1.本发明属于胶原蛋白提取技术领域，尤其涉及一种自体胶原蛋白的提取方法。
背景技术：
2.胶原蛋白是人体内含量最多、分布最广的蛋白质，是人体组织的基本成分之一，约占人体蛋白质总量的1/3。胶原蛋白主要分布于皮肤、韧带、肌腱、软骨等部位，起到维持皮肤和各组织器官的形态结构的作用，同时也是修复各损伤组织的重要原料物质。因胶原蛋白具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，其可以在细胞表面黏附、趋化、生长、分化及发生介导免疫反应，被广泛应用于医学生物材料和医学临床治疗，同时，胶原蛋白可以补充皮肤各层所需的营养，使皮肤中胶原活性增强，有滋润皮肤，延缓衰老、美容等功效。
3.但是目前胶原蛋白的提取一般是从皮肤、韧带、肌腱、软骨等部位进行提取，而对血液中自体胶原蛋白提取的相关研究较少，且现有技术中的相关技术方案复杂，速度慢。
4.为此，能够提供一种简单、高效的自体胶原蛋白的提取方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现要素：
5.有鉴于此，本发明提供了一种自体胶原蛋白的提取方法，本发明通过采用盐析法和酶解法进行联合，对血液中的自体胶原蛋白进行提取，所获取的胶原蛋白提取率高，纯度高。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种自体胶原蛋白的提取方法，具体包括以下步骤：
8.(1)向血液中加入酶解液进行酶解，反应结束后，得到自体胶原粗提液；
9.(2)将胶原粗提液的ph调至6.5-7.5，然后加入中性盐并搅拌形成盐析液，静置、过滤所述盐析液即得自体胶原蛋白沉淀。
10.本发明通过采用盐析法和酶解法进行联合，对血液中的自体胶原蛋白进行提取，所获取的胶原蛋白提取率高，且纯度好。
11.优选地，所述酶解液由0.1-2g胃蛋白酶与1-2l酸性溶液混合而成。
12.采用在酸性条件下酶解的方法，可以水解掉胶原纤维蛋白的末端肽，提高胶原蛋白的产率；而且还不会破坏胶原蛋白的三股螺旋结构，保持其特性。
13.优选地，所述酸性溶液的浓度为0.1-0.2mol/l。
14.优选地，所述酸性溶液为乙酸、柠檬酸、酒石酸和亚酒石酸中的任意一种。
15.优选地，步骤(1)所述反应的条件为：酶解液加入后，保持ph为2-3，在5-10℃下反应5-6h。
16.优选地，步骤(2)所述ph通过氢氧化钠、氢氧化钾和碳酸氢钠中的任意一种调节，其中浓度为5-20％。
17.优选地，步骤(2)所述中性盐为氯化钠或者氯化钾。
18.本发明提供的提取胶原蛋白的方法，得到的胶原蛋白粗溶液杂质少，可以直接盐析和进行过滤纯化，操作方便。
19.优选地，步骤(2)所述中性盐的终浓度为3-5mol/l。
20.优选地，步骤(2)所述静置为在层析冰柜中放置12-24h。
21.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
22.本发明提供了一种自体胶原蛋白的提取方法，本发明通过采用盐析法和酶解法进行联合，对血液中的自体胶原蛋白进行提取，所获取的胶原蛋白提取率高，纯度高。
具体实施方式
23.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.实施例1
25.一种自体胶原蛋白的提取方法，具体包括以下步骤：
26.(1)向1l血液中加入酶解液，使反应液ph为2，在5℃下酶解反应5h，反应结束后，得到自体胶原粗提液；其中，酶解液由0.1g胃蛋白酶与1l0.1mol/l乙酸溶液混合而成。
27.(2)将胶原粗提液用5％的氢氧化钠ph调至6.5，然后加入氯化钠并搅拌形成盐析液，氯化钠终浓度为3mol/l，然后层析冰柜中放置12h，过滤盐析液即得自体胶原蛋白沉淀。
28.实施例2
29.一种自体胶原蛋白的提取方法，具体包括以下步骤：
30.(1)向1l血液中加入酶解液，使反应液ph为3，在10℃下酶解反应6h，反应结束后，得到自体胶原粗提液；其中，酶解液由0.1g胃蛋白酶与2l0.1mol/l乙酸溶液混合而成。
31.(2)将胶原粗提液用20％的氢氧化钠ph调至7.5，然后加入氯化钠并搅拌形成盐析液，氯化钠终浓度为5mol/l，然后层析冰柜中放置24h，过滤盐析液即得自体胶原蛋白沉淀。
32.实施例3
33.一种自体胶原蛋白的提取方法，具体包括以下步骤：
34.(1)向1l血液中加入酶解液，使反应液ph为2，在10℃下酶解反应5h，反应结束后，得到自体胶原粗提液；其中，酶解液由0.2g胃蛋白酶与1