1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、1-70、1-80、1-90、1-100、20-30、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、20-95、20-100、30-40、30-50、30-60、30-70、30-80、30-90、30-95、30-100、40-50、40-60、40-70、40-80、40-90、40-95、40-100、50-60、50-70、50-80、50-90、50-95、50-100、60-70、60-80、60-90、60-95、60-100、70-80、70-90、70-95、70-100、80-90、80-95、80-100、90-95、90-100或95-100。如本文所用的，去稳定比可定义为，感兴趣的蛋白质在不存在对效应子模块特异的刺激的情况下的表达、功能或水平与感兴趣的蛋白质被组成型表达并且在不存在对sre特异的刺激的情况下的表达、功能或水平的比率。如本文所用的“组成型”是指不与sre连接并且因此在存在和不存在刺激的情况下均表达的感兴趣的蛋白质的表达、功能或水平。在一些方面，去稳定比至少为0，例如至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9，或至少0-0.1、0-0.2、0-0.3、0-0.4、0-0.5、0-0.6、0-0.7、0-0.8、0-0.9、0.1-0.2、0.1-0.3、0.1-0.4、0.1-0.5、0.1-0.6、0.1-0.7、0.1-0.8、0.1-0.9、0.2-0.3、0.2-0.4、0.2-0.5、0.2-0.6、0.2-0.7、0.2-0.8、0.2-0.9、0.3-0.4、0.3-0.5、0.3-0.6、0.3-0.7、0.3-0.8、0.3-0.9、0.4-0.5、0.4-0.6、0.4-0.7、0.4-0.8、0.4-0.9、0.5-0.6、0.5-0.7、0.5-0.8、0.5-0.9、0.6-0.7、0.6-0.8、0.6-0.9、0.7-08、0.7-0.9或0.8-0.9。
[0165]
在一些实施方案中，效应子模块的sre可以1或更大的稳定比使感兴趣的有效负载稳定，其中稳定比可包括感兴趣的有效负载在存在刺激的情况下的表达、功能或水平与感兴趣的有效负载在不存在刺激的情况下的表达、功能或水平的比率。
[0166]
在一些实施方案中，sre可以0至0.09之间的去稳定比使感兴趣的有效负载去稳定，其中去稳定比可包括感兴趣的有效负载在不存在对sre特异的刺激的情况下的表达、功能或水平与感兴趣的有效负载被组成型表达并且在不存在对sre特异的刺激的情况下的表达、功能或水平的比率。
[0167]
sre的蛋白质-蛋白质相互作用
[0168]
在一些实施方案中，本公开提供了刺激响应元件(sre)，其可整体地或部分地包含来源于人碳酸酐酶2(ca2；seq id no.11717)的去稳定结构域(dd)。在一个实施方案中，dd可包括整个ca2(seq id no.11717)。在一些实施方案中，dd可包括人碳酸酐酶的部分或区域。ca2的部分或区域可以选自但不限于ca2(seq id no.11717)的氨基酸2-260，例如但不限于，seq id no.(210492)；ca2(seq id no.11717)的氨基酸1-142，例如但不限于，seq id no.(210820)；ca2(seq id no.11717)的氨基酸2-142，例如但不限于，seq id no.(210821)；ca2(seq id no.11717)的氨基酸1-190，例如但不限于，seq id no.(210822)；ca2(seq id no.11717)的氨基酸2-190，例如但不限于，seq id no.(210823)；ca2(seq id no.11717)的氨基酸1-89，例如但不限于，seq id no.(210824)；ca2(seq id no.11717)的氨基酸2-89，例如但不限于，seq id no.(210825)；ca2(seq id no.11717)的氨基酸1-243，例如但不限于，seq id no.(210826)；ca2(seq id no.11717)的氨基酸2-243，例如但不限于，seq id no.(210827)；ca2(seq id no.11717)的氨基酸1-166，例如但不限于，seq id no.(210828)；ca2(seq id no.11717)的氨基酸2-166，例如但不限于，seq id no.(210782)；ca2(seq id no.11717)的氨基酸1-116，例如但不限于，seq id no.(210830)；ca2(seq id no.11717)的氨基酸2-116，例如但不限于，seq id no.(210831)；ca2(seq id no.11717)的氨基酸1-152，例如但不限于，seq id no.(210832)；ca2(seq id no.11717)的氨基酸2-152，例如但不限于，seq id no.(210833)；ca2(seq id no.11717)的氨基酸1-43，例如但不限于，seq id no.(210834)；或ca2(seq id no.11717)的氨基酸2-43，例如但不限于，seq id no.(210835)。在一个实施方案中，dd可包括ca2(seq id no.11717)的氨基酸2至260。在一个实施方案中，dd可包括ca2(seq id no.11717)的氨基酸2至260，例如但不限于seq id no.210492。
[0169]
在一个实施方案中，dd可包括ca2(seq id no.11717)的氨基酸2至260。
[0170]
在一些实施方案中，dd可包括一个、两个、三个或更多个突变，例如但不限于，a115l、a116q、a116v、a133l、a133t、a141p、a152d、a152l、a152r、a173c、a173g、a173l、a173t、a23p、a247l、a247s、a257l、a257s、a38p、a38v、a54q、a54v、a54x、a65l、a65n、a65v、a77i、a77p、a77q、c205m、c205r、c205v、c205w、c205y、d101g、d101m、d110i、d129i、d138g、d138m、d138n、d161*、d161m、d161v、d164g、d164i、d174*、d174t、d179e、d179i、d179r、d189g、d189i、d19t、d19v、d242g、d242t、d32t、d34t、d41t、d52i、d52l、d71f、d71g、d71k、d71m、d71s、d71y、d72i、d72s、d72t、d72x、d75t、d75v、d85m、e106d、e106g、e106s、e117*、e117n、e14n、e186*、e186n、e204a、e204d、e204g、e204n、e213*、e213g、e213n、e220k、e220r、e220s、e233d、e233g、e233r、e235*、e235g、e235n、e237k、e237r、e238*、e238n、e238r、e26s、
e69d、e69k、e69s、f130l、f146v、f175i、f175l、f175s、f178l、f178s、f20l、f20s、f225i、f225l、f225s、f225y、f230i、f230l、f230s、f259l、f259s、f66s、f70i、f70l、f95y、g102d、g104r、g104v、g128r、g12d、g12e、g131e、g131r、g131w、g139d、g144d、g144v、g150a、g150s、g150w、g155a、g155c、g155d、g155s、g170a、g170d、g182a、g182w、g195a、g195r、g232r、g232w、g234l、g234v、g25e、g63d、g63v、g81e、g81v、g82d、g86a、g86d、g98v、h107i、h107q、h119t、h119y、h122t、h122y、h15l、h15t、h15y、h17d、h17i、h36i、h36q、h64m、h94t、h96t、i145f、i145m、i166h、i166l、i209d、i209l、i215h、i215s、i22l、i255n、i255s、i33s、i59f、i59n、i59s、i91f、k111e、k111n、k112r、k113i、k113n、k126n、k132e、k132r、k148e、k148r、k153*、k153n、k158e、k158n、k167*、k169n、k169r、k171q、k171r、k18r、k212n、k212q、k212r、k212w、k224e、k224n、k227*、k227n、k24r、k251e、k251r、k256q、k260f、k260l、k260q、k39s、k45n、k45s、k80m、k80r、l118f、l120w、l140v、l140w、l143*、l147*、l147f、l156f、l156h、l156p、l156q、l163a、l163w、l183p、l183s、l184f、l184p、l188p、l188w、l197*、l197m、l197p、l197r、l197t、l202f、l202h、l202i、l202p、l202r、l202s、l203p、l203s、l203w、l211*、l211a、l211s、l223*、l223i、l223v、l228f、l228h、l228t、l239*、l239f、l239t、l250*、l250p、l250t、l44*、l44m、l47c、l47v、l57*、l57x、l60s、l79f、l79s、l84w、l90*、l90v、m240d、m240l、m240r、m240w、n11d、n11k、n124t、n177*、n177t、n229*、n229t、n231d、n231f、n231k、n231l、n231m、n231q、n231t、n243q、n243t、n252e、n252t、n61r、n61t、n61y、n62k、n62m、n67d、n67t、p137l、p13a、p13h、p13l、p13s、p154l、p154r、p154t、p180l、p180s、p185l、p185s、p185v、p194q、p200a、p200l、p200s、p200t、p201a、p201l、p201r、p201s、p214t、p236l、p236t、p246l、p246q、p249a、p249f、p249h、p249i、p249x、p30l、p30s、p42l、p83a、q103k、q135s、q136n、q157r、q157s、q221a、q221r、q248f、q248l、q248s、q254a、q254k、q28s、q53h、q53k、q53n、q74r、q92h、q92s、r181h、r181s、r181v、r226h、r226p、r226v、r245a、r253g、r253q、r27a、r58g、r89d、r89f、r89i、r89x、r89y、s105l、s105q、s151a、s151i、s151q、s165f、s165p、s172e、s172v、s187i、s187p、s196h、s196l、s216a、s216q、s218a、s218q、s219a、s219q、s258f、s258p、s29c、s29p、s43p、s43t、s48l、s50p、s56f、s56n、s56p、s56x、s73l、s73n、s73x、s99h、t108l、t125i、t125p、t168k、t168n、t168q、t176h、t176l、t192d、t192f、t192i、t192n、t192p、t192x、t198d、t198i、t198p、t199a、t199h、t199p、t207d、t207i、t207p、t207s、t35i、t35l、t37q、t55l、t87l、v109m、v109w、v121f、v134c、v134f、v142f、v149g、v149l、v159l、v159s、v160c、v160l、v162a、v162c、v206*、v206c、v206m、v210c、v217l、v217r、v217s、v222a、v222c、v222g、v241g、v241w、v241x、v31l、v49f、v68l、v68w、v78c、w123g、w123r、w16g、w191*、w191g、w191l、w208g、w208l、w208s、w244*、w244g、w244l、w97c、w97g、y114h、y114m、y127m、y190*、y190l、y190t、y193c、y193f、y193i、y193l、y193t、y193v、y193x、y40m、y51f、y51m、y51t、y51x、y88t、k9n、s29a。如本文所用的，“*”指示终止密码子的翻译，并且x指示任何氨基酸。
[0171]
在一个实施方案中，dd可包括e106d、g63d、h122y、i59n、l156h、l183s、l197p、s56f、s56n、w208s、y193i或y51t突变。
[0172]
在一些实施方案中，dd可包括多个突变，例如但不限于ca2(wt的氨基酸2-260，r27l，h122y)、ca2(wt的氨基酸2-260，t87i，h122y)、ca2(wt的氨基酸2-260，h122y，n252d)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，v241f)、ca2(wt的氨基酸2-260，v241f，p249l)、ca2(wt的氨基
酸2-260，d72f，p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71l，l250r)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，p249f)、ca2(wt的氨基酸2-260，t55k，g63n，q248n)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，a257del，s258del，f259del，k260del)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，s2del，h3del，h4del，w5del)、ca2(wt的氨基酸2-260，w4y，l156h)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，g234del，e235del，p236del)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，f225l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d70n，d74n，d100n，l156h)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n，g102r)(seq id no.210598)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，e69v，n231i)(seq id no.210748)、ca2(wt的氨基酸2-260，r27l，t87i，h122y，n252d)(seq id no.210702)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，v241f，p249l)(seq id no.210503)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71l，t87n，l250r)(seq id no.210510)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，s172c，f178y，e186d)(seq id no.210756)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71f，n231f)(seq id no.210505)、ca2(wt的氨基酸2-260，a77i，p249f)(seq id no.210514)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k，p249h)(seq id no.210516)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，p249h)(seq id no.210518)、ca2(wt的氨基酸2-260，q53n，n61y)(seq id no.210521)、ca2(wt的氨基酸2-260，e106d，c205s)(seq id no.210523)、ca2(wt的氨基酸2-260，c205s，w208s)(seq id no.210525)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73n，r89y)(seq id no.210532)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k，t192f)(seq id no.210534)、ca2(wt的氨基酸2-260，y193l，k260l)(seq id no.210540)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71f，v241f，p249l)(seq id no.210544)、ca2(wt的氨基酸2-260，l147f，q248f)(seq id no.210548)、ca2(wt的氨基酸2-260，d52i，s258p)(seq id no.210550)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72s，t192n)(seq id no.210552)、ca2(wt的氨基酸2-260，d179e，t192i)(seq id no.210554)、ca2(wt的氨基酸2-260，s56n，q103k)(seq id no.210558)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71y，q248l)(seq id no.210560)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73n，r89f)(seq id no.210562)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k，n231l，e235g，l239f)(seq id no.210564)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，p249i)(seq id no.210568)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72x，v241x，p249x)(seq id no.210572)、ca2(wt的氨基酸2-260，a54x，s56x，l57x，t192x)(seq id no.210574)、ca2(wt的氨基酸2-260，y193v，k260f)(seq id no.210576)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，m240l)(seq id no.210578)、ca2(wt的氨基酸2-260，v134f，l228f)(seq id no.210580)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71g，n231k)(seq id no.210582)、ca2(wt的氨基酸2-260，s56f，d71s)(seq id no.210584)、ca2(wt的氨基酸2-260，d52l，g128r，q248f)(seq id no.210586)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73x，r89x)(seq id no.210588)、ca2(wt的氨基酸2-260，y51x，d72x，v241x，p249x)(seq id no.210592)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72i，w97c)(seq id no.210594)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k，t192f，n231f)(seq id no.210596)、ca2(wt的氨基酸2-260，h36q，s43t，y51f，n67d，g131w，r226h)(seq id no.210698)、ca2(wt的氨基酸2-260，f70i，f146v)(seq id no.210700)、ca2(wt的氨基酸2-260，k45n，v68l，h119y，k169r，d179e)(seq id no.210704)、ca2(wt的氨基酸2-260，h15l，a54v，k111e，e220k，f225i)(seq id no.210706)、ca2(wt的氨基酸2-260，pbs，p83a，d101g，k111n，f230i)(seq id no.210708)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，w123r，e220k)(seq id no.210712)、ca2(wt的氨基酸2-260，n11d，e69k，g86d，v109m，k113i，t125i，d138g，g155s)(seq id no.210714)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n，g102r，a173t)(seq id no.210716)、ca2(wt的氨基酸2-260，l79f，pl 80s)
(seq id no.210718)、ca2(wt的氨基酸2-260，a77p，g102r，d138n)(seq id no.210724)、ca2(wt的氨基酸2-260，f20l，k45n，g63d，e69v，n231i)(seq id no.210726)、ca2(wt的氨基酸2-260，t199n，l202p，l228f)(seq id no.210728)、ca2(wt的氨基酸2-260，k9n，h122y，t168k)(seq id no.210730)、ca2(wt的氨基酸2-260，q53h，l90v，q92h，g131e)(seq id no.210732)、ca2(wt的氨基酸2-260，l44m，l47v，n62k，e69d)(seq id no.210734)、ca2(wt的氨基酸2-260，d75v，k169n，f259l)(seq id no.210738)、ca2(wt的氨基酸2-260，t207s，v222a，n231d)(seq id no.210740)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59f，v206m，g232r)(seq id no.210742)、ca2(wt的氨基酸2-260，p13a，a133t)(seq id no.210744)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n，r89i)(seq id no.210750)、ca2(wt的氨基酸2-260，a65n，g86d，g131r，g155d，k158n，v162a，g170d，p236l)(seq id no.210752)、ca2(wt的氨基酸2-260，g12r，h15y，d19v)(seq id no.210754)、ca2(wt的氨基酸2-260，a65v，f95y，e106g，h107q，i145m，f175i)(seq id no.210758)和/或ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，e69v，n231i)(seq id no.210851或210847)。
[0173]
在一个实施方案中，dd可包括ca2(wt的氨基酸2-260，r27l，h122y)、ca2(wt的氨基酸2-260，t87i，h122y)、ca2(wt的氨基酸2-260，h122y，n252d)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，v241f)、ca2(wt的氨基酸2-260，v241f，p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71l，l250r)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，p249f)、ca2(wt的氨基酸2-260，t55k，g63n，q248n)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，a257del，s258del，f259del，k260del)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，s2del，h3del，h4del，w5del)、ca2(wt的氨基酸2-260，w4y，l156h)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，g234del，e235del，p236del)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，f225l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d70n，d74n，d100n，l156h)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n，g102r)(seq id no.210598)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，e69v，n231i)(seq id no.210748)、ca2(wt的氨基酸2-260，r27l，t87i，h122y，n252d)(seq id no.210702)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，v241f，p249l)(seq id no.210503)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71l，t87n，l250r)(seq id no.210510)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，s172c，f178y，e186d)(seq id no.210756)、ca2(wt的氨基酸2-260，a77i，p249f)(seq id no.210514)、ca2(wt的氨基酸2-260，e106d，c205s)(seq id no.210523)、ca2(wt的氨基酸2-260，c205s，w208s)(seq id no.210525)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73n，r89y)(seq id no.210532)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k，t192f)(seq id no.210534)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73n，r89f)(seq id no.210562)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，m240l)(seq id no.210578)、ca2(wt的氨基酸2-260，v134f，l228f)(seq id no.210580)和/或ca2(wt的氨基酸2-260，s56f，d71s)(seq id no.210584)。
[0174]
在一个实施方案中，dd可包括ca2(seq id no.11717)的氨基酸2至260，例如但不限于seq id no.(210492)。
[0175]
在一些实施方案中，sre可以是但不限于，ca2(wt的氨基酸2-260，r27l，h122y)、ca2(wt的氨基酸2-260，t87i，h122y)、ca2(wt的氨基酸2-260，h122y，n252d)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，v241f)、ca2(wt的氨基酸2-260，v241f，p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71l，l250r)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，p249f)、ca2(wt的氨基酸2-260，t55k，g63n，q248n)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，a257del，
no.210576)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，m240l)(seq id no.210578)、ca2(wt的氨基酸2-260，v134f，l228f)(seq id no.210580)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71g，n231k)(seq id no.210582)、ca2(wt的氨基酸2-260，s56f，d71s)(seq id no.210584)、ca2(wt的氨基酸2-260，d52l，g128r，q248f)(seq id no.210586)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73x，r89x)(seq id no.210588)、ca2(wt的氨基酸2-260，y51x，d72x，v241x，p249x)(seq id no.210592)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72i，w97c)(seq id no.210594)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k，t192f，n231f)(seq id no.210596)、ca2(wt的氨基酸2-260，h36q，s43t，y51f，n67d，g131w，r226h)(seq id no.210698)、ca2(wt的氨基酸2-260，f70i，f146v)(seq id no.210700)、ca2(wt的氨基酸2-260，k45n，v68l，h119y，k169r，d179e)(seq id no.210704)、ca2(wt的氨基酸2-260，h15l，a54v，ki he，e220k，f225i)(seq id no.210706)、ca2(wt的氨基酸2-260，pbs，p83a，d101g，k111n，f230i)(seq id no.210708)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，w123r，e220k)(seq id no.210712)、ca2(wt的氨基酸2-260，n11d，e69k，g86d，v109m，k113i，t125i，d138g，g155 s)(seq id no.210714)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n，g102r，a173t)(seq id no.210716)、ca2(wt的氨基酸2-260，l79f，p180s)(seq id no.210718)、ca2(wt的氨基酸2-260，a77p，g102r，d138n)(seq id no.210724)、ca2(wt的氨基酸2-260，f20l，k45n，g63d，e69v，n231i)(seq id no.210726)、ca2(wt的氨基酸2-260，t199n，l202p，l228f)(seq id no.210728)、ca2(wt的氨基酸2-260，k9n，h122y，t168k)(seq id no.210730)、ca2(wt的氨基酸2-260，q53h，l90v，q92h，g131e)(seq id no.210732)、ca2(wt的氨基酸2-260，l44m，l47v，n62k，e69d)(seq id no.210734)、ca2(wt的氨基酸2-260，d75v，k169n，f259l)(seq id no.210738)、ca2(wt的氨基酸2-260，t207s，v222a，n231d)(seq id no.210740)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59f，v206m，g232r)(seq id no.210742)、ca2(wt的氨基酸2-260，p13a，a133t)(seq id no.210744)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n，r89i)(seq id no.210750)、ca2(wt的氨基酸2-260，a65n，g86d，g131r，g155d，k158n，v162a，g170d，p236l)(seq id no.210752)、ca2(wt的氨基酸2-260，g12r，h15y，d19v)(seq id no.210754)、ca2(wt的氨基酸2-260，a65v，f95y，e106g，h107q，i145m，f175i)(seq id no.210758)和/或ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，e69v，n231i)(seq id no.210851或210847)。
[0177]
本文还提供了包含相对于seq id no.11717的至少一个突变的分离的多肽变体。相对于seq id no.11717的突变的非限制性实例包括a115l、a116q、a116v、a133l、a133t、a141p、a152d、a152l、a152r、a173c、a173g、a173l、a173t、a23p、a247l、a247s、a257l、a257s、a38p、a38v、a54q、a54v、a54x、a65l、a65n、a65v、a77i、a77p、a77q、c205m、c205r、c205v、c205w、c205y、d101g、d101m、d110i、d129i、d138g、d138m、d138n、d161*、d161m、d161v、d164g、d164i、d174*、d174t、d179e、d179i、d179r、d189g、d189i、d19t、d19v、d242g、d242t、d32t、d34t、d41t、d52i、d52l、d71f、d71g、d71k、d71m、d71s、d71y、d72i、d72s、d72t、d72x、d75t、d75v、d85m、e106d、e106g、e106s、e117*、e117n、e14n、e186*、e186n、e204a、e204d、e204g、e204n、e213*、e213g、e213n、e220k、e220r、e220s、e233d、e233g、e233r、e235*、e235g、e235n、e237k、e237r、e238*、e238n、e238r、e26s、e69d、e69k、e69s、f130l、f146v、f175i、f175l、f175s、f178l、f178s、f20l、f20s、f225i、f225l、f225s、f225y、f230i、f230l、f230s、f259l、f259s、f66s、f70i、f70l、f95y、g102d、g104r、g104v、g128r、g12d、g12e、
g131e、g131r、g131w、g139d、g144d、g144v、g150a、g150s、g150w、g155a、g155c、g155d、g155s、g170a、g170d、g182a、g182w、g195a、g195r、g232r、g232w、g234l、g234v、g25e、g63d、g63v、g81e、g81v、g82d、g86a、g86d、g98v、h107i、h107q、h119t、h119y、h122t、h122y、h15l、h15t、h15y、h17d、h17i、h36i、h36q、h64m、h94t、h96t、i145f、i145m、i166h、i166l、i209d、i209l、i215h、i215s、i22l、i255n、i255s、i33s、i59f、i59n、i59s、i91f、k111e、k111n、k112r、k113i、k113n、k126n、k132e、k132r、k148e、k148r、k153*、k153n、k158e、k158n、k167*、k169n、k169r、k171q、k171r、k18r、k212n、k212q、k212r、k212w、k224e、k224n、k227*、k227n、k24r、k251e、k251r、k256q、k260f、k260l、k260q、k39s、k45n、k45s、k80m、k80r、l118f、l120w、l140v、l140w、l143*、l147*、l147f、l156f、l156h、l156p、l156q、l163a、l163w、l183p、l183s、l184f、l184p、l188p、l188w、l197*、l197m、l197p、l197r、l197t、l202f、l202h、l202i、l202p、l202r、l202s、l203p、l203s、l203w、l211*、l211a、l211s、l223*、l223i、l223v、l228f、l228h、l228t、l239*、l239f、l239t、l250*、l250p、l250t、l44*、l44m、l47c、l47v、l57*、l57x、l60s、l79f、l79s、l84w、l90*、l90v、m240d、m240l、m240r、m240w、n11d、n11k、n124t、n177*、n177t、n229*、n229t、n231d、n231f、n231k、n231l、n231m、n231q、n231t、n243q、n243t、n252e、n252t、n61r、n61t、n61y、n62k、n62m、n67d、n67t、p137l、p13a、p13h、p13l、p13s、p154l、p154r、p154t、p180l、p180s、p185l、p185s、p185v、p194q、p200a、p200l、p200s、p200t、p201a、p201l、p201r、p201s、p214t、p236l、p236t、p246l、p246q、p249a、p249f、p249h、p249i、p249x、p30l、p30s、p42l、p83a、q103k、q135s、q136n、q157r、q157s、q221a、q221r、q248f、q248l、q248s、q254a、q254k、q28s、q53h、q53k、q53n、q74r、q92h、q92s、r181h、r181s、r181v、r226h、r226p、r226v、r245a、r253g、r253q、r27a、r58g、r89d、r89f、r89i、r89x、r89y、s105l、s105q、s151a、s151i、s151q、s165f、s165p、s172e、s172v、s187i、s187p、s196h、s196l、s216a、s216q、s218a、s218q、s219a、s219q、s258f、s258p、s29c、s29p、s43p、s43t、s48l、s50p、s56f、s56n、s56p、s56x、s73l、s73n、s73x、s99h、t108l、t125i、t125p、t168k、t168n、t168q、t176h、t176l、t192d、t192f、t192i、t192n、t192p、t192x、t198d、t198i、t198p、t199a、t199h、t199p、t207d、t207i、t207p、t207s、t35i、t35l、t37q、t55l、t87l、v109m、v109w、v121f、v134c、v134f、v142f、v149g、v149l、v159l、v159s、v160c、v160l、v162a、v162c、v206*、v206c、v206m、v210c、v217l、v217r、v217s、v222a、v222c、v222g、v241g、v241w、v241x、v31l、v49f、v68l、v68w、v78c、w123g、w123r、w16g、w191*、w191g、w191l、w208g、w208l、w208s、w244*、w244g、w244l、w97c、w97g、y114h、y114m、y127m、y190*、y190l、y190t、y193c、y193f、y193i、y193l、y193t、y193v、y193x、y40m、y51f、y51m、y51t、y51x、y88t、k9n、s29a。
[0178]
在一些实施方案中，分离的多肽变体可以是ca2(wt的氨基酸2-260，r27l，h122y)、ca2(wt的氨基酸2-260，t87i，h122y)、ca2(wt的氨基酸2-260，h122y，n252d)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，v241f)、ca2(wt的氨基酸2-260，v241f，p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，p249l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71l，l250r)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，p249f)、ca2(wt的氨基酸2-260，t55k，g63n，q248n)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，a257del，s258del，f259del，k260del)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，s2del，h3del，h4del，w5del)、ca2(wt的氨基酸2-260，w4y，l156h)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，g234del，e235del，p236del)、ca2(wt的氨基酸2-260，l156h，f225l)、ca2(wt的氨基酸2-260，d70n，d74n，
no.210734)、ca2(wt的氨基酸2-260，d75v，k169n，f259l)(seq id no.210738)、ca2(wt的氨基酸2-260，t207s，v222a，n231d)(seq id no.210740)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59f，v206m，g232r)(seq id no.210742)、ca2(wt的氨基酸2-260，p13a，a133t)(seq id no.210744)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n，r89i)(seq id no.210750)、ca2(wt的氨基酸2-260，a65n，g86d，g131r，g155d，k158n，v162a，g170d，p236l)(seq id no.210752)、ca2(wt的氨基酸2-260，g12r，h15y，d19v)(seq id no.210754)、ca2(wt的氨基酸2-260，a65v，f95y，e106g，h107q，i145m，f175i)(seq id no.210758)和/或ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，e69v，n231i)(seq id no.210851或210847)。
[0179]
本文还提供了包括至少一个效应子模块的生物回路系统。生物回路的效应子模块可包括刺激响应元件(sre)，并且所述sre全部或部分地包括人碳酸酐酶2(ca2；seq id no.11717)。生物回路还可包括至少一个有效负载，所述有效负载可与sre附接、附加或关联。
[0180]
全部或部分地包括人碳酸酐酶2(ca2；seq id no.11717)的生物回路系统的sre可包括一个、二个、三个或更多个突变，例如但不限于，a115l、a116q、a116v、a133l、a133t、a141p、a152d、a152l、a152r、a173c、a173g、a173l、a173t、a23p、a247l、a247s、a257l、a257s、a38p、a38v、a54q、a54v、a54x、a65l、a65n、a65v、a77i、a77p、a77q、c205m、c205r、c205v、c205w、c205y、d101g、d101m、d110i、d129i、d138g、d138m、d138n、d161*、d161m、d161v、d164g、d164i、d174*、d174t、d179e、d179i、d179r、d189g、d189i、d19t、d19v、d242g、d242t、d32t、d34t、d41t、d52i、d52l、d71f、d71g、d71k、d71m、d71s、d71y、d72i、d72s、d72t、d72x、d75t、d75v、d85m、e106d、e106g、e106s、e117*、e117n、e14n、e186*、e186n、e204a、e204d、e204g、e204n、e213*、e213g、e213n、e220k、e220r、e220s、e233d、e233g、e233r、e235*、e235g、e235n、e237k、e237r、e238*、e238n、e238r、e26s、e69d、e69k、e69s、f130l、f146v、f175i、f175l、f175s、f178l、f178s、f20l、f20s、f225i、f225l、f225s、f225y、f230i、f230l、f230s、f259l、f259s、f66s、f70i、f70l、f95y、g102d、g104r、g104v、g128r、g12d、g12e、g131e、g131r、g131w、g139d、g144d、g144v、g150a、g150s、g150w、g155a、g155c、g155d、g155s、g170a、g170d、g182a、g182w、g195a、g195r、g232r、g232w、g234l、g234v、g25e、g63d、g63v、g81e、g81v、g82d、g86a、g86d、g98v、h107i、h107q、h119t、h119y、h122t、h122y、h15l、h15t、h15y、h17d、h17i、h36i、h36q、h64m、h94t、h96t、i145f、i145m、i166h、i166l、i209d、i209l、i215h、i215s、i22l、i255n、i255s、i33s、i59f、i59n、i59s、i91f、k111e、k111n、k112r、k113i、k113n、k126n、k132e、k132r、k148e、k148r、k153*、k153n、k158e、k158n、k167*、k169n、k169r、k171q、k171r、k18r、k212n、k212q、k212r、k212w、k224e、k224n、k227*、k227n、k24r、k251e、k251r、k256q、k260f、k260l、k260q、k39s、k45n、k45s、k80m、k80r、l118f、l120w、l140v、l140w、l143*、l147*、l147f、l156f、l156h、l156p、l156q、l163a、l163w、l183p、l183s、l184f、l184p、l188p、l188w、l197*、l197m、l197p、l197r、l197t、l202f、l202h、l202i、l202p、l202r、l202s、l203p、l203s、l203w、l211*、l211a、l211s、l223*、l223i、l223v、l228f、l228h、l228t、l239*、l239f、l239t、l250*、l250p、l250t、l44*、l44m、l47c、l47v、l57*、l57x、l60s、l79f、l79s、l84w、l90*、l90v、m240d、m240l、m240r、m240w、n11d、n11k、n124t、n177*、n177t、n229*、n229t、n231d、n231f、n231k、n231l、n231m、n231q、n231t、n243q、n243t、n252e、n252t、n61r、n61t、n61y、n62k、n62m、n67d、n67t、p137l、
no.210558)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71y，q248l)(seq id no.210560)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73n，r89f)(seq id no.210562)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k，n231l，e235g，l239f)(seq id no.210564)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72f，p249i)(seq id no.210568)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72x，v241x，p249x)(seq id no.210572)、ca2(wt的氨基酸2-260，a54x，s56x，l57x，t192x)(seq id no.210574)、ca2(wt的氨基酸2-260，y193v，k260f)(seq id no.210576)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，m240l)(seq id no.210578)、ca2(wt的氨基酸2-260，v134f，l228f)(seq id no.210580)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71g，n231k)(seq id no.210582)、ca2(wt的氨基酸2-260，s56f，d71s)(seq id no.210584)、ca2(wt的氨基酸2-260，d52l，g128r，q248f)(seq id no.210586)、ca2(wt的氨基酸2-260，s73x，r89x)(seq id no.210588)、ca2(wt的氨基酸2-260，y51x，d72x，v241x，p249x)(seq id no.210592)、ca2(wt的氨基酸2-260，d72i，w97c)(seq id no.210594)、ca2(wt的氨基酸2-260，d71k，t192f，n231f)(seq id no.210596)、ca2(wt的氨基酸2-260，h36q，s43t，y51f，n67d，g131w，r226h)(seq id no.210698)、ca2(wt的氨基酸2-260，f70i，f146v)(seq id no.210700)、ca2(wt的氨基酸2-260，k45n，v68l，h119y，k169r，d179e)(seq id no.210704)、ca2(wt的氨基酸2-260，h15l，a54v，k111e，e220k，f225i)(seq id no.210706)、ca2(wt的氨基酸2-260，p13s，p83a，d101g，k111n，f230i)(seq id no.210708)、ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，w123r，e220k)(seq id no.210712)、ca2(wt的氨基酸2-260，n11d，e69k，g86d，v109m，k113i，t125i，d138g，g155s)(seq id no.210714)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n，g102r，a173t)(seq id no.210716)、ca2(wt的氨基酸2-260，l79f，pl 80s)(seq id no.210718)、ca2(wt的氨基酸2-260，a77p，g102r，d138n)(seq id no.210724)、ca2(wt的氨基酸2-260，f20l，k45n，g63d，e69v，n23 1i)(seq id no.210726)、ca2(wt的氨基酸2-260，t199n，l202p，l228f)(seq id no.210728)、ca2(wt的氨基酸2-260，k9n，h122y，t168k)(seq id no.210730)、ca2(wt的氨基酸2-260，q53h，l90v，q92h，g131e)(seq id no.210732)、ca2(wt的氨基酸2-260，l44m，l47v，n62k，e69d)(seq id no.210734)、ca2(wt的氨基酸2-260，d75v，k169n，f259l)(seq id no.210738)、ca2(wt的氨基酸2-260，t207s，v222a，n231d)(seq id no.210740)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59f，v206m，g232r)(seq id no.210742)、ca2(wt的氨基酸2-260，p13a，a133t)(seq id no.210744)、ca2(wt的氨基酸2-260，i59n，r89i)(seq id no.210750)、ca2(wt的氨基酸2-260，a65n，g86d，g131r，g155d，k158n，v162a，g170d，p236l)(seq id no.210752)、ca2(wt的氨基酸2-260，g12r，h15y，d19v)(seq id no.210754)、ca2(wt的氨基酸2-260，a65v，f95y，e106g，h107q，i145m，f175i)(seq id no.210758)和/或ca2(wt的氨基酸2-260，g63d，e69v，n231i)(seq id no.210851或210847)。
[0182]
本文所述的生物回路系统可包括对一种或多种刺激有响应的sre。
[0183]
在一些实施方案中，刺激可以是小分子，其中所述小分子是塞来昔布、伐地昔布、罗非昔布、乙酰唑胺、醋甲唑胺、多佐胺、布林佐胺、双氯非那胺、依索唑胺、唑尼沙胺、丹磺酰胺或二氯苯磺胺。在实施方案中，小分子可以是乙酰唑胺。
[0184]
本文还描述了编码生物回路系统的载体，以及包含所述生物回路系统和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
[0185]
有效负载
[0186]
如本文所用的“有效负载”或“目标有效负载”或“感兴趣的有效负载(poi)”被定义为其功能待改变的任何蛋白质或核酸。
[0187]
有效负载可包括任何编码或非编码基因或任何蛋白质或其片段。
[0188]
有效负载通常与本公开的多核苷酸中的一个或多个sre关联，可以被单独编码，也可以与一个或多个sre组合编码。有效负载本身可以改变(在蛋白质或核酸水平上)，从而提供效应子模块的附加的可维持层次。例如，有效负载可被工程改造或设计为含有单个或多个突变，所述突变影响有效负载的稳定性或其对降解、切割或运输的敏感性。可具有刺激响应谱的sre与被改变为显示输出信号的各种响应或等级(例如表达水平)的有效负载的组合产生了优于本领域的生物回路。例如，突变或取代设计，例如在wo2016048903中(特别是在其中的实施例1中)针对il12创建的那些(将该专利的内容通过引用整体并入本文)，可以结合本公开的sre用于任何蛋白质有效负载，从而创建双重可调生物回路。独立调节sre和有效负载两者的能力大大增加了本公开的效应子模块的使用范围。
[0189]
人工肽或有效负载的多肽组分可以来源于任何非天然存在的已知多肽。
[0190]
如本文所用的，当涉及效应子模块、sre或有效负载时，短语“来源于”是指效应子模块、sre或有效负载至少部分地来源于陈述的亲本分子或序列。例如，在设计sre时，这样的sre可来源于天然存在的蛋白质的表位或区域，但随后将其以本文教导的任何方式进行了修饰，以优化sre功能。
[0191]
在一个实施方案中，有效负载来源于亲本蛋白的区域或来自突变蛋白。亲本蛋白的区域的长度可以为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、
426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450个或多于450个氨基酸。亲本蛋白的区域的长度可以为5-50、25-75、50-100、75-125、100-150、125-175、150-200、175-225、200-250、225-275、250-300、275-325、300-350、325-375、350-400、375-425个或400-450个氨基酸。
[0192]
在一个实施方案中，有效负载来源于亲本蛋白的区域或来自突变蛋白并且包括亲本蛋白的区域。有效负载可包括亲本蛋白的区域，其为所述亲本蛋白或突变蛋白的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-100％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、10-30％、20-40％、30-50％、40-60％、50-70％、60-80％、70-90％、80-100％、10-40％、20-50％、30-60％、40-70％、50-80％、60-90％、70-100％、10-50％、20-60％、30-70％、40-80％、50-90％、60-100％、10-60％、20-70％、30-80％、40-90％、50-100％、10-70％、20-80％、30-90％、40-100％、10-80％、20-90％、30-100％、10-90％、20-100％、25-50％、50-75％或75-100％。
[0193]
在一个实施方案中，有效负载来源于亲本蛋白或来自突变蛋白，并且可以与所述亲本蛋白或突变蛋白具有1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％，5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-100％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％、10-30％、20-40％、30-50％、40-60％、50-70％、60-80％、70-90％、80-100％、10-40％、20-50％、30-60％、40-70％、50-80％、60-90％、70-100％、10-50％、20-60％、30-70％、40-80％、50-90％、60-100％、10-60％、20-70％、30-80％、40-90％、50-100％、10-70％、20-80％、30-90％、40-100％、10-80％、20-90％、30-100％、10-90％、20-100％、25-50％、50-75％或75-100％的同一性。
[0194]
在一个实施方案中，第一有效负载的跨膜结构域区域可以用来自第二亲本蛋白的跨膜结构域、其变体或片段代替。
[0195]
多肽和作为有效负载的多肽
[0196]
本公开的刺激、生物回路组分、效应子模块(包括它们的sre和有效负载)，可以作为整体多肽、多个多肽或多肽片段存在，它们可以独立地由一个或多个核酸、多个核酸、核酸片段或前述任何一者的变体编码。
[0197]
如本文所用的，术语“多肽”是指最常通过肽键连接在一起的氨基酸残基(天然或非天然)的聚合物。如本文所用的术语是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。在一些情况下，编码的多肽小于约50个氨基酸，于是将该多肽称为肽。如果多肽是肽，它将为至少约2个、3个、4个或至少5个氨基酸残基长。因此，多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直向同源物、旁系同源物、片段和前述物质的其他等效物、变体和类似物。多肽可以是单分子或可以是多分子复合物，比如二聚体、三聚体或四聚体。它们也可包含单链或多链多肽，并且可以缔合或连接。术语多肽也可适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个
氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。
[0198]
如本文所用的，术语“多肽变体”是指其氨基酸序列不同于天然或参考序列的分子。与天然或参考序列相比，氨基酸序列变体可具有在氨基酸序列内某些位置的取代、缺失和/或插入。通常，变体与天然或参考序列具有至少约50％的同一性(同源性)，优选地，它们与天然或参考序列具有至少约80％、更优选至少约90％的同一性(同源性)。
[0199]
在一些实施方案中，提供了“变体模拟物”。如本文所用的，术语“变体模拟物”是指含有将模拟活化序列的一个或多个氨基酸的变体。例如，谷氨酸可以用作磷酸化苏氨酸和/或磷酸化丝氨酸的模拟物。可替代地，变体模拟物可导致灭活或产生含有模拟物的失活产物，例如苯丙氨酸可作为酪氨酸的失活取代；或者丙氨酸可以作为丝氨酸的失活取代。本公开的药物组合物、生物回路、生物回路组分、效应子模块(包括它们的sre或有效负载)的氨基酸序列可以包含天然存在的氨基酸，因此可以被认为是蛋白质、肽、多肽或其片段。可替代地，药物组合物、生物回路、生物回路组分、效应子模块(包括它们的sre或有效负载)可包含天然和非天然存在的氨基酸。
[0200]
如本文所用的，术语“氨基酸序列变体”是指其氨基酸序列与天然序列或起始序列相比有一些差异的分子。氨基酸序列变体可具有在氨基酸序列内某些位置的取代、缺失和/或插入。如本文所用的，术语“天然”或“起始”，当指序列时，为相对术语，是指可以与之进行比较的原始分子。天然或起始序列不应该与野生型序列混淆。天然序列或分子可代表野生型(自然界中发现的序列)，但不必与野生型序列完全相同。
[0201]
通常，变体与天然序列具有至少约70％的同源性，优选地，它们与天然序列具有至少约80％、更优选至少约90％的同源性。
[0202]
如本文所用的，术语“同源性”，当其适用于氨基酸序列时，定义为在比对序列并且引入空位(如果需要的话)以实现最大同源性百分比之后，在候选氨基酸序列中与第二序列的氨基酸序列中的残基安全相同的残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域熟知的。应当理解的是，同源性取决于同一性百分比的计算，但是由于在计算中引入的空位和罚分，其值可能不同。
[0203]
如本文所用的，术语“同源物”，当它适用于氨基酸序列时，意指与第二物种的第二序列具有基本同一性的其他物种的相应序列。
[0204]
如本文所用的，术语“类似物”预期包括多肽变体，所述多肽变体因一个或多个氨基酸改变例如氨基酸残基的取代、添加或缺失而不同，但仍然保持亲本多肽的特性。
[0205]
如本文所用的，术语“衍生物”与术语“变体”作为同义词使用，并且是指相对于参考分子或起始分子以任何方式被修饰或改变的分子。
[0206]
本公开考虑了若干类型的药物组合物、生物回路、生物回路组分、效应子模块(包括它们的基于氨基酸的sre或有效负载)，包括变体和衍生物。这些包括取代、插入、缺失和共价变体和衍生物。正因为如此，包括在本公开范围内的是药物组合物、生物回路、生物回路部件、效应子模块(包括它们的sre或有效负载)，包括取代、插入、添加、缺失和/或共价修饰。可以将例如诸如一个或多个赖氨酸之类的序列标签或氨基酸添加至本公开的肽序列(例如，在n末端或c末端)。可以将序列标签用于肽纯化或定位。可以使用赖氨酸来增加肽溶解度或允许生物素化。可替代地，可任选地使位于肽或蛋白质的氨基酸序列的羧基和氨基末端区域的氨基酸残基缺失，从而提供截短的序列。可替代地，可以根据序列的用途，使某
些氨基酸(例如，c末端或n末端残基)缺失，例如，将序列表达为可溶的或与固体支持物连接的更大序列的一部分。
[0207]
当提及蛋白质时，“取代变体”是这样的蛋白质，其在天然或起始序列中有至少一个氨基酸残基被去除并且在所述残基的相同位置的位置插入不同的氨基酸。取代可以是单一的，其中分子中只有一个氨基酸被取代，也可以是多重的，其中同一个分子中有两个或更多个氨基酸被取代。
[0208]
如本文所用的，术语“保守氨基酸取代”是指用具有相似大小、电荷或极性的不同氨基酸取代序列中通常存在的氨基酸。保守取代的实例包括用非极性(疏水)残基比如异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸取代另一个非极性残基。同样，保守取代的实例包括一个极性(亲水)残基被另一个取代，例如在精氨酸和赖氨酸之间、在谷氨酰胺和天冬酰胺之间以及在甘氨酸和丝氨酸之间的取代。另外，用一个碱性残基比如赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代另一个碱性残基，或用一个酸性残基比如天冬氨酸或谷氨酸取代另一个酸性残基，这些是另外的保守取代的实例。非保守取代的实例包括用非极性(疏水性)氨基酸残基比如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸取代极性(亲水性)残基比如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸，和/或用极性残基取代非极性残基。
[0209]
如本文所用的，当提及蛋白质时，术语“插入变体”是指这样的蛋白质，其中紧邻在天然或起始序列的特定位置处的氨基酸插入一个或多个氨基酸。如本文所用的，术语“紧邻”是指与起始或参考氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团连接的相邻氨基酸。
[0210]
如本文所用的，当提及蛋白质时，术语“缺失变体”是指这样蛋白质，其中在天然或起始氨基酸序列中去除一个或多个氨基酸。通常，缺失变体将在分子的特定区域缺失一个或多个氨基酸。
[0211]
如本文所用的，如本文提及的术语“衍生物”包括天然或起始蛋白质的变体，其包含用有机蛋白质或非蛋白质衍生剂进行的一种或多种修饰以及翻译后修饰。传统上，通过使蛋白质的靶向氨基酸残基与能够与选定的侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应，或通过利用在选定的重组宿主细胞中起作用的翻译后修饰机制，引入共价修饰。所得共价衍生物可用于旨在鉴定残基的程序中，所述残基对于用于重组糖蛋白的免疫亲和纯化的抗蛋白抗体的生物活性、免疫测定或制备是重要的。这样的修饰在本领域的普通技术范围内，并且在没有过度实验的情况下进行。
[0212]
如本文所用的，术语“位点”，当它属于基于氨基酸的实施方案时，与“氨基酸残基”和“氨基酸侧链”作为同义词加以使用。位点代表肽或多肽内的位置，在本公开的基于多肽的分子内，其可以被修饰、操纵、变更、衍生或改变。
[0213]
如本文所用的，术语“末端”，当提及蛋白质时，是指肽或多肽的末端。这样的末端不只限于肽或多肽的第一位点或最终位点，但可以在末端区域中包括另外的氨基酸。本公开的基于多肽的分子的特征在于具有n末端(由具有游离氨基(nh2)的氨基酸终止)和c末端(由具有游离羧基(cooh)的氨基酸终止)。
[0214]
本公开的多肽或蛋白质在一些情况下由通过二硫键或通过非共价力结合在一起的多个多肽链组成(多聚体、寡聚体)。这些类别的蛋白质将有多个n末端和c末端。可替代地，视情况而定，可以修饰多肽的末端，使得它们以基于非多肽的部分(比如有机缀合物)开始或结束。
[0215]
一旦将任何特征鉴定或定义为本公开的生物回路系统组件、刺激、效应子模块(包括sre或有效负载)，可以通过移动、交换、倒位、缺失、随机化或复制来进行这些特征的若干操作和/或修饰中的任何一者。此外，应当理解的是，对特征的操作可以产生与对本公开的组合物的修饰相同的结果。例如，涉及使结构域缺失的操作将导致分子长度的改变，就像将核酸修饰为编码小于全长的分子一样。
[0216]
可以通过本领域已知的方法比如定点诱变来完成修饰和操作。然后可以使用如本文所述的那些体外或体内测定法或本领域已知的任何其他适合的筛选测定法，测试所得的修饰分子的活性。
[0217]
在一些实施方案中，本公开的组合物可包含一个或多个同位素原子。如本文所用的，术语“同位素”是指具有一个或多个另外的中子的化学元素。在一些实施方案中，本公开的化合物可以是氘化的。如本文所用的，术语“氘化”是指用氘同位素替换物质中一个或多个氢原子的过程。氘同位素是氢的同位素。氢原子核含有一个质子，而氘原子核含有一个质子和一个中子。本公开的药物组合物、生物回路、生物回路组分、效应子模块(包括它们的sre或有效负载)，可以被氘化，以便改变一种或多种物理性质，比如稳定性，或允许药物组合物、生物回路、生物回路组分、效应子模块(包括它们的sre或有效负载)，用于诊断和/或实验应用。
[0218]
在蛋白质水平，任何生物回路组分可包含一个或多个翻译后修饰(ptm)。在施用基于蛋白质的生物回路组分之后，或在作为编码所述生物回路组分的核酸施用的生物回路组分的翻译之时或之后，这样的ptm可以在细胞内发生。
[0219]
本公开的翻译后修饰(ptm)包括但不限于乙酰化、磷酸化、泛素化、羧化、脱酰胺、脱氨、脱乙酰化、二羟基化、去磷酸化、甲酰化、γ-羧基谷氨酸化、谷胱甘肽化、糖化、羟基化、甲基化、硝化、小泛素化(sumoylation)、n-或o-转谷氨酰胺化(transglutamination)、糖基化和法尼基化。
[0220]
效应子模块(包括其sre和有效负载)可以独立地具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个相同或不同的ptm。
[0221]
可将效应子模块设计为包括蛋白质家族的一个或多个结构或功能结构域、重复序列或基序。将这样的结构域、重复序列和基序按蛋白质家族分类；并且在位于http：//www.ebi.ac.uk/的embl-ebi数据库中给出了代表性的家族。
[0222]
在一些实施方案中，工程改造到本公开的组合物结构中的蛋白质修饰(比如糖基化和聚乙二醇化)也可用于本公开中，以干扰抗原加工和肽负载。本公开的组合物也可以被设计成包括非经典氨基酸侧链，以便设计免疫原性较低的组合物。在国际专利公开号wo2005051975中讨论的用于降低免疫原性的任何方法都可以用于本公开中(将其内容通过引用整体并入本文)。
[0223]
sre可以是但不限于肽、肽复合物、肽-蛋白质复合物、蛋白质、融合蛋白、蛋白质复合物、蛋白质-蛋白质复合物。sre可包括来源于任何天然或突变蛋白或抗体的一个或多个区域。在这个方面，当对刺激作出响应时，sre是能够调节有效负载的细胞内定位、分子内活化和/或降解的元件。
[0224]
在一些实施方案中，本公开的效应子模块可包含另外的促进效应子模块表达和调节的特征，所述特征例如一个或多个信号序列(ss)、一个或多个切割和/或加工位点、一个
或多个靶向和/或穿透肽、一个或多个标签和/或一个或多个接头。另外，本公开的效应子模块可还包含其他调节部分，比如诱导型启动子、增强子序列、微小rna位点和/或微小rna靶向位点。每个方面或调节的方式可以给效应子模块或生物回路带来不同调节的特征。例如，sre可以代表去稳定结构域，而在蛋白质有效负载中的突变可改变其切割位点或二聚化特性或半衰期，并且包括一个或多个微小rna或微小rna结合位点可赋予细胞去靶向或运输特征。因而，本公开包括在其可维持性方面为多因素的生物回路。这样的生物回路可被工程改造为含有一个、两个、三个、四个或更多个调节特征。
[0225]
在一些实施方案中，本公开的效应子模块可包括调节表达的一个或多个降解决定子。如本文所用的，“降解决定子”是指在蛋白质内的足以被蛋白水解系统识别和降解的最小序列。降解决定子的重要特性在于，它们是可转移的，也就是说，将降解决定子附加至序列对于该序列赋予了降解。在一些实施方案中，可以将降解决定子附加至去稳定结构域、有效负载或两者。在本公开的效应子模块中降解决定子的掺入赋予了效应子模块另外的蛋白质不稳定性，并且可用于将基础表达降低至最低限度。在一些实施方案中，降解决定子可以是n降解决定子、磷酸化降解决定子、热诱导型降解决定子、光敏降解决定子、氧依赖性降解决定子。作为非限制性实例，降解决定子可以是鸟氨酸脱羧酶降解决定子，其由takeuchi等人描述(takeuchi j等人，(2008).biochem j.2008mar 1；410(2)：401-7；将其内容通过引用整体并入本文)。在本公开中有用的降解决定子的其他实例包括在国际专利公开号wo2017004022、wo2016210343和wo2011062962中描述的降解决定子；将每篇专利的内容通过引用整体并入本文。
[0226]
免疫治疗剂
[0227]
本文所述的生物回路可包括免疫治疗剂。在一些实施方案中，本公开的有效负载可以是在生物体中诱导免疫响应的免疫治疗剂。免疫治疗剂可以是但不限于，抗体及其片段和变体、嵌合抗原受体(car)、嵌合开关受体、细胞因子、趋化因子、细胞因子受体、趋化因子受体、细胞因子-细胞因子受体融合多肽或任何诱导免疫响应的剂。在一个实施方案中，免疫治疗剂在细胞或受试者中诱导抗癌免疫响应。
[0228]
细胞因子、趋化因子和其他因子
[0229]
根据本公开，本公开的有效负载可以是由免疫细胞、癌细胞和其他细胞类型产生的细胞因子、趋化因子、生长因子和可溶蛋白，它们充当体内细胞和组织之间的化学通讯物质。这些蛋白质介导了从对细胞生长、分化、迁移和存活到许多效应子活性的影响的范围广泛的生理功能。例如，活化的t细胞产生多种细胞因子，具有细胞毒功能，以消除肿瘤细胞。
[0230]
在一些实施方案中，本公开的有效负载可以是细胞因子及其片段、变体、类似物和衍生物，包括但不限于白细胞介素、肿瘤坏死因子(tnf)、干扰素(ifn)、tgfβ和趋化因子。本领域应该理解的是，同一基因或蛋白质的某种基因和/或蛋白质命名法可以包括或不包括标点符号
“‑”
，比如破折号或符号，如希腊字母。无论这些在本文中被包括还是排除，其含义并不意味着被改变，正如本领域技术人员理解的那样。例如，il2、il2和il-2指的是同一种白细胞介素。同样，tnfα、tnfα、tnf-α、tnf-a、tnfalpha和tnfα都指同一种蛋白质。同样，cd40l、cd40l和cd40lg指的是同一种蛋白质。
[0231]
在一些实施方案中，本公开的有效负载可以是刺激免疫响应的细胞因子。在其他实施方案中，本公开的有效负载可以是负面影响抗癌免疫响应的细胞因子的拮抗剂。
[0232]
在一些实施方案中，本公开的有效负载可以是细胞因子受体、重组受体、其变体、类似物和衍生物；或细胞因子的信号成分。
[0233]
在一些实施方案中，可以利用本公开的细胞因子来提高用于免疫疗法的免疫细胞比如cd8+tem、自然杀伤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(til)的扩增、存活、持久性和效力。在其他实施方案中，利用t细胞来提供t细胞活化和肿瘤微环境重塑的动力学控制，所述t细胞经过用两种或更多种dd调节的细胞因子工程改造。在一个方面，本公开提供了用于将细胞因子疗法相关毒性降至最低限度的生物回路和组合物。尽管全身性细胞因子疗法在减轻肿瘤负荷方面取得了成功，但它经常导致产生严重的剂量限制性副作用。有两个因素导致了观察到的毒性：(a)多效性，其中细胞因子影响不同的细胞类型，有时根据情况对相同的细胞产生相反的作用(b)细胞因子具有短的血清半衰期，因此需要以高剂量施用来实现治疗作用，这加剧了多效性作用。在一个方面，本公开的细胞因子可用于在副作用的情况下调节细胞因子表达。在一些实施方案中，可将本公开的细胞因子设计成具有延长的寿命或增强的特异性，从而将毒性降至最低限度。
[0234]
在一些实施方案中，本公开的有效负载可以是白细胞介素(il)细胞因子。白细胞介素(il)是一类由白细胞产生的调节免疫响应的糖蛋白。如本文所用的，术语“白细胞介素(il)”是指来自任何物种或来源的白细胞介素多肽，并且包括全长蛋白以及所述蛋白质的片段或部分。在一些方面，白细胞介素有效负载选自il1、il1α(也称为造血素-1)、il1β(分解代谢的)、il1δ、il1ε、il1η、il1ζ、白细胞介素-1家族成员1至11(il1f1至il1f11)、白细胞介素1同源物1至4(il1h1至il1h4)、il1相关蛋白1至3(il1rp1至il1rp3)、il2、il3、il4、il5、il6、il7、il8、il9、il10、il10c、il10d、il11、il11a、il11b、il12、il13、il14、il15、il16、il17、il17a、i117b、il17c、il17e、il17f、il18、il19、il20、il20样(il20l)、i121、il22、il23、il23a、il23-p19、il23-p40、il24、il25、il26、il27、il28a、il28b、il29、il30、il31、il32、il33、il34、il35、il36α、il36β、il36γ、il36rn、il37、il37a、il37b、il37c、il37d、il37e和il38。在其他方面，本公开的有效负载可以是白细胞介素受体，其选自cd121a、cdw121b、il2rα/cd25、il2rβ/cd122、il2rγ/cd132、cdw131、cd124、cd131、cdw125、cd126、cd130、cd127、cdw210、il8ra、il11rα、cd212、cd213α1、cd213α2、il14r、il15rα、cdw217、il18rα、il18rβ、il20rα和il20rβ。在其他方面，本公开的有效负载可以是tnf超家族的成员，包括但不限于tnfα、cd40l、淋巴毒素(lta)α、ltaβ和ox40l。
[0235]
抗体以及抗体片段和变体
[0236]
本文所述的生物回路可包括一种或多种本文所述的抗体。在一些实施方案中，本文所述的一种或多种抗体可以是有效负载。
[0237]
在一些实施方案中，抗体片段和变体可包含来自完整抗体的抗原结合区。抗体片段和变体的实例包括但不限于fab、fab1、f(ab
′
)2和fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子比如单链可变片段(scfv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。本公开的药物组合物、生物回路、生物回路组分、效应子模块(包括它们的sre或有效负载)可包含这些片段中的一个或多个。
[0238]
出于本文的目的，“抗体”可包含重链可变结构域和轻链可变结构域以及fc区。如本文所用的，术语“天然抗体”通常是指约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由两条完全相同的轻(l)链和两条完全相同的重(h)链通过二硫键相互连接而成。每条重链在一端具有可变
结构域(vh)，随后是多个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(vl)，在另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。
[0239]
如本文所用的，术语“可变结构域”是指在抗体重链和轻链上发现的特异性抗体结构域，它们在抗体之间的序列差异很大，用于每个特定抗体与其特定抗原的结合和特异性。可变结构域包含高变区。如本文所用的，术语“高变区”是指在可变结构域内包含负责抗原结合的氨基酸残基的区域。在高变区内存在的氨基酸决定了互补决定区(cdr)的结构，其成为抗体的抗原结合位点的一部分。如本文所用的，术语“cdr”是指包含与其靶抗原或表位互补的结构的抗体区域。将不与抗原相互作用的可变结构域的其他部分称为框架(fw)区。抗原结合位点(也称为抗原结合部位或互补位)包含与特定抗原相互作用所必需的氨基酸残基。
[0240]
vh和vl结构域各自具有三个cdr。当沿着可变结构域多肽从n末端移动到c末端时，按照出现顺序，vl cdr在本文中被称为cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3。当沿着可变结构域多肽从n末端移动到c末端时，按照出现顺序，vh cdr在本文中被称为cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3。
[0241]
如本文所用的，术语“fv”是指包含形成完整抗原结合位点所需的抗体上的最小片段的抗体片段。这些区域由紧密非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。fv片段可通过蛋白水解切割生成，但在很大程度上不稳定。用于生成稳定的fv片段的重组方法是本领域已知的，通常通过在轻链可变结构域和重链可变结构域之间插入柔性接头(以形成单链fv(scfv))或通过在重链和轻链可变结构域之间引入二硫桥(strohl，w.r.therapeutic antibody engineering.woodhead publishing，philadelphia pa.2012.第3章，第46-47页，将其内容通过引用整体并入本文)。
[0242]
如本文所用的，术语“轻链”是指来自任何脊椎动物物种的抗体成分，根据恒定结构域的氨基酸序列，指定为两种明显不同的类型，称为κ和λ。根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，可将抗体指定为不同的类型。有五种主要的完整抗体的类型：iga、igd、ige、igg和igm，并且其中一些可被进一步分成亚型(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga和iga2。
[0243]
如本文所用的，术语“单链fv”“scfv”是指vh和vl抗体结构域的融合蛋白，其中这些结构域通过柔性肽接头连接在一起形成单个多肽链。在一些实施方案中，fv多肽接头使scfv能够形成用于抗原结合的期望的结构。在一些实施方案中，scfv与噬菌体展示、酵母展示或其他展示方法结合使用，其中它们可以与表面成员(例如噬菌体外壳蛋白)结合表达，并用于鉴定针对给定抗原的高亲和力肽。
[0244]
利用分子遗传学，可以将两个单链抗体进行串联工程改造为由接头结构域分开的单个多肽，称为“串联scfv”(tascfv)。构建具有两种不同的scfv的基因的tascfv，产生“双特异性单链可变片段”(bis-scfv)。商业公司临床开发了仅有两种tascfv；两者都是用于肿瘤适应症的由micromet在活跃早期开发中的双特异性剂，并且被描述为“双特异性t细胞接合剂(bite)”。博纳吐单抗(blinatumomab)为抗cd19/抗cd3双特异性tascfv，其增强对2期的b细胞非霍奇金淋巴瘤的t细胞响应。mt110为抗ep-cam/抗cd3双特异性tascfv，其增强对1期的实体瘤的t细胞响应。affimed(nelson，a.l.，mabs.，2010，jan-feb；2(1)：77-83)也在研究双特异性四价“tandab”。还可包括igg的大型抗体(与igg fc(ch2-ch3结构域)的氨基
末端融合的二价scfv)。
[0245]
如本文所用的，术语“双特异性抗体”是指能够结合两种不同抗原的抗体。这样的抗体通常包含来自至少两种不同抗体的区域。双特异性抗体可包括任何在以下文献中描述的那些：riethmuller，g.cancer immunity.2012，12：12-18，marvin等人，2005.acta pharmacologica sinica.2005，26(6)：649-658和schaefer等人，pnas.2011，108(27)：11187-11192，将每篇文献的内容通过引用整体并入本文。
[0246]
如本文所用的，术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段。双抗体是功能性双特异性单链抗体(bscab)。双抗体包含与同一多肽链中的轻链可变结构域vl连接的重链可变结构域vh。通过使用太短以至于不允许同一条链上的两个结构域配对的接头，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。
[0247]
术语“细胞内抗体”是指不从产生它的细胞中分泌出来而是靶向一种或多种细胞内蛋白质的抗体形式。细胞内抗体可用于影响许多细胞过程，包括但不限于细胞内运输、转录、翻译、代谢过程、增殖信号传导和细胞分裂。在一些实施方案中，本公开的方法可包括基于细胞内抗体的疗法。在一些这样的实施方案中，可将本文公开的可变结构域序列和/或cdr序列掺入一个或多个构建体中，所述构建体用于基于细胞内抗体的疗法。
[0248]
如本文所用的，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的细胞(或克隆)的群获得的抗体，即，包含该群的单独的抗体是完全相同的和/或结合同一个表位，可在单克隆抗体生产过程中产生的可能变体除外，这样的变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
[0249]
修饰语“单克隆的”表示从基本上同质的抗体群获得的抗体的特性，并且不被解释为需要通过任何特定的方法产生抗体。本文中的单克隆抗体包括这样的“嵌合”抗体(免疫球蛋白)：其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列完全相同或同源，而所述链的其余部分与来源于另一物种或属于另一种抗体类别或亚类的抗体中的相应序列完全相同或同源；还包括这样的抗体的片段。
[0250]
如本文所用的，术语“人源化抗体”是指这样的嵌合抗体，其包含来源于一种或多种非人(例如鼠)抗体来源的最小部分，其余部分来源于一种或多种人免疫球蛋白来源。大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的抗体的高变区的残基被来自具有期望的特异性、亲和力和/或能力的诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物等非人物种的抗体(供体抗体)的高变区的残基替换。在一个实施方案中，抗体可以是人源化全长抗体。作为非限制性实例，可以使用美国专利公开号us20130303399中教导的方法将抗体人源化，将所述专利的内容通过引用整体并入本文。
[0251]
如本文所用的，术语“抗体变体”指修饰的抗体(相对于天然或起始抗体)或在结构和/或功能上类似于天然或起始抗体的生物分子(例如抗体模拟物)。与天然抗体相比，抗体变体在其氨基酸序列、组成或结构方面可以改变。抗体变体可包括但不限于，具有改变的同种型(例如，iga、igd、ige、iggl、igg2、igg3、igg4或igm)的抗体、人源化变体、优化变体、多特异性抗体变体(例如，双特异性变体)和抗体片段。
[0252]
在一些实施方案中，本公开的药物组合物、生物回路、生物回路组分、效应子模块(包括它们的sre或有效负载)可以是抗体模拟物。如本文所用的，术语“抗体模拟物”是指模拟抗体的功能或作用并且特异性地并以高亲和力与其分子靶标结合的任何分子。在一些实
施方案中，抗体模拟物可以是单抗体，其被设计成掺入作为蛋白质支架的纤连蛋白iii型结构域(fn3)(us 6,673,901；us 6,348,584)。在一些实施方案中，抗体模拟物可以是本领域已知的那些，包括但不限于亲和体(affibody)分子、affilin、affitin、抗运载蛋白(anticalin)、高亲合性多聚体(avimer)、centyrins、darpinstm、菲诺体(fynomer)以及库尼兹(kunitz)和结构域肽。在其他实施方案中，抗体模拟物可包括一个或多个非肽区。
[0253]
在一个实施方案中，抗体可包含修饰的fc区。作为非限制性实例，修饰的fc区可以通过美国专利公开号us20150065690中描述的方法来制备或者可以是所述专利中描述的任何区域，将所述专利的内容通过引用整体并入本文。
[0254]
在一些实施方案中，本公开的有效负载可编码结合多于一个表位的多特异性抗体。如本文所用的，术语“多体”或“多特异性抗体”是指其中两个或更多个可变区与不同表位结合的抗体。所述表位可以在相同或不同的靶标上。在一个实施方案中，可以通过国际专利公开号wo2011109726和美国专利公开号us20150252119中描述的方法生成和优化多特异性抗体，将所述专利各自的内容通过引用整体并入本文。这些抗体能够以高特异性和高亲和力与多种抗原结合。
[0255]
在某些实施方案中，多特异性抗体是识别相同或不同抗原上的两个不同表位的“双特异性抗体”。在一方面，双特异性抗体能够结合两种不同的抗原。这样的抗体通常包含来自至少两种不同抗体的抗原结合区。例如，双特异性单克隆抗体(bsmab，bsab)是由两种不同单克隆抗体的片段组成的人工蛋白质，因而允许bsab与两种不同类型的抗原结合。双特异性抗体框架可包括任何描述于下列文献中的那些框架：riethmuller，g.，2012.cancer immunity，2012，12：12-18；marvin等人，acta pharmacologica sinica.2005，26(6)：649-658；和schaefer等人，pnas.2011，108(27)：11187-11192，将所述专利各自的内容通过引用整体并入本文。已经开发了被称为“三功能双特异性”抗体的新一代bsmab。这些由两条重链和两条轻链组成，每条链来自两种不同的抗体，其中两个fab区(臂)针对两种抗原，并且fc区(足)包含两条重链并形成第三个结合位点。
[0256]
在一些实施方案中，有效负载可编码包含单个抗原结合结构域的抗体。这些分子极小，其分子量大约为针对全尺寸mab测出的分子量的十分之一。进一步的抗体可包括“纳米抗体”，其来源于缺乏轻链的在骆驼和羊驼属(llamas)中发现的重链抗体的抗原结合可变重链区(vhh)(nelson，a.l.，mabs.2010.jan-feb；2(1)：77-83)。
[0257]
在一些实施方案中，所述抗体可以是“小型化的”。mab小型化的最佳实例是trubion制药公司的小模块免疫药物(smip)。这些分子可以是单价或二价的，是重组单链分子，含有一个vl、一个vh抗原结合结构域和一个或两个恒定的“效应子”结构域，它们都通过接头结构域连接。据推测，这种分子可能提供片段所主张的增加组织或肿瘤渗透的优点，同时保留恒定结构域所赋予的效应免疫功能。至少三种“小型化”smip已经进入临床开发。
[0258]
小型化抗体的一个实例被称为“单抗体”(“unibody”)，其中铰链区已经从igg4分子中去除。虽然igg4分子不稳定并且可以相互交换轻链-重链异二聚体，但铰链区的缺失完全阻止了重链-重链配对，留下高度特异性的单价轻/重异二聚体，同时保留fc区来确保稳定性和体内半衰期。
[0259]
在一些实施方案中，本公开的有效负载可以编码单结构域抗体(sdab或纳米体)，其为由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。像全抗体一样，它能够选择性地与特异
性抗原结合。在一方面，sdab可以是“骆驼ig或“骆驼科vhh”。如本文所用的，术语“骆驼ig”是指重链抗体的最小已知抗原结合单位(koch-no lte等人，faseb j.，2007，21：3490-3498)。“重链抗体”或“骆驼科抗体”是指含有两个vh结构域且无轻链的抗体(riechmannl.等人，j.immunol.methods，1999，231：25-38；国际专利公开号wo1994/04678和wo1994/025591；和美国专利第6,005,079号)。另一方面，sdab可以是“免疫球蛋白新抗原受体”(ignar)。如本文所用的，术语“免疫球蛋白新抗原受体”是指来自鲨鱼免疫库中的一类抗体，由一个可变新抗原受体(vnar)结构域和五个恒定新抗原受体(cnar)结构域的同二聚体组成。
[0260]
在一些实施方案中，本公开的有效负载可编码细胞内抗体。细胞内抗体是不从产生它的细胞中分泌出来而是靶向一种或多种细胞内蛋白质的抗体形式。细胞内抗体在细胞内表达和起作用，可用于影响许多细胞过程，包括但不限于细胞内运输、转录、翻译、代谢过程、增殖信号传导和细胞分裂。在一些实施方案中，本文所述的方法包括基于细胞内抗体的疗法。在一些这样的实施方案中，将本文公开的可变结构域序列和/或cdr序列掺入一个或多个构建体中，所述构建体用于基于细胞内抗体的疗法。例如，细胞内抗体可以靶向一种或多种糖化细胞内蛋白质，或者可以调节一种或多种糖化细胞内蛋白质和替代蛋白质之间的相互作用。
[0261]
在一些方面，本公开的有效负载可编码美国专利第5,091,513号中描述的生物合成抗体，将该专利的内容通过引用整体并入本文。这样的抗体可包括一个或多个氨基酸序列，这些氨基酸序列构成了用作生物合成抗体结合位点(babs)的区域。这些位点包含1)非共价缔合或二硫键键合的合成vh和vl二聚体，2)vh-vl或vl-vh单链，其中vh和vl通过多肽接头附接，或3)单独的vh或vl结构域。结合结构域包括连接的cdr和fr区域，它们可以来源于单独的免疫球蛋白。生物合成抗体还可包括其他多肽序列，其作用为例如作为酶、毒素、结合位点或固定介质或放射性原子的附着位点。公开了用于产生生物合成抗体、用于设计具有可通过抗体的体内生成引发的任何特异性的babs以及用于产生其类似物的方法。
[0262]
在一些实施方案中，有效负载可编码具有美国专利第8,399,625号中教导的抗体受体框架的抗体。这样的抗体受体框架可能特别良好地适合接受来自感兴趣的抗体的cdr。
[0263]
在一个实施方案中，抗体可以是条件活性生物蛋白。抗体可用于生成在野生型正常生理条件下可逆或不可逆失活的条件活性生物蛋白，以及这样的条件活性生物蛋白和这样的条件活性生物蛋白的用途。这样的方法和条件活性蛋白教导于例如国际公开号wo2015175375和wo2016036916以及美国专利公开号us20140378660中，将所述专利各自的内容通过引用整体并入本文。
[0264]
用于免疫疗法的抗体
[0265]
在一些实施方案中，本公开的有效负载可以是对肿瘤特异抗原(tsa)和肿瘤相关抗原(taa)特异的抗体、其片段和变体。抗体在全身循环，直到它们找到并附着于tsa/taa时为止。一旦附着，它们募集免疫系统的其他部分，从而增强adcc(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和adcp(抗体依赖性细胞介导的吞噬作用)来破坏肿瘤细胞。如本文所用的，术语“肿瘤特异性抗原(tsa)”意指在肿瘤细胞中产生的抗原物质，其可以在宿主生物中触发抗肿瘤免疫响应。在一个实施方案中，tsa可以是肿瘤新抗原。肿瘤抗原特异性抗体介导针对表达相同抗原的肿瘤细胞的补体依赖性细胞毒性响应。
[0266]
在一些实施方案中，肿瘤特异性抗原(tsa)、肿瘤相关抗原(taa)、病原体相关抗原或其片段可以表达为肽或完整的蛋白质或其部分。完整的蛋白质或其一部分可以是天然的或经诱变处理的。如本文所述的与癌症或病毒诱导的癌症相关的抗原是本领域熟知的。这样的tsa或taa可能先前与癌症相关，或者可以通过本领域已知的任何方法加以鉴定。
[0267]
在一个实施方案中，抗原是cd19，其为在整个b细胞发育过程中表达的b细胞表面蛋白。cd19是熟知的b细胞表面分子，其在b细胞受体活化后增强b细胞群的b细胞抗原受体诱导的信号传导和扩增。cd19在正常b细胞和肿瘤性b细胞中广泛表达。来源于b细胞的恶性肿瘤，比如慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病和许多非霍奇金淋巴瘤经常保留cd19表达。这种近乎普遍的表达和对单细胞谱系的特异性使cd19成为用于免疫疗法的有吸引力的靶标。人cd19有14个外显子，其中外显子1-4编码cd19的细胞外部分，外显子5编码cd19的跨膜部分，外显子6-14编码胞质尾。
[0268]
在一个实施方案中，本公开的有效负载可以是针对cd19抗原特异的抗体、其片段和变体。
[0269]
在一些实施方案中，免疫治疗剂可以是与选自肿瘤特异性抗原(tsa)、肿瘤相关抗原(taa)或抗原表位的抗原具有特异性免疫响应性的抗体。
[0270]
在一方面，抗原可以是抗原表位。在一些实施方案中，抗原表位可以是cd19。
[0271]
肿瘤特异性抗原(tsa)可以是肿瘤新抗原。新抗原是仅由肿瘤细胞表达的突变抗原，这是因为基因突变或转录改变而改变了蛋白质编码序列，因此产生了新的外来抗原。遗传变化是由于天然同源蛋白(即，在正常细胞中表达的分子)的遗传取代、插入、缺失或任何其他遗传变化所致。
[0272]
嵌合抗原受体(car)
[0273]
本文所述的生物回路可包括嵌合抗原受体。在一些实施方案中，本公开的有效负载可以是嵌合抗原受体(car)，当其被转导到免疫细胞(例如，t细胞和nk细胞)中时，可以针对表达被car的细胞外靶部分识别的分子的靶标(例如，肿瘤细胞)，将免疫细胞重定向。
[0274]
如本文所用的，术语“嵌合抗原受体(car)”是指模拟t细胞表面上的tcr的合成受体。一般而言，car由细胞外靶向结构域、跨膜结构域/区域和细胞内信号传导/活化结构域组成。在标准的car受体中，将细胞外靶向结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导/活化结构域以线性方式构建为单个融合蛋白。细胞外区域包含靶向结构域/部分(例如，scfv)，其识别特异性肿瘤抗原或其他肿瘤细胞表面分子。细胞内区域可含有tcr复合物的信号传导结构域(例如cd3ζ的信号区和/或一个或多个共刺激信号传导结构域，例如来自cd28、4-1bb(cd137)和ox-40(cd134)的信号传导结构域)。例如，“第一代car”只有cd3ζ信号传导结构域。为了增强t细胞的持久性和增殖，添加了共刺激细胞内结构域，从而产生具有cd3ζ信号传导结构域加一个共刺激信号传导结构域的第二代car和具有cd3ζ信号结构域加两个或更多个共刺激信号传导结构域的第三代car。当由t细胞表达时，car赋予t细胞由car的细胞外靶向部分决定的抗原特异性。最近，还希望添加一个或多个元件，比如归巢基因和自杀基因，以开发更有活性和更安全的car架构，即所谓的第四代car。
[0275]
在一些实施方案中，具有效应子模块的免疫治疗剂是嵌合抗原受体(car)。嵌合抗原可包含细胞外靶部分；跨膜结构域；细胞内信号传导结构域；和任选地，一个或多个共刺激结构域。
[0276]
在一些实施方案中，细胞外靶向结构域通过铰链(也称为空间结构域或间隔物)和跨膜区与细胞内信号传导结构域连接。铰链将细胞外靶向结构域域跨膜结构域连接，跨膜结构域横向穿过细胞膜并与细胞内信号传导结构域连接。由于靶向部分结合的靶蛋白的大小以及靶向结构域本身的大小和亲和力的缘故，可能需要改变铰链，以优化表达car的细胞对癌细胞的效力。在靶向部分被靶细胞识别并与之结合后，细胞内信号传导结构域产生针对car t细胞的活化信号，所述信号被来自一个或多个细胞内共刺激结构域的“第二信号”进一步放大。car t细胞一旦被活化，就能破坏靶细胞。
[0277]
在一些实施方案中，本公开的car可以分为两个部分，每个部分连接二聚化结构域，使得触发二聚化的输入促进完整功能性受体的组装。wu和lim最近报道了一种分裂car，其中细胞外cd19结合结构域和细胞内信号传导元件是分离的，并且连接至fkbp结构域和frb*(fkbp-雷帕霉素结合的t2089l突变体)结构域(它们在雷帕霉素类似物ap21967的存在下异二聚化)。分裂受体在ap21967存在下组装，同时进行特异性抗原结合，活化t细胞(wu等人，science，2015，625(6258)：aab4077)。
[0278]
在一些实施方案中，本公开的car可以被设计为诱导型car。sakemura等人最近报道了tet-on诱导系统与cd19 car构建体的结合。cd19 car仅在多西环素(dox)存在时活化。sakemura报道，与常规的cd19car t细胞相比，在dox存在下的tet-cd19car t细胞对cd19+细胞系具有同等的细胞毒性，并且在cd19刺激后具有同等的细胞因子产生和增殖(sakemura等人，cancer immuno.res.，2016年6月21日，印刷前的电子出版)。在一个实例中，这种tet-car可以是在本公开的sre(例如，dd)控制下的效应子模块的有效负载。双重系统提供了更大的打开和关闭转导t细胞中的car表达的灵活性。
[0279]
根据本公开，本公开的有效负载可以是第一代car，或第二代car，或第三代car，或第四代car。在一些实施方案中，本公开的有效负载可以是由细胞外结构域、铰链和跨膜结构域以及细胞内信号传导区组成的全car构建体。在其他实施方案中，本公开的有效负载可以是全car构建体的组分，包括细胞外靶向部分、铰链区、跨膜结构域、细胞内信号传导区、一个或多个共刺激结构域，以及改善car架构和功能性的其他附加元件，包括但不限于前导序列、归巢元件和安全开关，或这些组分的组合。
[0280]
由本公开的生物回路和组合物调节的car是可调的，由此提供了若干优点。可逆的打开-关闭开关机制允许管理由过度的car-t细胞扩增引起的急性毒性。通过循环配体水平，可以实现使用本公开的sre的搏动式car表达。car的配体赋予的调节可有效抵消由抗原丢失诱导的肿瘤逃逸，从而避免由于慢性抗原暴露引起的增强的信号传导引起的功能衰竭，并改善car表达细胞在体内的持久性。
[0281]
在一些实施方案中，可以利用本公开的生物回路和组合物来下调car表达，以限制由肿瘤溶解综合征引起的中靶组织毒性。抗肿瘤功效后下调本公开的car表达可以防止(1)正常组织中由抗原表达引起的脱靶肿瘤毒性，(2)体内抗原非依赖性活化。
[0282]
细胞外靶向结构域/部分
[0283]
根据本公开，car的细胞外靶部分可以是以高特异性和亲和力识别和结合给定靶分子(例如，肿瘤细胞上的新抗原)的任何剂。靶部分可以是特异性地与肿瘤细胞上靶分子结合的抗体及其变体，或基于其与肿瘤细胞上靶分子结合的能力从随机序列库(poo1)中选择的肽适体，或其可与肿瘤细胞上靶分子结合的变体或片段，或来自天然t细胞受体(tcr)
activation potential directs alternative t cell fates and therapeutic potency.nature medicine 25，82-88(2019)；将其内容通过引用整体并入本文)。
[0293]
在一些实施方案中，gitr共刺激结构域可用于本文所述的car中。在一些实施方案中，gitr结构域或许能够诱导t细胞效应子功能并活化t细胞。在一些方面，本文所述的gitr结构域或许能够抑制阻断免疫响应的抑制性调节性t细胞。在一些实施方案中，含有gitr细胞内结构域的car t细胞可以减少细胞因子的产生，这可以减轻细胞因子释放综合征。在国际专利公开wo2018045034中描述了gitr结构域的任何一种；将其内容通过引用整体并入本文。
[0294]
跨膜结构域和铰链区
[0295]
在一些实施方案中，本公开的car可包含跨膜结构域。如本文所用的，术语“跨膜结构域(tm)”广义上是指跨质膜的长度约为15个残基的氨基酸序列。更优选地，跨膜结构域包括至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44个或45个氨基酸残基，并且跨越质膜。在一些实施方案中，本公开的跨膜结构域可以来源于天然来源或合成来源。car的跨膜结构域可以来源于任何天然的膜结合蛋白或跨膜蛋白。例如，跨膜区可来源于t细胞受体的α、β或ζ链、cd3ε、cd4、cd5、cd8、cd8a、cd9、cd16、cd22、cd33、cd28、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd152或cd154的跨膜结构域(即至少包含其跨膜结构域)。
[0296]
可替代地，本公开的跨膜结构域可以是合成的。在一些方面，合成序列可主要包含疏水残基，比如亮氨酸和缬氨酸。
[0297]
在一些实施方案中，本公开的跨膜结构域可以选自cd8a跨膜结构域、cd4跨膜结构域、cd 28跨膜结构域、ctla-4跨膜结构域、pd-1跨膜结构域和人igg4 fc区。作为非限制性实例，跨膜结构域可以是包含国际专利公开号wo2014/100385的seq id no.1-5的氨基酸序列的ctla-4跨膜结构域；和包含国际专利公开号wo2014100385的seq id no.6-8的氨基酸序列的pd-1跨膜结构域；将每篇专利的内容通过引用并入本文。
[0298]
在一些实施方案中，本公开的car可包含任选的铰链区(也称为间隔物)。铰链序列是短的氨基酸序列，其促进细胞外靶向结构域的灵活性，使靶结合结构域离开效应细胞表面，以实现适当的细胞/细胞接触、靶结合和效应细胞活化(patel等人，gene therapy，1999；6：412-419)。铰链序列可定位在靶向部分和跨膜结构域之间。
[0299]
在一些实施方案中，本公开的car可包含在car的任何结构域之间的一个或多个接头。接头的长度可以在1-30个氨基酸之间。
[0300]
在一些实施方案中，可以将包括本公开的靶向部分、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域在内的组分构建在单个融合多肽中。融合多肽可以是本公开的效应子模块的有效负载。在一些实施方案中，在效应子模块中可包括多于一个car融合多肽，例如，在效应子模块中可包括在单个sre(例如dd)的控制下的两个、三个或更多个car。
[0301]
在一个实施方案中，car构建体包含cd19scfv(例如cat13.1e10或fmc63)、cd8α间隔物或跨膜结构域以及4-1bb和cd3ζ胞内结构域。与具有fmc63的构建体相比，这些具有cat13.1e10的构建体在体外刺激后可具有增加的增殖、增加的针对cd19+靶标的细胞毒性以及增加的效靶相互作用。
[0302]
在一些实施方案中，本公开的有效负载可以是本文所述的任何共刺激分子和/或
细胞内结构域。在一些实施方案中，在本公开中可以使用各自处于不同sre的控制下的一种或多种共刺激分子。还可以结合第一代car、第二代car、第三代car、第四代car或本文描述的任何其他car设计来表达sre调节的共刺激分子。
[0303]
串联car(tancar)
[0304]
在一些实施方案中，本公开的car可以是串联嵌合抗原受体(tancar)，其能够靶向两种、三种、四种或更多种肿瘤特异性抗原。在某些方面，car是双特异性tancar，其包括识别肿瘤细胞上的两种不同tsa的两个靶向结构域。双特异性car可进一步定义为包含细胞外区，所述细胞外区包含对第一肿瘤抗原特异的靶向结构域(例如，抗原识别结构域)和对第二肿瘤抗原特异的靶向结构域(例如，抗原识别结构域)。在其他方面，car是多特异性tancar，其包括以串联排列配置的三个或更多个靶向结构域。tancar中靶向结构域之间的间隔长度可以在约5个至约30个氨基酸之间，例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29个和30个氨基酸。
[0305]
分裂car
[0306]
在一些实施方案中，可以将包括本公开的靶向部分、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域在内的组分分裂成两个或更多个部分，使得它依赖于促进完整功能受体组装的多个输入。在一个实施方案中，可以构建分裂的合成car系统，其中活化car受体的组装依赖于配体与sre(例如小分子)的结合以及特异性抗原与靶向部分的结合。作为非限制性实例，分裂car由以小分子依赖方式组装的两个部分组成；受体的一个部分的特征为细胞外抗原结合结构域(例如scfv)，另一个部分具有细胞内信号传导结构域，比如cd3ζ细胞内结构域。
[0307]
在其他方面，可以进一步修饰car系统的分裂部分，以增强信号。在一个实例中，可以通过将跨膜结构域(例如，cd8α跨膜结构域)掺入构建体而将细胞质片段的第二部分锚定到质膜上。还可以将另外的细胞外结构域，例如，介导同二聚化的细胞外结构域添加至car系统的第二部分。这些修饰可增强受体输出活性，即，t细胞活化。
[0308]
在一些方面，分裂car系统的两个部分含有异二聚化结构域，它们在异二聚化小分子结合后有条件地相互作用。正因为如此，受体组分在小分子存在下组装，形成完整的系统，然后所述系统可以通过抗原接合而活化。可以将任何已知的异二聚化组分掺入分裂的car系统中。还可以使用其他小分子依赖性异二聚化结构域，包括但不限于赤霉素诱导的二聚化系统(gid1-gai)、甲氧苄啶-slf诱导的ecdhfr和fkbp二聚化(czlapinski等人，j am chem soc.，2008，130(40)：13186-13187)和aba(脱落酸)诱导的pp2c和pyl结构域的二聚化(cutler等人，annu rev plant biol.2010，61：651-679)。使用分裂的car系统的诱导组装(例如，配体依赖性二聚化)和降解(例如，去稳定结构域诱导的car降解)的双重调节，可以提供更多的控制car修饰的t细胞的活性的灵活性。
[0309]
可切换car
[0310]
在一些实施方案中，本公开的car可以是可切换car。juillerat等人(juilerat等人，sci.rep.，2016，6：18950；将其内容通过引用整体并入本文)最近报道了可控制的car，其可以对刺激(例如小分子)有响应而被瞬时打开。在这种car设计中，将系统直接整合在铰链结构域中，将car中的scfv结构域与细胞膜结构域分开。这样的系统可能使car的不同关键功能分裂或组合，所述功能比如在受体复合物不同链内的活化和共刺激，从而模仿tcr天然架构的复杂性。这个整合的系统可以在由刺激的不存在/存在控制的开/关状态之间切换
scfv和抗原的相互作用。
[0311]
可逆car
[0312]
在其他实施方案中，本公开的car可以是可逆car系统。在这种car结构中，在car系统中掺入lid结构域(配体诱导的降解)。通过添加lid结构域的配体，car可以被暂时下调。lid和dd介导的调节的结合，对于持续活化的car t细胞提供了可调控制，从而降低了car介导的组织毒性。
[0313]
活化条件性car
[0314]
在一些实施方案中，本公开的有效负载可以是活化条件性嵌合抗原受体，其仅在活化的免疫细胞中表达。car的表达可以与活化条件性控制区偶联，所述活化条件性控制区是指一个或多个核酸序列，其诱导序列例如在其控制下的car的转录和/或表达。这样的活化条件性控制区可以是在效应免疫细胞活化过程中上调的基因的启动子，例如il2启动子或nfat结合位点。在一些实施方案中，可以通过组成型表达的car来实现免疫细胞的活化(国际公开号wo2016126608；将其内容通过引用整体并入本文)。
[0315]
多核苷酸
[0316]
生物回路组分，包括效应子模块、它们的sre和有效负载，可以是基于核酸的。术语“核酸”在其最广泛的意义上，包括任何包含核苷酸(例如连接的核苷)的聚合物的化合物和/或物质。这些聚合物通常称为多核苷酸。本公开的示例性核酸或多核苷酸包括但不限于核糖核酸(rna)、脱氧核糖核酸(dna)、苏糖核酸(tna)、乙二醇核酸(gna)、肽核酸(pna)、锁核酸(lna，包括具有[β-d-ribo构型的lna、具有a-l-ribo构型的a-lna(lna的非对映体)、具有2
’‑
氨基官能化的2
’‑
氨基-lna和具有2
’‑
氨基官能化的2
’‑
氨基-α-lna)或它们的杂交体。
[0317]
在一些实施方案中，核酸分子是信使rna(mrna)。如本文所用的，术语“信使rna”(mrna)是指编码感兴趣的多肽的任何多核苷酸，其能够被翻译，以体外、体内、原位或离体的方式产生编码的感兴趣的多肽。本公开的多核苷酸可以是mrna或任何核酸分子，并且可以经过或可以未经过化学修饰。
[0318]
传统上，mrna分子的基本组分至少包括编码区、5’utr、3’utr、5’帽和poly-a尾。在这种野生型模块化结构的基础上，本公开通过提供维持模块化组织的有效负载，扩大了传统mrna分子的功能范围，但是它们包括一种或多种结构和/或化学修饰或改变，所述修饰或改变对多核苷酸赋予了有用的特性，例如功能的可维持性。如本文所用的，“结构”特征或修饰是这样的特征或修饰，其中在多核苷酸中进行两个或更多个连接核苷的插入、缺失、重复、倒位或随机化，而对核苷本身没有显著的化学修饰。因为化学键将必然断裂并重新形成而实现结构修饰，所以结构修饰是具有化学性质的，因此是化学修饰。然而，结构修饰将导致不同的核苷酸序列。例如，多核苷酸“atcg”可被化学修饰为“at-5mec-g”。同一个多核苷酸可以在结构上从“atcg”修饰为“atcccg”。这里，已经插入了二核苷酸“cc”，导致多核苷酸的结构修饰。
[0319]
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸可包含在翻译起始中起作用的5’utr序列。5’utr序列可包括多个特征，比如通常已知参与核糖体启动基因翻译过程的kozak序列，kozak序列具有共有的xccr(a/g)ccaug，其中r是起始密码子(aug)上游三个碱基的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，x是任何核苷酸。在一个实施方案中，kozak序列是accgcc。通过工程改造通
常在靶细胞或组织的大量表达的基因中发现的特征，可以增强本公开的多核苷酸的稳定性和蛋白质产生。
[0320]
进一步提供了可含有内部核糖体进入位点(ires)的多核苷酸，在多核苷酸中不存在5’帽结构的情况下，所述内部核糖体进入位点在启动蛋白质合成中起重要作用。ires可以充当唯一的核糖体结合位点，或者，可以用作多个结合位点之一。含有多于一个功能性核糖体结合位点的本公开的多核苷酸可以编码若干肽或多肽，它们独立地被核糖体翻译，产生双顺反子和/或多顺反子核酸分子。
[0321]
在一个实施方案中，本公开的多核苷酸可编码与参考多肽序列具有一定的同一性的变体多肽。如本文所用的，“参考多肽序列”是指起始多肽序列。参考序列可以是野生型序列或在设计另一个序列时参考的任何序列。
[0322]
如本领域已知的术语“同一性”是指在两个或多个序列之间的通过比较所述序列确定的关系。在本领域中，同一性还意指在序列之间的序列相关性的程度，正如由两个或更多个残基(氨基酸或核酸)串之间的匹配数决定。同一性量度了两个或更多个序列之间相同匹配的百分比，它们之间的空位比对(如果有的话)是通过特定的数学模型或计算机程序(即，“算法”)解决的。可通过已知的方法容易地计算相关序列的同一性。这样的方法包括但不限于在下列文献中描述的那些：computational molecular biology，lesk，a.m.编辑，oxford university press，new york，1988；biocomputing：informatics and genome projects，smith，d.w.编辑，academic press，new york，1993；computer analysis of sequence data，part 1，griffin，a.m.和griffin，h.g.编辑，humana press，new jersey，1994；sequence analysis in molecular biology，vonheinje，g.，academic press，1987；sequence analysis primer，gribskov，m.和devereux，j.编辑，m.stockton press，new york，1991；和carillo等人，siam j.applied math.48，1073(1988)。
[0323]
在一些实施方案中，变体序列可以具有与参考序列相同或相似的活性。可替代地，变体可以相对于参考序列具有改变的活性(例如，增加或降低)。通常，本公开的特定多核苷酸或多肽的变体将与特定的参考多核苷酸或多肽具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％的序列同一性，如通过本文所述并且本领域技术人员已知的序列比对程序和参数所确定的。这样的比对工具包括blast套件的那些(stephen f.altschul，thomas l.madden，alejandro a.schaffer.jinghui zhang，zheng zhang，webb miller和david j.lipman(1997)，
″
gapped blast and psi-blast：a new generation of protein database search programs
″
，nucleic acids res.25：3389-3402。)
[0324]
对多核苷酸的化学修饰
[0325]
根据本公开，术语“修饰”或在适当时的“修饰的”多核苷酸是指相对于a、g、u(dna中的t)或c核苷酸的修饰。
[0326]
本公开的多核苷酸的修饰可以在包含多核苷酸的核苷的核苷碱基和/或糖部分上。在一些实施方案中，在修饰的核酸或一个或多个单独的核苷或核苷酸中包含多个修饰。例如，对核苷的修饰可包括对核碱基和糖的一个或多个修饰。对本公开的多核苷酸的修饰可以包括例如在国际公开wo2013052523中教导的任何修饰，将其内容通过引用整体并入本文。
[0327]
如本文所述的“核苷”被定义为含有糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物以及有机碱(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物(本文也称为“核碱基”)的化合物。如本文所述，“核苷酸”被定义为包含磷酸基团的核苷。
[0328]
可以在核苷间键联(例如，磷酸骨架)上将可以掺入多核苷酸中的修饰核苷酸进行修饰。在本文多核苷酸主链的上下文中，短语“磷酸酯”和“磷酸二酯”可互换使用。可以通过用不同的取代基取代一个或多个氧原子来修饰骨架磷酸基团。此外，修饰的核苷和核苷酸可包括用另一个核苷间键联完全替换未修饰的磷酸部分。修饰的磷酸基团的实例包括但不限于硫代磷酸酯、硒代憐酸酯(phosphonoselenoate)、硼烷磷酸(boranophosphate)、硼烷磷酸酯(boranophosphate ester)、磷酸氢盐、氨基磷酸酯、磷酸二亚胺(phosphonodiamidite)、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非连接氧都被硫取代。还可以通过用氮(桥接的氨基磷酸酯)、硫(桥接的硫代磷酸酯)和碳(桥接的亚甲基膦酸酯)替换连接氧来修饰磷酸酯接头。可以使用的其他修饰在例如国际申请wo2013052523中有教导，将其内容通过引用整体并入本文。
[0329]
不同的糖修饰、核苷酸修饰和/或核苷间键联(例如，主链结构)可以存在于多核苷酸的不同位置。本领域普通技术人员将理解，核苷酸类似物或其他修饰可以位于多核苷酸的任何位置，使得多核苷酸的功能没有显著降低。修饰也可以是5’或3’末端修饰。多核苷酸可含有从约1％到约100％的修饰核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即a、g、u或c中的任何一种或多种)或任何居间的百分比(例如，从1％到20％、从1％到25％、从1％到50％、从1％到60％、从1％到70％、从1％到80％、从1％到90％、从1％到95％、从10％到20％、从10％到25％、从10％到50％、从10％到60％、从10％到70％、从10％到80％、从10％到90％、从10％到95％、从10％到100％、从20％到25％、从20％到50％、从20％到60％、从20％到70％、从20％到80％、从20％到90％、从20％到95％、从20％到100％、从50％到60％、从50％到70％、从50％到80％、从50％到90％、从50％到95％、从50％到100％、从70％到80％、从70％到90％、从70％到95％、从70％到100％、从80％到90％、从80％到95％、从80％到100％、从90％到95％、从90％到100％以及从95％到100％)。
[0330]
在一些实施方案中，多核苷酸保包含修饰的嘧啶或嘌呤。在一些实施方案中，多核苷酸分子中的嘧啶或嘌呤可以用从约1％到约100％的修饰的尿嘧啶或修饰的尿苷(例如，从1％到20％、从1％到25％、从1％到50％、从1％到60％、从1％到70％、从1％到80％、从1％到90％、从1％到95％、从10％到20％、从10％到25％、从10％到50％、从10％到60％、从10％到70％、从10％到80％、从10％到90％、从10％到95％、从10％到100％、从20％到25％、从20％到50％、从20％到60％、从20％到70％、从20％到80％、从20％到90％、从20％到95％、从20％到100％、从50％到60％、从50％到70％、从50％到80％、从50％到90％、从50％到95％、从50％到100％、从70％到80％、从70％到90％、从70％到95％、从70％到100％、从80％到90％、从80％到95％、从80％到100％、从90％到95％、从90％到100％以及从95％到100％的修饰的嘧啶或嘌呤)替换。
[0331]
在一些实施方案中，多核苷酸可包含两个或更多个效应子模块组件序列，所述序列具有重复一次、两次或多于三次的模式，比如ababab或aabbaabbaabb或abcabcabc或其变体。在这些模式中，每个字母a、b或c代表不同的效应子模块组件。
[0332]
在又另一个实施方案中，多核苷酸可包含两个或更多个效应子模块组件序列，其
中每个组件具有一个或多个序列。作为非限制性实例，序列可以呈在每个区域中重复一次、两次或多于三次的模式，比如ababab或aabbaabbaabb或abcabcabc或其变体。作为另一个非限制性实例，序列可以呈在整个多核苷酸上重复一次、两次或多于三次的模式，比如ababab或aabbaabbaabb或abcabcabc或其变体。在这些模式中，每个字母a、b或c代表不同的序列或组件。
[0333]
密码子选择
[0334]
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸的一个或多个密码子可以用编码天然氨基酸序列的其他密码子替换，从而通过称为密码子选择的过程来调节sre的表达。由于mrna密码子和trna反密码子库倾向于随着生物、细胞类型、亚细胞位置并且随着时间而变化，本文所述的密码子选择是时空(st)密码子选择。
[0335]
在本公开的一些实施方案中，某些多核苷酸特征可以经历密码子优化。密码子优化是指修饰核酸序列以便增强宿主细胞中的表达的过程，该过程为通过在保持天然氨基酸序列的同时用在该宿主细胞的基因中最频繁地使用的密码子替换天然序列的至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个密码子。可以使用密码子适应指数(cai)来测量密码子使用，所述密码子适应指数测量编码多核苷酸序列与参考基因集的偏差。可在密码子使用数据库(http：//www.kazusa.or.jp/codon/)获得密码子使用表，并且可以通过emboss cai程序(http：//emboss.sourceforge.net/)计算cai。密码子优化方法是本领域已知的，并且可用于努力实现几个目标中的一个或多个。这些目标包括匹配靶标生物和宿主生物中的密码子频率以确保正确折叠；偏置核苷酸含量以改变稳定性或减少二级结构；最小化可能损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基串；定制转录和翻译控制区；插入或移除蛋白质信号传导序列；移除/添加编码蛋白质中的翻译后修饰位点(例如糖基化位点)；添加、移除或改组蛋白质结构域；插入或删除限制性位点；修饰核糖体结合位点和降解位点，以调节翻译速率，使蛋白质的各个结构域正确折叠；或减少或消除多核苷酸内有问题的二级结构。在一个实施方案中，使用优化算法进行多核苷酸序列或其部分的密码子优化。针对每种氨基酸的密码子选项是本领域熟知的，各种物种表也是如此，以便优化在该特定物种中的表达。
[0336]
在本公开的一些实施方案中，某些多核苷酸特征可以经历密码子优化。例如，密码子优化的优选区域可以是编码多肽的区域的上游(5’)或下游(3’)。可以将这些区域在有效负载编码区或开放阅读框(orf)的密码子优化之前和/或之后掺入多核苷酸中。
[0337]
在优化之后(如果需要的话)，将多核苷酸组分重组并且转化到载体中，所述载体例如但不限于质粒、病毒、粘粒和人工染色体。
[0338]
在一些实施方案中，多核苷酸的某些区域对于密码子选择可能是优选的。例如，密码子选择的优选区域可以是编码多肽的区域的上游(5’)或下游(3’)。可以将这些区域在有效负载编码区或开放阅读框(orf)的密码子选择之前和/或之后掺入多核苷酸中。
[0339]
可以将本公开的多核苷酸的终止密码子修饰为包括这样的序列和基序，所述序列和基序改变本公开的sre、有效负载和效应子模块的表达水平。可以掺入这样的序列来诱导终止密码子读通，其中所述终止密码子可以指定氨基酸，例如硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸。在其他情况下，可以完全跳过终止密码子，通过交替开放阅读框继续翻译。可以利用终止密码子通读以特定比率(例如，由终止密码子上下文决定)调节效应子模块组件的表达。优选的终止密码子基序的实例包括ugan、uaan和uagn，其中n是c或u
[0340]
在许多病毒mrna的翻译过程中发生终止的抑制，作为产生具有延伸羧基末端的第二种蛋白质的手段。在逆转录病毒中，gag和pol基因由单个mrna编码，并由琥珀终止密码子uag分开。琥珀密码子的翻译抑制允许合成gag pol前体。由能够识别终止密码子并插入特定氨基酸的抑制型trna介导翻译抑制。在一些实施方案中，本文所述的效应子模块可以结合琥珀终止密码子。在双顺反子构建体中，这样的密码子可以用来替代或补充ires和p2a序列。终止密码子通读可以与p2a相结合，以获得下游基因(例如il12)的低水平表达。在一些实施方案中，琥珀终止密码子可以与trna表达或氨基-酰基trna合成酶相结合，用于进一步控制。在一方面，有效负载可以是受调节的trna合成酶。
[0341]
缀合物
[0342]
本公开预期的是，本公开的组合物可以与一种或多种同源或异源分子复合、缀合或结合。如本文所用的，术语“同源分子”是指在结构或功能的至少一者方面与起始分子相似的分子，而“异源分子”是指在结构或功能的至少一者方面与起始分子不同的分子。因此，结构同源物是基本上结构相似的分子。在一些实施方案中，这样的同源物可以是完全相同的。功能同源物是基本上功能相似的分子。在一些实施方案中，这样的同源物可以是完全相同的。
[0343]
本公开的药物组合物、生物回路、生物回路组分、效应子模块(包括它们的sre或有效负载)可以包含缀合物。本公开这种缀合物可以包括天然存在的物质或配体，比如蛋白质(例如人血清白蛋白(hsa)、低密度脂蛋白(ldl)、高密度脂蛋白(hdl)或球蛋白)；碳水化合物(例如右旋糖酐、普鲁兰多糖、甲壳素、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸)；或脂质。缀合物还可以是重组或合成分子，比如合成聚合物，例如合成聚氨基酸、寡核苷酸(例如适体)。聚氨基酸的实例可包括聚赖氨酸(pll)、聚l-天冬氨酸、聚l-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(l-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(hmpa)、聚乙二醇(peg)、聚乙烯醇(pva)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、n-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚膦嗪(polyphosphazine)。多胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(pll)、精胺、亚精胺、多胺、假肽-多胺、肽模拟物多胺、树枝状多胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、多胺的季盐或α螺旋肽。
[0344]
在一些实施方案中，缀合物也可包括靶向基团。如本文所用的，术语“靶向基团”是指与剂附接的官能团或部分，其有助于所述剂定位至期望的区域、组织、细胞和/或蛋白质。这样的靶向基团可包括但不限于细胞或组织靶向剂或基团(例如凝集素、糖蛋白、脂质、蛋白质、与特定细胞类型比如肾细胞或其他细胞类型结合的抗体)。在一些实施方案中，靶向基团可包括
[0345]
促黑激素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白a、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、n-乙酰基-半乳糖胺、n-乙酰基-葡糖胺、多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸盐、聚天冬氨酸盐、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸盐、维生素b12、生物素、rgd肽、rgd肽模拟物或适体。
[0346]
在一些实施方案中，靶向基团可以是蛋白质，例如糖蛋白，或肽，例如对共配体具有特异性亲和力的分子，或抗体，例如与指定细胞类型(比如癌细胞、内皮细胞或骨细胞)结合的抗体。靶向基团还可包含激素和/或激素受体。
[0347]
在一些实施方案中，靶向基团可以是能够靶向特异性受体的任何配体。实例包括
但不限于叶酸盐、galnac、半乳糖、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、适体、整合素受体配体、趋化因子受体配体、转铁蛋白、生物素、血清素受体配体、psma、内皮素、gcpii、生长抑素、ldl和hdl配体。在一些实施方案中，靶向基团是适体。这样的适体可以是未修饰的或包含本文公开的修饰的任何组合。
[0348]
仍然在其他实施方案中，本公开的药物组合物、生物回路、生物回路组分、效应子模块(包括它们的sre或有效负载)可以与细胞穿透多肽共价缀合。在一些实施方案中，细胞穿透肽还可以包括信号序列。在一些实施方案中，可将本文所述的缀合物设计成具有增强的稳定性、增强的细胞转染和/或改变的生物分布(例如，靶向至特定组织或细胞类型。)
[0349]
在一些实施方案中，可将缀合部分添加至本公开的药物组合物、生物回路、生物回路组分、效应子模块(包括它们的sre或有效负载)，使得它们允许可检测标记物附着到靶标上以便清除。这样的可检测标记物包括但不限于生物素标记物、泛素、荧光分子、人流感血凝素(ha)、c-myc、组氨酸(his)、flag、谷胱甘肽s-转移酶(gst)、v5(猿猴病毒5表位的副粘病毒)、生物素、亲和素、链霉亲和素、辣根过氧化物酶(hrp)和地高辛配基。
[0350]
在一些实施方案中，本公开的药物组合物、生物回路、生物回路组分、效应子模块(包括它们的sre或有效负载)可以在疾病和/或病症的治疗中相互组合或与其他分子组合。
[0351]
另外的效应子模块功能
[0352]
本公开的效应子模块可以还包含调节感兴趣的有效负载的分布的信号序列、促进从效应子模块构建体切割有效负载的切割和/或处理特征、可以调节效应子模块的细胞定位的靶向和/或穿透信号、标签和/或一个或多个连接效应子模块的不同组件的接头序列。
[0353]
在一些实施方案中，本公开的另外的效应子模块特征包括但不限于在表7中教导的任何特征。
[0354]
表7：效应子模块特征
[0355][0356]
信号序列
[0357]
除了sre和有效负载区域之外，本公开的效应子模块可还包含一个或多个另外的特征，比如一个或多个信号序列。
[0358]
信号序列(有时称为信号肽、靶向信号、靶肽、定位序列、转运肽、前导序列或前导肽)将蛋白质(例如，本公开的效应子模块)导向至其指定的细胞和/或细胞外位置。蛋白质信号序列在几乎所有分泌蛋白和许多整合膜蛋白的靶向和转位中起着核心作用。
[0359]
信号序列是短(5-30个氨基酸长)肽，存在于大多数新合成的目的地为特定位置的蛋白质的n末端。信号序列可以被信号识别颗粒(srp)识别，并且被i型和ii型信号肽肽酶切割。来源于人蛋白质的信号序列可以作为效应子模块的调节模块掺入，以将效应子模块导向至特定的细胞和/或细胞外位置。这些信号序列已经过实验验证，并且可以被切割(zhang z.和henzel w.j.；
″
signal peptide prediction based on analysis of experimentally verified cleavage sites.
″
；protein sci.2004，13：2819-2824)。
[0360]
在一些实施方案中，信号序列可以(尽管不一定)位于效应子模块的n末端或c末端，并且可以(尽管不一定)从期望的效应子模块切下，以产生“成熟的”有效负载。
[0361]
在一些实施方案中，本文使用的信号序列可排除信号序列的氨基酸序列位置1的甲硫氨酸。这可以称为m1del突变。
[0362]
除了天然存在的信号序列外，例如来自分泌蛋白的信号序列，信号序列可以是从
蛋白质的已知信号序列修饰的变体。例如，授予sleep的美国专利第8,258,102号和第9,133,265号公开了修饰的白蛋白信号序列，其具有分泌信号和额外的x1-x2-x3-x4-x5-基序，可以增加蛋白质分泌；授予do的美国专利第9,279,007号公开了人免疫球蛋白重链结合蛋白(bip)的修饰片段的信号序列，其可以增强蛋白质的表达和分泌；授予leonhartsberger等人的美国专利第8,148,494号公开了具有切割位点的信号肽，其可与重组蛋白融合；将各自的内容通过引用整体并入本文。
[0363]
在一些情况下，分泌的信号序列可以是细胞因子信号序列，例如但不限于il2信号序列或p40信号序列。
[0364]
在一些情况下，可以使用将感兴趣的有效负载导向至靶细胞的表面膜的信号序列。可以利用有效负载在靶细胞表面上的表达来限制有效负载向非靶标体内环境扩散，从而潜在地提高有效负载的安全性。另外，为了较长的半衰期，有效负载的膜呈递可以允许生理和定性信号传导以及有效负载的稳定和再循环。膜序列可以是感兴趣的有效负载的n末端组分的内源性信号序列。任选地，可能希望将这个序列交换为不同的信号序列。可以基于信号序列与感兴趣细胞类型的分泌途径的相容性来选择信号序列，以便将有效负载呈递在t细胞表面上。在一些实施方案中，信号序列可以是ige信号序列、cd8a信号序列(也称为cd8a前导序列)或il15ra信号序列(也称为il15ra前导序列)或m1del cd8a信号序列(也称为m1del cd8前导序列)。
[0365]
可用于本效应子模块的其他信号序列变体可包括在美国专利申请公开号2007/01416666；pct专利申请公开号1993/018181中讨论的那些；将各自的内容通过引用整体并入本文。
[0366]
信号序列的其他实例包括这样的变体，其可以是在美国专利第8,148,494号；第8,258,102号；第9,133,265号；第9,279,007号；和美国专利申请公开号20070141666；以及国际专利申请公开号wo1993018181中讨论的修饰的信号序列，将各自的内容通过引用整体并入本文。
[0367]
在其他实例中，信号序列可以是来自其他生物比如病毒、酵母和细菌的异质信号序列，其可以将效应子模块导向至特定的细胞部位，比如细胞核(例如，ep 1209450)。其他实例可包括来自木霉属的天冬氨酸蛋白酶(nsp24)信号序列，其可以增加融合蛋白比如酶的分泌(例如，授予cervin和kim的美国专利第8,093,016号)、细菌脂蛋白信号序列(例如授予lau和rioux的pct申请公开号wo 199109952)、大肠杆菌肠毒素ii信号肽(例如授予kwon等人的美国专利第6,605,697号)、大肠杆菌分泌信号序列(例如，授予malley等人的美国专利公开号us2016090404)、来自甲基营养型酵母的脂肪酶信号序列(例如，美国专利第8,975,041号)和来源于棒状细菌的dna酶的信号肽(例如，美国专利第4,965,197号)，将各自的内容通过引用整体并入本文。
[0368]
信号序列还可包括核定位信号(nls)、核输出信号(nes)、极化细胞管-囊状结构定位信号(参见，例如，美国专利第8,993,742号；cour等人，nucleic acids res.2003，31(1)：393-396；将各自的内容通过引用整体并入本文)、细胞外定位信号、到亚细胞位置(例如溶酶体、内质网、高尔基体、线粒体、质膜和过氧化物酶体等)的信号(例如，参见美国专利第7,396,811号；和negi等人，database，2015，1-7，将各自的内容通过引用整体并入本文。
[0369]
切割位点
30个氨基酸的长度，或20-80个氨基酸的长度，或50-100个氨基酸的长度。也可以根据使用的有效负载的类型并且基于有效负载的晶体结构优化接头长度。在一些情况下，可以优选地选择较短的接头长度。在一些方面，肽接头由通过肽键连接在一起的氨基酸组成，优选地为通过肽键连接的1-20个氨基酸，其中所述氨基酸选自20种天然存在的氨基酸：甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、丝氨酸(s)、半胱氨酸(c)、苏氨酸(t)、甲硫氨酸(m)、脯氨酸(p)、苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)、组氨酸(h)、赖氨酸(k)、精氨酸(r)、天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)、天冬酰胺(n)和谷氨酰胺(q)。如本领域技术人员理解的，这些氨基酸中的一种或多种可以被糖基化。
[0382]
接头序列可以是来源于多结构域蛋白的天然接头。天然接头是短肽序列，它将蛋白质内两个不同的结构域或基序分开。
[0383]
在一些方面，接头可以是柔性的或刚性的。在其他方面，接头可以是可切割的或不可切割的。如本文所用的，术语“可切割接头结构域或区域”或“可切割肽接头”可互换使用。在一些实施方案中，接头序列可以被酶切割和/或化学切割。
[0384]
本公开的接头也可以是非肽接头。例如，可以使用烷基接头，比如-nh-(ch2)a-c(o)-，其中a＝2-20。这些烷基接头可以进一步被任何非空间位阻基团取代，所述基团例如低级烷基(例如c
1-c6)低级酰基、卤素(例如cl、br)、cn、nh2、苯基等。
[0385]
靶向或穿透肽
[0386]
在一些实施方案中，效应子模块包含靶向和/或穿透肽。
[0387]
可以采用选择性地识别细胞表面标志物(例如，受体、跨膜蛋白和细胞外基质分子)的小靶向和/或穿透肽将效应子模块靶向至期望的器官、组织或细胞。可以将体外合成的短肽(5-50个氨基酸残基)和天然存在的肽或其类似物、变体、衍生物掺入效应子模块中，用于使效应子模块归巢到期望的器官、组织和细胞和/或细胞内的亚细胞位置。
[0388]
在一些实施方案中，靶向序列和/或穿透肽可以被包含在效应子模块中，以驱动效应子模块到达靶器官或组织或细胞(例如癌细胞)。在其他实施方案中，靶向和/或穿透肽可以将效应子模块导向至细胞内的特定亚细胞位置。作为非限制性实例，这样的靶向序列和/或穿透肽可包括用于将效应子模块靶向至期望区域的那些，所述区域属于中枢神经系统(例如，美国专利第9,259,432号；美国申请公开号2015/259392)；或脂肪组织(例如，美国专利第8,067,377号和第8,710,017号)；或前列腺(例如，美国专利公开号2016/0046668)；将各自的内容通过引用整体并入本文。
[0389]
在其他实施方案中，靶向和/或穿透肽可以将效应子模块导向至细胞内的特定亚细胞位置。作为非限制性实例，效应子模块中可包括线粒体靶向肽和/或线粒体膜穿透肽，以将效应子模块驱动至细胞的线粒体。参见例如美国专利第9,260,495号；第9,173,952号和第9,132,198号；和美国申请公开号2015/361140；将各自的内容通过引用整体并入本文。
[0390]
靶向肽具有约6个至约30个(包括端值)中的任意数目的氨基酸。所述肽可具有6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29个或30个氨基酸。通常，靶向肽可具有25个或更少的氨基酸，例如20个或更少，例如15个或更少。
[0391]
识别特定组织或细胞的天然存在的小靶向和/或穿透肽以高亲和力结合细胞表面分子(例如，受体、跨膜蛋白)，这使得它们成为有吸引力的运输部分。这样的肽可包括来自微生物、昆虫(例如，蝎子、蜜蜂、蜘蛛)、动物(例如蛇)和植物的肽毒素及其类似物、变体和
衍生物；以及分泌的肽激素、配体和信号肽。
[0392]
在一些方面，来自天然毒素的消除其细胞毒活性的类似物、变体和衍生物可以用作靶向肽。外毒素是由细菌分泌的毒素。许多外毒素已经显示结合特定的细胞分子。例如，肠毒素，一组由细菌生物产生和分泌的蛋白质毒素，其结合肠壁的粘膜(上皮)细胞。肠毒素可包括但不限于大肠杆菌热稳定肠毒素(st)、霍乱毒素(ct)、大肠杆菌不耐热肠毒素(lt)、百日咳博德特菌来源的百日咳毒素(pt)、铜绿假单胞菌外毒素a(eta)、葡萄球菌肠毒素、白喉棒状杆菌来源的白喉毒素、来自轮状病毒属的肠毒素nsp4。其他外毒素包括影响神经系统的神经毒素、影响心脏的心脏毒素、假单胞菌外毒素、肉毒神经毒素、志贺毒素、志贺样毒素1和2、艰难梭菌毒素、产气荚膜梭菌ε毒素和炭疽毒素。
[0393]
除外毒素外，其他毒素可包括从植物中分离的毒素，比如玉米rip、白树毒素(gelonin)、美洲商陆抗病毒蛋白、肥皂草素、天花粉蛋白(trichsanthin)、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白；蝎子，比如蝎毒素；蜘蛛，比如pctxl；鸡心螺，比如pctxl；海葵，比如海葵溶细胞素1；蜜蜂，比如蜂毒素，一组水溶性的、阳离子的、两亲性的26个氨基酸的α-螺旋肽，从蜜蜂的毒液中分离，所述蜜蜂为蜜蜂(apis mellifera)(西方蜜蜂或欧洲蜜蜂或大蜜蜂)、小蜜蜂(apisflorea)(小蜜蜂或矮蜜蜂)、大蜜蜂(apis dorsata)(巨型蜜蜂)和东方蜜蜂(apis cerana)(东方蜜蜂)；蛇毒素；铃蟾肽，最初从蟾蜍皮分离，结合胃肠道和大脑中的g蛋白偶联胃泌素释放肽受体(比如bbr-1/2/3)。参见，例如suchanek，g.等人，pnas(1978)75：701-704；将其内容通过引用整体并入本文。
[0394]
肽激素和其他信号肽传递细胞间通讯的重要信息，其选择性地结合以高亲和力表达其受体的细胞。在一些方面，效应子模块中可包括肽激素。这样的小肽激素和信号肽可包括但不限于脂联素、脂肪来源的激素、刺鼠信号肽、咽侧体抑制素、胰淀素(amylin)、血管紧张素、心房利钠肽、蛙皮素(bomben)样肽、大胃泌素、促胰岛生长素(betatrophin)、缓激肽、降钙素、促肾上腺皮质激素释放激素、替可克肽(cosyntrophin)、内皮素、肠高血糖素、fgf、fndc5、卵泡刺激素、胃泌素、饥饿素(ghrelin)、胰高血糖素和胰高血糖素样肽、促性腺激素、粒细胞集落刺激因子、生长激素、生长激素释放激素铁调素(hepcidin)、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳素、肠降血糖素(incretin)、胰岛素和胰岛素类似物、胰岛素样生长因子、瘦素、小胃泌素、利拉鲁肽、促黄体生成素、黑皮质素、小促胃液素、α-黑素细胞刺激素、神经肽y、神经生长因子(ngf)、神经营养因子-3/4、nph胰岛素、食欲素、肥胖抑制素、骨钙素、胰腺激素、甲状旁腺激素、肽激素、肽yy、催乳素、前激素原、松弛素(relaxi)、肾素、鲑鱼降钙素(salcatonin)、生长抑素(sst)、分泌素、p物质、辛卡利特、硬骨鱼瘦素(teleost leptin)、牛蛙抗菌肽(temporin)、替莫瑞林(tesamorelin)、促甲状腺激素、尿皮质素(urocortin)、血管活性肠肽(vip)、vgf和卵黄蛋白原。
[0395]
靶向和穿透肽也可以是工程化仿生肽和/或化学修饰的小肽。鉴定了许多具有特定基序和序列的肽，所述肽在正常或疾病条件下以高亲和力和选择性靶向特定的细胞和组织。合成靶向肽的长度可达30个氨基酸或更长。靶向肽通常具有至少约5个氨基酸，但是可具有更少的氨基酸，例如4个氨基酸或3个氨基酸。通常，靶向肽具有约6个至约30个(包括端值)中的任意数目的氨基酸。所述肽可具有6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29个或30个氨基酸。通常，靶向肽可具有25个或更少的氨基酸，例如20个或更少，例如15个或更少。
[0396]
也可以利用来自天然存在的蛋白质和人工氨基酸序列的融合氨基酸合成嵌合肽。
[0397]
刺激
[0398]
用一种或多种刺激触发本公开的生物回路。刺激包括配体、外部添加的或内源的代谢物、确定的配体的存在或不存在、一个或多个效应子模块的存在或作用、或离子或生物分子的浓度梯度等。
[0399]
配体
[0400]
在一些实施方案中，刺激是配体。配体可以是基于核酸的、基于蛋白质的、基于脂质的、有机的、无机的或前述项的任何组合。
[0401]
在一些实施方案中，配体可以是但不限于蛋白质、肽、核酸、脂质、脂质衍生物、固醇、类固醇、代谢物、代谢物衍生物和小分子。
[0402]
在一些实施方案中，刺激是小分子。在一些实施方案中，小分子是细胞可渗透的。在一些实施方案中，小分子是fda批准的、安全的和口服施用的。
[0403]
在一些实施方案中，配体与碳酸酐酶结合。在一些实施方案中，配体结合并抑制碳酸酐酶功能，并且在本文中称为碳酸酐酶抑制剂。
[0404]
在一些实施方案中，配体是与碳酸酐酶2结合的小分子。在一个实施方案中，小分子是ca2抑制剂。ca2抑制剂的实例包括但不限于塞来昔布(也称为西乐葆)、伐地昔布、罗非昔布、乙酰唑胺、醋甲唑胺、多佐胺、布林佐胺、双氯非那胺、依索唑胺、唑尼沙胺、丹磺酰胺和二氯苯磺胺。
[0405]
在一些实施方案中，配体可包含已知介导与ca2结合的小分子的部分。也可以将配体修饰为减少与除ca2以外的碳酸酐酶的脱靶结合，并且增加与ca2的特异性结合。
[0406]
也可以通过结构活性关系(sar)研究，根据已知ca2配体的活性对其分子/化学结构的依赖性的分析来选择配体。可以利用本领域已知的任何与sar相关的方法来鉴定本公开的稳定配体。可以利用sar来改善配体的特性，比如特异性、效力、药代动力学、生物利用度和安全性。也可以将已知的ca2抑制剂的sar分析与复合有配体的ca2的高分辨率x射线结构相结合。
[0407]
在一个实施方案中，本公开的刺激可以是fda批准的能够与特定的dd或dd内的靶区域结合的配体。
[0408]
在一些实施方案中，可以优选地选择在不存在sre的情况下不影响免疫细胞和/或嵌合抗原受体的活性的配体。
[0409]
在一些实施方案中，可以利用两种或更多种配体来稳定同一种刺激响应元件。
[0410]
配体缀合物
[0411]
在一些实施方案中，配体可以与另一种分子复合或结合，所述另一种分子例如但不限于另一种配体、蛋白质、肽、核酸、脂质、脂质衍生物、固醇、类固醇、代谢物、代谢物衍生物或小分子。在一些实施方案中，配体刺激与一种或多种其他分子复合或结合。在一些实施方案中，配体刺激与一种或多种不同种类和/或数量的其他分子复合或结合。在一些实施方案中，配体刺激是同一种配体的多聚体。在一些实施方案中，配体刺激多聚体包含2个、3个、4个、5个、6个或更多个单体。
[0412]
可以测试配体(比如众所周知结合候选蛋白质的小分子)在蛋白质响应中的调节作用。临床上证明小分子可能是安全的，并且具有适当的药物动力学和分布。在一些实施方
案中，刺激是去稳定结构域(dd)的配体，例如，结合去稳定结构域并且使与去稳定结构域融合的poi稳定的小分子。
[0413]
在一些实施方案中，刺激是小分子。在一些实施方案中，小分子是细胞可渗透的。
[0414]
嵌入的刺激、信号或其他调节部分
[0415]
在一些实施方案中，本公开的效应子模块可还包含一个或多个微小rna、微小rna结合位点、启动子和可调元件。
[0416]
微小rna
[0417]
在一个实施方案中，微小rna可用于支持可调生物回路的创建。每个方面或调节的方式可以给效应子模块或生物回路带来不同调节的特征。例如，去稳定结构域可改变有效负载的切割位点或二聚化特性或半衰期，并且包括一个或多个微小rna或微小rna结合位点可赋予细胞去靶向或运输特征。因而，本公开包括在其可维持性方面为多因素的生物回路。这样的生物回路和效应子模块可被工程改造为含有一个、两个、三个、四个或更多个调节特征。
[0418]
微小rna(或mirna)是19-25个核苷酸长的非编码rna，其与核酸分子的3’utr结合，并且通过降低核酸分子稳定性或抑制翻译来下调基因表达。本公开的多核苷酸可包含一个或多个微小rna靶序列、微小rna序列或微小rna种子。
[0419]
例如，如果不意图将多核苷酸递送至肝脏，但是最终到达肝脏，那么肝脏中丰富的mir-122(一种微小rna)可以抑制多核苷酸的表达，条件是将mir-122的一个或多个靶位点工程改造到多核苷酸中。可以设计不同微小rna的一个或多个结合位点的引入，以进一步降低多核苷酸的寿命、稳定性和蛋白质翻译，因此提供除了刺激选择、sre设计和有效负载变化之外的另外的可维持层次。
[0420]
如本文所用的，术语“微小rna位点”是指微小rna靶位点或微小rna识别位点，或与微小rna结合或缔合的任何核苷酸序列。应当理解的是，“结合”可以遵循传统的沃森-克里克(watson-crick)杂交规则，或者可以反映微小rna与位于或邻近微小rna位点的靶序列的任何稳定缔合。
[0421]
相反，出于本公开的多核苷酸的目的，为了增加特定组织中的蛋白质表达，可以将微小rna结合位点从它们天然存在的序列中工程改造除去(即，从中去除)。例如，可以去除mir-122结合位点来改善肝脏中的蛋白质表达。
[0422]
通过引入或去除一个或几个微小rna结合位点，可以完成在多种组织中的表达的调节。
[0423]
具体而言，已知微小rna在免疫细胞(也称为造血细胞)中有差异地表达，所述免疫细胞比如抗原呈递细胞(apc)(例如树突细胞和巨噬细胞)、巨噬细胞、单核细胞、b淋巴细胞、t淋巴细胞、粒细胞、自然杀伤细胞等。免疫细胞特异性微小rna涉及免疫原性、自身免疫、对感染的免疫响应、炎症以及在基因疗法和组织/器官移植之后不需要的免疫响应。免疫细胞特异性微小rna还调节造血细胞(免疫细胞)的发育、增殖、分化和凋亡的许多方面。例如，mir-142和mir-146仅在免疫细胞中表达，特别是在髓样树突细胞中大量表达。将mir-142结合位点引入本公开的多肽的3
’‑
utr可以通过mir-142介导的mrna降解而选择性地抑制抗原呈递细胞中的基因表达，限制专职apc(例如树突细胞)中的抗原呈递，从而防止基因递送之后的抗原介导的免疫响应(参见，annoni a等人，blood，2009，114，5152-5161，将其
内容通过引用整体并入本文。)
[0424]
在一个实施方案中，可以将已知在免疫细胞特别是抗原呈递细胞中表达的微小rna结合位点工程改造到多核苷酸中，以便通过微小rna介导的rna降解来抑制多核苷酸在apc中的表达，减弱抗原介导的免疫响应，同时在不表达免疫细胞特异性微小rna的非免疫细胞中保持多核苷酸的表达。
[0425]
已经进行了许多微小rna表达研究，并且在本领域中进行了描述，以便描绘微小rna在各种癌细胞/组织和其他疾病中的差异表达。一些微小rna在某些癌细胞中异常过表达，而另一些则表达不足。例如，微小rna在下列情况有差异地表达：癌细胞(wo2008/154098、us2013/0059015、us2013/0042333、wo2011/157294)；癌症干细胞(us2012/0053224)；胰腺癌和疾病(us2009/0131348、us2011/0171646、us2010/0286232、us8389210)；哮喘和炎症(us8415096)；前列腺癌(us2013/0053264)；肝细胞癌(wo2012/151212、us2012/0329672、wo2008/054828、us8252538)；肺癌细胞(wo2011/076143、wo2013/033640、wo2009/070653、us2010/0323357)；皮肤t细胞淋巴瘤(wo2013/011378)；结直肠癌细胞(wo2011/0281756、wo2011/076142)；癌症阳性淋巴结(wo2009/100430、us2009/0263803)；鼻咽癌(ep2112235)；慢性阻塞性肺疾病(us2012/0264626、us2013/0053263)；甲状腺癌(wo2013/066678)；卵巢癌细胞(us2012/0309645、wo2011/095623)；乳腺癌细胞(wo2008/154098、wo2007/081740、us2012/0214699)；白血病和淋巴瘤(wo2008/073915、us2009/0092974、us2012/0316081、us2012/0283310、wo2010/018563；将各自的内容通过引用整体并入本文)。
[0426]
在一个实施方案中，如本文所述，微小rna可用于支持可调生物回路的创建。
[0427]
在一些实施方案中，可以将效应子模块设计成编码(作为dna或rna或mrna)一个或多个有效负载、sre和/或调控序列，比如微小rna或微小rna结合位点。在一些实施方案中，任何编码的有效负载或sre可以通过突变而被稳定或去稳定，然后与一个或多个调控序列结合，从而产生双重或多重调节的效应子模块或生物回路系统。
[0428]
每个方面或调节的方式可以给效应子模块或生物回路带来不同调节的特征。例如，sre可以代表去稳定结构域，而在蛋白质有效负载中的突变可改变其切割位点或二聚化特性或半衰期，并且包括一个或多个微小rna或微小rna结合位点可赋予细胞靶向或运输特征。因而，本公开包括在其可维持性方面为多因素的生物回路。
[0429]
这样的生物回路可被工程改造为含有一个、两个、三个、四个或更多个调节特征。
[0430]
启动子
[0431]
在一些实施方案中，本公开的组合物包含启动子。
[0432]
如本文所用的，将启动子定义为由细胞的转录机器识别的、启动本公开的多核苷酸序列的特异性转录需要的dna序列。载体可包含与本公开的多核苷酸可操作连接的天然或非天然启动子。选择的启动子可以是强启动子、弱启动子、组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、发育阶段特异性启动子和/或生物特异性启动子。适合的启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(cmv)启动子，例如但不限于seq id no：210476-210478。此启动子序列是强的组成型启动子序列，能够驱动与其可操作连接的多核苷酸序列的高水平表达。启动子的另一个实例是延伸生长因子-1α(ef-1α)，例如但不限于，seq id no：210479-210483。也可以使用其他组成型启动子，包括但不限于猿猴病毒40(sv40)、小鼠乳腺肿瘤病
毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒病毒(hiv)、长末端重复序列(ltr)、启动子、禽白血病病毒启动子、eb病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，包括但不限于磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子(非限制性实例包括seq id no∶210484-210491)、肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子、泛素c(ubc)启动子、人u6小核蛋白启动子和肌酸激酶启动子。在一些情况下，可以使用诱导型启动子，例如但不限于，金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
[0433]
在一些实施方案中，基于在不存在配体的情况下实现本公开的sre和有效负载的的最小表达的能力以及在存在配体的情况下的可检测表达，可以选择最佳启动子。
[0434]
可以使用另外的启动子元件例如增强子来调节转录起始的频率。这样的区域可以位于起始位点上游或下游10-100个碱基对。在一些情况下，可以使用两个或更多个启动子元件来协作地或独立地活化转录。
[0435]
在一些实施方案中，本公开的启动子可以是tet-on启动子。转录调控tet系统与dd的结合允许同时控制基因表达和蛋白质稳定性。由pedone等人(2018)doi：https：//doi.org/10.1101/404699描述的任何双重tet on-dd系统可以在本公开中使用(将其内容通过引用整体并入本文。)
[0436]
其他调控特征
[0437]
在一些实施方案中，本公开的组合物可以包括任选的蛋白酶体衔接子。如本文所用的，术语“蛋白酶体衔接子”是指靶向附加的有效负载以便降解的任何核苷酸/氨基酸序列。在一些方面，衔接子直接靶向有效负载以便降解，从而规避对泛素化反应的需要。蛋白酶体衔接子可以与去稳定结构域结合使用，以降低有效负载的基础表达。示例性的蛋白酶体衔接子包括rad23或hhr23b、hpv e7的ubl结构域，其以高亲和力与靶蛋白rb和蛋白酶体的s4亚单位结合，这允许直接的蛋白酶体靶向，从而绕过泛素化机器；与rb和蛋白酶体亚单位s6结合的蛋白质癌性锚蛋白重复序列(gankyrin)。
[0438]
示例性效应子模块构建体
[0439]
本公开的生物回路可包含至少一个效应子模块，所述效应子模块可包含至少一个来源于ca2的sre(称为“ca2 sre”)，其可与至少一个感兴趣的有效负载可操作连接。这些类型的生物回路和效应子模块称为“ca2生物回路”和“ca2效应子模块”。另外，ca2效应子模块可包含另外的特征，包括但不限于，信号序列、接头、间隔物、标签、标志、切割位点和ires。本文教导的或本领域已知的任何示例性sre(例如，dd)、感兴趣的有效负载、信号序列、接头、间隔物、标签、标志、切割位点和ires可以组合，以产生本公开的ca2效应子模块。
[0440]
感兴趣的有效负载
[0441]
在一个实施方案中，ca2效应子模块包含感兴趣的有效负载。感兴趣的有效负载可以是野生型多肽、野生型多肽的片段和/或包含相对于野生型多肽的一个或多个突变。
[0442]
在一个实施方案中，ca2效应子模块产生调节的白细胞介素-15(il15)。
[0443]
在一个实施方案中，ca2效应子模块产生调节的白细胞介素-15受体亚单位α(il15ra)。
[0444]
在一个实施方案中，ca2效应子模块产生调节的荧光蛋白。在一个实施方案中，ca2效应子模块中的至少一个有效负载是mcherry蛋白。在一个实施方案中，ca2效应子模块中的至少一个有效负载是海肾萤光素酶野生型序列(seq id no：210643，由seq id no：
210644编码)。在一个实施方案中，ca2效应子模块中的至少一个有效负载是海肾萤光素酶序列。在一个实施方案中，ca2效应子模块中的至少一个有效负载是萤火虫萤光素酶序列。在一个实施方案中，ca2效应子模块中的至少一个有效负载是萤火虫萤光素酶序列的区域。在一个实施方案中，ca2效应子模块中的至少一个有效负载是东海墨绿多管水母gfp(acgfp)序列。在一个实施方案中，ca2效应子模块中的至少一个有效负载是acgfp序列的区域。
[0445]
在一个实施方案中，ca2效应子模块产生调节的cd19 scfv。ca2效应子模块可包括来自另一种亲本蛋白的跨膜结构域和/或细胞质结构域的有效负载以及cd19 scfv有效负载。在一个实施方案中，与野生型序列相比，ca2效应子模块中的至少一个有效负载包括至少一个突变。
[0446]
在一个实施方案中，ca2效应子模块产生调节的car。
[0447]
在一些方面，本文所述的有效负载可以与嵌合抗原受体共表达。
[0448]
在一个实施方案中，ca2效应子模块产生调节的白细胞介素-12(il12)。
[0449]
在一个实施方案中，效应子模块产生调节的
[0450]
本公开的ca2生物回路和/或ca2效应子模块可以是单顺反子或多顺反子的，表示产生了一个(单顺反子)或多于一个(多顺反子)信息(例如，感兴趣的有效负载)。如果产生了两条信息，那么ca2生物回路或ca2效应子模块被认为是双顺反子的。
[0451]
在一个实施方案中，本公开的至少一个ca2效应子模块是单顺反子的。
[0452]
在一个实施方案中，本公开的至少一个ca2效应子模块是多顺反子的。
[0453]
在一个实施方案中，本公开的至少一个ca2效应子模块是双顺反子的。
[0454]
在一个实施方案中，本公开的ca2生物回路是单顺反子的。
[0455]
在一个实施方案中，本公开的ca2生物回路是多顺反子的。
[0456]
在一个实施方案中，本公开的ca2生物回路是双顺反子的。
[0457]
ca2 gfp效应子模块
[0458]
在一个实施方案中，ca2 dd通过融合构建体的n末端或c末端的接头序列与acgfp融合。这些被称为“ca2 gfp效应子模块。”可以通过诸如蛋白质印迹法和facs的方法来评价融合蛋白的去稳定特性和配体依赖性稳定特性。表8提供了与gfp融合的ca2突变体的实例。可将构建体克隆到本领域已知的任何载体中，例如但不限于plvx.ires.puro载体。在表8中，星号指示终止密码子的翻译。
[0459]
表8：ca2 gfp构建体
[0460]
[0461]
[0462]
[0463]
[0464]
[0465]
[0466]
[0467][0468]
表9提供了与gfp融合的ca2突变体的另外的实例。可将构建体克隆到本领域已知的任何载体例如但不限于plvx.ires.puro载体中。
[0469]
[0470]
[0471]
[0472]
[0473]
[0474]
[0475]
[0476]
[0477]
[0478]
[0479]
[0480]
[0481]
[0482]
[0483]
[0484]
[0485][0486]
ca2 car和ca2il15效应子模块
[0487]
在一个实施方案中，可以将本文所述的ca2 dd附加至一个或多个感兴趣的car有
效负载。这些被称为“ca2 car效应子模块。”表10提供了ca2 car构建体。
[0488]
表10：ca2 car和ca2il15构建体
[0489][0490]
表11提供了另外的ca2 car构建体。
[0491]
表11：ca2car
[0492]
[0493]
[0494][0495]
ca2 cd40l效应子模块
[0496]
在一些实施方案中，可将本文所述的ca2 dd附加至cd40l。表13提供了附加至cd40l的示例性ca2 dd。表12提供了制备表13中列出的调节的cd40l ca2构建体的构建体组分。在表13中，“*”代表终止密码子的翻译。
[0497]
表12.ca2 cd40l构建体组分
[0498][0499]
表13.ca2 cd40l构建体
[0500][0501]
具有car效应子模块的ca2 mbil12
[0502]
在一些实施方案中，可将本文所述的ca2 dd附加至膜结合il12(本文称为“mbil12”)。表15提供了附加至mbil12有效负载的ca2 dd。表15中提供了这样的效应子模块，其可进一步与本文所述的任何car可操作连接，其中膜结合il12构建体与cd19 car串联。本文所述的任何dd可与表14中的构建体组分结合，以制备表15中列出的调节的膜结合il12构建体。在表15中，“*”代表终止密码子的翻译
[0503]
表14.具有car构建体组分的ca2 mbil2
[0504]
[0505][0506]
表15.具有car构建体的ca2 mbil2
[0507]
[0508]
[0509]
[0510][0511]
ii.药物组合物和制剂
[0512]
本教导还包括药物组合物，其包含本公开的刺激、ca2生物回路、ca2效应子模块或系统中的一者或多者以及任选的至少一种药学上可接受的赋形剂或惰性成分。
[0513]
如本文所用的，术语“药物组合物”是指本文所述的ca2生物回路或组分中的一者或多者或其药学上可接受的盐的制剂，任选地具有其他化学组分，比如生理学上适合的载体和赋形剂。
[0514]
术语“赋形剂”或“非活性成分”是指添加到药物组合物中以进一步促进化合物施用的惰性或非活性物质。这样的惰性成分的非限制性实例在本文的制剂下公开。
[0515]
在一些实施方案中，将组合物施用于人、人患者或受试者。出于本公开的目的，短
语“活性成分”通常是指如本文所述待递送的任何一种或多种ca2生物回路组分。
[0516]
虽然本文提供的药物组合物的描述主要针对适合于施用于人的药物组合物，但本领域技术人员将理解，这样的组合物通常适合于施用于任何其他动物，例如非人动物，例如非人哺乳动物。预期施用药物组合物的受试者包括但不限于非人哺乳动物，包括农业动物，比如牛、马、鸡和猪；家畜，比如猫、狗；或研究动物，比如小鼠、大鼠、兔、狗和非人灵长类动物。
[0517]
根据本公开的药物组合物可以作为单个单位剂量和/或多个单个单位剂量来制备、包装和/或批量销售。如本文所用的，“单位剂量”是包含预定量活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将施用于受试者的活性成分的剂量和/或这样的剂量的方便部分，例如这样的剂量的一半或三分之一。
[0518]
在根据本公开的药物组合物中，活性成分、药学上可接受的赋形剂或惰性成分和/或任何另外的成分的相对量将变化，这取决于被治疗受试者的身份、大小和/或状况，并进一步取决于组合物的施用途径。举例来说，组合物可包含0.1％至100％之间，例如0.5％至50％之间、1％-30％之间、5％-80％之间、至少80％(w/w)的活性成分。
[0519]
通过例如测量疾病进展、疾病缓解、症状严重程度、疼痛减轻、生活质量、维持治疗作用所需的药物剂量、疾病标志物水平或任何其他对于正在治疗或作为预防目标的给定疾病适当的可测量参数，可以评估治疗效果或疾病改善。通过测量这些参数中的任何一个或参数的任何组合来监测治疗或预防的效果，完全在本领域技术人员的能力之内。关于本发明组合物的施用，例如对于癌症“有效”，表示以临床上适当的方式施用对至少统计学上显著比例的患者产生有益效果，比如症状的改善、治愈、疾病负荷的降低、肿瘤质量或细胞数量的降低、寿命的延长、生活质量的改善或熟悉治疗特定类型癌症的医生通常认为是积极的其他效果。
[0520]
当在疾病状态的一个或多个参数方面存在统计学上显著的改善时，或者通过使得否则会被预期的症状免于恶化或发生，治疗或预防效果是明显的。作为实例，在疾病的可测量参数方面的至少10％，并且优选至少20％、30％、40％、50％或更多的有利改变，可以指示有效治疗。也可以使用如本领域已知的给定疾病的实验动物模型，判定本公开的给定组合物或制剂的效果。当使用实验动物模型时，当观察到统计学上显著的变化时治疗效果是明显的。
[0521]
制剂
[0522]
可以将本公开的组合物配制成任何适合于递送的方式。制剂可以是但不限于纳米颗粒、聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)微球、类脂质、脂质复合物、脂质体、聚合物、碳水化合物(包括单糖)、阳离子脂质及其组合。
[0523]
在一个实施方案中，制剂是可包含至少一种脂质的纳米颗粒。脂质可以选自，但不限于，dlin-dma、dlin-k-dma、98n12-5、c12-200、dlin-mc3-dma、dlin-kc2-dma、dodma、plga、peg、peg-dmg和聚乙二醇化脂质。在另一个方面，脂质可以是阳离子脂质，例如但不限于dlin-dma、dlin-d-dma、dlin-mc3-dma、dlin-kc2-dma和dodma。
[0524]
对于本公开的多核苷酸，制剂可以选自例如国际申请pct/us2012/069610中教导的任何制剂，将其内容通过引用整体并入本文。
[0525]
非活性成分
[0526]
在一些实施方案中，药物或其他制剂可包含至少一种赋形剂，其为非活性成分。如本文所用的，术语“非活性成分”是指制剂中包含的一种或多种非活性剂。在一些实施方案中，全部、没有一种或一些可以用于本公开的制剂中的非活性成分可获得美国食品药品监督管理局(fda)批准。
[0527]
iii.给药、递送和施用
[0528]
本公开的组合物可以通过一种或多种途径和模式递送至细胞或受试者。可以使用含有本文所述的一个或多个ca2生物回路、ca2效应子模块、sre、有效负载和其他组分的病毒载体将它们递送至细胞和/或受试者。也可以使用其他模式，比如mrna、质粒和重组蛋白。
[0529]
递送
[0530]
裸递送
[0531]
可以裸形式将本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)递送至细胞、组织、器官和/或生物体。如本文所用的，术语“裸”是指将药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)在没有促进转染或通透性的剂或修饰的情况下进行递送。可以使用本领域已知的和本文所述的施用途径将裸的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)递送至细胞、组织、器官和/或生物体。在一些实施方案中，裸递送可以包括在简单缓冲液比如盐水或pbs中的制剂。
[0532]
配制递送
[0533]
在一些实施方案中，可以使用本文所述的方法配制本文公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)。制剂可包含药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的可以是修饰和/或未修饰的sre或有效负载)。制剂还包括但不限于细胞渗透剂、药学上可接受的载体、递送剂、生物蚀解或生物相容性聚合物、溶剂和/或持续释放递送储库。可以使用本领域已知的和本文所述的施用途径将本公开的制剂递送至细胞。
[0534]
还可以将药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)配制成以本领域的几种方式中的任何一种直接递送至器官或组织，所述方式包括但不限于直接浸泡或沐浴，经由导管，通过凝胶、粉末、软膏、乳膏、凝胶、洗剂和/或滴剂，通过使用基底(比如涂覆或浸渍有组合物的织物或可生物降解材料)，等。
[0535]
递送至细胞
[0536]
在本公开的另一方面，可以将编码本公开的ca2生物回路、ca2效应子模块、sre(例如ca2 dd)、感兴趣的有效负载(例如免疫治疗剂)和组合物的多核苷酸以及包含所述多核苷酸的载体引入细胞中。作为非限制性实例，细胞可以是效应免疫细胞。
[0537]
在本公开的一个方面，可以将编码本公开的ca2生物回路、ca2效应子模块、sre(例如ca2 dd)、感兴趣的有效负载(例如免疫治疗剂)和组合物的多核苷酸包装到病毒载体中或整合到病毒基因组中，从而允许多核苷酸的瞬时或稳定表达。优选的病毒载体是逆转录病毒载体，包括慢病毒载体。为了构建逆转录病毒载体，将编码ca2生物回路、ca2效应子模块、ca2 dd或感兴趣的有效负载(例如，免疫治疗剂)的多核苷酸分子插入到病毒基因组中代替某些病毒序列，从而产生复制缺陷的病毒。然后将重组病毒载体引入含有gag、pol和env基因但不含ltr和包装组分的包装细胞系中。重组逆转录病毒颗粒分泌到培养基中，然
后收集，任选地浓缩，并用于基因转移。慢病毒载体是特别优选的，因为它们能够感染分裂细胞和非分裂细胞两者。
[0538]
通过物理方法，比如针、电穿孔、声穿孔、加氢穿孔(hyrdoporation)等；化学载体，比如无机颗粒(例如磷酸钙、二氧化硅、金)和/或化学方法，也可以通过非病毒方法将载体转移到细胞中。在一些实施方案中，合成的或天然的可生物降解剂可用于递送，例如阳离子脂质、脂质纳米乳液、纳米颗粒、肽基载体或基于聚合物的载体。
[0539]
在一些实施方案中，可将本公开的多肽直接递送至细胞。在一个实施方案中，可以使用合成肽递送本公开的多肽，所述合成肽包含与细胞穿透结构域(cld)融合的内体渗漏结构域(eld)。将本公开的多肽与eld-cld-合成肽共同引入细胞中。eld有助于截留在内体中的蛋白质逃逸到胞质溶胶中。这样的结构域是微生物和病毒来源的衍生蛋白质，并且在本领域中已有描述。cpd允许蛋白质穿过质膜转运，并且在本领域中也有描述。与单独用任一结构域的共转导相比，eld-cld融合蛋白协同提高了转导效率。在一些实施方案中，可以任选地将富含组氨酸的结构域添加到穿梭构建体中，作为允许货物从内体逃逸到胞质溶胶中的附加方法。穿梭构建体还可以在n或c末端包含半胱氨酸残基，以生成融合肽的多聚体。与单一融合肽构建体相比，通过在肽末端添加半胱氨酸残基而生成的eld-cld融合肽的多聚体显示出更高的转导效率。还可以将本公开的多肽附加至适当的定位信号，以将货物导向至适当的亚细胞位置，例如细胞核。在一些实施方案中，在国际专利公开wo2016161516和wo2017175072中教导的eld、cld或融合eld-cld合成肽中的任何一种可用于本公开中(将各自的内容通过引用整体并入本文)。
[0540]
递送模式和/或载体
[0541]
可以使用一种或多种模式来递送本公开的ca2生物回路系统、ca2效应子模块、sre和/或有效负载。本公开还提供了包装本公开的编码ca2生物回路、ca2效应子模块、sre(例如ca2 dd)和感兴趣的有效负载及其组合的多核苷酸的载体。本公开的载体也可用于将包装的多核苷酸递送至细胞、局部组织部位或受试者。这些载体可以是任何种类的，包括dna载体、rna载体、质粒、病毒载体和颗粒。病毒载体技术是熟知的并且描述于sambrook等人(2001，molecular cloning：a laboratory manual，cold spring harbor laboratory，new york)。可用作载体的病毒包括但不限于慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体、单纯疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、溶瘤病毒，等。
[0542]
一般而言，载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列和方便的限制性内切酶位点，以及一个或多个选择标记，例如耐药基因。
[0543]
在一些实施方案中，重组表达载体可包含调控序列，比如转录和翻译起始和终止密码子，其对载体将要引入其中的宿主细胞的类型是特异的。
[0544]
在一些实施方案中，本公开的载体可包含本文教导的一个或多个有效负载，其中两个或更多个有效负载可以被包括在一个ca2效应子模块中。在这种情况下，两个或更多个有效负载同时受到同一种刺激的调节。在其他实施方案中，本公开的载体可包含两个或更多个ca2效应子模块，其中每个ca2效应子模块包含不同的有效负载。在这种情况下，两个或更多个ca2效应子模块和有效负载受到不同刺激的调节，从而分别提供两个或多个组分的独立调节。在其他实施方案中，本公开的载体可包含一个或多个ca2效应子模块和一个或多个非ca2效应子模块，其中每个ca2效应子模块包含不同的有效负载。在这种情况下，ca2效
stomatitis indiana virus(vsiv))和水泡性口炎新泽西病毒(vesicular stomatitis new jersey virus(vsnjv))和/或暂时归类在水疱病毒属中的毒株，其为草鲡弹状病毒(grass carp rhabdovirus)、bean 157575病毒(bean 157575)、博特克病毒(boteke virus(btkv))、卡尔查基病毒(calchaqui virus(cqiv))、美洲鳗病毒(eel virus american(eva))、格雷洛奇病毒(gray lodge virus(glov))、朱罗纳病毒(durona virus(jury))、克拉马斯病毒(klamath virus(klav))、克瓦塔病毒(kwatta virus(kwav))、拉霍亚病毒(lajoya virus(ljv))、马尔佩斯泉病毒(malpais spring virus(mspv))、茫特埃尔贡蝙蝠病毒(mount elgon bat virus(mebv))、佩里内特病毒(perinet virus(perv))、梭子鱼苗弹状病毒(pike fry rhabdovirus(pfrv))、波登病毒(porton virus(porv))、拉迪病毒(radi virus(radiv))、鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus(svcv))、图帕伊阿病毒(tupaia virus(tupv))、溃疡病弹状病毒(ulcerative disease rhabdovirus(udrv))和尤格波格丹诺夫奇病毒(yug bogdanovac virus(ybv))。gp64或其他杆状病毒env蛋白可以来源于苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(autographa californica nucleopolyhedrovirus(acmnpv))、芹菜夜蛾核型多角体病毒(anagraphafalcifera nuclear polyhedrosis virus)、家蚕核型多角体病毒(bombyx mori nuclear polyhedrosis virus)、云杉卷叶蛾核型多角体病毒(choristoneurafiimiferana nucleopolyhedrovirus)、黄杉毒蛾单核衣壳核型多角体病毒(orgyia pseudotsugata single capsid nuclear polyhedrosis virus)、苹浅褐卷蛾核型多角体病毒(epiphyas postvittana nucleopolyhedrovirus)、美国白蛾核型多角体病毒(hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus)、大蜡螟核型多角体病毒(galleria mellonella nuclear polyhedrosis virus)、多理病毒(dhori virus)、托高土病毒(thogoto virus)、柞蚕核型多角体病毒(antheraea pemyi nucleopolyhedrovius)或巴特肯病毒(batken virus)。
[0552]
在慢病毒颗粒中提供的其他元件可包括位于5’或3’末端的逆转录病毒ltr(长末端重复序列)、逆转录病毒输出元件、任选的慢病毒逆向响应元件(rre)、其启动子或活性部分以及基因座控制区(lcr)或活性部分。ca2效应子模块与载体连接。
[0553]
本领域讨论了生成重组慢病毒颗粒的方法，例如美国专利第8,846,385号；第7,745,179号；第7,629,153号；第7,575,924号；第7,179,903号；和第6,808,905号；将各自的内容通过引用整体并入本文。
[0554]
使用的慢病毒载体可以选自但不限于plvx、plenti、plenti6、pljml、fugw、pwpxl、pwpi、plenti cmv puro dest、pljm1-egfp、pultra、pinducer20、phiv-egfp、pcw57.1、ptrpe、pelps、prrl和plionii。
[0555]
慢病毒媒介物是基于质粒或基于病毒的，并且是本领域已知的(参见美国专利第9,260,725号；第9,068,199号；第9,023,646号；第8,900,858号；第8,748,169号；第8,709,799号；第8,420,104号；第8,329,462号；第8,076,106号；第6,013,516号；和第5,994,136号；将各自的内容通过引用整体并入本文)。
[0556]
慢病毒载体和细胞工程
[0557]
慢病毒载体用于将转基因引入t细胞(例如原代人t细胞或jurkat细胞)中进行临床前研究和临床应用，包括最近批准的产品，比如用于复发/难治性b细胞淋巴瘤的替沙仑赛(tisagenlecleucel)vsv-g假型化的第三代慢病毒载体具有高滴度、
高转导效率和安全性，已成为t细胞工程的首选载体。虽然不希望受理论的束缚，但t细胞工程通常涉及通过cd3/cd28抗体活化t细胞，随后进行慢病毒转导，然后进行细胞扩增，可能持续5至30天(例如，9至14天或9至15天)。一般而言，慢病毒转基因整合可能需要超过7天才能在t细胞(例如原代人t细胞或jurkat细胞)中完全稳定。虽然更长的培养可以增加细胞数，但更长的培养也可以使t细胞表型改变为更分化的状态。因此，离体培养的持续时间会影响car t细胞的持久性和功效。例如，培养时间较短的细胞可能显示较低的分化表型，并且在临床前模型中高度有效。
[0558]
虽然不希望受理论的束缚，但t细胞分化的状态可以影响过继转移后t细胞的植入和持久性。ghassemi等人(reducing ex vivo culture improves the antileukemic activity of chimeric antigen receptor(car)t cells.cancer immunol res；6(9)sept.2018；将其内容通过引用整体并入本文)描述了原代人t细胞随时间的分化，并发现早期收获的car t细胞表现出增强的效应子功能和增殖，以及增强的体内效力和持久性。
[0559]
慢病毒动力学，例如在离体t细胞(例如原代人t细胞或jurkat细胞)中慢病毒引入的转基因的转导、整合和/或表达动力学，可以影响体内抗肿瘤响应的功效和持久性。一些类型的t细胞可产生不同的结果。例如，jurkat细胞系可能不提供像原代人t细胞那样的表达的动态范围。评价这些慢病毒动力学的方法是本领域已知的，并且在本文中进行了描述。
[0560]
在一些实施方案中，为了确定转基因表达动力学，可以将cd3/cd28活化的原代人t细胞用携带转基因的慢病毒(例如，受调控的转基因或组成型转基因，比如cd19 car、il12、荧光蛋白或本文所述的任何转基因(例如，有效负载))转导。可以通过本文所述和/或本领域已知的方法分析细胞的活力、病毒基因组整合(例如，通过使用定量pcr)、转录物水平(例如，通过使用定量rt-pcr)和转基因的细胞表面表达(如果适用的话)(例如，如果转基因是或包括cd19car，则可以评价cd19car的表面表达)。可以在转导前和/或转导后例如在转导后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或超过30天分析细胞。
[0561]
在一些实施方案中，可以在转导后用cd3/cd28珠再活化cd3/cd28活化的原代人t细胞。可以在转导后5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或超过30天再活化细胞。可以通过本文所述和/或本领域已知的方法分析细胞的活力、病毒基因组整合(例如，通过使用定量pcr)、转录物水平(例如，通过使用定量rt-pcr)、转基因的细胞表面表达(如果适用的话)(例如，如果转基因是或包括cd19car，则可以评价cd19 car的表面表达)、拷贝数和/或mrna水平。
[0562]
在一些实施方案中，用携带转基因的慢病毒转导的活化的原代人t细胞的细胞活力大于65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％。作为非限制性实例，细胞活力大于90％。作为非限制性实例，细胞活力大于85％。
[0563]
在一些实施方案中，用携带转基因的慢病毒转导的jurkat细胞的细胞活力大于65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％。作为非限制性实例，细胞活力大于90％。作为非限制性实例，细胞活力大于85％。
[0564]
在一些实施方案中，转基因到细胞基因组中的整合可以处于或高于饱和点。作为
非限制性示例，饱和点可以是每细胞3个拷贝。
[0565]
在一些实施方案中，转基因到基因组中的整合在评价的初始时间点可能是高的，然后在对于培养物的剩余部分变得稳定之前下降到较低的整合值。作为非限制性实例，在下降到每细胞2个拷贝之前的早期时间点，转基因到基因组中的整合可以达到每细胞20个拷贝，并且在整个剩余的培养中是稳定的。
[0566]
在一些实施方案中，可以评价t细胞的转导能力。可以按照预期达到饱和水平的剂量(例如，如果泊松分布是预期的，那么每个细胞应该含有足够的病毒拷贝)和超过饱和5倍的更高的慢病毒剂量，用含有转基因的慢病毒转导来自至少一个供体的t细胞。可以检测每细胞的拷贝数、细胞百分比和mfi(或转基因在培养基中的浓度)，以确定是否所有细胞都表达转基因。作为非限制性实例，可以用包含转基因的慢病毒转导来自两个不同供体的t细胞。转导可以具有两个剂量，饱和和5倍饱和，并且显示在转导后5-10天，所有组可达到或超过整合转基因的预期饱和水平和跨组的相似表达强度，但是不是所有细胞都表达转基因。并非所有的t细胞都具有相等的转导敏感性，甚至在来自同一供体时也如此。表达gfp的总细胞比例(高于检测阈值)可因供体、批次和/或病毒剂量而变化。来自单个供体的表达gfp的总细胞的百分比可以在70％至95％之间。
[0567]
在一些实施方案中，一定百分比的培养的t细胞(例如，原代人t细胞和/或jurkat细胞)可以表达转基因。表达转基因的培养t细胞的百分比可以是，但不限于，5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或大于99％。作为非限制性示例，百分比可大于70％。作为非限制性示例，百分比可大于75％。作为非限制性示例，百分比可大于80％。作为非限制性示例，百分比可大于85％。作为非限制性示例，百分比可大于90％。作为非限制性示例，百分比可大于95％。
[0568]
在一些实施方案中，培养物的mrna水平可能在研究期间下降。这种下降可能不仅限于特定的转基因，并且这种趋势可见于多个类别的表达的蛋白质中。为了增加mrna水平，在mrna水平从初始水平降低后，可将细胞再活化。可以在转导后5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或超过30天再活化细胞。
[0569]
在一些实施方案中，培养物的表面表达可能在研究期间下降。例如，表面表达可能在转导后第3至13天、第3至14天或第3至15天下降。为了增加表面表达，在表面表达从初始水平降低后，可将细胞再活化。可以在转导后5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或超过30天再活化细胞。
[0570]
在一些实施方案中，转基因是car，例如但不限于cd19 car。作为非限制性实例，car是cd19 car。在用cd19 car转导的细胞中，细胞活力可大于90％。在用cd19 car转导的细胞中，细胞活力可大于85％。如果细胞是用cd19 car转导的原代t细胞，那么活细胞数可能在减少之前的初始时间点上增加。如果细胞是用cd19 car转导的jurkat细胞，那么活细胞数可能增加至少10天。对于cd19 car转导的细胞，每细胞的拷贝数在初始时间点可能更高，然后在随后的时间点减少50％或更多。在研究过程中，cd19 car的细胞表面表达可能在10天期间(例如，第3天至第13天)从约20000car mfi降低至小于5000car mfi。在第15天再
刺激后，mfi可能增加到5000car mfi以上。在转导后3-13天，表达car的原代人t细胞的百分比可以在40％至60％之间。在转导后3-13天，表达car的jurkat细胞的百分比可以在30％至70％之间。在转导后的第3天和第6天之间，可以看到约20％的初始下降。t细胞的再刺激可以使car阳性细胞的百分比增加恢复到初始百分比水平(例如，大约60％)。
[0571]
在一些实施方案中，转基因编码荧光蛋白，例如但不限于细胞溶质绿色荧光蛋白(gfp)、萤光素酶和mcherry。作为非限制性实例，荧光蛋白是gfp。在用gfp转导的细胞中，细胞活力可大于90％。在用gfp转导的细胞中，细胞活力可大于85％。如果细胞是用gfp转导的原代t细胞，那么活细胞数可能在减少之前的初始时间点上增加。如果细胞是用gfp转导的jurkat细胞，那么活细胞数可能增加至少10天。对于gfp转导的细胞，每细胞的拷贝数在初始时间点可能更高，然后在随后的时间点减少50％或更多。细胞的表面表达可存在稳定和快速的下降，在第10天降至最低点，如果再刺激会有轻微的增加。在其余研究中的降低之前，在jurkat细胞中的gfp的细胞表面表达的最高水平可能在第10天(约35000gfp mfi)。在转导后3-13天，表达gfp的原代人t细胞的百分比可以在80％左右。在转导后3-13天，表达gfp的jurkat细胞的百分比可以在90％左右。
[0572]
在一些实施方案中，本文所述的慢病毒工程化细胞具有基因组dna整合，所述整合在拷贝数最初下降之后稳定化，从而降低随时间的rna和表面表达水平，并且在再刺激后增加rna和表面表达。
[0573]
在一些实施方案中，可以使用以下14天方法评价慢病毒工程化细胞，其中在整个培养过程中收集样品5次。在第1天，可以将t细胞(例如，原代人t细胞或jurkat细胞)解冻，并且加入cd3/cd28珠。在第0天，加入每种条件下的慢病毒(例如，4ml的细胞，0.5e6/ml)，并有未转导细胞作为对照。在第1天将培养基加倍至8ml，然后在第2天将培养基加倍至16ml。第3天，收获4ml，然后在第4天将培养基加倍至24ml。第6天收获4ml，然后将培养基加倍至40ml。细胞可以在第8天分裂(例如14ml 0.5e6个细胞/ml)，然后在第6天收获4ml升，然后将培养基加倍至40ml。在培养基加倍至20ml之前，可在第10天收获4ml。在第13天，收获4ml，然后将培养基加倍至32ml。将培养物分成两半，将一半培养物活化(cd3/cd28活化珠1∶1)，并且刺激过夜。在第14天，将刺激细胞和非刺激细胞各自收获4ml，并结束培养。通过收获细胞和提取基因组dna，然后用标准曲线qpcr将内源基因组和转基因序列定量，然后将检测的数量转换成比率，从而测定每细胞的转基因拷贝数。在attune上通过flo用适当的染色法对每个组测定平均荧光强度(mfi)。还可以在attune上通过flo对超过阈值的发荧光的细胞的百分比定量来测定表达的百分比。可通过在每个标记的时间点收获培养物上清液并运行中尺度发现(mesoscale discovery，msd)平板测定法，然后将细胞密度归一化，将可溶性有效负载定量。
[0574]
腺相关病毒颗粒
[0575]
可以使用重组腺相关病毒(raav)载体来实现本公开的感兴趣的任何ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块、sre或有效负载的递送。这样的载体或病毒颗粒可以设计成利用任何已知的血清型衣壳或血清型衣壳的组合。
[0576]
aav载体不仅包括单链载体，还包括自身互补aav载体(scaav)。scaav载体含有退火在一起形成双链载体基因组的dna。通过跳过第二链合成，scaav允许在细胞中快速表达。
[0577]
通过本领域的标准方法，比如通过在sf9昆虫细胞中或在人细胞(比如hek293细
胞)的悬浮细胞培养物中的三重转染，可以制造raav载体。
[0578]
可以将感兴趣的ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块、sre或有效负载编码在一个或多个病毒基因组中，所述病毒基因组将被包装在本文教导的aav衣壳中。
[0579]
除了至少一个或两个itr(反向末端重复)之外，这样的载体或病毒基因组还可包括载体或病毒基因组表达所必需的某些调控元件。这样的调控元件是本领域熟知的，并且包括例如启动子、内含子、间隔物、填充序列等。
[0580]
本公开的感兴趣的ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块、sre或有效负载可以一个或多个aav颗粒的形式施用。
[0581]
在一些实施方案中，ca2效应子模块可以一个或多个aav颗粒的形式施用。在一些实施方案中，在病毒基因组中可以编码多于一个的ca2效应子模块或sre。
[0582]
逆转录病毒媒介物/颗粒(γ-逆转录病毒载体)
[0583]
在一些实施方案中，可以使用逆转录病毒媒介物/颗粒来递送本公开的感兴趣的ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块、sre或有效负载。逆转录病毒载体(rv)允许转基因永久整合在靶细胞中。除了基于复杂的hiv-1/2的慢病毒载体外，基于简单的γ-逆转录病毒的逆转录病毒载体已被广泛用于递送治疗基因，并在临床上被证明是能够转导广泛细胞类型的最有效和最强大的基因递送系统之一。γ逆转录病毒的实例包括鼠白血病病毒(mlv)和猫白血病病毒(felv)。
[0584]
在一些实施方案中，来源于哺乳动物γ-逆转录病毒比如鼠白血病病毒(mlv)的γ-逆转录病毒载体是重组的。γ逆转录病毒的mlv科包括亲嗜性、兼嗜性、异嗜性和多嗜性亚科。亲嗜性病毒只利用mcat-1受体感染鼠细胞。亲嗜性病毒的示例有莫洛尼(莫洛尼)mlv和akv。兼嗜性病毒通过pit-2受体感染鼠、人和其他物种。兼嗜性病毒的一个实例是4070a病毒。异嗜性和多嗜性病毒利用相同的(xprl)受体，但它们的物种向性不同。异嗜性病毒比如nzb-9-1感染人和其他物种，但不感染鼠物种，而多嗜性病毒比如病灶形成病毒(mcf)感染鼠、人和其他物种。
[0585]
可以通过用几个质粒共转染细胞而在包装细胞中产生γ-逆转录病毒载体，所述质粒包括编码逆转录病毒结构和酶(gag-pol)多蛋白的质粒、编码包膜(env)蛋白的质粒和编码载体mrna的质粒，所述载体mrna包含编码本公开组合物的多核苷酸(将被包装在新形成的病毒颗粒中)。
[0586]
在一些方面，用来自其他病毒的包膜蛋白将重组γ-逆转录病毒载体假型化。将包膜糖蛋白掺入病毒颗粒的外层脂质层，可增加/改变细胞向性。示例性包膜蛋白包括长臂猿白血病病毒包膜蛋白(galv)或水泡性口炎病毒g蛋白(vsv-g)、或猴内源性逆转录病毒包膜蛋白、或麻疹病毒h和f蛋白、或人免疫缺陷病毒gpl20包膜蛋白、或科卡尔(cocal)水疱病毒属包膜蛋白(参见，例如，美国申请公开号2012/164118；将其内容通过引用整体并入本文)。在其他方面，可将包膜糖蛋白遗传修饰以将靶向/结合配体掺入到γ-逆转录病毒载体中，所述结合配体包括但不限于肽配体、单链抗体和生长因子(waehler等人，nat.rev.genet.2007，8(8)：573-587；将其内容通过引用整体并入本文)。这些工程化糖蛋白可以将载体重新靶向至表达其相应靶部分的细胞。在其他方面，可以引入“分子桥”将载体导向至特定细胞。分子桥具有双重特异性：一端可以识别病毒糖蛋白，另一端可以与靶细胞上的分子决定簇结合。这样的分子桥，例如配体-受体、亲和素-生物素和化学缀合物、单
克隆抗体和工程化促融合蛋白，可以引导病毒载体附着到靶细胞上进行转导(yang等人，biotechnol.bioeng.，2008，101(2)：357-368；和maetzig等人，viruses，2011，3，677-713；将各自的内容通过引用整体并入本文)。
[0587]
在一些实施方案中，重组γ-逆转录病毒载体是自灭活(sin)γ-逆转录病毒载体。这些载体不能复制。sin载体在最初包含增强子/启动子活性的3’u3区内可以包含缺失。此外，可以用来源于巨细胞病毒或rsv的强启动子(包装细胞系中需要的)或选择的内部启动子和/或增强子元件替换5’u3区。可以根据本公开特定目的所需的基因表达的特定要求来进行内部启动子的选择。
[0588]
在一些实施方案中，将编码ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块、sre的多核苷酸插入重组病毒基因组中。通过插入或去除天然存在的序列(例如，插入ires、插入编码感兴趣的多肽或抑制性核酸的异源多核苷酸、从不同的逆转录病毒或病毒中改组更有效的启动子来代替野生型启动子等)，可以修饰重组γ-逆转录病毒载体的病毒mrna的其他组分。在一些实例中，重组γ-逆转录病毒载体可包含修饰的包装信号、和/或引物结合位点(pbs)、和/或5
’‑
长末端重复序列(ltr)的u3区中的5
’‑
增强子/启动子元件、和/或3
′‑
ltr的u3区中修饰的3
′‑
sin元件。这些修饰可增加滴度和感染能力。
[0589]
适合于递送本公开的感兴趣的ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块、sre或有效负载的γ病毒载体可以选自下列专利中公开的那些：美国专利第8,828,718号；第7,585,676号；第7,351,585号；美国申请公开号2007/048285；pct申请公开号wo2010/113037；wo2014/121005；wo2015/056014；和欧洲专利号ep1757702；ep1757703(将各自的内容通过引用整体并入本文)。
[0590]
溶瘤病毒载体
[0591]
在一些实施方案中，可将本公开的多核苷酸包装到溶瘤病毒中。如本文所用的，术语“溶瘤病毒”是指优先感染和杀伤癌细胞的病毒，比如疫苗病毒。溶瘤病毒可以天然存在，或者可以是基因修饰的病毒，比如溶瘤腺病毒和溶瘤疱疹病毒。
[0592]
在一些实施方案中，溶瘤疫苗病毒可包括胸苷激酶(tk)缺陷的、表达粒细胞巨噬细胞(gm)-集落刺激因子(csf)的、具有复制能力的痘苗病毒载体的病毒颗粒，其足以诱导肿瘤中的细胞的溶瘤作用；参见例如美国专利第9,226,977号；将其内容通过引用整体并入本文。
[0593]
信使rna(mrna)
[0594]
在一些实施方案中，可以将本公开的ca2效应子模块设计为信使rna(mrna)。如本文所用的，术语“信使rna”(mrna)是指编码感兴趣的多肽的任何多核苷酸，其能够被翻译，以体外、体内、原位或离体的方式产生编码的感兴趣的多肽。这样的mrna分子可以具有在国际申请号pct/us2013/030062中教导的任何那些的结构组分或特征，将其内容通过引用整体并入本文。
[0595]
在一些实施方案中，可将ca2效应子模块设计为自扩增rna。如本文所用的“自扩增rna”是指可以在宿主中复制的导致rna和由rna编码的蛋白质的量增加的rna分子。这样的自扩增rna可以具有在国际专利申请公开号wo2011005799中教导的任何那些的结构特征或成分(将其内容通过引用整体并入本文)。
[0596]
给药
[0597]
本公开提供了包括向有需要的受试者施用ca2生物回路系统的任何一种或多种或组分的方法。可以使用有效预防或治疗疾病、疾患和/或病症(例如，与癌症或自身免疫性疾病相关的疾病、疾患和/或病症)或使其成像的任何量和任何施用途径，将这些组分施用于受试者。所需的确切量因受试者而异，取决于受试者的物种、年龄和一般状况、疾病的严重程度、特定的组合物、其施用方式、其活动方式等。
[0598]
通常将根据本公开的组合物配制成剂量单位形式，以便于施用和剂量的均匀性。然而，应当理解，将由主治医师在合理的医学判断范围内决定本公开组合物的每日总用量。对于任何特定的患者，具体的治疗有效、预防有效或适当的成像剂量水平将取决于多种因素，所述因素包括所治疗的疾患和所述疾患的严重性；采用的特定化合物的活性；所采用的特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和采用的特定化合物的排泄率；治疗持续时间；与采用的具体化合物联合或同时使用的药物；以及医学领域熟知的类似因素。
[0599]
在一些实施方案中，本公开的组合物可以按照不同的剂量使用，以避免t细胞耗竭，预防细胞因子释放综合征，并且使与免疫疗法相关的毒性降至最低限度。例如，低剂量的本公开的组合物可用于初始治疗具有高肿瘤负荷的患者，而低肿瘤负荷的患者可用高剂量和重复剂量的本公开的组合物治疗，以确保最小肿瘤抗原负荷的识别。在另一种情况下，可以搏动方式递送本公开的组合物，以减少强直t细胞信号传导并增强体内持久性。在一些方面，在施用高剂量之前，可以通过最初使用低剂量的本公开的组合物将毒性降至最低限度。如果血清标志物，比如铁蛋白、血清c响应蛋白、il6、干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α升高，那么可以改变给药。
[0600]
在一些实施方案中，神经毒性可能与car或til疗法相关。这样的神经毒性可能与cd19-car相关。毒性可能是由于大脑中过度的t细胞浸润所致。在一些实施方案中，可以通过阻止t细胞穿过血脑屏障来减轻神经毒性。这可以通过内源性α-4整合素抑制剂如泰萨布里(tysabri)/那他珠单抗的靶向基因缺失来实现，其也可用于本公开中。
[0601]
本文还提供了向有需要的受试者施用根据本公开的配体的方法。可以使用有效调节本公开的ca2生物回路的任何量和任何施用途径，将配体施用于受试者或细胞。所需的确切量因受试者而异，取决于受试者的物种、年龄和一般状况、疾病的严重程度、特定的组合物、其施用方式、其活动方式等。受试者可以是人、哺乳动物或动物。通常将根据本公开的组合物配制成单位剂型，以便于施用和剂量的均匀性。然而，应当理解，将由主治医师在合理的医学判断范围内决定本公开组合物的每日总用量。在某些实施方案中，可以按照每天足以递送受试者体重的从约0.0001mg/kg到约100mg/kg、从约0.001mg/kg到约0.05mg/kg、从约0.005mg/kg到约0.05mg/kg、从约0.001mg/kg到约0.005mg/kg、从约0.05mg/kg到约0.5mg/kg、从约0.01mg/kg到约50mg/kg、从约0.1mg/kg到约40mg/kg、从约0.5mg/kg到约30mg/kg、从约0.01mg/kg到约10mg/kg、从约0.1mg/kg到约10mg/kg、或从约1mg/kg到约25mg/kg、从约10mg/kg到约100mg/kg、从约50mg/kg到约500mg/kg、从约100mg/kg到约1000mg/kg的剂量水平施用根据本公开的配体，每天一次或多次，从而获得期望的效果。在一些实施方案中，剂量水平可以是每天为受试者体重的l mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、100mg/kg、110mg/kg、120mg/kg、130mg/kg、140mg/kg、150mg/kg、160mg/kg、170mg/kg、180mg/kg、
190mg/kg或mg/kg的剂量水平，每天一次或多次，从而获得期望的效果。
[0602]
本公开提供了将本文所述的任何配体递送至细胞或组织的方法，包括使细胞或组织与所述配体接触，并且可以在体外、离体或体内完成。在某些实施方案中，可以按照足以递送从约1nm到约10nm、从约5nm到约50nm、从约10nm到约100nm、从约50nm到约500nm、从约100nm到约1000nm、从约1μm到约10μm、从约5μm到约50μm、从约10μm到约100μm、从约25μm到约250μm、从约50μm到约500μm的剂量水平将根据本公开的配体施用于细胞。在一些实施方案中，可以按照选自但不限于0.00064μm、0.0032μm、0.016μm、0.08μm、0.4μm、1μm2μm、10μm、50μm、75μm、100μm、150μm、175μm、200μm、250μm的剂量将配体施用于细胞。
[0603]
可以按照仅一次、每天三次、每天两次、每天一次、隔天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次递送本公开配体的期望的剂量。在某些实施方案中，可以利用多次施用(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)来递送期望的剂量。当采用多次施用时，可以使用比如本文所述的分次给药方案。如本文所用的，“分开剂量”是将“单个单位剂量”或总日剂量分成两个或更多个剂量，例如“单个单位剂量”的两次或更多次施用。如本文所用的，“单个单位剂量”是以一次剂量/一次/单途径/单接触点施用的任何治疗剂的剂量，即单次施用事件。可以按照“脉冲剂量”或“连续流”的形式施用本公开配体的期望的剂量。如本文所用的，“脉冲剂量”是在一段时间内以设定频率施用的任何治疗剂的一系列单个单位剂量。如本文所用的，“连续流”是在单途径/单接触点连续施用一段时间的治疗剂的剂量量，即连续施用事件。总日剂量，即在24小时期间内给予或开处方的量，其可以通过这些方法中的任何一种，或作为这些方法的组合，或通过任何其他适合于药物施用的方法来施用。
[0604]
施用
[0605]
在一些实施方案中，可以将用于免疫疗法的组合物离体地施用于细胞，随后施用于受试者。
[0606]
在一些实施方案中，根据细胞的性质，可以通过多种方式将细胞引入宿主生物例如哺乳动物中，所述方式包括注射、输液、输注、局部滴注或植入。在一些方面，可将本文所述的细胞在肿瘤部位引入。所采用的细胞的数量将取决于多种情况、引入的目的、细胞的寿命、将要使用的方案，例如，施用次数、细胞繁殖的能力等。细胞可以在生理学上可接受的介质中。
[0607]
在一些实施方案中，本文所述的细胞可以多个剂量施用于患有疾病或病症的受试者。施用通常实现癌症或临床病症的一种或多种症状的改善和/或治疗或预防癌症或临床病症或其症状。
[0608]
在一些实施方案中，用于免疫疗法的组合物可以体内施用。在一些实施方案中，包含本公开的ca2生物回路、ca2效应分子、sre、感兴趣的有效负载(免疫治疗剂)和组合物的本公开的多肽可以体内递送给受试者。免疫治疗剂的体内递送在本领域有很好的描述。例如，在欧洲专利号ep0930892 a1中描述了递送细胞因子的方法，将其内容通过引用并入本文。递送途径
[0609]
本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分(包括它们的sre(例如ca2 dd)、有效负载(例如免疫治疗剂))的ca2效应子模块、载体和细胞可以通过任何途径施用，以实现治疗有效的结果。
[0610]
本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)可以通过任何途径施用，以实现治疗有效的结果。这些途径包括但不限于，肠内(进入肠)、胃肠内、硬膜外(进入硬脑膜)、口服(通过口腔)、透皮、硬膜外、脑内(进入大脑)、脑室内(进入脑室)、表皮内(应用于皮肤)、皮内(进入皮肤本身)、皮下(皮肤下)、鼻腔施用(通过鼻子)、静脉内(进入静脉)、静脉推注、静脉滴注、动脉内(进入动脉)、肌内(进入肌肉)、心内(进入心脏)、骨内输注(进入骨髓)、鞘内(进入椎管内)、腹膜内(输注或注射入腹膜)、膀胱内输注、玻璃体内(通过眼睛)、阴茎海绵体内注射(进入病理腔内)、腔内(进入阴茎根部)、阴道内施用、子宫内、羊膜外施用、透皮(通过完整皮肤扩散，以便全身分布)、经粘膜(通过粘膜扩散)、经阴道、吹入法(嗅吸法)、舌下、唇下、灌肠、滴眼液(滴到结膜上)、滴耳液、耳(在耳内或通过耳)、颊(朝向脸颊)、结膜、皮肤、牙(针对一颗牙或多颗牙)、电渗、子宫颈内、窦内、气管内、体外、血液透析、浸润、间质、腹内、羊膜内、关节内、胆管内、支气管内、囊内(intrabursal)、软骨内(在软骨内)、尾内(在马尾内)、脑池内(在小脑延髓池内)、角膜内(在角膜内)、牙(intracornal)、冠状动脉内(在冠状动脉内)、阴茎海绵体内(在阴茎海绵体的可扩张空间内)、椎间盘内(在椎间盘内)、导管内(在腺体的导管内)、十二指肠内(在十二指肠内)、硬膜内(在硬膜之内或之下)、表皮内(至表皮)、食管内(至食管)、胃内(在胃内)、牙龈内(在牙龈内)、回肠内(在小肠远端部分内)、病变内(在局部病变内或直接引入局部病变)、管腔内(在管腔内)、淋巴管内(在淋巴内)、髓内(在骨髓腔内)、脑膜内(在脑膜内)、心肌内(在心肌内)、眼内(在眼睛内)、卵巢内(在卵巢内)、心包内(在心包内)、胸膜内(在胸膜内)、前列腺内(在前列腺内)、肺内(在肺或其支气管内)、窦内(在鼻窦或眶周窦内)、脊柱内(在脊柱内)、滑膜内(在关节的滑膜腔内)、腱内(在腱内)、睾丸内(在睾丸内)、鞘内(在任何水平的脑脊髓轴的脑脊液内)、胸腔内(在胸腔内)、小管内(在器官的小管内)、肿瘤内(在肿瘤内)、鼓室内(在中耳(aurus media)内)、血管内(在一个或多个血管内)、心室内(在心室内)、离子电渗疗法(通过可溶盐离子迁移到身体组织中的电流)、冲洗(浸洗或冲洗开放性伤口或体腔)、喉部(直接在喉上)、鼻胃(通过鼻子并且进入胃)、封闭敷料技术(局部途径施用，然后用封闭区域的敷料覆盖)、眼科(至眼睛外部)、口咽(直接到口腔和咽部)、肠胃外、经皮、关节周围、硬膜外、神经周围、牙周、直肠，呼吸系统(通过经口或经鼻吸入的呼吸道内，用于局部或全身作用)、球后(脑桥后或眼球后)、心肌内(进入心肌)、软组织、蛛网膜下腔、结膜下、粘膜下、局部、经胎盘(通过或穿过胎盘)、经气管(通过气管壁)、经鼓膜(穿过或通过鼓室腔)、输尿管(至输尿管)、尿道(至尿道)、阴道、骶管阻滞、诊断的、神经阻滞、胆道灌注、心脏灌注、光分离置换法(photopheresis)或脊柱。
[0611]
肠胃外和可注射施用
[0612]
在一些实施方案中，本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)可以肠胃外施用。用于口服和肠胃外施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳剂、微乳液、溶液、混悬剂、糖浆和/或酏剂。除了活性成分之外，液体剂型可以包含本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，比如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯，以及它们的混合物。除了惰性稀释剂之外，口服组合物可包括佐剂，比如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。在肠
胃外施用的某些实施方案中，将组合物与增溶剂如醇类、油类、改性油、乙二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或它们的组合。在其他实施方案中，包括表面活性剂，比如羟丙基纤维素。
[0613]
可以根据已知技术使用适合的分散剂、润湿剂和/或悬浮剂来配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性混悬剂。无菌可注射制剂可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂/或溶剂中的无菌可注射溶液、混悬剂和/或乳剂，例如，作为1，3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的媒介物和溶剂包括水、林格氏溶液、u.s.p.和等渗氯化钠溶液。无菌、不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为了这个目的，可以采用任何无刺激性的不挥发性油，包括合成的单甘油酯或甘油二酯。脂肪酸，比如油酸，也可以用于制备可注射剂。
[0614]
可将可注射制剂灭菌，例如，通过细菌保留过滤器过滤，和/或通过掺入无菌固体组合物的形式的灭菌剂，所述组合物可在使用前溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。
[0615]
为了延长活性成分的作用，通常希望减慢皮下注射或肌肉注射制剂中的活性成分的吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。活性成分的吸收率取决于溶出率，而溶出率又取决于晶体大小和晶型。可替代地，通过将药物溶解或悬浮在油媒介物中来实现肠胃外施用的药物形式的延迟吸收。通过在生物可降解聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成药物的微囊化基质来制备可注射的储库形式。根据药物与聚合物的比率和所采用的特定聚合物的性质，可以控制药物释放速率。其他可生物降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备储库型可注射制剂。
[0616]
眼或耳施用
[0617]
在一些实施方案中，可以将本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)以适合于眼和/或耳施用的制剂形式来制备、包装和/或出售。这样的制剂可以是例如滴眼剂和/或滴耳剂的形式，包括例如在水性和/或油性液体赋形剂中的活性成分的0.1/1.0％(w/w)的溶液和/或混悬剂。这样的滴剂可还包含缓冲剂、盐和/或一种或多种本文所述的任何其他附加成分。其他有用的可眼部施用制剂包括那些包含呈微晶和/或脂质体制剂形式的活性成分的制剂。视网膜下插入物也可以用作施用形式。
[0618]
可检测剂和标签
[0619]
刺激、ca2生物回路系统和组分、ca2效应子模块(包括sre和有效负载)可与一种或多种放射性试剂或可检测剂相关联或结合。
[0620]
这些物质包括各种有机小分子、无机化合物、纳米颗粒、酶或酶底物、荧光材料、发光材料(例如，鲁米诺)、生物发光材料(例如，萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白)、化学发光材料、放射性物质(例如，
18
f、
67
ga、
81m
kr、
82
rb、
111
in、
123
i、
133
xe、
201
t1、
125
i、
35
s、
14
c、3h或
99m
tc(例如，如高锝酸盐(过锝酸盐(vii)，tco
4-))、和造影剂(例如，金(例如，金纳米颗粒)、钆(例如]螯合的gd)、氧化铁(例如，超顺磁性氧化铁(spio)、单晶氧化铁纳米颗粒(mion)和超小超顺磁性氧化铁纳米颗粒(uspio))、锰螯合物(例如，mn-dpdp)、硫酸钡、碘化造影剂(碘海醇)、微泡或全氟化碳)。
[0621]
在一些实施方案中，可检测试剂可以是在活化后变得可检测的不可检测前体(例
如，荧光四嗪-荧光团构建体(例如，四嗪-bodipy fl、四嗪-oregon green 488或四嗪-bodipy tmr-x)或酶可活化荧光试剂(例如，(visen medical)))。其中可以使用酶标记组合物的体外测定法包括但不限于，酶联免疫吸附测定(elisa)、免疫沉淀测定、免疫荧光、酶免疫测定(eia)、放射免疫测定(ria)和蛋白质印迹分析。
[0622]
试剂盒
[0623]
本公开包括多种用于方便和/或有效地进行本公开的方法的试剂盒。通常，试剂盒将包括足够量和/或数量的组分，从而允许使用者对受试者进行一次或多次治疗和/或进行一次或多次实验。
[0624]
在一个实施方案中，本公开提供了用于体外或体内抑制基因的试剂盒，其包含本公开的ca2生物回路或本公开的ca2生物回路的组合，任选地与任何其他适合的活性剂组合。
[0625]
试剂盒可还包括包装和说明书和/或递送剂，以形成制剂组合物。递送剂可包括例如盐水、缓冲溶液。
[0626]
在另外的实施方案中，提供了测定筛选试剂盒。试剂盒包括用于筛选测定的容器。试剂盒中应包括使用测定法的说明书和关于筛选方法的信息。
[0627]
ii.应用
[0628]
本公开的ca2生物回路、ca2效应子模块、sre、刺激、包含刺激、ca2生物回路、ca2效应子模块中的一者或多者的的组合物或系统可用于多种应用中，包括但不限于治疗、诊断和预后、生物工程、生物加工、生物工厂、研究试剂、代谢组学、基因表达、酶替代等。
[0629]
治疗用途
[0630]
癌症免疫疗法
[0631]
癌症免疫疗法旨在诱导或恢复免疫系统对癌症的响应性。免疫疗法研究的重大进展导致了各种策略的发展，这些策略可大致分为主动免疫疗法和被动免疫疗法。一般而言，可利用这些策略直接杀伤癌细胞或对抗免疫抑制肿瘤微环境。主动免疫疗法旨在诱导内源的、持久的肿瘤抗原特异性免疫响应。通过免疫响应调节剂比如细胞因子的非特异性刺激可进一步增强响应。相比之下，被动免疫疗法包括其中将效应免疫分子比如肿瘤抗原特异性细胞毒性t细胞或抗体施用于宿主的方法。这种方法持续时间短，需要多次应用。
[0632]
尽管取得了重大进展，但当前免疫疗法策略的功效受到相关毒性的限制。这些通常与免疫疗法相关的窄治疗窗有关，部分地起因于为了获得临床上有意义的治疗效果，需要将治疗剂量推到潜在致命毒性的边缘。此外，由于过继转移的免疫细胞在患者体内继续增殖，体内剂量扩大通常是不可预测的。
[0633]
免疫疗法涉及的主要风险是响应于肿瘤相关抗原(taa)的正常组织表达的t细胞活化产生的中靶脱肿瘤副作用。利用表达针对特异性taa的t细胞受体的t细胞的临床试验报告了对免疫疗法有响应的皮疹、结肠炎和听力损失。
[0634]
当肿瘤细胞因对免疫疗法有响应而被杀伤时，免疫疗法也可能产生中靶的肿瘤上毒性。不良响应包括肿瘤溶解综合征、细胞因子释放综合征和相关的巨噬细胞活化综合征。重要的是，这些不良响应可能发生在肿瘤破坏过程中，因此即使是成功的肿瘤上免疫疗法也可能导致毒性。因而，可调节地控制免疫疗法的方法是非常需要的，因为它们具有降低毒性和使功效最大化的潜力。
[0635]
本公开提供了用于癌症免疫疗法的系统、组合物、免疫治疗剂和方法。这些组合物在免疫疗法中提供了基因表达和功能的可调调节。本公开还提供了ca2生物回路、ca2效应子模块、刺激响应元件(sre)和有效负载，以及编码任何前述项的多核苷酸。在一方面，可以通过单独添加的刺激来控制本公开的系统、组合物、免疫治疗剂和其他组分，为调节癌症免疫疗法提供了显著灵活性。此外，本公开的系统、组合物和方法也可以与治疗剂比如化学治疗剂、小分子、基因疗法和抗体联合。
[0636]
本公开的系统和组合物的可调性质具有提高免疫疗法效力和功效持续时间的潜力。使用本公开的组合物可逆地使过继转移的细胞的生物活性发生沉默，允许将细胞疗法的潜力最大化，而没有不可恢复地杀伤和终止治疗。
[0637]
本公开提供了将免疫疗法施用于患者之后进行微调的方法。这进而提高了免疫疗法的安全性和有效性，并且增加了可受益于免疫疗法的受试者群体。
[0638]
在一个实施方案中，ca2生物回路、ca2效应子模块、sre和调节任何剂的表达水平和活性的组分可用于免疫疗法。作为非限制性实例，免疫治疗剂可以是抗体及其片段和变体、癌症特异性t细胞受体(tcr)及其变体、抗肿瘤特异性嵌合抗原受体(car)、嵌合开关受体、共抑制受体的抑制剂或配体、共刺激受体的激动剂和配体、细胞因子、趋化因子、细胞因子受体、趋化因子受体、可溶性生长因子、代谢因子、自杀基因、归巢受体、或在细胞和受试者中诱导免疫响应的任何剂。
[0639]
在一些实施方案中，用于诱导免疫响应的组合物可以包含ca2效应子模块。在一些实施方案中，ca2效应子模块可包含与至少一个有效负载可操作连接的刺激响应元件(sre)。在一方面，有效负载可以是免疫治疗剂。
[0640]
在一些实施方案中，本公开的ca2生物回路、ca2效应子模块和组合物涉及蛋白质(有效负载)的翻译后调节，其在免疫治疗剂的抗肿瘤免疫响应中起作用。
[0641]
1.过继细胞转移(过继免疫疗法)
[0642]
在一些实施方案中，经基因修饰以表达至少一种ca2生物回路、ca2效应子模块、sre(例如ca2 dd)和/或感兴趣的有效负载(免疫治疗剂)的细胞可用于过继细胞疗法(act)。如本文所用的，过继细胞转移是指施用具有直接抗癌活性的免疫细胞(来自自体、同种异体或基因修饰的宿主)。act在对抗恶性和传染性疾病的临床应用中显示出希望。例如，经基因工程改造识别cd19的t细胞已被用于治疗滤泡性b细胞淋巴瘤(kochenderfer等人，blood，2010，116：4099-4102；以及kochenderfer和rosenberg，nat rev clin oncol.，2013，10(5)：267-276)，并且使用经遗传修饰表达抗肿瘤t细胞受体的自体淋巴细胞的act已用于治疗转移性黑色素瘤(rosenberg和dudley，curr.opin.immunol.2009，21：233-240)。
[0643]
根据本公开，ca2生物回路和系统可用于开发和实施细胞疗法，比如过继细胞疗法。国际公开号wo2017/180587中的图7-12给出了在细胞疗法中有用的某些效应子模块，将其内容通过引用整体并入本文。ca2生物回路、ca2效应子模块及其sre和有效负载可用于实现car疗法的细胞疗法中、til的操纵或调节、同种异体细胞疗法、t细胞疗法与其他治疗线(例如，放射、细胞因子)的联合、编码工程改造的tcr或修饰的tcr、或增强除tcr外的t细胞(例如，通过引入细胞因子基因、检查点抑制剂pd1、ctla4的基因)。
[0644]
本文提供了用于过继细胞疗法的方法。所述方法包括预处理有需要的受试者，用
本公开的sre、ca2生物回路和组合物调节免疫细胞，向受试者施用表达本公开的组合物的工程化免疫细胞，以及将工程化细胞成功植入受试者体内。
[0645]
在一些实施方案中，本公开的sre、ca2生物回路和组合物可用于将与过继细胞疗法相关的预处理方案减到最少。如本文所用的“预处理”是指施用于受试者以改善过继细胞疗法结果的任何治疗方案。预处理策略包括但不限于全身照射和/或淋巴细胞清除化学疗法。没有预处理的过继疗法临床试验未能证明任何临床益处，表明预处理在act中的重要性。然而，预处理与显著的毒性相关，并且限制了适合于act的受试者队列。在一些情况下，可以使用本公开的sre对用于act的免疫细胞进行工程改造，以表达细胞因子如il12和il15作为有效负载，从而减少预处理的需要(pengram等人，(2012)blood 119(18)：4133-41；将其内容通过引用整体并入本文)。
[0646]
在一些实施方案中，用于act的免疫细胞可以是树突细胞、t细胞如cd8
+ t细胞和cd4
+ t细胞、自然杀伤(nk)细胞、nk t细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、淋巴因子活化的杀伤(lak)细胞、记忆性t细胞、调节性t细胞(treg)、辅助性t细胞、细胞因子诱导的杀伤(cik)细胞及其任何组合。在其他实施方案中，用于act的免疫刺激细胞可由胚胎干细胞(esc)和诱导的多能干细胞(ipsc)生成。在一些实施方案中，将自体或同种异体免疫细胞用于act。
[0647]
在一些实施方案中，用于act的细胞可以是经工程改造以表达car的t细胞，所述car包含对感兴趣的肿瘤细胞上的抗原特异的抗原结合结构域。在其他实施方案中，用于act的细胞可以是经工程改造以表达car的nk细胞，所述car包含对感兴趣的肿瘤细胞上的抗原特异的抗原结合结构域。除了用于免疫疗法的经基因修饰的t细胞(例如car t细胞)的过继转移之外，表达car的白细胞的替代类型，可以单独地或与car t细胞联合用于过继免疫疗法。在一个实例中，可将t细胞和nk细胞的混合物用于act。根据本公开，在t细胞和nk细胞中car的表达水平受到与ca2效应子模块中的car可操作连接的dd结合的小分子的调节和控制。
[0648]
在一些实施方案中，可将本公开的car置于t细胞中t细胞受体α恒定区(trac)基因座的转录控制之下，以实现均匀的car表达，同时增强t细胞效力。可以用crispr/cas 9、锌指核酸酶(zfn)、talen破坏trac基因座，然后插入car构建体。导向至trac基因座的car构建体的工程改造方法描述于eyquem j.等人(2017)nature.543(7643)：113-117(将其内容通过引用整体并入本文)。
[0649]
在一些实施方案中，经工程改造以表达本发明组合物的nk细胞可用于act。nk细胞活化诱导靶细胞的穿孔素/颗粒酶依赖性凋亡。nk细胞活化还诱导细胞因子比如ifnγ、tnf-α和gm-csf的分泌。这些细胞因子增强巨噬细胞的吞噬功能及其抗微生物活性，并通过抗原呈递细胞(比如树突细胞(dc))的抗原呈递上调来增强适应性免疫响应(综述见于vivier等人，nat.immunol.，2008，9(5)：503-510)。
[0650]
基因修饰的其他实例可包括引入嵌合抗原受体(car)和下调抑制性nk细胞受体，比如nkg2a。
[0651]
也可以将nk细胞进行基因重编程，从而在与肿瘤细胞相互作用时避开nk细胞抑制性信号。例如，使用crispr、zfn或talen对nk细胞进行基因修饰，使其抑制性受体沉默，可增强nk细胞的抗肿瘤能力。
[0652]
可以使用本领域已知的多种方法离体地分离和扩增免疫细胞。例如，分离和扩增细胞毒性t细胞的方法描述于美国专利第6,805,861和第6,531,451号；美国专利公开号us20160348072a1和国际专利公开号wo2016168595a1，将各自的内容通过引用整体并入本文。nk细胞的分离和扩增描述于美国专利公开号us20150152387a1、美国专利第7,435,596号；和oyer，j.l.(2016).cy totherapy.18(5)：653-63；将各自的内容通过引用整体并入本文。具体地说，人原代nk细胞可以在饲养细胞存在下扩增，所述饲养细胞例如已经过基因修饰以表达膜结合的il15、il21、il12和4-1bbl的髓系细胞系。
[0653]
在一些情况下，可以富集免疫细胞的亚群而用于act。国际专利公开号wo2015039100a1教导了免疫细胞富集的方法。在另一个实例中，b和t淋巴细胞衰减标志物(btla)阳性的t细胞可用于富集具有抗癌响应性的t细胞，如美国专利第9,512,401中所述(将各自的内容通过引用整体并入本文)。
[0654]
在一些实施方案中，可将用于act的免疫细胞中的选定亚群耗尽，以增强t细胞扩增。例如，使用美国专利公开号us 20160298081a1中教导的方法，可以将免疫细胞中的foxp3+ t淋巴细胞耗尽，将抗肿瘤免疫响应降至最低限度；将该专利的内容通过引用整体并入本文。
[0655]
在一些实施方案中，通过在细胞表面上瞬时表达的嵌合抗原受体(car)的抗原刺激来实现用于act的t细胞的活化和扩增。这样的活化方法在国际专利号wo2017015427中有教导，将该专利的内容通过引用整体并入本文。
[0656]
在一些实施方案中，可以通过与抗原呈递细胞(apc)相关的抗原活化免疫细胞。在一些实施方案中，apc可以是抗原特异性或非特异性的树突细胞、巨噬细胞或b细胞。apc在其器官中可以是自体的或同源的。在一些实施方案中，apc可以是人工抗原呈递细胞(aapc)，例如基于细胞的aapc或无细胞的aapc。基于细胞的aapc可以选自基因修饰的同种异体细胞(如人红白血病细胞)或异种细胞(比如鼠成纤维细胞和果蝇细胞)。可替代地，apc可以是无细胞的，其中抗原或共刺激结构域存在于合成表面比如乳胶珠、聚苯乙烯珠、脂质囊泡或外泌体上。
[0657]
在一些实施方案中，可以使用人工细胞平台扩增本公开的细胞，特别是t细胞。在一个实施方案中，可以使用由seetcs等人在2017.natmethods.14，521-530描述的人工胸腺类器官(ato)(将其内容通过引用整体并入本文)生成成熟的t细胞。ato是基于表达δ样典型缺口配体(dll1)的基质细胞系。在这种方法中，基质细胞通过离心与造血干细胞和祖细胞聚集，并在空气-流体界面的细胞培养插入物上展开，生成类器官培养物。ato衍生的t细胞表现出幼稚的表型、多样的t细胞受体(tcr)库和依赖于tcr的功能。
[0658]
在一些实施方案中，通过自体转移进行过继细胞疗法，其中细胞来源于需要治疗的受试者，并且将细胞在分离和处理后施用于同一受试者。在其他情况下，act可涉及同种异体转移，其中细胞是从最终接受细胞疗法的受体受试者以外的供体受试者中分离和/或制备的。供体受试者和受体受试者可能在基因上相同或相似，或者可表达相同的hla类别或亚型。
[0659]
在一些实施方案中，引入到用于act的免疫细胞(例如，t细胞和nk细胞)中的多种免疫治疗剂可以受到相同的ca2生物回路控制。在其他实施方案中，引入到用于act的免疫细胞(例如，t细胞和nk细胞)中的多种免疫治疗剂可以受到不同的ca2生物回路控制。在另
一个实例中，自杀基因和car构建体可与两个独立的ca2效应子模块连接。
[0660]
在使用本公开的sre、ca2生物回路和组合物进行基因调节后，将细胞施用于有需要的受试者。用于过继细胞疗法的细胞的施用方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继t细胞治疗方法描述于例如授予gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；授予rosenberg的美国专利第4,690,915号；rosenberg(2011)nat rev clin oncol.8(10)：577-85)。参见，例如themeli等人，(2013)nat biotechnol.31(10)：928-933；tsukahara等人，(2013)biochem biophys res commun438(1)：84-9；davila等人(2013)plos one 8(4)：e613 3 8；将各自的内容通过引用整体并入本文。
[0661]
在一些实施方案中，可将用于act的免疫细胞修饰为表达一种或多种免疫治疗剂，促进免疫细胞的活化、浸润、扩增、存活和抗肿瘤功能。免疫治疗剂可以是对不同的靶分子特异的第二car或tcr；细胞因子或细胞因子受体；将抑制信号转化为刺激信号的嵌合开关受体；归巢受体，其将过继转移的细胞引导至靶位点，比如肿瘤组织；优化免疫细胞代谢的剂；或安全开关基因(例如自杀基因)，当过继细胞转移后观察到严重事件或当转移的免疫细胞不再需要时，该基因杀伤活化t细胞。
[0662]
在一些实施方案中，可以将用于过继细胞转移的免疫细胞进行基因操纵，以提高它们的持久性、细胞毒性、肿瘤靶向能力和体内归巢到疾病部位的能力，总体目标是进一步提高它们杀伤癌症患者中的肿瘤的能力。一个实例是将本公开的包含细胞因子比如γ-细胞因子(il2和il15)的ca2效应子模块引入免疫细胞中，以促进免疫细胞增殖和存活。将细胞因子基因(例如，γ-细胞因子il2和il15)转导至细胞中将能够使免疫细胞繁殖，而无需添加外源性细胞因子，并且表达细胞因子的nk细胞具有增强的肿瘤细胞毒性。
[0663]
在一些实施方案中，可以利用ca2生物回路、sre或ca2效应子模块来防止t细胞耗竭。如本文所用的，“t细胞耗竭”是指由慢性t细胞活化引起的t细胞功能的逐步的进行性丧失。t细胞耗竭是限制抗病毒和抗肿瘤免疫疗法的功效的主要因素。耗竭的t细胞具有低的增殖和细胞因子产生能力，同时具有高凋亡率和多种抑制性受体的高表面表达。导致耗竭的t细胞活化可能发生在抗原存在或不存在的情况下。
[0664]
在一些实施方案中，在嵌合抗原受体-t细胞疗法(car-t)的情况下，可以利用ca2生物回路及其组分来防止t细胞耗竭。在这种背景下，在某些情况下的耗竭可能是由细胞表面上car的scfv的寡聚化引起的，其导致car的细胞内结构域的持续活化。作为非限制性实例，本公开的car可包括不能寡聚化的scfv。作为另一个非限制性实例，也可以选择抗原暴露后快速内化和再表达的car，以防止细胞表面上的慢性scfv寡聚化。在一个实施方案中，可以将scfv的框架区修饰为防止组成型car信号传导(long等人2014.cancerresearch.74(19)s1；将其内容通过引用整体并入本文)。也可以使用本公开的可调ca2生物回路来调节t细胞表面上car的表面表达，以防止慢性t细胞活化。也可以将本公开的car设计成将耗竭降至最低限度。作为非限制性实例，可以将41-bb信号传导结构域掺入到car设计中，以改善t细胞耗竭。在一些实施方案中，可以利用由long h a等人公开的任何策略来防止耗竭(long a h等人，(2015)nature medicine 21，581-590；将其内容通过引用整体并入本文)。
[0665]
在一些实施方案中，可以利用本公开的ca2生物回路的可调性质来逆转用强直性car信号传导观察到的人t细胞耗竭。使用本公开的组合物可逆地使过继转移的细胞的生物活性沉默可用于逆转强直性信号传导，进而可使t细胞恢复活力。可以通过与耗竭相关的多
种抑制性受体的下调来量度耗竭的逆转。
[0666]
在一些实施方案中，可以修饰t细胞代谢途径，以降低t细胞对耗竭的易感性。代谢途径可包括但不限于，糖酵解、尿素循环、柠檬酸循环、β氧化、脂肪酸生物合成、戊糖磷酸途径、核苷酸生物合成和糖原代谢途径。作为非限制性实例，可以利用降低糖酵解速率的有效负载来限制或防止t细胞耗竭(long等人，journal for immunotherapy of cancer 2013，l(suppl 1)：p21；将其内容通过引用整体并入本文)。在一个实施方案中，本公开的t细胞可以与糖酵解抑制剂比如2-脱氧葡萄糖和雷帕霉素联合使用。
[0667]
在一些实施方案中，本公开的有效负载可以与靶向与t细胞耗竭相关的t细胞表面标志物的抗体或片段结合使用。可以使用的与t细胞耗竭相关的t细胞表面标志物包括但不限于ctla-1、pd-1、tgit、lag-3、2b4、btla、tim3、vista和cd96。
[0668]
在一个实施方案中，本公开的有效负载可以是cd276 car(具有cd28、4-ibb和cd3细胞内结构域)，其未显示与早期t细胞耗竭相关的标志物的上调(参见国际专利公开号wo2017044699；将其内容通过引用整体并入本文)。
[0669]
在一些实施方案中，可以利用本公开的组合物来改变受试者中的til(肿瘤浸润淋巴细胞)群。在一个实施方案中，可以利用本文所述的任何有效负载来改变cd4阳性细胞与cd8阳性群的比率。在一些实施方案中，可以离体分选til并且将其工程改造为表达本文所述的任何细胞因子。可以使用本公开的有效负载来扩增til的cd4群和/或cd8群，以增强til介导的免疫响应。
[0670]
2.癌症疫苗
[0671]
在一些实施方案中，本公开的ca2生物回路、ca2效应子模块、感兴趣的有效负载(例如，免疫治疗剂)、载体、细胞和组合物可以与癌症疫苗结合使用。
[0672]
在一些实施方案中，癌症疫苗可以包含来源于肿瘤相关抗原(taa)的肽和/或蛋白质。可以利用这样的策略诱发在受试者中的免疫响应，在一些情况下可以是细胞毒性t淋巴细胞(ctl)响应。还可以将用于癌症疫苗的肽修饰为匹配受试者的突变谱。例如，具有突变的egfr衍生肽已成功用于肺癌患者，所述突变与需要治疗的受试者中发现的突变相匹配(li f等人，(2016)oncoimmunology.oct 7；5(12)：e1238539；将其内容通过引用整体并入本文)。
[0673]
在一个实施方案中，本公开的癌症疫苗可以是来源于taa的超激动剂改变的肽配体(apl)。这些是与天然肽序列相差一个或多个氨基酸的突变肽配体，其比天然表位更有效地活化特异性ctl克隆。这些改变可允许使肽更好地与限制性i类mhc分子结合，或更好地与给定肿瘤特异性ctl亚群的tcr相互作用。可以使用美国专利公开号us2016031763 3a1中教导的方法来选择apl，将其内容通过引用整体并入本文。
[0674]
3.联合治疗
[0675]
在一些实施方案中，希望将本公开的组合物、载体和细胞联合用于对受试者施用。包含不同免疫治疗剂的本公开的组合物可以联合用于增强免疫疗法。
[0676]
在一些实施方案中，希望将本公开的组合物与佐剂联合，所述佐剂可以增强抗原特异性免疫响应的效力和寿命。在联合治疗中用作免疫刺激剂的佐剂包括生物分子或递送抗原的递送载体。作为非限制性实例，本公开的组合物可以与生物佐剂比如细胞因子、toll样受体、细菌毒素和/或皂苷联合。在其他实施方案中，本公开的组合物可以与递送载体联
合。示例性递送载体包括聚合物微球、免疫刺激复合物、乳剂(水包油或油包水)、铝盐、脂质体或病毒体。
[0677]
在一些实施方案中，经修饰以表达本公开的ca2生物回路、ca2效应子模块、sre(例如，dd)和有效负载的效应免疫细胞可与本文所述的生物佐剂联合。car和细胞因子及配体的双重调节将靶介导活化的动力学控制与固有的t细胞扩增分开。这样的双重调节还将患者对预处理方案的需要减到最少。作为非限制性实例，dd调节的car例如cd19 car可以与细胞因子例如il12联合，以增强car的抗肿瘤功效(pegram h.j.等人，tumor-targeted t cells modified to secrete il12eradicate systemic tumors without need for prior conditioning.blood.2012；119：4133-41，将各自的内容通过引用整体并入本文)。作为另一个非限制性实例，merchant等人将基于树突细胞的疫苗接种与重组人il7相结合，以改善高危儿科肉瘤患者的结果(merchant，m.s.等人，adjuvant immunotherapy to improve outcome in high-risk pediatric sarcomas.clin cancer res.2016.22(13)：3182-91；将各自的内容通过引用整体并入本文)。
[0678]
在一些实施方案中，经修饰以表达一种或多种抗原特异性tcr或car的效应免疫细胞可与本公开的组合物联合，所述组合物包含转化免疫抑制肿瘤微环境的免疫治疗剂。
[0679]
在一个方面，可以将修饰为表达对在同一细胞上的不同靶分子特异的car的效应免疫细胞联合。在另一方面，可以将修饰为表达相同car构建体的不同免疫细胞比如nk细胞和t细胞联合用于肿瘤治疗，例如，可以将修饰为表达cd19 car的t细胞与修饰为表达相同cd19car的nk细胞联合用于治疗b细胞恶性肿瘤。
[0680]
在其他实施方案中，可以将修饰为表达car的免疫细胞与检查点阻断剂联合。
[0681]
在一些实施方案中，本公开的经修饰以表达ca2生物回路、ca2效应子模块、sre(例如ca2 dd)和有效负载的效应免疫细胞可以与本公开的癌症疫苗联合。
[0682]
在一些实施方案中，本公开的方法可包括将本公开的组合物与有效治疗癌症、感染疾病和其他免疫缺陷疾患的其他剂比如抗癌剂联合。如本文所用的，术语“抗癌剂”是指能够例如通过杀伤癌细胞、诱导癌细胞凋亡、降低癌细胞的生长速率、降低转移的发生率或数量、减小肿瘤大小、抑制肿瘤生长、减少肿瘤或癌细胞的血液供应、促进针对癌细胞或肿瘤的免疫响应、预防或抑制癌症的发展或延长癌症受试者的寿命而对受试者的癌症产生负面影响的任何剂。
[0683]
在一些实施方案中，抗癌剂或疗法可以是与本公开联合改善治疗的治疗效果的化学治疗剂、或放射疗法、免疫治疗剂、手术、或任何其他治疗剂。
[0684]
在一个实施方案中，可以使用国际专利申请号wo2016164580中教导的方法，将包含cd19 car的ca2效应子模块与氨基嘧啶衍生物比如burkit酪氨酸受体激酶(btk)抑制剂联合使用，将该专利的内容通过引用整体并入本文。
[0685]
在一些实施方案中，本公开的组合物可以与除了本文所述的本发明疗法之外的免疫治疗剂联合使用，所述免疫治疗剂比如对肿瘤细胞表面上的一些靶分子特异的抗体。
[0686]
示例性化学疗法包括但不限于阿西维辛(acivicin)；阿柔比星(aclarubicin)；盐酸阿考达唑(acodazole hydrochloride)；阿克罗宁(acronine)；阿多来新(adozelesin)；阿地白介素(aldesleukin)；六甲密胺(altretamine)；安波霉素(ambomycin)；乙酸阿美蒽醌(ametantrone acetate)；安吖啶(amsacrine)；阿那曲唑(anastrozole)；安曲霉素
(anthramycin)；天冬酰胺酶(asparaginase)；asperrin、舒林酸(sulindac)、姜黄素(curcumin)、烷化剂，包括：氮芥，比如二氯甲基二乙胺(mechlor-ethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)和苯丁酸氮芥(chlorambucil)；亚硝脲类，比如卡莫司汀(bc u)、洛莫司汀(ccnu)和司莫司汀(甲基-cc u)；乙烯亚胺(thylenimine)/甲基蜜胺(methylmelamine)，比如三乙撑蜜胺(thriethylenemelamine)(tem)、三乙烯(triethylene)、三亚乙基硫代磷酰胺(thiophosphoramide，噻替派)、六甲三聚氰胺(hmm，六甲蜜胺)；烷基磺酸盐类，比如白消安；三嗪类，比如达卡巴嗪(dtic)；抗代谢物，包括叶酸类似物比如甲氨蝶呤和三甲曲沙(trimetrexate)、吡咯烷类似物比如5-氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、吉西他滨、胞嘧啶阿糖胞苷(arac，阿糖胞苷)、5-阿扎胞苷、2，2
′‑
二氟脱氧胞苷、嘌呤类似物比如6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、2
’‑
脱氧柯福霉素(喷司他丁)、赤羟基壬基腺嘌呤(ehna)、氟达拉滨磷酸盐和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨，2-cda)；天然产物，包括抗有丝分裂药物，比如紫杉醇、长春花生物碱，包括长春碱(vlb)、长春新碱和长春瑞滨、泰素帝(taxotere)、雌莫司汀和磷酸雌莫司汀；表鬼臼毒素类，比如依托泊苷和替尼泊苷；抗生素类，比如放线菌素d、道诺霉素(红比霉素)、多柔比星、米托蒽醌、伊达比星、博来霉素、普卡霉素(光神霉素)、丝裂霉素c和放线菌素；酶类，比如l-天冬酰胺酶，细胞因子类，比如干扰素(ifn)-γ、肿瘤坏死因子(tnf)-α、tnf-β和gm-csf，抗血管生成因子，比如血管抑素和内皮抑素，fgf或vegf抑制剂，比如血管生成因子受体的可溶性形式，包括可溶性vgf/vegf受体，铂配位络合物，比如顺铂和卡铂，蒽二酮类，比如米托蒽醌，取代脲，比如羟基脲，甲基肼衍生物，包括n-甲基肼(miff)和丙卡巴肼，肾上腺皮质抑制剂，比如米托坦(o-ddd)和氨鲁米特；激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂，比如泼尼松及其等同物、地塞米松和氨鲁米特；孕激素，比如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮；雌激素，比如乙酚和炔雌醇等同物；抗雌激素，比如他莫昔芬；雄激素类，包括丙酸睾丸酮和氟甲睾酮/等同物；抗雄激素类，比如氟他胺、促性腺激素释放激素类似物和亮丙瑞林；非甾体抗雄激素，比如氟他胺；激酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、甲基化抑制剂、蛋白酶体抑制剂、单克隆抗体、氧化剂、抗氧化剂、端粒酶抑制剂、bh3模拟物、泛素连接酶抑制剂、stat抑制剂和受体酪氨酸激酶抑制剂，比如甲磺酸伊马替尼(上市为gleevac或glivac)和埃罗替尼(一种egf受体抑制剂)，现上市为tarveca；抗病毒药，比如磷酸奥司他韦、两性霉素b和帕利珠单抗；sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老衍生抑制剂1；磷乙酰门冬氨酸(sparfosic acid)；穗霉素d(spicamycin d)；螺莫司汀(spiromustine)；脾脏五肽(splenopentin)；海绵抑素1(spongistatin 1)；角鲨胺；斯替皮米德(stipiamide)；基质分解素抑制剂；索非诺辛(sulfinosine)；超活性血管活性肠肽拮抗剂；维拉雷琐(velaresol)；藜芦明(veramine)；威尔丁(verdin)；维替泊芬(verteporfin)；长春瑞滨；维萨汀(vinxaltine)；维他新(vitaxin)；伏氯唑；扎诺特隆；折尼铂(zeniplatin)；亚苄维(zilascorb)和净司他丁斯酯(zinostatin stimalamer)；pi3kβ小分子抑制剂、gsk2636771；泛pi3k抑制剂(bkm120)；braf抑制剂。维莫非尼(vemurafenib)(日沛乐(zelboraf))和达拉非尼(dabrafenib)(泰菲乐(tafinlar))；或前述项的任何类似物或衍生物和变体。
[0687]
放射治疗剂和因素包括诱导dna损伤的辐射和波，例如γ照射、x射线、uv照射、微波、电子发射、放射性同位素等等。通过用上述形式的辐射照射局部肿瘤部位，可以实现治
疗。最有可能的是，所有这些因素对dna、dna的前体、dna的复制和修复以及染色体的组装和维护产生广泛范围的损伤。x射线的剂量范围为从长期(3至4周)的50至200伦琴的每日剂量到2000至6000伦琴的单剂量的范围。放射性同位素的剂量范围变化很大，取决于同位素的半衰期、发射的辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的摄取。
[0688]
在一些实施方案中，化学治疗剂可以是免疫调节剂，比如来那度胺(len)。最近的研究证明，来那度胺可以增强car修饰的t细胞的抗肿瘤功能(otahal等人，oncoimmunology，2015，5(4)：e1115940)。抗肿瘤抗体的一些实例包括托珠单抗(tocilizumab)、司妥昔单抗(siltuximab)。
[0689]
可以与本公开的组合物联合使用的其他剂还可包括但不限于，影响细胞表面受体及其配体比如fas/fas配体、dr4或dr5/trail和gap连接的上调的剂；细胞抑制和分化剂；细胞粘附抑制剂，比如如黏着斑激酶(fak)抑制剂和洛伐他汀；或增加超增殖细胞对凋亡诱导剂比如抗体c225的敏感性的剂。
[0690]
联合可包括同时或分别施用本公开的组合物和其他剂。可替代地，本发明的免疫疗法可以在其他剂/疗法之前或之后，间隔范围从几分钟、几天、几周到几个月。
[0691]
4.疾病
[0692]
本公开提供了降低有需要的受试者的肿瘤体积或负荷的方法，所述方法包括向受试者引入本公开的组合物。
[0693]
本公开还提供了用于治疗受试者中的癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的经基因修饰以表达本公开的至少一种ca2效应子模块的效应免疫细胞。
[0694]
癌症
[0695]
可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)来治疗各种癌症。如本文所用的，术语“癌症”是指以倾向于侵入周围组织并转移到新的身体部位的间变性细胞的增殖为特征的任何恶性肿瘤，并且还指以这样的恶性肿瘤生长为特征的病理状况。癌症可以是肿瘤或血液恶性肿瘤，并且包括但不限于所有类型的淋巴瘤/白血病、癌和肉瘤，比如在肛门、膀胱、胆管、骨、脑、乳房、子宫颈、结肠/直肠、子宫内膜、食道、眼、胆囊、头与颈、肝、肾、喉、肺、纵隔(胸部)、口腔、卵巢、胰腺、阴茎、前列腺、皮肤、小肠、胃、脊髓、尾骨、睾丸、甲状腺和子宫中发现的那些癌症或肿瘤。
[0696]
可以用本公开的组合物治疗的癌的类型包括但不限于，乳头状瘤/癌、绒毛膜癌、内胚窦瘤、畸胎瘤、腺瘤/腺癌、黑色素瘤、纤维瘤、脂肪瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、间皮瘤、血管瘤、骨瘤、软骨瘤、胶质瘤、淋巴瘤/白血病、鳞状细胞癌、小细胞癌、大细胞未分化癌、基底细胞癌和鼻腔鼻窦未分化癌。
[0697]
可以用本公开的组合物治疗的肉瘤类型包括但不限于，软组织肉瘤，比如腺泡状软组织肉瘤、血管肉瘤、皮肤纤维肉瘤、硬纤维瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤和askin瘤、ewing肉瘤(原始神经外胚层瘤)、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤和软骨肉瘤。
[0698]
感染性疾病
[0699]
在一些实施方案中，本公开的ca2生物回路可用于治疗感染性疾病。本公开的ca2
生物回路可以引入适合于过继细胞转移的细胞中，比如巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞和/或t细胞。通过本公开的ca2生物回路治疗的感染性疾病可以是由病毒、细菌、真菌和/或寄生虫引起的疾病。本公开的il15-il15ra有效负载可用于增进免疫细胞增殖和/或用于治疗感染性疾病的免疫细胞的持久性。
[0700]“感染性疾病”在本文中是指由感染哺乳动物细胞(优选人细胞)并引起疾病状况的任何病原体或因子引起的疾病。病原体或因子的实例包括细菌、酵母、真菌、原生动物、支原体属、病毒、朊病毒和寄生虫。实例包括涉及下列疾病的那些：(a)病毒性疾病，例如由下列病毒的感染引起的疾病：腺病毒、疱疹病毒(例如，hsv-i、hsv-ii、cmv或vzv)、痘病毒(例如，正痘病毒属，比如天花或牛痘或传染性软疣)、小核糖核酸病毒(例如，鼻病毒或肠道病毒)、正粘病毒(例如流感病毒)、副粘病毒(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒和呼吸道合胞病毒(rsv))、冠状病毒(例如，sars)、乳多空病毒(例如乳头瘤病毒，比如引起生殖器疣、寻常疣或足底疣的那些)、肝病毒(例如，乙型肝炎病毒)、黄病毒(例如，丙型肝炎病毒或登革热病毒)或逆转录病毒(例如慢病毒，比如hiv)；(b)细菌性疾病，例如由下列细菌的感染引起的疾病：例如埃希菌属、肠杆菌属、沙门菌属、葡萄球菌属、志贺菌属、李斯特菌属、产气杆菌属、螺杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、链球菌属、衣原体属、支原体属、肺炎球菌属、奈瑟菌属、梭菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、分枝杆菌属、弯曲杆菌属、弧菌属、沙雷菌属、普罗威登斯菌属、色杆菌属、布鲁菌属、耶尔森菌属、嗜血杆菌属或博德特菌属；以及(c)其他传染病，比如衣原体、真菌疾病，包括但不限于念珠菌病、曲霉病、组织胞浆菌病、隐球菌性脑膜炎，寄生虫病，包括但不限于疟疾、卡氏肺孢子菌肺炎、利什曼病、隐孢子虫病、弓形体病和锥虫感染，以及引起人疾病的朊病毒感染，比如克雅病(creutzfeldt-jakob disease(cjd)、变异型克雅病(vcjd)、格斯特曼-斯特劳斯勒-申克综合征(gerstmann-straussler-scheinker syndrome)、致死性家族性失眠症和库鲁病(kuru)。
[0701]
联合治疗
[0702]
本公开进一步涉及本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)用于治疗一种或多种形式的癌症的用途，将它们与其他药物和/或其他治疗方法，例如与已知的药物和/或已知的治疗方法，例如目前用于治疗这些疾患的那些药物和/或治疗方法联合。例如，本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)也可以与一种或多种另外的抗癌治疗比如生物治疗、化学疗法和放射疗法结合施用。因此，治疗可以包括，例如，伊马替尼(gleevac)、全反式维甲酸、单克隆抗体治疗(吉妥珠单抗、奥唑米星)、化学疗法(例如，苯丁酸氮芥、泼尼松、泼尼松龙、长春新碱、阿糖胞苷、氯法拉滨、法尼基转移酶抑制剂、地西他滨、mdr1抑制剂)、利妥昔单抗、干扰素-α、蒽环类临床药物(比如柔红霉素或伊达比星)、l-天冬酰胺酶、多柔比星、环磷酰胺、多柔比星、博来霉素、氟达拉滨、依托泊苷、喷司他丁或克拉屈滨)、骨髓移植物、干细胞移植物、放射疗法、抗代谢药(甲氨蝶呤和6-巯基嘌呤或在国际专利号wo2017/180587(将其内容通过引用整体并入本文)的表5中教导的任何抗体或它们的组合。
[0703]
与放射的联合
[0704]
放射疗法(也称为放疗、x射线疗法或照射)是利用电离辐射杀死癌细胞和缩小肿
瘤。放射疗法可以通过外束放射治疗(ebrt)在外部施用，也可以通过近距离放射疗法在内部进行。放射疗法的效果定位并且局限于正在治疗的区域。放射疗法可用于治疗几乎所有类型的实体瘤，包括脑癌、乳腺癌、宫颈癌、喉癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、子宫癌或软组织肉瘤。放射也用于治疗白血病和淋巴瘤。
[0705]
与化学疗法联合
[0706]
化学疗法是用能破坏癌细胞的药物治疗癌症。在当前用法中，术语“化学疗法”通常是指通常影响快速分裂细胞的细胞毒性药物，与靶向治疗相反。化疗药物以各种可能的方式干扰细胞分裂，例如干扰dna的复制或新形成染色体的分离。大多数形式的化学疗法靶向所有快速分裂的细胞，并且对癌细胞没有特异性，不过某种程度的特异性可能来自许多癌细胞不能修复dna损伤，而正常细胞通常可以修复。
[0707]
大多数化疗方案是联合给予的。示例性化学治疗剂包括但不限于5-fu增强剂、9-ac、ag2037、ag3340、聚集蛋白聚糖酶抑制剂、氨鲁米特、安吖啶(m-amsa)、天冬酰胺酶、阿扎胞苷、巴马司他(bb94)、bay 12-9566、bch-4556、双-萘酰亚胺、白消安、卡培他滨、卡铂、6
[0708]
osan、cdk4/cdk2抑制剂、苯丁酸氮芥、ci-994、顺铂、克拉屈滨、cs-682、阿糖胞苷hcl、d2163、更生霉素、柔红霉素hcl、depocyt、德西氟萨米得(dexifosamide)、多西他赛、多拉司他汀(dolastain)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、dx8951f、e 7070、egfr、表柔比星、促红细胞生成素、雌莫司汀磷酸钠、依托泊苷(vp16-213)、法尼基转移酶抑制剂、fk 317、夫拉平度(flavopiridol)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨、氟尿嘧啶(5-fu)、氟他胺(flutamide)、弗拉吉林(fragyline)、吉西他滨、六甲三聚氰胺(hmm)、羟基脲(hydroxyurea)(羟基脲(hydroxycarbamide))、异环磷酰胺、干扰素alfa-2a、干扰素alfa-2b、白细胞介素-2、伊立替康、isi641、云芝多糖(krestin)、柠檬醛dp 2202、乙酸亮丙瑞林(lhrh释放因子类似物)、左旋咪唑、ligla(γ-亚麻酸锂)、罗丁(lodine)种子、洛美曲索(lometexol)、洛莫司汀(ccnu)、马立司他(marimistat)、氮芥hcl(氮芥)、醋酸甲地孕酮、葡甲胺(meglamine)gla、巯嘌呤、美司钠(mesna)、米托胍腙(mitoguazone)(甲基-gag；甲基乙二醛双-脒基腙；mgbg)、米托坦(o.p
′‑
ddd)、米托蒽醌、米托蒽醌hc1、mmi270、mmp、mta/ly 231514、奥曲肽、odn 698、ok-432、口服铂类、口服紫杉烷、紫杉醇(taxol.rtm.)、parp抑制剂、pd 183805、喷司他丁(2
’‑
脱氧柯福霉素)、pkc 412、普卡霉素、丙卡巴肼hcl、psc 833、雷替曲塞(ralitrexed)、ras法尼基转移酶抑制剂、ras癌基因抑制剂、司莫司汀(甲基-ccnu)、链脲佐菌素(streptozocin)、苏拉明(suramin)、枸橼酸他莫昔芬、紫杉烷类似物、替莫唑胺、替尼泊苷(vm-26)、硫鸟嘌呤、噻替派、托泊替康、酪氨酸激酶、uft(替加氟(tegafur)/尿嘧啶)、戊柔比星(valrubicin)、硫酸长春碱、硫酸长春地辛、vx-710、vx-853、ym 116、zd 0101、zd 0473/anormed、zd 1839、zd 9331。
[0709]
免疫肿瘤学和细胞疗法
[0710]
癌症免疫学领域的最新进展允许开发若干方法来帮助免疫系统阻止癌症。这样的免疫治疗方法包括通过单克隆抗体或通过离体工程化t细胞(例如，含有嵌合抗原受体或工程化t细胞受体)的过继转移来靶向癌症抗原。
[0711]
在一些实施方案中，本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)可用于调节或改变或利用免疫系统来靶向一种或多种癌症。这种方法也可以与其他这样的生物方法一起考虑，例如免疫响应调节疗法，比如施
用干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、其他单克隆抗体、疫苗、基因疗法和非特异性免疫调节剂，也可以将其设想为与本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)联合的抗癌疗法。
[0712]
癌症免疫疗法是指一套多样的被设计为诱导患者的自身免疫系统来对抗癌症的治疗策略。在一些实施方案中，将本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)设计为免疫肿瘤疗法。
[0713]
细胞疗法
[0714]
有几种类型的细胞免疫疗法，包括肿瘤浸润淋巴细胞(til)疗法、携带嵌合抗原受体(car)的基因工程化t细胞和重组tcr技术。
[0715]
根据本公开，ca2生物回路和系统可用于开发和实施细胞疗法，比如过继细胞疗法。国际公开wo2017/180587的图8-13中给出了在细胞疗法中有用的某些ca2效应子模块(将各自的内容通过引用整体并入本文)。ca2生物回路、ca2效应子模块及其sre和有效负载可用于细胞疗法中，以实现tcr去除-tcr基因破坏、tcr工程、调节带表位标签的受体、用于刺激t细胞的apc平台、作为增强离体apc刺激的工具、改进t细胞扩增方法、用抗原进行离体刺激、tcr/car联合、til的操纵或调节、同种异体细胞疗法、t细胞疗法与其他治疗线(例如放射、细胞因子)联合、编码工程化tcr或修饰tcr、或增强除tcr外的t细胞(例如通过引入细胞因子基因、检查点抑制剂pd1、ctla4的基因)。
[0716]
在一些实施方案中，获得了支持细胞疗法的改善的响应率。
[0717]
通过调节或微调有效负载，例如在t细胞、nk细胞或其他免疫相关细胞中的受体或途径成分，可以实现细胞群的扩增和持久性。在一些实施方案中，将ca2生物回路、sre或ca2效应子模块设计成在空间上和/或在时间上控制增强t细胞或nk细胞响应的蛋白质的表达。在一些实施方案中，将ca2生物回路、sre或ca2效应子模块设计成在空间上和/或在时间上控制抑制t细胞或nk细胞响应的蛋白质的表达。
[0718]
在一些实施方案中，将ca2生物回路、sre或ca2效应子模块设计成重塑肿瘤微环境，从而将生物回路或药物组合物的效用扩展到直接细胞杀伤之外。
[0719]
在一些实施方案中，将ca2生物回路、sre或ca2效应子模块设计成降低、减轻或消除car细胞因子风暴。在一些实施方案中，这样的降低、减轻和/或消除发生在实体瘤或肿瘤微环境中。
[0720]
在一些实施方案中，ca2效应子模块可以编码一种或多种细胞因子。
[0721]
在一些实施方案中，用于细胞扩增的本公开的ca2效应子模块可包括包含ras超家族基因的任何一种的有效负载。
[0722]
可以利用免疫系统来治疗癌症以外的疾病。ca2生物回路、它们的组分、sre或ca2效应子模块可用于治疗疾病的免疫疗法中，所述疾病包括但不限于，自身免疫性疾病、过敏、移植物抗宿主病以及可能导致免疫缺陷的疾病和疾患，比如获得性免疫缺陷综合征(aids)。
[0723]
在一些实施方案中，本公开的有效负载可以是嵌合抗原受体(car)，当其被转导到免疫细胞(例如，t细胞和nk细胞)中时，可以针对表达被car的细胞外靶部分识别的分子的靶标(例如，肿瘤细胞)，将免疫细胞重定向。
[0724]
在一些实施方案中，car构建体的靶向部分可以是靶分子的天然配体，或其能够结
3、stat-5、stat-6、stead、stn、生存素、syk-zap70、ta-90(mac-2结合蛋白亲环素c-相关蛋白)、taal6、tacstd1(肿瘤相关钙信号转导子1)、tacstd2、tag-72-4、tage、tarp(t细胞受体γ交替阅读框蛋白)、tel/aml1融合蛋白、tem1、tem8(内皮唾液酸蛋白或cd248)、tgfβ、tie2、tlp、tmprss2 ets融合基因、tnf-受体(tnf-α受体、tnf-β受体；或tnf-γ受体)、转铁蛋白受体、tps、trp-1(酪氨酸相关蛋白1)、trp-2、trp-2/int2、tsp-180、vegf受体、wnt、wt-1(wilm瘤抗原)和xage。
[0727]
作为非限制性实例，本公开的靶向部分可以是识别肿瘤特异性抗原(tsa)的scfv抗体，例如特异性地识别和结合人间皮素的抗体ss、ssi和hn1的scfv(美国专利第9,359,447号)、gd2抗体的scfv(美国专利第9,315,585号)、cd19抗原结合结构域(美国专利第9,328,156号)；nkg2d配体结合结构域(美国专利第9,273,283号；美国专利公开号us20160311906a1)；人抗间皮素scfv，其包含美国专利第9,272,002号的seq id no.：11和12；抗csl结合剂(美国专利公开号us20160075784)；抗bcma结合结构域(国际专利公开号wo2016/014565)；具有美国专利第9,102,761号中的seq id no.：20的抗cd19 scfv抗体；具有国际专利公开号2016/025880的seq id no.：59和79的氨基酸序列的gfrα4抗原结合片段；抗cll-1(c型凝集素样分子1)结合结构域，其具有国际专利公开号wo2016014535的seq id no.：47、44、48、49、50、39、40、41、42、43、45、46、51、73、70、74、75、76、65、66、67、68、69、71、72、77、195、86、83、87、88、89、78、79、80、81、82、84、85、90和196的氨基酸序列的结合结构域；cd33结合结构域，其具有国际专利公开号wo2016014576的seq id no.：39-46的氨基酸序列；gpc3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3)结合结构域(国际专利公开号wo2016036973的seq id no.：2和seq id no.：4)；gfra4(糖基磷脂酰肌醇(gpi)连接的gdnf家族α-受体4细胞表面受体)结合结构域(国际专利公开号wo2016025880)；cd123结合结构域，其具有国际专利公开号wo20160258896的seq id no.：480、483、485、478、158、159、160、157、217、218、219、216、276、277、278和275的氨基酸序列；抗ror1抗体或其片段(国际专利公开号wo2016016344)；gpc-3特异性scfv(国际专利公开号wo2016049459的seq id no.：2)；cspg4的scfv(国际专利公开号wo2015080981的seq id no.：2；叶酸受体α的scfv(美国专利公开号us20170002072a1)；将各自的内容通过引用整体并入本文。
[0728]
car融合多肽的细胞内结构域在与其靶分子结合后，向效应免疫细胞传递信号，活化效应免疫细胞的至少一种正常效应功能，包括细胞溶解活性(例如，细胞因子分泌)或辅助细胞活性。因此，细胞内结构域包含t细胞受体的(tcr)的“细胞内信号传导结构域”。在一些实施方案中，本公开的细胞内信号传导结构域可以含有被称为免疫受体酪氨酸活化基序(itam)的信号传导基序。在一些实施方案中，本公开的细胞内区域还包含一个或多个共刺激信号传导结构域，其向效应免疫细胞提供另外的信号。这些共刺激信号传导结构域与信号传导结构域相结合，可以进一步提高car工程改造的免疫细胞(例如car t细胞)的扩增、活化、记忆、持久性和肿瘤根除效率。在一些情况下，共刺激信号传导区含有一个或多个细胞内信号传导和/或共刺激分子的1个、2个、3个或4个细胞质结构域。
[0729]
在本公开的一个实施方案中，本公开的car是cd19特异性car。在本公开的上下文中，效应子模块可包含与cd19 car融合构建体可操作连接的ca2 dd。
[0730]
在一些实施方案中，本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)可用于调节或改变或利用免疫系统，以靶向一种或
多种自身响应性免疫组分，比如自身抗体和自身响应性免疫细胞，从而减轻自身免疫性疾病。在一些实施方案中，本公开的sre可用于调控或调节基于嵌合自身抗体受体(caar)的t细胞疗法，以便优化其在自身免疫性疾病治疗中的效用(ellebrecht c.t.等人，science.2016.jul 8；353(6295)：179-84；将其内容通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，将ca2生物回路、sre或ca2效应子模块设计成调节treg，以减轻自身免疫性疾病。在这种情况下，可以使用如本文所述的单调节模块或具有多个调节特征的模块来调节il2。
[0731]
在一些实施方案中，ca2生物回路、sre或ca2效应子模块可用于基于免疫疗法的治疗，以减轻或缓和移植物抗宿主病(gvhd)。gvhd是指在干细胞或骨髓移植后同种异体供体免疫细胞对宿主组织产生响应的情况。在一些实施方案中，将ca2生物回路、sre或ca2效应子模块设计成调控调节性t细胞(treg)，用于治疗gvhd。在一个实施方案中，含有编码肿瘤坏死因子-α的ca2效应子模块的ca2生物回路可用于调控调节性t细胞(treg)，以将gvhd降至最低限度(pierini，a.等人，blood.2016.aug 11；128(6)：866-71；将其内容通过引用整体并入本文)。
[0732]
在一些实施方案中，将ca2生物回路、sre或ca2效应子模块设计成比本领域的其他生物回路或开关的免疫原性显著更低。
[0733]
如本文所用的，“免疫原性显著更低”是指可检测到的免疫原性降低。在另一个实施方案中，该术语是指免疫原性的成倍降低。在另一个实施方案中，该术语指的是指这样的降低，使得可以施用有效量的ca2生物回路、sre或ca2效应子模块而不触发可检测的免疫响应。在另一个实施方案中，该术语是指这样的降低，使得ca2生物回路、sre或ca2效应子模块可以重复施用而不引发免疫响应。在另一个实施方案中，所述降低使得ca2生物回路、sre或ca2效应子模块可以重复施用而不引发免疫响应。
[0734]
在另一个实施方案中，ca2生物回路、sre或ca2效应子模块的免疫原性比其未修饰的对应物或参考化合物低2倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低3倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低5倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低7倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低10倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低15倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低50倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低100倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低200倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低500倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低1000倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低2000倍。在另一个实施方案中，免疫原性降低另一个倍差。
[0735]
确定免疫原性的方法是本领域熟知的，并且包括例如测量细胞因子(例如il-12、ifn-α、tnf-α、rantes、mip-lα或β、il6、ifn-β或il8)的分泌，测量dc活化标志物(例如cd83、hla-dr、cd80和cd86)的表达，或测量作为适应性免疫响应的佐剂的能力。
[0736]
疾病和毒素
[0737]
可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)来治疗各种感染性疾病。如本文所用的，术语“感染性疾病”是指由生物比如细菌、病毒、真菌或寄生虫引起的任何疾患。
[0738]
可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)来处理各种毒素。毒素的非限制性实例包括蓖麻毒素、炭疽杆菌毒素、志贺毒素和志贺样毒素、肉毒毒素。
[0739]
可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)来治疗各种热带疾病。热带疾病的非限制性实例包括基孔肯雅热、登革热、恰加斯病、狂犬病、疟疾、埃博拉病毒、马尔堡病毒、西尼罗河病毒、黄热病、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒。
[0740]
可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)来治疗各种食源性疾病和胃肠炎。食源性疾病和胃肠炎的非限制性实例包括轮状病毒属、诺瓦克病毒(诺如病毒)、空肠弯曲杆菌、艰难梭菌、溶组织内阿米巴、幽门螺杆菌、金黄色葡萄球菌肠毒素b、甲型肝炎病毒(hav)、戊型肝炎、单核细胞增生李斯特菌、沙门菌属、产气荚膜梭菌和沙门菌属。
[0741]
可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)来处理各种感染原。感染原的非限制性实例包括腺病毒、嗜吞噬细胞无形体(anaplasma phagocytophilium)、似蚓蛔线虫(ascaris lumbricoides)、炭疽杆菌(bacillus anthracis)、蜡状芽孢杆菌(bacillus cereus)、拟杆菌属物种(bacteriodes sp.)、巴马森林病毒(barmah forest virus)、杆状巴尔通体(bartonella bacilliformis)、汉氏巴尔通体(bartonella henselae)、五日热巴尔通体(bartonella quintana)、产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)β-毒素、百日咳博德特菌(bordetella pertussis)、副百日咳博德特菌(bordetella parapertussis)、伯氏疏螺旋体(borrelia burgdorferi)、宫本疏螺旋体(borrelia miyamotoi)、回归热疏螺旋体(borrelia recurrentis)、疏螺旋体属物种(borrelia sp.)、肉毒毒素、布鲁菌属物种(brucella sp.)、类鼻疽伯克霍尔德菌(burkholderia pseudomallei)、加利福尼亚脑炎病毒(california encephalitis virus)、弯曲杆菌属(campylobacter)、白色念珠菌(candida albicans)、基孔肯雅病毒(chikungunya virus)、鹦鹉热衣原体(chlamydia psittaci)、沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)、华支睾吸虫(clonorchis sinensis)、艰难梭菌(clostridium difficile bacteria)、破伤风梭菌(clostridium tetani)、科罗拉多蜱热病毒(colorado tick fever virus)、白喉棒状杆菌(corynebacterium diphtheriae)、微小棒状杆菌(corynebacterium minutissimum)、贝氏柯克斯体(coxiella burnetii)、柯萨奇病毒a(coxsackie a)、柯萨奇病毒b(coxsackie b)、克里米亚-刚果出血热病毒(crimean-congo hemorrhagic fever virus)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)、登革热病毒(dengue virus)、东方马脑炎病毒(eastern equine encephalitis virus)、埃博拉病毒(ebola virus)、埃可病毒(echovirus)、查菲埃利希体(ehrlichia chaffeensis)、马埃利希体(ehrlichia equi.)、埃利希体属物种(ehrlichia sp.)、溶组织内阿米巴(entamoeba histolytica)、肠杆菌属物种(enterobacter sp.)、粪肠球菌(enterococcus faecalis)、肠道病毒71型(enterovirus 71)、爱泼斯坦-巴尔病毒(epstein-barr virus)(ebv)、红斑丹毒丝菌(erysipelothrix rhusiopathiae)、大肠杆菌(escherichia coli)、黄病毒属(flavivirus)、坏死梭杆菌(fusobacterium necrophorum)、阴道加德纳菌(gardnerella vaginalis)、b族链球菌(group b streptococcus)、埃及嗜血杆菌(haemophilus aegyptius)、杜克雷嗜血杆菌(haemophilus ducreyi)、流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)、汉坦病毒属(hantavirus)、幽门螺杆菌(helicobacter pylori)、甲型肝炎(hepatitis a)、乙型肝炎(hepatitis b、丙型肝炎(hepatitis c)、丁型
肝炎(hepatitis d)、戊型肝炎(hepatitis e)、单纯疱疹病毒(herpes simplex)1型和2型、6型人疱疹病毒、8型人疱疹病毒、人免疫缺陷病毒1型和2型、人t细胞白血病病毒i型和ii型、流感病毒(a、b、c)、詹姆斯敦峡谷病毒(jamestown canyon virus)、日本脑炎抗原复合物(japanese encephalitis antigenic)、日本脑炎病毒(japanese encephahtis virus)、约翰
·
坎宁安病毒(john cunninham virus)、胡宁病毒(juninvirus)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(kaposi
′
s sarcoma-associated herpes virus)(kshv)、肉芽肿克雷伯菌(klebsiella granulomatis)、克雷伯菌属物种(klebsiella sp.)、卡萨诺尔森林病病毒(kyasanur forest disease virus)、拉克罗斯病毒(la crosse virus)、拉沙病毒(lassavirus)、嗜肺军团菌(legionella pneumophila)、问号钩端螺旋体(leptospira interrogans)、单核细胞增生李斯特菌(listeria monocytogenes)、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus)、狂犬病病毒属(lyssavirus)、马秋波病毒(machupovirus)、马尔堡病毒(marburg virus)、麻疹病毒(measles virus)、mers冠状病毒(mers-cov)、栖息微球菌(micrococcus sedentarius)、活动弯曲杆菌属物种(mobiluncus sp.)、软疣痘病毒属(molluscipoxvirus)、卡他莫拉菌(moraxella catarrhalis)、morbilli-rubeola病毒、腮腺炎病毒(mumpsvirus)、麻风分枝杆菌(mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(mycobacterium ulcerans)、生殖支原体(mycoplasma genitalium)、支原体属物种(mycoplasma sp.)、内罗毕病毒属(nairovirus)、淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis)、诺卡氏菌属(nocardia)、诺瓦克病毒(norwalk virus)、诺如病毒(norovirus)、鄂木斯克出血热病毒(omsk hemorrhagic fever virus)、乳头瘤病毒(papilloma virus)、副流感病毒1-3型(parainfluenza 1-3)、副痘病毒属(parapoxvirus)、细小病毒bl9(parvovirus bl9)、消化链球菌属物种(peptostreptococccus sp.)、疟原虫属物种(plasmodium sp.)、i型、ii型和iii型脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、变形杆菌属物种(proteus sp.)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、类鼻疽假单胞菌(pseudomonas pseudomallei)、假单胞菌属物种(pseudomonas sp.)、狂犬病病毒(rabies virus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)、蓖麻毒素(ricin toxin)、澳洲立克次体(rickettsia australis)、康诺尔立克次体(rickettsia conori)、弗诺立克次体(rickettsia honei)、普氏立克次体(rickettsia prowazekii)、罗斯河病毒(ross river virus)、轮状病毒属(rotavirus)、风疹病毒(rubella virus)、圣路易斯脑炎(saint louis encephalitis)、伤寒沙门菌(salmonella typhi)、疥螨(sarcoptes scabiei)、sars相关冠状病毒(sars-cov)、沙雷菌属物种(serratia sp.)、志贺毒素和志贺样毒素、志贺菌属物种(shigella sp.)、辛诺柏病毒(sin nombre virus)、雪鞋野兔病毒(snowshoe hare virus)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)、念珠状链杆菌(streptobacillus moniliformis)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、无乳链球菌(streptococcus agalactiae)、无乳链球菌(streptococcus agalactiae)、a-h组链球菌(streptococcus group a-h)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)、梅毒螺旋体梅毒亚种(treponema pallidum subsp.pallidum)、苍白密螺旋体carateum变种(treponema pallidum var.carateum)、苍
白密螺旋体endemicum变种(treponema pallidum var.endemicum)、惠普尔养障体(tropheryma whippelii)、解脲脲原体(ureaplasma urealyticum)、水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus)、天花病毒(variola virus)、霍乱弧菌(vibrio cholerae)、西尼罗河病毒(west nile virus)、黄热病病毒(yellow fever virus)、小肠结肠炎耶尔森菌(yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森菌(yersiniapestis)和寨卡病毒(zika virus)。
[0742]
可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)来治疗各种罕见疾病。如本文所用的，术语“罕见疾病”是指影响小百分比人群的任何疾病。
[0743]
可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)来治疗各种自身免疫性疾病和自身免疫相关疾病。如本文所用的，术语“自身免疫性疾病”是指其中身体产生攻击其自身组织的抗体的疾病。作为非限制性实例，自身免疫性疾病可以是急性播散性脑脊髓炎(adem)、急性坏死性出血性白质脑炎、艾迪生病(addison’s disease)、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗gbm/抗tbm肾炎、抗磷脂综合征(aps)、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性自主神经机能异常、自身免疫性肝炎、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳疾病(aied)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性血小板减少性紫癜(atp)、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性荨麻疹、轴突和神经元神经病、巴洛病(balo disease)、白塞病(behcet’s disease)、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯特曼病(castleman disease)、乳糜泻、恰加斯病(chagas disease)、慢性疲劳综合征**、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(cidp)、慢性复发性多灶性骨髓炎(crmo)、查格-施特劳斯综合征(churg-strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮、克罗恩病、科根综合征(cogans syndrome)、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇病毒性心肌炎、crest病、原发性混合型冷球蛋白血症、脱髓鞘性神经病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克病(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德雷斯勒综合征(dressler’s syndrome)、子宫内膜异位症、嗜酸性粒细胞性食管炎、嗜酸性粒细胞性筋膜炎、结节性红斑、实验性过敏脑脊髓炎、伊文思综合征(evans syndrome)、纤维肌痛(fibromyalgia)**、纤维化性肺泡炎、巨细胞性动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞性心肌炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征(goodpasture’s syndrome)、肉芽肿性多血管炎(gpa)(以前称为韦格纳肉芽肿病)、格雷夫斯病(graves’disease)、格林-巴利综合征(guillain-barre syndrome)、桥本脑炎(hashimoto’s encephalitis)、桥本甲状腺炎(hashimoto’s thyroiditis)、溶血性贫血、过敏性紫癜(henoch-schonlein purpura)、妊娠疱疹(herpes gestationis)、低丙种球蛋白血症、特发性血小板减少性紫癜(itp)、iga肾病、igg4相关硬化性疾病、免疫调节性脂蛋白、包涵体肌炎、间质性膀胱炎、青少年关节炎、青少年糖尿病(1型糖尿病)、青少年肌炎、川畸综合征(kawasaki syndrome)、兰伯特-伊顿综合征(lambert-eaton syndrome)、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、木样结膜炎、线状iga病(lad)、狼疮(sle)、莱姆病(lyme disease)、慢性梅尼埃病(chronic，meniere’s disease)、显微镜下多血管炎、混合结缔组织病(mctd)、莫伦溃疡(mooren’s ulcer)、穆哈-哈伯曼病(mucha-habermann disease)、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(德维克)、中性粒细胞减少症、眼部瘢痕性类天疱疮、视神经炎、复发性风湿病(palindromic rheumatism)、
pandas(与链球菌感染相关的儿童自身免疫性神经精神障碍)、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(pnh)、帕里-罗姆伯格综合(parry romberg syndrome)、帕森-特纳综合征(parsonnage-turner syndrome)、睫状体平坦部炎(pars planitis)(周边葡萄膜炎)、天疱疮、周围神经病变、静脉周脑脊髓炎(perivenous encephalomyelitis)、恶性贫血、poems综合征、结节性多动脉炎、i、ii和iii型自身免疫性多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、黄体酮皮炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、银屑病、银屑病关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍、雷诺现象、响应性关节炎、反射性交感神经营养不良、赖特综合征(reiter’s syndrome)、复发性多软骨炎、不宁腿综合征、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、施密特综合征(schmidt syndrome)、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征(sjogren’s syndrome)、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征(stiff person syndrome)、亚急性细菌性心内膜炎(sbe)、苏萨克综合征(susac’s syndrome)、交感性眼炎、高安动脉炎(takayasu’s arteritis)、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、血小板减少性紫癜(ttp)、托洛萨-亨特综合征(tolosa-hunt syndrome)、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(uctd)、葡萄膜炎、血管炎、水疱大疱性皮肤病、白癜风和韦格纳肉芽肿病(现在称为肉芽肿性多血管炎(gpa))。
[0744]
可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)来治疗各种肾脏疾病。
[0745]
可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)来治疗各种心血管疾病。作为非限制性实例，心血管疾病可以是缺血性心脏病(也称为冠状动脉疾病)、脑血管疾病(中风)、外周血管疾病、心力衰竭、风湿性心脏病和先天性心脏病。
[0746]
可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)来治疗各种抗体缺陷病。作为非限制性实例，抗体缺陷病可以是x连锁无丙种球蛋白血症(xla)、常染色体隐性无丙种球蛋白血症(ara)、普通变异型免疫缺陷病(cvid)、igg(igg1、igg2、igg3和igg4)亚类缺陷病、选择性iga缺陷病、特异性抗体缺陷病(sad)、婴儿短暂性低丙种球蛋白血症、免疫球蛋白正常或升高的抗体缺陷病、选择性igm缺陷病、伴胸腺瘤免疫缺陷病(古德综合征(good’s syndrome))、运钴胺蛋白ii缺陷、疣、低丙种球蛋白血症、感染、先天性骨髓粒细胞缺乏症(whim)综合征、药物诱导的抗体缺陷、κ链缺陷、重链缺陷、减数分裂后分离(pms2)障碍和非特异性低丙种球蛋白血症。
[0747]
可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)来治疗各种眼部疾病。作为非限制性实例，眼部疾病可以是甲状腺眼病(ted)、格雷夫斯病(gd)和眼眶病、视网膜变性、白内障、视神经萎缩、黄斑变性、莱伯先天性黑朦(leber congenital amaurosis)、视网膜变性、视锥-视杆细胞营养不良、厄舍综合征(usher syndrome)、豹综合征(leopard syndrome)、畏光和光厌恶。
[0748]
可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)来治疗各种神经系统疾病。
[0749]
可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)来治疗各种心理障碍。
[0750]
可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)来治疗各种肺病。作为非限制性实例，肺病可以是石棉沉着病、哮喘、支气管扩张症、支气管炎、慢性咳嗽、慢性阻塞性肺疾病(copd)、哮吼、囊性纤维化、汉坦病毒属、特发性肺纤维化、百日咳、胸膜炎、肺炎、肺栓塞、肺动脉高压、结节病、睡眠呼吸暂停、肺活量测定、婴儿猝死综合征(sids)、结核、阿拉吉欧综合征(alagille syndrome)、自身免疫性肝炎、胆道闭锁、肝硬化、ercp(内镜逆行胰胆管造影术)和血色素沉着病。非酒精性脂肪性肝炎、卟啉病、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎。
[0751]
可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)来治疗各种骨病。作为非限制性实例，骨病可以是骨质疏松症、神经纤维瘤病、成骨不全症(oi)、佝偻病、骨肉瘤、软骨发育不全、骨折、骨髓炎、骨尤文瘤、骨软化症、髋关节发育不良、骨佩吉特病、大理石骨病、骨软骨瘤、骨癌、骨病、骨软骨病、骨瘤、纤维性发育不良、锁骨颅骨发育不全、破骨细胞瘤、骨囊肿、代谢性骨病、肢骨纹状肥大、骨痂、卡菲综合征(caffey syndrome)和下颌骨颜面发育不全。
[0752]
可以用本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)来治疗各种血液病。作为非限制性实例，血液病可以是贫血和ckd(对于卫生保健专业人员)、再生障碍性贫血和骨髓增生异常综合征、深静脉血栓形成、血色素沉着病、血友病、过敏性紫癜(henoch-schonlein purpura)、特发性血小板减少性紫癜、缺铁性贫血、恶性贫血、肺栓塞、镰状细胞贫血、镰状细胞性状和其他血红蛋白病、地中海贫血、血栓性血小板减少性紫癜和血管性血友病(von willebrand disease)。
[0753]
中枢神经系统(cns)
[0754]
在一些实施方案中，本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)可用于调节或改变或利用中枢神经系统中的蛋白质，包括脑脊髓(csf)蛋白质。
[0755]
在一些实例中，本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)可用于向中枢神经系统提供可调ert(酶替代疗法)产品。许多溶酶体贮积病(lsd)涉及中枢神经系统症状，比如精神发育迟滞、癫痫发作、深度神经变性、行为异常和精神运动缺陷。lsd的ert是现代分子医学中真正的成功案例之一。ert的成功应用依赖于受控的溶酶体蛋白(例如酶)和对中枢神经系统细胞的递送。
[0756]
在一些实例中，本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)可用于局部地产生针对cns和csf中的蛋白质聚集体的单克隆抗体。这样的抗体可用于治疗退行性疾病，如阿尔茨海默病(ad)、亨廷顿病(hd)和帕金森病(pd)。
[0757]
在其他实例中，本公开的药物组合物、ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)可用于调节中枢神经系统中的神经营养因子。
[0758]
基因编辑
[0759]
已经开发和修饰crispr-cas9系统用于基因编辑，所述系统被证明是一种高效和特异的技术，即使在真核细胞中也用于编辑核酸序列。许多研究者公开了对细菌crispr-cas系统的各种改良，并证明crispr-cas系统可用于操纵细胞中的核酸，比如哺乳动物细胞和植物细胞中的核酸。代表性参考文献包括美国专利第8,993,233号；第8,999,641号；第8,
945,839号；第8,932,814号；第8,906,616号；第8,895,308号；第8,889,418号；第8,889,356号；第8,871,445号；第8,865,406号；第8,771,945号；和第8,697,359号；美国专利公开号20150031134；20150203872；20150218253；20150176013；20150191744；20150071889；20150067922；和20150167000；将各自的内容通过引用整体并入本文。
[0760]
然而，控制crispr-cas系统(例如引导rna和核酸酶)的作用和活性一直具有挑战性，并且经常是有问题的。
[0761]
本公开的ca2生物回路和/或它们的任何组分可用于调控或调节crispr/cas9系统，以优化其效用。
[0762]
用于调节系统的示例在国际公开号wo2017/180587的图19a和图19b中示出(将其内容通过引用整体并入本文)。
[0763]
在一些实施方案中，本公开的ca2效应子模块的有效负载可以包括cas9酶的替代同工型或直向同源物。
[0764]
最常用的cas9来源于酿脓链球菌，并且ruvc结构域可因d10a突变而失活，hnh结构域可因h840a突变而失活。
[0765]
除了来源于酿脓链球菌的cas9之外，还可以将其他rna引导的核酸内切酶(rgen)用于可编程基因组编辑。已经鉴定了在600多种细菌菌株中的cas9序列。虽然cas9家族显示出高度多样性的氨基酸序列和蛋白质大小，但所有cas9蛋白共享具有中央hnh核酸酶结构域和分裂的ruvc/rhase h结构域的共同架构。
[0766]
在一些实施方案中，本公开的有效负载可以是分裂的cas-9(zetsche b等人，a split-cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation.nat biotechnol.2015feb；33(2)：139-42；将其内容通过引用整体并入本文)。
[0767]
除了cas9直向同源物外，其他cas9变体，比如无活性dcas9和具有不同功能的效应结构域的融合蛋白，可用作基因调节的平台。任何前述酶都可用于本公开中。
[0768]
基于crispr/cas9的ca2生物回路可以通过在国际公开号wo2016106244和gao y等人的complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dcas9 regulators.nat methods.2016dec；13(12)：1043-1049中教导的任何方法来生成，将每篇专利的内容通过引用整体并入本文)。
[0769]
还可利用crispr/cas9系统来调节基因表达，可与其基因编辑效用相结合。在一些实施方案中，本公开的ca2效应子模块的有效负载可包括crispr相关的转录活化因子，例如vp64-p65-rta(vpr)；或者抑制子，例如与crispr/cas9系统相关的kruppel相关盒(krab)。
[0770]
干细胞应用
[0771]
本公开的ca2生物回路和/或它们的任何组分可用于调节的细胞重编程、干细胞植入或其他应用，其中这样的重编程因子的受控或可调表达是有用的。
[0772]
本公开的ca2生物回路可用于对包括干细胞或诱导干细胞在内的细胞进行重编程。由takahashi和yamanaka(cell，2006.126(4)：663-76；将其通过引用整体并入本文)使用表达klf4、c-myc、oct4和sox2(另外统称为kmos)的病毒载体首次实现了诱导性多能干细胞(ipsc)的诱导。
[0773]
本公开的ca2效应子模块可包括包含任何下列基因的有效负载，所述基因包括但不限于oct，比如oct4；sox，比如sox1、sox2、sox3、sox15和sox18；nanog；klf，比如klf1、
klf2、klf4和klf5；myc，比如c-myc和n-myc；rem2；tert和lin28及其变体，这些基因支持细胞重编程。这样的重编程因子的序列在例如国际申请pct/us2013/074560中有教导，将其内容通过引用整体并入本文。
[0774]
本公开的ca2效应子模块可包括有效负载，所述有效负载包括有助于干细胞动员的任何因子。在自体干细胞疗法中，用于移植的干细胞的来源可包括骨髓、外周血单核细胞和脐带血。刺激干细胞使之从这些来源(例如骨髓)释出到血流中。因此，有足够的干细胞可供收集，用于将来回输。可以使用一种细胞因子策略或多种策略的联合来动员干细胞，包括但不限于粒细胞集落刺激因子(非格司亭)、粒细胞集落刺激因子(gm-csf)和化疗前细胞因子(化疗动员)。
[0775]
代谢肽和激素
[0776]
在一些实施方案中，本公开的ca2生物回路和/或它们的任何组分可用于调节肽(天然或合成)。天然存在的肽可包括但不限于肽激素、利钠肽、食品肽以及衍生物和前体。
[0777]
本公开的ca2生物回路和/或它们的任何组分还可用于激素或其他肽类药物的脉冲式释放。
[0778]
酶替代疗法(ert)
[0779]
酶替代疗法(ert)是一种替代患者中的酶的医学治疗。ert提供治疗干预，以解决在许多疾病中由缺陷酶引起的潜在的代谢缺陷。这样的疾患包括但不限于溶酶体贮积病(lsd)、先天性糖基化障碍和以细胞质中酶活性缺失或降低为特征的代谢性疾病。
[0780]
在一些实施方案中，本公开的ca2生物回路和/或它们的任何组分还可用于调节ert期间的酶活性。作为非限制性实例，本公开的ca2生物回路的有效负载可以是用于ert的功能性溶酶体酶，比如a-d-甘露糖苷酶、n-天冬氨酰-β-氨基葡萄糖苷酶、酸性脂肪酶；己糖胺酶a、a-半乳糖苷酶a、β-半乳糖苷酶、溶酶体蛋白酶、神经酰胺酶、岩藻糖苷酶；β-葡糖苷酶、n-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、硫酸酯酶、透明质酸酶、半乳糖脑苷脂酶；芳基硫酸酯酶a；n-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶；a-l-艾杜糖醛酸酶；艾杜糖醛酸硫酸酯酶；乙酰肝素磺酰胺酶；n-乙酰氨基葡萄糖苷酶；乙酰coa：a-氨基葡萄糖乙酰转移酶；n-乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶；n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶；n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶；β-葡糖醛酸糖苷酶；透明质酸酶；唾液酸酶；硫酸酯酶；鞘磷脂酶；酸性a-葡萄糖苷酶；β-甘露糖苷酶；组织蛋白酶k；β-己糖胺酶a；β-己糖胺酶b、a-n-乙酰半乳糖胺酶、唾液酸转运蛋白(sialin)和己糖胺酶。
[0781]
凝血
[0782]
凝血缺陷通常引起出血和/或血栓形成。最著名的凝血因子失常是血友病。三种主要形式为血友病甲(因子viii缺乏症)、血友病乙(因子ix缺乏症或“圣诞疾病”)和血友病c(因子xi缺乏，轻度出血倾向)。由凝血因子缺陷引起的其他疾患还包括但不限于，血管性血友病(von willebrand disease)(由冯
·
维勒布兰德因子(vwf)缺陷引起)、巨血小板综合征(伯纳德-索利尔综合征(bemard-soulier syndrome))(由vwf受体gpib的缺陷或缺乏引起)、血栓性静脉炎(由因子xii突变引起)、先天性无纤维蛋白原血症、家族性肾淀粉样变性(由因子i突变引起)、先天性转变加速因子/因子vii缺乏症、血栓形成倾向(由因子ii缺乏引起)、先天性因子x缺乏症、先天性因子xiiia/b缺乏症、前激肽释放酶/弗莱彻因子(fletcher factor)缺乏症、激肽原缺乏症、纤维连接蛋白沉积肾小球病、肝素辅因子ii缺
乏症、蛋白c缺乏症、蛋白s缺乏症、蛋白z缺乏症、抗凝血酶iii缺乏症、纤溶酶原缺乏症、i型(木性结膜炎)、抗纤维蛋白溶酶缺乏症、纤溶酶原活化物抑制剂-1缺乏症和魁北克血小板紊乱(quebec platelet disorder)。
[0783]
用于凝血因子替代的基因疗法是一种治疗由凝血缺陷引起的疾患的医学治疗。根据本公开，本公开的ca2生物回路和/或它们的任何组分还可用于调节用于基因疗法的凝血因子。在一些实例中，凝血因子可选自因子i(纤维蛋白原)、因子ii(凝血酶原)、因子iii(组织因子)、因子iv、因子v(促凝血球蛋白原)、因子vi、因子vii(稳定因子)、因子viii(抗血友病因子a)、因子ix(抗血友病因子b)、因子x(斯图亚特因子(stuart-prower factor))、因子xi(血浆促凝血酶原激酶前体)、因子xii(海格曼因子(hageman factor))、因子xiii(纤维蛋白稳定因子)、血管性血友病因子(von willebrand factor)、前激肽释放酶(弗莱彻因子(fletcher factor))、高分子量激肽原(hmwk)(菲茨杰拉德因子(fitzgerald factor))、纤连蛋白、抗凝血酶iii、肝素辅因子ii、蛋白c、蛋白s、蛋白z、蛋白z相关蛋白酶抑制剂(zpi)、纤溶酶原、组织型纤溶酶原活化剂(tpa)、尿激酶、纤溶酶原、纤溶酶原活化剂抑制剂1(pai1)和纤溶酶原活化剂抑制剂2(pai2)。
[0784]
在一个实施方案中，凝血因子是用于血友病的基因疗法的因子viii，包括野生型因子viii、工程化因子viii、活化的fviii(fviiia)或等同物。示例性工程化因子viii可包括由roberts等人(j.genet.syndr.gene ther.，2011，1：sl-006；将其内容通过引用整体并入本文)讨论的那些。
[0785]
患者分层
[0786]
在一个实施方案中，还可以根据患者的免疫细胞呈现的免疫原性肽将患者分层，并且可以将其用作参数来确定可能在治疗上受益于本公开的组合物的适合的患者队列。
[0787]
微生物组
[0788]
本公开的ca2生物回路和/或它们的任何组分可用于调控或调节微生物组。共生(symbiotic)、共栖(commensal)和致病的微生物的多样群落存在于身体的所有环境暴露部位，本文将其称为“微生物群”。可能有微生物组栖息的身体的环境暴露部位包括皮肤、鼻咽、口腔、呼吸道、胃肠道和生殖道。微生物组与身体的密切联系对人的健康和疾病(包括哮喘、炎性肠病、代谢性疾病、心血管疾病和癌症)有深远的影响。在一些实施方案中，本公开的ca2生物回路、ca2生物回路组分、ca2效应子模块(包括它们的sre或有效负载)可用于调节或改变或利用微生物组和/或微生物组的微环境。
[0789]
在一些实施方案中，可以用由非微生物生物分子组成的ca2生物回路作为有效负载将微生物组工程改造。有效负载的非限制性实例包括抗病毒肽、酶、神经肽、细胞因子和其他可溶性因子。这样的策略将微生物组转化为治疗疾病的治疗剂。作为非限制性实例，胰高血糖素样肽-1可用作有效负载。施用经工程改造为表达胰高血糖素样肽-1的加氏乳杆菌诱导了宿主中的胰岛素产生，并且减轻了高血糖症(duan，f.等人，diabetes，64，1794-1803(2015)；将其内容通过引用整体并入本文)。
[0790]
在一些实施方案中，微生物组可包含杀伤开关。如本文所用的术语“杀伤开关”是指本公开的生物回路，其包括一种或多种毒素作为有效负载。经工程改造为用于体内施用的微生物可以被编程为在特定的时间、在一个或多个基因的递送之后和/或在宿主经历治疗效果之后死亡。具体地说，防止宿主被生物长期定殖或微生物扩散到感兴趣的区域之外
可能是有用的。可用于杀伤开关的毒素的实例包括但不限于细菌素、溶素和其他通过溶解细胞膜、降解细胞dna或其他机制引起细胞死亡的分子。
[0791]
转基因生物
[0792]
在一些实施方案中，本公开提供了表达编码本公开的多肽的核酸的转基因生物。如本文所用的术语“转基因生物”是指包含人工转移的外源遗传物质的任何非人实体。这种方法提供了在确定的细胞、组织或整个生物体中暂时调节有效负载的能力。这样的方法在建立针对某些疾病状态的转基因模型中或用于研究胚胎发育是有用的。
[0793]
本文所述的转基因生物可包括啮齿动物、鱼类、爬行动物以及无脊椎动物。在优选实施方案中，这样的转基因生物可以选自啮齿动物家族，包括小鼠和大鼠。
[0794]
可调调节
[0795]
本公开的ca2生物回路和/或它们的任何组分还可用于调节另一个效应子模块比如包含poi的重组构建体的表达。在一些实施方案中，ca2生物回路和/或ca2效应子模块可包含蛋白酶(也称为肽酶或解蛋白酶)。当将这两种组分共同引入细胞、组织或生物体时，可调蛋白酶可将无活性构建体切割成活性构建体。
[0796]
在其他实例中，包含蛋白酶的ca2生物回路和/或ca2效应子模块还可用于调节蛋白质加工，包括切割初始蛋白质产物以产生较小的活性蛋白质或肽。
[0797]
在一些实施方案中，本公开的ca2生物回路和/或它们的任何组分可包含在蛋白质加工和修饰中起作用的任何因子。蛋白质翻译后修饰可以包括但不限于，通过酶添加疏水基团(例如，肉豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化、异戊烯化、法尼基化、香叶基香叶基化、糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚)；辅因子的附接以增强功能(例如，脂酰化、黄素、磷酸泛酰巯基乙胺化和血红素c)；添加小的化学基团(例如酰化、甲酰化、烷基化、磷酸化、甲基化、精氨酰化、聚谷氨酰化、聚甘氨酰化(polyglycylation)、丁酰化、糖基化、丙酰化、s-谷胱甘肽化、s-亚硝基化、s-亚磺酰化、琥珀酰化、硫酸化和乙酰化)；其他蛋白质和/或肽的连接，比如isg化、sumo化、泛素化、类泛素化和蛹化；氨基酸的化学修饰；和结构变化。
[0798]
布尔开关
[0799]
还可以将本公开的ca2生物回路掺入到细胞布尔开关的设计中。如本文所用的，布尔开关指的是被设计成基于一个或多个输入执行逻辑运算并产生输出的回路。由布尔开关执行的逻辑运算，包括但不限于与、或、或非、与非、非、蕴含、蕴含非、异或和异或非。或门和与门代表最基本的逻辑运算，其中或代表需要一个或多个输入中的任何一个来产生输出的情况，而与代表需要所有输入来生成输出的情况。还可以使用本公开的ca2生物回路来生成由多个逻辑运算组成的复合布尔开关。在一些实施方案中，ca2生物回路和/或它们的任何组分可以代表布尔开关中的一个或多个输入。在其他实施方案中，本公开的ca2生物回路可以与本领域已知的开关组合而生成布尔开关。布尔开关的输出可取决于所利用的有效负载。作为非限制性示例，可以生成基于与的布尔开关，其中第一输入包括以基因编辑核酸酶cas9作为有效负载的ca2生物回路，并且第二输入包括以转录活化因子vpr作为有效负载的ca2生物回路。在存在靶基因引导rna的情况下，为了靶基因的转录活化，需要向两个输入添加刺激(gao y等人，(2016)nat methods.13(12)：1043-1049；将其内容通过引用整体并入本文)。
[0800]
生物工厂
[0801]
本公开的ca2生物回路和/或它们的任何组分可用于调节生物工厂中的蛋白质产生的水平。如本文所用的，术语“生物工厂”是指经基因修饰或未经基因修饰的细胞、组织、器官或生物体，其可产生具有包括治疗目的(抑制剂、酶、抗体、抗原等)在内的多种应用的蛋白质或工业感兴趣的初级或次级产品。在一些实例中，细胞可以是原核细胞、真核细胞、哺乳动物细胞、植物细胞，等。
[0802]
在一些实施方案中，本公开的ca2生物回路可用于调节靶组织(例如，肝脏和肾脏)中产生的药物蛋白质。肝脏是产生分泌蛋白的器官，所述分泌蛋白包括主要血浆蛋白、止血和纤维蛋白溶解因子、载体蛋白、激素、激素原和载脂蛋白，或各种通常受到严格调节的短寿命的代谢肽和酶，或其他非肝脏蛋白。在这种背景下，肝脏充当基因表达工厂(生物工厂)的角色，为疾病(例如代谢性疾病)的治疗供应蛋白质。
[0803]
在其他实施方案中，本公开的ca2生物回路可用于调节工业过程的蛋白质。
[0804]
肝脏靶向
[0805]
肝脏是产生蛋白质的重要器官，并且涉及血液凝固和多种代谢功能。多种疾病可能影响肝脏，靶向肝脏进行疾病治疗已是有前途的方法，尤其是肝脏靶向的基因疗法。本公开的ca2生物回路和/或它们的任何组分可用于调节肝脏靶向的基因疗法和基因转移。
[0806]
可靶向肝脏并构建到本发明用于调节的ca2生物回路的蛋白质可包括在下列疾病中的蛋白质：肝癌，比如肝细胞癌(hcc)、纤维板层hcc、胆管癌、血管肉瘤和继发性肝癌；由缺陷基因引起的遗传障碍，比如血色病、威尔逊病(wilson disease)、酪氨酸血症、α1抗胰蛋白酶缺乏症、糖原贮积病；由于酶缺乏引起的代谢性疾病，比如吉尔伯特综合征(gilbert
′
s syndrome)、溶酶体酸脂肪酶缺乏症(lald)和戈谢病(gaucher disease)；自身免疫性肝炎；脂肪肝疾病；和病毒性肝炎(甲型、乙型和丙型)。在一些实例中，本发明的ca2生物回路可用于导向用于肝细胞癌(hcc)的il12和用于糖尿病神经病变的il10。
[0807]
在一些实施方案中，本发明的ca2生物回路可用于控制用于基因疗法的肝脏特异性基因产物。
[0808]
在一些实施方案中，本发明的ca2生物回路可用于控制分泌(例如，分泌到血液中)的肝脏蛋白质。
[0809]
微流体学
[0810]
在一些实施方案中，含有本公开的ca2生物回路和/或它们的任何组分的细胞可用于微流体装置中。如本文所用的“微流体装置”指的是在人工制造的微系统中对皮升至纳升规模体积的流体的操作。包含本公开的ca2生物回路的微流体装置可用于研究细胞培养模型、细胞微环境、细胞分泌、趋化性、凋亡、血管功能、神经元细胞生长、胚胎发育、单细胞代谢组学、基因表达、药物研究、细胞分离、干细胞生物学、生物响应器、三维细胞培养和组织工程。
[0811]
用于制作治疗剂的工具和剂
[0812]
本公开提供了可用于生成治疗剂的工具和剂，所述治疗剂例如但不限于用于降低有需要的受试者中的肿瘤体积或负荷的免疫治疗剂。生产治疗剂涉及相当多的变量，比如有效负荷的结构、细胞的类型、基因转移的方法、体外扩增的方法和时间、预处理以及受试者中的肿瘤负荷的量和类型。可以使用本文所述的工具和剂优化这样的参数。
[0813]
细胞系
[0814]
本公开提供了用本公开的组合物进行了基因修饰的哺乳动物细胞。适合的哺乳动物细胞包括原代细胞和永生化细胞系。适合的哺乳动物细胞系包括但不限于，人胚胎肾细胞系293、成纤维细胞细胞系nih 3t3、人结直肠癌细胞系hct116、卵巢癌细胞系skov-3、永生化t细胞系(例如jurkat细胞和suptl细胞)、淋巴瘤细胞系raji细胞、nalm-6细胞、k562细胞、hela细胞、pc12细胞、hl-60细胞、nk细胞系(例如nkl、nk92、nk962和yts)，等。在一些情况下，细胞不是永生化细胞系，而是从个体获得的细胞，并且在本文中称为原代细胞。例如，细胞是从个体获得的t淋巴细胞。其他实例包括但不限于，从个体获得的细胞毒性细胞、干细胞、外周血单核细胞或祖细胞。
[0815]
跟踪sre、生物回路和细胞系
[0816]
在一些实施方案中，可能希望跟踪本公开的组合物或由本公开的组合物修饰的细胞。可以通过使用诸如报道部分的有效负载来实现跟踪，如本文所用的，所述报道部分是指能够响应于输入而产生可检测信号的任何蛋白质。实例包括碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、过氧化物酶、β-内酰胺酶、催化抗体、生物发光蛋白(例如萤光素酶)和荧光蛋白(比如绿色荧光蛋白(gfp))。
[0817]
报道部分可用于监测添加对应于sre的配体后sre的响应。在其他情况下，报道部分可用于跟踪细胞存活、持久性、细胞生长和/或体外、体内或离体定位。
[0818]
在一些实施方案中，优选的报道部分可以是萤光素酶蛋白。
[0819]
伴侣蛋白
[0820]
在一些实施方案中，本公开的ca2效应子模块可包括一种或多种调节有效负载的表达的伴侣蛋白。在本公开中有用的伴侣蛋白可以是细胞伴侣蛋白或被称为药理学伴侣蛋白的小分子。细胞伴侣蛋白是指一大群不相关的蛋白质家族，其作用是稳定未折叠的客户蛋白，或展开客户蛋白以便跨膜转位或降解，和/或帮助它们正确折叠和组装。伴侣蛋白还与蛋白质稳态网络(比如蛋白酶体系统)和自噬的其他组分合作，以促进蛋白质清除。分子伴侣蛋白家族的实例包括小热休克蛋白，比如hsp25；热休克蛋白60家族蛋白，比如cpn60和groel；热休克蛋白70家族蛋白，比如dnak和bip；热休克蛋白90家族蛋白；热休克蛋白100家族蛋白，比如cip；凝集素伴侣蛋白，比如钙联蛋白和钙网蛋白；以及折叠伴侣蛋白，比如蛋白质二硫化物异构酶(pdi)、肽基脯氨酰基顺反异构酶(ppi)和erp57。在一些实施方案中，本公开的有效负载可以是细胞伴侣蛋白。在不存在使sre稳定的刺激的情况下，细胞伴侣蛋白可与sre结合，因此不能与其客户蛋白相互作用。在存在对sre特异的刺激的情况下，sre被稳定化，并且伴侣蛋白可以与客户蛋白相互作用。在一些实施方案中，可以将本公开的有效负载附加至伴侣蛋白，使得有效负载的稳定性或不稳定性可增强。在其他实施方案中，本公开的sre可由一种或多种分子伴侣蛋白组成。
[0821]
在本公开中有用的伴侣蛋白还可包括药理学伴侣蛋白，其利用小分子促进细胞蛋白质的正确折叠和稳定。细胞蛋白质的突变可导致蛋白质错误折叠和/或聚集，最终导致它们降解。药理学伴侣蛋白被设计成与错误折叠的靶蛋白结合，促进它们正确折叠，从而防止它们降解。在一些实施方案中，本公开的sre可包含一种或多种错误折叠的蛋白质，并且对sre特异的刺激可包括一种或多种药理学伴侣蛋白，使得ca2效应子模块只有在药理学伴侣蛋白存在的情况下才被稳定化。
[0822]
动物模型
[0823]
可以在体内动物模型(优选小鼠模型)中测试本公开的组合物的效用和功效。使用的小鼠模型可以是同系小鼠模型，其中用本公开的组合物修饰小鼠细胞，并且在具有相同遗传背景的小鼠中进行测试。实例包括pmel-1和4t1小鼠模型。可替代地，异种移植模型也可用于这样的研究中，其中将人细胞比如肿瘤细胞和免疫细胞引入免疫缺陷小鼠中。使用的免疫缺陷小鼠可以是cbyj.cg-foxnlnu/j、b6；129s7-ragltmlmom/j、b6.129s7-ragltmlmom/j、b6.cb17-prkdcscid/szj、nod.129s7(b6)-ragltmlmom/j、nod.cg-ragltmlmomprfltmlsdz/sz、nod.cb17-prkdcscid/szj、nod.cg-prkdcscidb2mtmlunc/j、nod-scid il2rgnull、nude(nu)小鼠、scid小鼠、nod小鼠、rag1/rag2小鼠、nod-scid小鼠、il2rg null小鼠、b2mnull小鼠、nod-scid il2r null小鼠、nod-scid-b2m null小鼠、灰棕色小鼠和hla转基因小鼠。
[0824]
细胞测定法
[0825]
在一些实施方案中，可以使用细胞测定法来评价本公开的组合物作为免疫治疗剂的效果。可以根据本领域已知的用于鉴定蛋白质和/或将蛋白质水平定量的任何方法来确定本公开的组合物的表达水平和/或同一性。在一些实施方案中，这样的方法可包括蛋白质印迹法、流式细胞术和免疫测定。
[0826]
本文提供了用于在功能上表征表达本公开的sre、ca2生物回路和组合物的细胞的方法。在一些实施方案中，功能表征在原代免疫细胞或永生化免疫细胞系中进行，并且可以通过细胞表面标志物的表达来确定。t细胞的细胞表面标志物的实例包括但不限于cd3、cd4、cd8、cd 14、cd20、cd11b、cd 16、cd45和hla-dr、cd 69、cd28、cd44、ifnγ。t细胞耗竭的标志物包括pd1、tim3、btla、cd 160、2b4、cd39和lag3。抗原呈递细胞的细胞表面标志物的实例包括但不限于mhc i类、mhc ii类、cd40、cd45、b7-1、b7-2、ifnγ受体和il2受体、icam-1和/或fcγ受体。树突细胞的细胞表面标志物的实例包括但不限于mhc i类、mhc ii类、b7-2、cd18、cd29、cd31、cd43、cd44、cd45、cd54、cd58、cd83、cd86、cmrf-44、cmrf-56、dcir和/或dectin-1，等等；而在一些情况下还不存在cd2、cd3、cd4、cd8、cd14、cd15、cd16、cd 19、cd20、cd56和/或cd57。nk细胞的细胞表面标志物的实例包括但不限于ccl3、ccl4、ccl5、ccr4、cxcr4、cxcr3、nkg2d、cd71、cd69、ccr5、磷酸化jak/stat、磷酸化erk、磷酸化p38/mapk、磷酸化akt、磷酸化stat3、颗粒溶素、颗粒酶b、颗粒酶k、il10、il22、ifng、lap、穿孔素和tnfa。
[0827]
诊断学
[0828]
在一些实施方案中，本公开的scfv、car和组合物可用作诊断。在一些情况下，本公开的scfv、car和/或组合物可用于将表达靶抗原的细胞、组织、器官等鉴定、标记或染色。在进一步的实施方案中，本公开的scfv、car和/或组合物可用于鉴定组织切片(即组织学组织切片)(包括已知或疑似具有癌细胞的组织)中存在的cd19抗原。使用本公开的scfv的这种方法在一些情况下可用于鉴定组织切片中的癌细胞或肿瘤。组织切片可以来自任何组织或器官，包括但不限于乳腺、结肠、胰腺、卵巢、脑、肝、肾、脾、肺、皮肤、胃、肠、食管和骨。本公开的scfv、car和/或组合物也可用于鉴定疑似具有或已知为癌性血液样品的血液样品，并将其与正常组织区分开。
[0829]
t细胞耗竭
[0830]
在一些实施方案中，可以利用ca2生物回路、sre或ca2效应子模块来防止t细胞耗
竭。如本文所用的，“t细胞耗竭”是指由慢性t细胞活化引起的t细胞功能的逐步的进行性丧失。t细胞耗竭是限制抗病毒和抗肿瘤免疫疗法的功效的主要因素。耗竭的t细胞具有低的增殖和细胞因子产生能力，同时具有高凋亡率和多种抑制性受体的高表面表达。导致耗竭的t细胞活化可能发生在抗原存在或不存在的情况下。
[0831]
细胞
[0832]
根据本公开，提供了经基因修饰以表达至少一种本公开的ca2生物回路、sre(例如ca2 dd)、ca2效应子模块和免疫治疗剂的细胞。本公开的细胞可包括但不限于免疫细胞、干细胞和肿瘤细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是效应免疫细胞，包括但不限于，t细胞，比如cd8+ t细胞和cd4+ t细胞(例如thl、th2、thl7、foxp3+细胞)；记忆t细胞，比如t记忆干细胞、中枢t记忆细胞和效应记忆t细胞；终末分化效应t细胞、自然杀伤(nk)细胞、nk t细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调节性t细胞(treg)和树突细胞(dc)、可引发效应子功能的其他免疫细胞或它们的混合物。t细胞可以是tαβ细胞和tγδ细胞。在一些实施方案中，干细胞可以来自人胚胎干细胞、间充质干细胞和神经干细胞。在一些实施方案中，可以使t细胞的内源性t细胞受体耗竭(参见美国专利第9,273,283号；第9,181,527号；和第9,028,812号；将各自的内容通过引用整体并入本文)。
[0833]
在一些实施方案中，相对于特定的个体受试者，本公开的细胞可以是自体的、同种异体的、同系的或异种的。
[0834]
在一些实施方案中，本公开的细胞可以是哺乳动物细胞，特别是人细胞。本公开的细胞可以是原代细胞或永生化细胞系。
[0835]
在一些实施方案中，本公开的细胞可包括作为有效负载来触发细胞的增殖和扩增的扩增因子。示例性有效负载包括ras超家族的成员。
[0836]
可以通过用ca2生物回路、ca2效应子模块、sre和/或感兴趣的有效负载(例如，免疫治疗剂)的多肽、或编码所述多肽的多核苷酸、或包含所述多核苷酸的载体转导细胞组合物来实现工程化免疫细胞。载体可以是病毒载体，比如慢病毒载体、γ-逆转录病毒载体、重组aav病毒、腺病毒载体和溶瘤病毒载体。在其他方面，也可以使用非病毒载体，例如纳米颗粒和脂质体。在一些实施方案中，本公开的免疫细胞经基因修饰以表达至少一种本公开的免疫治疗剂，所述免疫治疗剂可使用刺激进行调节。在一些实例中，将在相同的ca2生物回路和ca2效应子模块中构建的两种、三种或更多种免疫治疗剂引入细胞中。在其他实例中，可以将各自包含免疫治疗剂的两个、三个或更多个ca2生物回路、ca2效应子模块引入细胞中。
[0837]
在一些实施方案中，本公开的免疫细胞可以是经修饰以表达抗原特异性t细胞受体(tcr)的t细胞，或本文教导的抗原特异性嵌合抗原受体(car)的t细胞(称为car t细胞)。因此，将至少一个编码本文所述的car系统(或tcr)的多核苷酸或包含该多核苷酸的载体引入到t细胞中。表达car或tcr的t细胞通过car或tcr的细胞外靶向部分与特异性抗原结合，从而通过细胞内信号传导结构域将信号传递到t细胞中，作为结果，t细胞被活化。活化的car t细胞改变其行为，包括细胞毒性细胞因子(例如肿瘤坏死因子和淋巴毒素等)的释放)、细胞增殖率的提高、细胞表面分子的变化，等等。这样的变化引起表达被car或tcr识别的抗原的靶细胞的破坏。另外，细胞因子的释放或细胞表面分子的变化刺激其他免疫细胞，例如b细胞、树突细胞、nk细胞和巨噬细胞。
[0838]
在一些实施方案中，本公开的car t细胞可经进一步修饰以表达另一种、两种、三种或更多种免疫治疗剂。免疫治疗剂可以是对不同的靶分子特异的另一种car或tcr；细胞因子比如il2、il12、il15和il18或细胞因子受体比如il15ra；将抑制信号转化为刺激信号的嵌合开关受体；归巢受体，其将过继转移的细胞引导至靶位点，比如肿瘤组织；优化免疫细胞代谢的剂；或安全开关基因(例如自杀基因)，当过继细胞转移后观察到严重事件或当转移的免疫细胞不再需要时，该基因杀伤活化t细胞。这些分子可以被包含在同一个效应子模块中，或者包含在单独的效应子模块中。
[0839]
在一个实施方案中，本公开的car t细胞(包括tcr t细胞)可以是用包含car的ca2效应子模块和包含细胞因子的ca2效应子模块转化的“武装的”car t细胞。诱导型或组成型分泌的活性细胞因子进一步“铠装”car t细胞，以提高功效和持久性。在这种背景下，这样的car t细胞也被称为“铠装的car t细胞”。可以基于肿瘤微环境以及先天和适应性免疫系统的其他元件来选择“铠装”分子。在一些实施方案中，所述分子可以是刺激因子，比如il2、il12、il15、il18、i型ifn、cd40l和4-1bbl，已证明在面对敌对的肿瘤微环境时它们通过不同的机制进一步增强car t细胞的功效和持久性(yeku等人，biochem soc trans.，2016，44(2)：412-418)。
[0840]
在一些实施方案中，本公开的免疫细胞可以是经修饰以表达抗原特异性t细胞受体(tcr)或或本文教导的抗原特异性嵌合抗原受体(car)的nk细胞。
[0841]
nk细胞可以从外周血单核细胞(pbmc)中分离或来源于人胚胎干细胞(es)和诱导的多能干细胞(ipsc)。可将分离自pbmc的原代nk细胞进一步扩增，用于过继免疫疗法。用于nk细胞扩增的策略和方案可包括白细胞介素2(il2)刺激和使用自体饲养细胞或使用经基因修饰的同种异体饲养细胞。在一些方面，可以用刺激配体的组合选择性地扩增nk细胞，所述刺激配体包括il15、il21、il2、41bbl、il12、il18、mica、2b4、lfa-1和bcm1/slamf2(例如，美国专利公开号us20150190471)。
[0842]
表达包含car和/或其他免疫治疗剂的ca2效应子模块的免疫细胞可用作癌症免疫疗法。免疫疗法包括作为活性成分的表达car和/或其他免疫治疗剂的细胞，并且可以还包括适合的赋形剂。赋形剂的实例可包括前述的药学上可接受的赋形剂，包括各种细胞培养基和等渗氯化钠。
[0843]
在一些实施方案中，本公开的细胞可以是经基因修饰以表达本公开的组合物的树突细胞。这样的细胞可以用作癌症疫苗。
[0844]
v.定义
[0845]
在本说明书的不同地方，本公开的组合物的特征或功能以组或范围的形式公开。具体地说，本公开包括这些组和范围的成员的每个单独的子组合。以下是术语定义的非限制性清单。
[0846]
活性：如本文所用的，术语“活性”是指事情正在发生或正在进行的状况。本公开的组合物可以具有活性，并且该活性可以涉及一种或多种生物事件。在一些实施方案中，生物事件可包括细胞信号传导事件。在一些实施方案中，生物事件可以包括与一种或多种相应的蛋白质、受体、小分子或本文所述的任何生物回路组分的蛋白质相互作用相关的细胞信号传导事件。
[0847]
过继细胞疗法(act)：如本文所用的，术语“过继细胞疗法”或“过继细胞转移”是指
涉及将细胞转移到患者体内的细胞疗法，其中细胞可能源自患者或另一个体，并且在转移返回到患者体内之前被工程改造(改变)。治疗细胞可以来源于免疫系统，比如效应免疫细胞：cd4+t细胞；cd8+ t细胞、自然杀伤细胞(nk细胞)；以及来源于切除肿瘤的b细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(til)。最常见的转移细胞是离体扩增或操作后的自体抗肿瘤t细胞。例如，自体外周血淋巴细胞可以被基因工程改造为通过表达t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)来识别特异性肿瘤抗原。
[0848]
剂：如本文所用的，术语“剂”是指生物、药物或化学的化合物。非限制性实例包括简单或复杂的有机或无机分子、肽、蛋白质、寡核苷酸、抗体、抗体衍生物、抗体片段、受体和可溶性因子。
[0849]
激动剂：如本文所用的术语“激动剂”是指与受体结合可产生细胞响应的化合物。激动剂可以是与受体直接结合的配体。可替代地，通过例如(a)与直接结合受体的另一个分子形成复合物，或(b)另外导致另一种化合物的修饰使得另一种化合物直接结合受体，激动剂可与受体间接结合。激动剂可以称为特定受体或受体家族的激动剂，例如，共刺激受体的激动剂。
[0850]
拮抗剂：如本文所用的术语“拮抗剂”是指抑制或降低其结合的靶标的生物活性的任何剂。
[0851]
抗原：如本文使用的术语“抗原”定义为当其被引入到受试者中或由受试者产生时激发免疫响应的分子，比如由癌症发展本身产生的肿瘤抗原。这种免疫响应可能涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞比如细胞毒性t淋巴细胞和辅助性t细胞的活化，或两者都有。抗原可以来源于生物体、蛋白质/抗原的亚单位、杀死或灭活的全细胞或裂解物。在本公开的上下文中，术语“感兴趣的抗原”或“期望的抗原”是指本文提供的那些蛋白质和/或其他生物分子，它们与本公开的抗体和/或本文所述的其片段、突变体、变体和/或改变形式免疫特异性地结合或相互作用。在一些实施方案中，感兴趣的抗原可以包含本文所述的任何多肽或有效负载或蛋白质，或其片段或部分。
[0852]
大约：如本文所用的，当应用于一个或多个感兴趣的值时，术语“大约”或“约”是指与陈述参考值相似的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”是指落入陈述参考值的任一方向上(大于或小于)的25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1(或更小)之内的值的范围，除非另有说明或另外地从上下文中显而易见(这样的数字超过可能值的100的情况除外)。
[0853]
与......缔合：如本文所用的，当用于两个或更多个部分时，术语“与
……
缔合”、“缀合”、“连接”、“附接”和“拴系”是指这些部分直接地或通过一个或多个用作连接剂的另外的部分彼此物理缔合或连接，以形成足够稳定的结构，使得这些部分在使用该结构的条件(例如生理条件)下保持物理缔合。“缔合”不必严格地通过直接的共价化学键合。这也可能表明离子键合或氢键合或基于杂交的连接性足够稳定，使得“缔合的”实体保持物理缔合。
[0854]
自体的：如本文所用的术语“自体的”意指来源于同一个体的任何材料，其随后被重新引入到所述个体中。
[0855]
条形码：如本文使用的术语“条形码”是指与另一者相区分的一种多核苷酸或氨基酸的多核苷酸或氨基酸序列。
[0856]
癌症：术语“癌症”是指以体内异常细胞的不受控制的生长为特征的一组广泛的各种疾病。不受调控的细胞分裂和生长导致恶性肿瘤的形成，所述恶性肿瘤侵袭邻近组织，最终通过淋巴系统或血流转移到身体的远处部位。
[0857]
共刺激分子：如本文所用的，根据其在免疫t细胞活化中的含义，是指一组免疫细胞表面受体/配体，其在t细胞和apc之间接合并在t细胞中生成刺激信号，所述刺激信号与由apc上的抗原/mhc复合物(pmhc)的t细胞受体(tcr)识别产生的t细胞中的刺激信号相结合。
[0858]
细胞因子：如本文使用的，术语“细胞因子”是指具有多效性功能的小的可溶性因子的家族，其由许多细胞类型产生，能够影响和调节免疫系统的功能。
[0859]
递送：如本文所用的术语“递送”是指递送化合物、物质、实体、部分、货物或有效负载的行为或方式。“递送剂”是指至少部分地促进一种或多种物质(包括但不限于本公开的化合物和/或组合物)到细胞、受试者或其他生物系统细胞的体内递送的任何剂。
[0860]
去稳定的：如本文所用的，术语“去稳定的”、“去稳定”、“去稳定区域”或“去稳定结构域”表示比相同区域或分子的起始、参考、野生型或天然形式更不稳定的区域或分子。
[0861]
工程改造的：如本文所用的，当本公开的实施方案被设计成相比于起点、野生型或天然分子具有不同的特征或性质(无论是结构的还是化学的)时，它们是“工程改造的”。
[0862]
表达：如本文所用的，核酸序列的“表达”是指一种或多种下列事件：(1)从dna序列产生rna模板(例如，通过转录)；(2)rna转录物的加工(例如，通过剪接、编辑、5’帽形成和/或3’端加工)；(3)将rna翻译成多肽或蛋白质；(4)多肽或蛋白质的折叠；和(5)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
[0863]
特征：如本文所用的，“特征”是指特点、特性或特征性元件。
[0864]
制剂：如本文所用的，“制剂”至少包括本公开的化合物和/或组合物和递送剂。
[0865]
片段：如本文所用的，“片段”指的是一部分。例如，蛋白质片段可包含通过消化全长蛋白质获得的多肽。在一些实施方案中，蛋白质的片段包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，抗体片段包括抗体的多个部分。
[0866]
功能性的：如本文所用的，“功能性”生物分子是具有某种结构和形式的生物实体，在所述结构和形式中它表现出表征它的特性和/或活性。
[0867]
免疫细胞：如本文所用的，术语“免疫细胞”是指免疫系统中来源于骨髓中造血干细胞的任何细胞，其产生两个主要谱系，髓系祖细胞(其产生髓系细胞，比如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、巨核细胞和粒细胞)和淋巴系祖细胞(其产生淋巴样细胞，比如t细胞、b细胞和自然杀伤(nk)细胞)。示例性免疫系统细胞包括cd4+ t细胞、cd8+ t细胞、cd4-cd8-双阴性t细胞、tγδ细胞、tαβ细胞、调节性t细胞、自然杀伤细胞和树突细胞。巨噬细胞和树突细胞可被称为“抗原呈递细胞”或“apc”，它们是当apc表面上与肽复合的主要组织相容性复合体(mhc)受体与t细胞表面上的tcr相互作用时，能够活化t细胞的特化细胞。
[0868]
免疫疗法：如本文所用的术语“免疫疗法”，是指通过诱导或恢复免疫系统对疾病的响应性来治疗疾病的一种类型。
[0869]
免疫治疗剂：如本文使用的术语“免疫治疗剂”是指通过用生物、药物或化学的化合物诱导或恢复免疫系统对疾病的响应性来治疗疾病。
[0870]
体外：如本文所用的，术语“体外”是指在人工环境中发生的事件，例如在试管或响应容器中、在细胞培养物中、在培养皿中，等等，而不是在生物体(例如，动物、植物或微生物)中。
[0871]
体内：如本文所用的，术语“体内”是指在生物体(例如动物、植物或微生物或其细胞或组织)内发生的事件。
[0872]
接头：如本文所用的，接头是指连接两个或更多个结构域、部分或实体的部分。在一个实施方案中，接头可包含10个或更多个原子。在一个另外的实施方案中，接头可包含一组原子，例如10-1000个原子，并且可以由原子或基团组成，例如但不限于碳、氨基、烷基氨基、氧、硫、亚砜、磺酰基、羰基和亚胺。在一些实施方案中，接头可包含一个或多个包含一个或多个核苷酸的核酸。在一些实施方案中，接头可包含氨基酸、肽、多肽或蛋白质。在一些实施方案中，通过接头结合的部分可以包括但不限于原子、化学基团、核苷、核苷酸、核碱基、糖、核酸、氨基酸、肽、多肽、蛋白质、蛋白质复合物、有效负载(例如治疗剂)或标志物(包括但不限于化学、荧光、放射性或生物发光标志物)。如本文所述，接头可用于任何有用的目的，例如形成多聚体或缀合物，以及施用有效负载。可以掺入到接头中的化学基团的实例包括但不限于，烷基、烯基、炔基、酰氨基、氨基、醚、硫醚、酯、亚烷基、杂亚烷基、芳基或杂环基，如本文所述，它们中的每一个都可以任选地被取代。接头的实例包括但不限于，不饱和烷烃、聚乙二醇(例如乙二醇或丙二醇单体单元，例如二甘醇、二丙二醇、三甘醇、三丙二醇、四乙二醇或四乙二醇)和葡聚糖聚合物，其他实例包括但不限于接头内的可裂解部分，例如二硫键(-s-s-)或偶氮键(-n＝n-)，其可以使用还原剂或光解来裂解。选择性地可裂解的键的非限制性实例包括例如通过使用三(2-羧乙基)膦(tcep)或其他还原剂和/或光解可以裂解的酰胺键，以及例如通过酸或碱水解可以裂解的酯键。
[0873]
检查点/因子：如本文所用的，检查点因子是其功能作用于过程连接处的任何部分或分子。例如，检查点蛋白、配体或受体可以起到停止或加速细胞周期的作用。
[0874]
代谢物：代谢物是由细胞内天然存在的酶催化的代谢响应的中间产物。这个术语通常用于描述小分子、较大生物分子的片段或加工产物。修饰的：如本文所用的，术语“修饰的”是指与母体或参考分子或实体相比，分子或实体的状态或结构被改变。分子可以通过多种方式加以修饰，包括化学修饰、结构修饰和功能修饰。在一些实施方案中，通过引入非天然氨基酸来修饰本公开的化合物和/或组合物。
[0875]
突变：如本文所用的，术语“突变”是指变化和/或改变。在一些实施方案中，突变可以是蛋白质(包括肽和多肽)和/或核酸(包括多核酸)的变化和/或改变。在一些实施方案中，突变包括蛋白质和/或核酸序列的变化和/或改变。这样的变化和/或改变可包括一个或多个氨基酸(在蛋白质和/或肽的情况下)和/或核苷酸(在核酸和/或多核酸例如多核苷酸的情况下)的添加、取代和/或缺失。在一些实施方案中，其中突变包括氨基酸和/或核苷酸的添加和/或取代，这样的添加和/或取代可包括1个或多个氨基酸和/或核苷酸残基，并且可包括修饰的氨基酸和/或核苷酸。具有突变、变化或改变的所得构建体、分子或序列在本文中可称为突变体。
[0876]
新抗原：如本文所用的，术语“新抗原”是指存在于肿瘤细胞中但不存在于正常细胞中并且在胸腺中不诱导它们的同源抗原特异性t细胞的缺失(即中枢耐受)的肿瘤抗原。这些肿瘤新抗原可以提供类似于病原体的“外来”信号，以诱导癌症免疫疗法所需要的有效
免疫响应。新抗原可能局限于特异性肿瘤。新抗原是具有错义突变的肽/蛋白质(错义新抗原)，或具有来自新开放阅读框(neoorf)的长的、完全新的氨基酸串的新肽。通过框外插入或缺失(由于引起微卫星不稳定的dna错配修复的缺陷所致)、基因融合、终止密码子的通读突变或不正确剪接的rna的翻译，可以在一些肿瘤中生成neoorf(例如，saeterdal等人，proc natl acad sci usa，2001，98：13255-13260)。
[0877]
脱靶：如本文所用的，“脱靶”是指对任何一种或多种靶标、基因、细胞转录物、细胞和/或组织的任何非预期效应。
[0878]
可操作连接：如本文所用的，短语“可操作连接”是指两个或更多个分子、构建体、转录物、实体、部分等之间的功能连接。
[0879]
有效负载或感兴趣的有效负载(poi)：如本文所用的，术语“有效负载”和“感兴趣的有效负载(poi)”可互换使用。感兴趣的有效负载(poi)是指其功能将被改变的任何蛋白质或化合物。在本公开的上下文中，poi是包括先天和适应性免疫系统在内的免疫系统的组分。感兴趣的有效负载可以是蛋白质、编码融合蛋白的融合构建体、或非编码基因、或其变体和片段。当基于氨基酸时，感兴趣的有效负载可称为感兴趣的蛋白质。
[0880]
药学上可接受的赋形剂：如本文所用的，术语“药学上可接受的赋形剂”是指药物组合物中存在的除活性剂(如本文所述)之外的任何成分，其具有在受试者中基本无毒且非炎性的特性。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是能够悬浮和/或溶解活性剂的媒介物。赋形剂可包括，例如：抗粘剂、抗氧化剂、粘合剂、包衣剂、压缩助剂、崩解剂、染料(着色剂)、润肤剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣剂、调味剂、芳香剂、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂和水合水。示例性赋形剂包括但不限于：丁羟甲苯(bht)、碳酸钙、磷酸钙(二元)、硬脂酸钙、交联羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交联聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶化淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、淀粉乙醇酸钠、山梨醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素a、维生素e、维生素c和木糖醇。
[0881]
药学上可接受的盐：本文所述化合物的药学上可接受的盐是所公开化合物的形式，其中酸或碱部分是其盐形式(例如，通过游离碱基团与适合的有机酸响应生成)。药学上可接受的盐的实例包括但不限于，诸如胺类的碱性残基的矿物盐或有机酸盐；诸如羧酸的酸性残基的碱盐或有机盐；等等。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐，等等。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。药学上可接受的盐包括常规的无毒盐，例如来自无毒
的无机酸或有机酸的盐。在一些实施方案中，通过常规的化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物制备药学上可接受的盐。通常，通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的适当的碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中响应，可以制备这样的盐；通常，非水介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。适合的盐的清单可以见于remington’s pharmaceutical sciences(第17版)，mack publishing company，easton，pa.，1985，p.1418，pharmaceutical salts∶properties，selection，and use，p.h.stahl和c.g.wermuth(编辑)，wiley-vch，2008，以及berge等人，journal of pharmaceutical science，66，1-19(1977)，将每篇文献通过引用整体并入本文。药学上可接受的溶剂化物：如本文所用的，术语“药学上可接受的溶剂化物”是指化合物的结晶形式，其中适合溶剂的分子结合在晶格中。例如，通过从包含有机溶剂、水或其混合物的溶液中结晶、重结晶或沉淀，可以制备溶剂化物。适合溶剂的实例是乙醇、水(例如，一水合物、二水合物和三水合物)、n-甲基吡咯烷酮(nmp)、二甲亚砜(dmso)、n，n
’‑
二甲基甲酰胺(dmf)、n，n
’‑
二甲基乙酰胺(dmac)、1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(dmeu)、1，3-二甲基-3，4，5，6-四氢-2-(1h)-嘧啶酮(dmpu)、乙腈(acn)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯烷酮、苯甲酸苄酯，等等。当水是溶剂时，溶剂化物被称为“水合物”在一些实施方案中，掺入溶剂化物中的溶剂的类型或水平对于被施用溶剂化物的生物体是生理上可耐受的(例如，以药物组合物的单位剂量形式)。
[0882]
稳定的：如本文所用的“稳定”是指化合物或实体足够鲁棒，能够从响应混合物中以有用的纯度分离，并且优选能够配制成有效的治疗剂。
[0883]
稳定化：如本文所用的，术语“稳定化”、“稳定化的”、“稳定化区域”意指使其稳定或变得稳定。在一些实施方案中，相对于绝对值来量度稳定性。在一些实施方案中，相对于次要状况或状态或参考化合物或实体来量度稳定性。
[0884]
标准car：如本文所用的，术语“标准car”是指嵌合抗原受体的标准设计。将包括细胞外scfv片段、跨膜结构域和一个或多个细胞内结构域的car融合蛋白的组分以线性方式构建为单一融合蛋白。
[0885]
刺激响应元件(sre)：如本文所用的，术语“刺激响应元件”(sre)是效应子模块的组件，其与效应子模块的一个或多个有效负载连接、附接、链接或关联，并且在一些情况下，负责效应子模块对一种或多种刺激的响应性质。如本文所用的，sre对刺激的“响应”性质可以通过与刺激的共价或非共价相互作用、直接或间接关联或结构响应或化学响应来表征。此外，任何sre对刺激的响应都可以是程度或种类的问题。响应可以是部分响应。响应可以是可逆响应。响应最终可导致信号或输出的调节。这样的输出信号可以是刺激的相对性质的输出信号，例如，产生1至100之间的调节作用，或者成倍增大或减小，例如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多。sre的一个非限制性实例是去稳定结构域(dd)。
[0886]
受试者：如本文所用的，术语“受试者”或“患者”是指可被施用根据本公开的组合物的任何生物体，例如用于实验、诊断、预防和/或治疗目的。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物，比如小鼠、大鼠、兔子、非人灵长类动物和人)和/或植物。
[0887]
t细胞：t细胞是产生t细胞受体(tcr)的免疫细胞。t细胞可以是幼稚的(未暴露于抗原；cd62l、ccr7、cd28、cd3、cd 127和cd45ra的表达增加，与t
cm
相比cd45ro的表达减少)、记忆t细胞(tm)(经历抗原且寿命长)和效应细胞(经历抗原，具有细胞毒性)。tm可进一步分
为中枢记忆t细胞亚群(t
cm
，与幼稚t细胞相比，cd62l、ccr7、cd28、cd127、cd45ro和cd95表达增加，并且cd54ra表达减少)和效应记忆t细胞(t
em
，与幼稚t细胞或t
cm
相比，cd62l、ccr7、cd28、cd45ra表达减少，并且cd127表达增加)。效应t细胞(te)是指经历抗原的cd8+细胞毒性t淋巴细胞，与t
cm
相比，其具有cd62l、ccr7、cd28表达降低，并且颗粒酶和穿孔素阳性。其他示例性t细胞包括调节性t细胞，例如cd4+cd25+(foxp3+)调节性t细胞和tregl7细胞，以及tr1、th3、cd8+cd28-和qa-1限制性t细胞。
[0888]
t细胞受体：t细胞受体(tcr)是指免疫球蛋白超家族成员，其具有可变抗原结合结构域、恒定结构域、跨膜结构域和短胞质尾，其能够特异性地结合至与mhc受体结合的抗原肽。tcr可见于细胞表面上或呈可溶性形式，通常由具有α和β链(也分别称为tcrα和tcrβ)或γ和δ链(也分别称为tcrγ和tcrδ)的异二聚体组成。tcr链(例如α链、β链)的细胞外部分含有两个免疫球蛋白结构域：在n末端的可变结构域(例如α链可变结构域或vα，β-链可变结构域或v
β
)和邻近细胞膜的一个恒定结构域(例如，α-链恒定结构域或cα和β-链恒定结构域或c
β
)。与免疫球蛋白相似，可变结构域含有被框架区(fr)分开的互补决定区(cdr)。tcr通常与cd3复合物缔合形成tcr复合物。如本文所用的，术语“tcr复合物”是指由cd3与tcr缔合形成的复合物。例如，tcr复合物可以由cd3γ链、cd3δ链、两条cd3ε链、cd3ζ链的同二聚体、tcrα链和tcrβ链组成。可替代地，tcr复合物可以由cd3γ链、cd3δ链、两条cd3ε链、cd3ζ链的同二聚体、tcrγ链和tcrδ链组成。如本文所用的，“tcr复合物的组分”是指tcr链(即tcra、tcrβ、tcrγ或tcrδ)、cd3链(即cd3γ、cd3δ、cd3ε或cd3ζ)、或由两条或更多条tcr链或cd3链形成的复合物(例如tcrα和tcrβ的复合物、tcrγ和tcrδ的复合物、cd3ε和cd3δ的复合物、cd3γ和cd3ε的复合物、或tcrα、tcrβ、cd3γ、cd3δ和两条cd3ε链的亚tcr复合物。
[0889]
治疗有效量：如本文所用的，术语“治疗有效量”意指待递送剂(例如，核酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量，当施用于患有或易感于感染、疾病、疾患和/或病症时，所述量足以治疗所述感染、疾病、疾患和/或病症；改善其症状；诊断、预防所述感染、疾病、疾患和/或病症和/或延迟其发作。在一些实施方案中，治疗有效量被提供为单剂量。在一些实施方案中，以包含多个剂量的剂量方案施用治疗有效量。本领域技术人员将理解，在一些实施方案中，如果单位剂型包含作为这样的剂量方案的一部分施用时有效的量，则该单位剂型可以被认为包含治疗有效量的特定剂或实体。
[0890]
治疗(treatment)或治疗(treating)：如本文所用的，术语治疗(“treatment”)或治疗(“treating”)表示用于获得有益或期望的结果(包括并且优选有益或期望的临床结果)的途径。这种有益或期望的临床结果包括但不限于以下一项或多项：减少癌细胞或其他患病细胞的增殖(或破坏所述细胞)、减少癌症中发现的癌细胞的转移、缩小肿瘤的大小、减少疾病引起的症状、提高患有疾病者的生活质量、减少治疗疾病所需要的其他药物的剂量、延缓疾病的进展和/或延长个体的生存期。
[0891]
调节：如本文所用的，术语“调节”意指响应于刺激或朝向特定结果的调整、平衡或适应一件事物。在一个非限制性实例中，本公开的sre和/或dd响应于特定的刺激和/或环境而调整、平衡或适应附加至、附接至它们或与它们关联的组合物的功能或结构。
[0892]
等同物和范围
[0893]
本领域技术人员将认识到或能够确定使用不超出常规的实验、根据本文所述的本公开的具体实施方案的许多等效形式。本公开的范围预期不限于以上说明，而是如所附权
利要求中阐述。
[0894]
在权利要求中，冠词如“一个/一种”(“a”)、“一个/一种”(“an”)和“该”可以表示一个或多于一个，除非有相反的指示或从上下文中显而易见。如果一个、多于一个或所有的组成员存在于给定的产品或过程中、在给定的产品或过程中采用、或以别的方式与给定的产品或过程有关，那么包括该组的一个或多个成员之间的“或”的权利要求或描述被认为是满意的，除非有相反的指示或另外从上下文中显而易见。本公开包括这样的实施方案，其中该组中恰好有一个成员存在于给定的产品或过程中、在给定的产品或过程中采用或以别的方式与给定的产品或过程有关。本公开包括这样的实施方案，其中多于一个或全部组成员存在于给定的产品或过程中、在给定的产品或过程中采用或以别的方式与给定的产品或过程有关。
[0895]
还注意的是，术语“包含”旨在是开放式的，允许但不要求包括另外的要素或步骤。当术语“包含”在本文中使用时，术语“由
……
组成”因此也被涵盖和公开。
[0896]
在给出范围的情况下，端点被包括在内。此外，应当理解，除非另有说明或另外从上下文和本领域普通技术人员的理解显而易见，否则在本公开的不同实施方案中，被表示为范围的值可以采取陈述范围内的任何特定值或子范围，一直到该范围的下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。
[0897]
另外，应当理解，落入现有技术中的本公开的任何特定实施方案都可以被明确排除在任何一项或多项权利要求之外。因为这样的实施方案被认为是本领域普通技术人员已知的，所以即使本文里没有明确阐述排除，它们也可以被排除。本公开的组合物的任何特定实施方案(例如，任何抗生素、治疗或活性成分；任何生产方法；任何使用方法；等等。)可以出于任何原因被排除在任何一项或多项权利要求之外，无论是否与现有技术的存在有关。
[0898]
应当理解，已经使用的词语是描述性而不是限制性的词语，并且在不脱离本公开的更广泛方面的真实范围和精神的情况下，可以在所附权利要求的范围内做出改变。
[0899]
虽然已经相对于若干所述的实施方案相当详尽地并且以一定的特殊性描述了本公开，但是并不意指本公开应当限于任何这样的细节或实施方案或者任何特定的实施方案，而是参考所附权利要求进行解释，从而基于现有技术提供对这样的权利要求的尽可能广泛的解释，并且因此有效地涵盖本公开的预期范围。通过以下非限制性实施例进一步说明展示本公开。
[0900]
实施例
[0901]
在下面的实施例中，构建体和dd通过它们的标识符(例如，ot-001976)而提及。关于构建体和dd的附加信息可以在整个说明书中找到。
[0902]
实施例1.ca2突变体饱和文库
[0903]
生成了其中seq id no.11717的第2至260位内的每个氨基酸被突变的突变体文库。突变文库通过接头与报道蛋白例如acgfp融合，并且转导到jurkat细胞中。使用选择标记mcherry选择了表达文库的细胞。将表达文库的细胞进行“低分选”，其中将gfp阳性群的后10％分选，以便仅收集最低的基础表达克隆。将表达文库的细胞用10μm塞来昔布处理24小时，单独将前10％和前10％-30％的gfp阳性细胞分选，收集，以确保在这个步骤中仅选择在配体存在下具有高gfp表达的细胞。将这两个群体，即前10％和前10％-30％合并用于随后的分选步骤，其中分选和收集后22％的表达gfp的细胞。在相似条件下，将最终文库用
dmso或10μm塞来昔布处理，并与ot-001987和ot-001515(具有ca2的w208s突变)进行比较。对于用配体处理观察到低基础表达和配体依赖性稳定，虽然最大表达没有ot-001987构建体那么高。与ot-001987相比，ot-001515对塞来昔布显示出配体依赖性稳定。从最终文库分离基因组dna，扩增，并通过gibson组装插入到慢病毒载体中。表16提供了通过此方法生成的碳酸酐酶2突变体以及它们在最终文库中出现的频率。在表16中，“*”代表终止密码子的翻译。在表16中，构建体id(ot-xxxxxx)是指包含参考的ca2突变体的构建体，文库id(libcxxxxxx)是指ca2突变体本身。
[0904]
表16.ca2饱和文库突变体
[0905]
[0906][0907]
将选择的构建体转导到nih3t3细胞中，并使用facs测试突变体对24小时的增加剂量的乙酰唑胺、塞来昔布或媒介物对照的响应。表17和表18显示了未用配体处理的mfi、最大倍数变化和ec
50
。所有测试的构建体的mfi随着利用的配体的剂量的增加而增加。一般而言，ot-001977和ot-001979对于两种配体都显示出最强的mfi增加。用乙酰唑胺获得的mfi值远高于用塞来昔布处理获得的mfi。
[0908]
表17.乙酰唑胺剂量响应
[0909]
构建体id基础mfi最大倍数变化ec50ot-0015151796.51.41ot-0019774965.980.185ot-001978135.6713.920.493ot-001979576.335.430.371ot-001980367.336.290.179
[0910]
表18.塞来昔布剂量响应
[0911][0912][0913]
可替代地，通过最终分选的文库库的荧光活化细胞分选生成单细胞克隆。通过用l0um乙酰唑胺处理来测试克隆。将与媒介物处理相比显示gfp表达增加至少5倍的克隆扩
001989两者中的car表达。对于伐地昔布，观察到很少或没有配体依赖性car调节。
[0925]
表21.以临床上可达到的配体剂量调节car表达
[0926][0927]
对于构建体ot-001988和ot-001989，将来自人供体的活化t细胞用10μl的慢病毒转导。在t细胞扩增的第10天，将细胞以10∶1、3∶1、1∶1、0.3∶1、0.1∶1、0.03∶1的效∶靶(e∶t)细胞比与nalm6-nuclightred细胞混合，并且用10μm乙酰唑胺或媒介物(dmso)对照处理5天。每2小时收集红色荧光图像，并使用incucyte zoom作为nalm6肿瘤细胞增殖的量度进行定量。如表22所示，在实验过程中，即120小时，载体转导的t细胞未抑制nalm6增殖，但ot-001407(seq id no.210963；由seq id no.210964编码)组成型car转导的t细胞在以10∶1、3∶1或1∶1的e∶t比培养时抑制了增殖。用ot-001988和ot-001989转导的t细胞在高e∶t比为10∶1和3∶1时，在不存在配体的情况下显示出nalm6细胞杀伤，表明具有基础活性，但在较低的e∶t比1∶1、0.3∶1、0.1∶1、0.03∶1时，在存在乙酰唑胺的情况下显示出特异性和调节性杀伤。
[0928]
表22.在低效：靶比时的细胞特异性和调节性细胞杀伤
[0929][0930][0931]
在72小时，从共培养物中收集上清液，并通过msd测定法分析干扰素ifnγ和il2水平。将细胞因子水平归一化为未转导的t细胞与nalm6-nuclightred细胞共培养的倍数变化。在表23和表24中所示的结果表明，载体转导的t细胞不分泌ifng或il2，但ot-001407组成型car转导的t细胞以细胞剂量依赖性方式分泌。在不存在配体的情况下，ca2 dd转导的t
细胞在高e∶t比(比如10∶1和3∶1)时显示出一定的细胞因子分泌，但在存在配体的情况下，在1∶1、0.3∶1、0.1∶1和0.03∶1比时显示出特异性和调节性细胞因子分泌。
[0932]
表23.在低效：靶细胞比时的特异性和调节性ifnγ分泌
[0933][0934]
表24.在低效：靶细胞比时的特异性和调节性il2分泌
[0935][0936]
实施例4.人碳酸酐酶2的去稳定突变体筛选
[0937]
为了鉴定在配体与ca2结合后被稳定化的人ca2的去稳定突变，使用genscript(中国)提供的慢病毒ca2突变体文库进行了两轮突变体筛选。使用诱变引物和易错pcr，这些方法用于生成突变多肽文库。genscript还提供了表达与gfp(ot-001986)可操作连接的模板(野生型人ca2)的慢病毒载体以及ca2突变体文库。将文库包装到慢病毒中，以大约0.3的感染复数(moi)转导到nih3t3细胞中，并通过用选择标记嘌呤霉素进行选择，得到选择的稳定的细胞库。
[0938]
为了鉴定含有当ca2与其相应配体结合时稳定的ca2的去稳定突变体的细胞库，使用facs分选细胞。在第初始轮中，选择了在不存在配体的情况下gfp阴性的后15％的群体。将细胞扩增，然后用10μm塞来昔布处理24小时，并收获用于细胞分选。收集与未处理相比对配体处理也有响应的前11％的gfp阳性细胞。将塞来昔布从培养物中移除并用dmso代替。通过facs分析细胞，仅选择与来自在存在塞来昔布的情况下显示gfp表达的先前分选的群体不重叠的细胞群。与初始ca2文库相比，当用塞来昔布或伐地昔布处理时，相对于dmso对照处理，最终分选后的文库显示出在gfp表达方面的4-6倍诱导。分离基因组dna并扩增，将ca2突变体重新引入至其中ca2与gfp可操作连接的慢病毒载体。对于每个克隆，用慢病毒载体将构建体转导到nih3t3细胞中。将细胞用10μm伐地昔布或10μm塞来昔布处理24小时，并通过facs分析。表25显示了表示为“中位pe”的中位荧光强度和指示为sr的稳定比。在表25中，构建体id(ot-xxxxxx)是指包含参考的ca2突变体的构建体，文库id(libcxxxxxx)是指ca2突变体本身。
[0939]
表25.ca2突变体的配体依赖性响应
[0940][0941][0942]
响应于配体处理，lib000198、libc000208、libc000193；libc000186；ot-002006；libc000226显示出大于2的稳定比。
[0943]
通过facs测量和分析nih3t3细胞对24小时的不同剂量的伐地昔布或塞来昔布的响应。表26和表27显示了分别用伐地昔布或塞来昔布处理的表示为“med”的中位荧光强度、表示为“p”的亲本细胞和指示为sr的稳定比。
[0944]
表26.ca2突变体对伐地昔布的剂量响应
[0945][0946]
表27.ca2突变体对塞来昔布的剂量响应
[0947][0948]
当用伐地昔布或塞来昔布处理时，libc000226、ot-002006、libc000186、libc000193和libc000208显示出剂量依赖性稳定。
[0949]
通过用1、3、10或30μm塞来昔布或伐地昔布处理nih3t3细胞24小时也证实了libc000226、ot-002006、libc000186、libc000193和libc000208的配体依赖性稳定。通过细胞裂解物对于gfp的免疫印迹来测量在存在配体的情况下的蛋白质表达。所有测试的构建体都显示出随着配体剂量增加的gfp稳定。在存在或不存在配体的情况下，对于ot-001986构建体都没有观察到表达的变化。
[0950]
通过facs测量和分析nih3t3细胞对24小时的不同剂量的乙酰唑胺的响应。表28显示了对于乙酰唑胺的表示为“中位fitc”的中位荧光强度和指示为sr的稳定比。
[0951]
表28.ca2突变体对乙酰唑胺的剂量响应
[0952][0953]
包括libc000208在内的所有测试的ca2 dd/ca2构建体在对乙酰唑胺的响应中显示出gfp表达的剂量响应稳定。
[0954]
通过用0.3、1、3、10或30μm乙酰唑胺处理nih3t3细胞24小时，也证实了libc000184、ot-002006、libc000186、libc000193和libc000208的配体依赖性稳定。通过细胞裂解物对于gfp的免疫印迹来测量在存在配体的情况下的蛋白质表达。所有测试的构建体都显示出随着配体剂量增加的gfp稳定。在存在或不存在配体的情况下，对于ot-001986构建体都没有观察到表达的变化。
[0955]
对用不同配体处理的克隆进行比较，以检查每个突变体对于配体的行为。为了能够在不同日期进行的不同实验之间进行比较，将塞来昔布和伐地昔布的数据标准化如下：(mfi(实验第x天)/mfi(亲本第x天))*mfi(亲本第1天)，其中亲本第1天代表乙酰唑胺处理的克隆的dmso值。结果示于表29中。
[0956]
表29.ca2突变体的比较分析
[0957][0958][0959]
实施例5.嵌合构建体的体外活性
[0960]
在人原代t细胞中测试了il15嵌合构建体ot-002019((met；cd34(wt的氨基酸1-32，mig，s32a)；il15(wt的30-162)；接头((gs)15)；cd8a铰链和跨膜结构域；接头(gs)；终止)，氨基酸seq id no：210876，核酸seq id no：210877)和ot-002090((igk轻链前导序列；
il15(wt的49-162)；接头((gs)15)；b7-1铰链、跨膜结构域和尾部；接头(gs)；终止)，氨基酸seq id no：210878，核酸seq id no：210879)和ca2调节的il-15嵌合构建体(ot-002094)。在用cd3/cd28珠活化后24小时，用慢病毒转导人原代t细胞。将细胞扩增10天。在用10um乙酰唑胺(acz)处理24小时后，在第6天通过流式细胞术分析调节的il15的表达。对于每个处理组获得的il-15阳性细胞的百分比如下：(a)ot-002019：82.3％(b)ot-002090：43.6％(c)ot-002094，具有dmso：0.7％(d)ot-002094，具有10um acz：27.9％，以及(e)未转导的(ut)：0.3％。
[0961]
为了测试il-15依赖性扩增，在第10天移除珠子并洗涤细胞。然后将表达il15的t细胞或对照t细胞仅仅在新鲜培养基中培养或在存在乙酰唑胺或外源性il15(1ng/ml)的情况下培养10天。通过流式细胞术确定t细胞数(表30)和cd4/cd8比率的变化(表31)。il15阳性细胞的百分比示于表32中。
[0962]
表30：t细胞数
[0963][0964]
表31：cd4/cd8比率
[0965][0966]
表32：il15阳性细胞的百分比
[0967][0968]
培养物中的连续乙酰唑胺导致在10天中扩增3.6倍，并且乙酰唑胺处理降低了cd4/cd8比率。
[0969]
实施例6.t细胞中的cd40l体外调节
[0970]
生成受到碳酸酐酶dd调节的cd40l构建体并将其克隆到慢病毒载体中。将纯化的t细胞解冻并用acd3 acd28 dynabeads培养(以3个珠子对1个t细胞的比率)。
[0971]
第二天，将构建体转导到t细胞中。添加病毒后48小时，使用50μm乙酰唑胺或媒介物对照(dmso)测试配体依赖性调节。在添加配体后24小时，针对cd40l表达将t细胞染色，并使用facs进行分析。在存在乙酰唑胺的情况下，与媒介物对照和表达无插入物的空载体的t细胞相比，ot-001990显示出cd40l表达增加。测量cd4+和cd8+ t细胞中响应于增加剂量的乙酰唑胺的cd40l表达。用乙酰唑胺处理细胞24小时，使用facs测量cd40l表达。将结果显示为表33中的中位荧光强度和表34中的cd40l阳性细胞百分比。
[0972]
表33.cd40l mfi
[0973]
乙酰唑胺cd4+cd8+0.011121050.051231040.21851360.84813073.184038012.5278315995037282184
[0974]
表34.cd40l阳性细胞百分比
[0975][0976]
如表33和表34中所示，在cd4+ t细胞和cd8+ t细胞中都观察到配体依赖性调节。然而，cd4+细胞中的绝对mfi值和cd40l阳性细胞的百分比更高。在人可达到的在配体水平内，需要乙酰唑胺的量实现cd40l稳定。
[0977]
实施例7.膜结合il12-ca2在原代人car-t细胞中的调节
[0978]
用双顺反子构建体(ot-002008)转导t细胞，对cd19-car表达赋予ca2 dd调节的膜结合形式的il-12的表达。将t细胞活化，用指示的构建体转导，并如上所述进行扩增。将转导的细胞用100μm乙酰唑胺(或媒介物作为对照)处理20小时。用抗il12p70抗体(bd，franklin lakes，nj)检测表面il12表达。与媒介物对照相比，乙酰唑胺处理诱导了表面il12表达的6倍增加。由ot-002008表达细胞表达的il12高于仅用car构建体ot-001407转导的t细胞所观察到的il12水平。
[0979]
在第0天，在含有10％胎牛血清(fbs)的培养基中，用dynabeads(t-expander cd3/cd28)以3∶1的珠：细胞比刺激原代人t细胞。第二天，在存在减少的血清(5％fbs)的情况下，加入用表达cd19-car和膜结合的flexi il12的构建体ot-002007、ot-002008、ot-002010和
ot-002012产生的慢病毒。第2天，将细胞用新鲜的10％fbs培养基以1∶2稀释。细胞总共被扩增10-11天，然后将其在液氮中冷冻。接下来，将t细胞解冻并计数。将每孔1-2e5个细胞在v型底96孔板中铺板，用可溶性cd3/cd28 immunocult试剂(stem cell technologies)再刺激，并用0-100μm范围内的乙酰唑胺的剂量响应进行处理。孵育24小时后，使用cd19-fc通过流式细胞术检测表面car表达来分析有效负载表达。用抗il12p70抗体(bd)检测表面il12表达。绘制car+细胞上的表面il12p70表达的几何mfi(表35)，并使用prism软件进行剂量响应曲线拟合。剂量响应曲线拟合显示在图2中。
[0980]
表35.表面il12 mfi
[0981][0982][0983]
如表35所示，ot-002010显示了对乙酰唑胺的动态剂量响应，其中在最低配体浓度时为低表达，在存在配体的情况下为强诱导。这些数据表明，ca2 dd能够调节膜结合的il12有效负载。
[0984]
实施例8.t细胞中的cd40l体外时程调节
[0985]
生成受到碳酸酐酶dd调节的cd40l构建体并将其克隆到慢病毒载体中。将纯化的t细胞解冻并用acd3 acd28 dynabeads培养(以3个珠子对1个t细胞的比率)。
[0986]
将构建体转导到t细胞中，并给予50μm剂量的乙酰唑胺或媒介物对照(dmso)，维持48小时。还评价了空载体(ev)对照和组成型cd40l(ot-001661)。在第2、4、6、8、24和48小时，将细胞固定，然后将t细胞针对cd40l表达进行染色，使用facs进行分析。将结果显示为表36中的中位荧光强度和表37中的cd40l阳性细胞百分比。
[0987]
表36.cd40l mfi
[0988][0989]
表37.cd40l阳性细胞百分比
[0990][0991][0992]
在存在乙酰唑胺的情况下，与媒介物对照和表达无插入物的空载体的t细胞相比，ot-001990显示出cd40l表达增加。测量cd4+和cd8+ t细胞中响应于增加剂量的乙酰唑胺的cd40l表达。如表36和表37所示，在cd4+ t细胞以及cd8+ t细胞中都观察到配体依赖性调节。cd4+细胞中的mfi绝对值和cd40l阳性细胞百分比较高。表达在24小时达到峰值，其中最高剂量表达高于组成水平。
[0993]
实施例9.ca2对t细胞中cd40l的调节
[0994]
为了测试调节，将活化t细胞用ca2调节的cd40l(ot-001990)和对照cd40l(ot-001661)通过慢病毒转导。在两天后，如表38中所述，用媒介物或50mm配体处理细胞24小时，之后分析它们的cd40l表面表达。以下显示了针对cd4+和cd8+细胞以及总的细胞的结果。在表中，“acz”是乙酰唑胺。
[0995]
表38：表达cd40l的细胞的百分比
[0996][0997]
去稳定结构域的调节表达显著增强了cd40l表达，其超过内源性水平。ca2去稳定结构域显示出接近于组成型表达的水平，其中配体剂量接近临床相关水平。
[0998]
实施例10.配体剂量滴定
[0999]
为了评价响应于乙酰唑胺的ca2调节的car表达，在存在cd3/cd28 dynabeads的情况下，以3∶1的珠∶细胞比，将t细胞解冻并活化过夜。第二天，用指示的构建体或空载体转导细胞。在10天的过程中，通过添加新鲜培养基使细胞扩增，将细胞维持在0.5xl0^6细胞/ml左右。在扩增的第8天，将等分试样的细胞接种到96孔板中，用滴定的乙酰唑胺处理，然后在孵育24小时后通过facs用10ug/ml cd19-fc染色分析car表达。
[1000]
如表39所示，例如，ot-002175显示了低基础car表达的良好特征，其中在低(＜lum)配体浓度时的调节表达中增加大于10倍。
[1001]
表39.响应于乙酰唑胺(acz)的ca2调节的car表达
[1002][1003]
在spotfire中通过将4参数曲线拟合至相对于配体剂量的单线态|活细胞门控的％car+细胞来计算表40中显示的ec50值。
[1004]
表40.响应于乙酰唑胺的ca2调节的car表达-ec50值
[1005][1006][1007]
实施例11.在用于体内研究的大批量细胞中证实ca2调节的car表达和细胞毒性
[1008]
为了在用于体内研究的大批量细胞中证实ca2调节的car表达，在存在cd3/cd28 dynabeads的情况下，以3∶1的珠∶细胞比，将t细胞解冻并活化过夜。第二天，将细胞用来自构建体pelds-001、ot-001407或ot-002175的慢病毒转导。在10天的过程中，通过添加新鲜培养基使细胞扩增，将细胞维持在0.5xl0^6细胞/ml左右，然后冷冻。为了检查car的表达，将细胞解冻，并且在存在dmso或10um乙酰唑胺的情况下，在具有cd3/cd28珠(珠∶细胞比为1∶1)或细胞因子(il2、il7、il15和il21各自10ng/ml)的t细胞培养基中培养过夜。在孵育24小时后，通过facs染色用lug/ml cd19-fc分析细胞的car表达，并且使用单线态|活细胞门控确定car+细胞的％。
[1009]
如表41所示，在过夜培养解冻的细胞后，约40-50％的细胞为car阳性。
[1010]
表41.大批量car+解冻后细胞的百分比
[1011][1012]
为了在用于体内研究的大批量细胞中证实细胞毒性，在存在cd3/cd28 dynabeads的情况下，以3∶1的珠∶细胞比，将t细胞解冻并活化过夜。第二天，将细胞用来自构建体pelds-001、ot-001407或0t-002175的慢病毒转导。在10天的过程中，通过添加新鲜培养基使细胞扩增，将细胞维持在0.5xl0^6细胞/ml左右，然后冷冻。为了证实细胞毒性，将细胞解冻，并且以10∶1、3∶1、1∶1、0.3∶1、0.1∶1、0.03∶1的效∶靶(e∶t)细胞比与nalm6-nuclightred混合，并且用10μm乙酰唑胺或媒介物(dmso)对照处理5天。每2小时收集红色荧光图像，并使用incucyte zoom作为nalm6肿瘤细胞增殖的量度进行定量。
[1013]
表42中显示的结果表明，在实验过程中，即120小时，载体转导的t细胞未抑制nalm6增殖，但ot-001407(seq id no.210963；由seq id no.210964编码)组成型car转导的t细胞在以10∶1、3∶1或1∶1的e∶t比培养时抑制了增殖。用ot-002175转导的t细胞在高e∶t比10∶1时，在不存在配体的情况下显示出nalm6细胞杀伤，表明具有基础活性，但在存在乙酰唑胺的情况下显示出增加的杀伤。
[1014]
表42.大批量解冻后细胞的细胞毒性
[1015]
e∶t比pelns-001∶dmsoot-001407∶dmsoot-002175∶dmsoot-002175∶acz 10nm10∶16923745715255406428113∶11010606137817200785801321∶11104630341838834657887002
[1016]
在72小时，从共培养物中收集上清液，并通过msd测定法分析ifn-g和il-2水平。在表43中所示的结果表明，载体转导的t细胞不分泌ifn-g或il-2，但ot-001407组成型car转导的t细胞以细胞剂量依赖性方式分泌。在存在配体的情况下，ot-002175转导的t细胞在10∶1和3∶1比时显示出调节的细胞因子分泌。
[1017]
表43.ifn-g和il-2水平对应于细胞毒性的持续时间和水平
[1018] delns-001∶dmsoot-001407∶dmsoot-002175∶dmsoot-002175∶acz 10um10∶1 ifn-g05625147393383∶1 ifn-g03333730109610∶1 il-20.3243465303∶1 il-20.1550110295
[1019]
实施例12.ca2调节的cd19 car的体内功效、药效学和药代动力学
[1020]
在ot-002175的有希望的体外结果之后，在8周龄大的雌性nsg小鼠的nalm6-luc异种移植模型中，在体内测试了此构建体的功效、药效学和药代动力学。将实验设计总结在表44中。
[1021]
表44.ot-002175体内分析的实验设计
[1022]
组n构建体体内治疗给药方案细胞剂1a，ib8pelds-001-013媒介物qd5m2a，2b8ot-001407媒介物qd5m3a，3b8ot-001407乙酰唑胺qd5m4a，4b8ot-002175媒介物qd5m5a，5b8ot-002175乙酰唑胺qd5m6a，6b8ot-002175乙酰唑胺qd 100mg/kg5m7a，7b8ot-002175乙酰唑胺qd 30mg/kg5m1c4pelns-001媒介物qd5m2c4ot-001407媒介物qd5m4c4ot-002175媒介物qd5m5c4ot-002175乙酰唑胺qd5m
[1023]
在媒介物(10％dmso；20％kolliphor rh40；30％peg 400；40％(12％)水中的captisol)中以200mg/kg施用乙酰唑胺的单个或重复的口服剂量。一直到单剂量后24小时，以及在重复每日剂量一直到100小时后，测量乙酰唑胺的血浆浓度(数据未显示)。在每日重复剂量后一直到12天，在第0-4天和第8-11天，测量体重(数据未显示)。多剂量范例显示，重复剂量的乙酰唑胺没有升高每日1hr cmax值，并且在每日剂量的第一周结束时，来自给药的体重变化开始趋于平稳，这表明接受多剂量乙酰唑胺的动物能够耐受长期重复给药。
[1024]
通过测量接受重复配体给药的小鼠中的总通量一直到肿瘤植入后32天，测试ot-002175的剂量响应性(数据未显示)。30mg/kg、100mg/kg和200mg/kg的乙酰唑胺浓度分别显示出增强的抗肿瘤活性，对体重的影响是相当的。
[1025]
这些结果证明，从给药的第二周开始，乙酰唑胺给药对体重的初始影响被克服，这表明配体具有良好的长期耐受性，并保持了高car表达。用ot-002175实现了剂量依赖性抗肿瘤功效。
[1026]
监测了输注car-t细胞后在全血中的ca2调节的car表达。在输注后7天，将50ul血液中的人t细胞数进行计数，发现低于在组成型表达cd19car的表达对照中观察到的细胞扩增，但仍受到乙酰唑胺治疗的调节(数据未显示)。收获cd19 ot-002175 car-t细胞，并评估cd69和cd25的表达，发现其偏向于活化cd8+表型(数据未显示)。
[1027]
这些结果证明，ca2调节的car表现出与功效实验一致的抗肿瘤活性，乙酰唑胺治疗使在血液中car介导的t细胞扩增和调节的car表达成为可能，其中乙酰唑胺以临床可达到的水平给药，并且cd19 car偏向于cd8+表型。
[1028]
进行终末收集以评估骨髓和转移瘤中的nalm6的cd19抗原状态，以确定抗原逃逸是否能解释cd19 ot-002175 car-t细胞与组成型car对照相比的调节功效降低。在肿瘤和骨髓样品中观察到cd19表达，并且没有观察到抗原逃逸的证据(数据未显示)。
[1029]
实施例13.表征在筛选和结构导向突变中鉴定的单个突变和突变组合
[1030]
设计了ca2 dd，其中单个或成对的点突变来源于筛选中鉴定的突变体。另外，还设计了具有合理设计的新突变的ca2 dd。如此生成的ca2 dd与acgfp连接并克隆到慢病毒载体中。用慢病毒转导jurkat细胞，用乙酰唑胺处理24小时，通过facs分析gfp表达。
[1031]
表45-51显示了各种ca2 dd突变体的表征。
[1032]
表45：ca2 dd的表征
[1033]
构建体drd基础max[acz]，μm倍数变化ec50，μmot-ca2-058ca2(g63d，m240l)1711346307.90.54ot-ca2-059ca2(a77i，p249f)1241208309.81.1ot-ca2-060ca2(d71k，t192f)2341352305.80.14
[1034]
表46：ca2 dd的表征
[1035]
构建体drd基础max[acz]，μm倍数变化ec50，μmot-ca2-085ca2(y51t)1907854252302.80.15ot-ca2-086ca2(s73n，r89f)1686748989302.90.07ot-ca2-087ca2(d72f，p249f)1151660576305.30.11ot-ca2-088ca2(t55k，g63n，q248n)7266823043011.30.73ot-ca2-089ca2(y193i)9777582253060.25ot-ca2-090ca2(s56f)8070874253010.80.77ot-ca2-091ca2(s56f，d71s)3395675273019.91.6ot-ca2-092ca2(s73n，r89y)2305675755303.30.07ot-ca2-093ca2(v134f，l228f)2621550435301.90.02
[1036]
表47：ca2 dd的表征
[1037]
构建体drd基础max[acz]，μm倍数变化ot-ca2-096ca2(l156h，4aadel30.85217.6307.1ot-ca2-097ca2(l156h，4aa del40.5131.6303.2ot-ca2-098ca2(w4y，l156h)39533.13013.7ot-ca2-099ca2(l156h，gep del27.7356.63012.9ot-ca2-101ca2(l156h，f225l)67.1960.63014.3ot-ca2-102ca2(d70n，d74n，38.05180.6304.7
[1038]
表48：ca2 dd的表征
[1039]
构建体drd基础max[acz]，μm倍数变化ot-ca2-073ca2(r27l，h122y)173.5725304.2ot-ca2-075ca2(t87i，h122y)493.51277.5302.6ot-ca2-077ca2(h122y，n252d)318.51091.5303.4ot-ca2-078ca2(d72f，v241f)3951569.5304ot-ca2-079ca2(v241f，p249l)13762262.5301.6ot-ca2-080ca2(d72f，p249l)5781563.5302.7ot-ca2-081ca2(d71l，t87n)1567.52372.5301.5ot-ca2-082ca2(d71l，l250r)4541674303.7
[1040]
表49：ca2 dd的表征
[1041]
构建体drd基础max[acz]，μm倍数变化ot-ca2-006ca2(e106d)98943268996502.8
[1042]
表50：ca2 dd的表征
[1043]
构建体drd基础max[acz]，μm倍数变化ot-ca2-038ca2(i59n)76.61156.63015.1ot-ca2-039ca2(g63d)644.12086.6303.2ot-ca2-046ca2(h122y)237.8220.8300.9
[1044]
表51：ca2 dd的表征
[1045]
构建体drd基础max[acz]，μm倍数变化ot-ca2-031ca2(l197p)6601753302.7ot-ca2-032ca2(l156h，s172c，f178y，e186d)483128263026.6ot-ca2-033ca2(l156h)683177263026ot-ca2-034ca2(r27l，t87i，h122y，n252d)306108263035.4
[1046]
表52和图3显示了ot-002347和ot-001978的剂量响应结果。
[1047]
表52：ca2 dd的剂量响应
[1048]
[acz]，μmot-0023470t-0019783087667.528337.5108174925959.833.375551.6724250.171.165318.3320978.830.3648149.3315438.670.1229860.339858.50.0421283.676473.50.013318682.675499.3330.00443316782.175327.167016539.675077.667ec50，μm0.47960.4589
[1049]
虽然已经相对于若干所述的实施方案相当详尽地并且以一定的特殊性描述了本公开，但是并不意指本公开应当限于任何这样的细节或实施方案或者任何特定的实施方案，而是参考所附权利要求进行解释，从而基于现有技术提供对这样的权利要求的尽可能广泛的解释，并且因此有效地涵盖本公开的预期范围。
[1050]
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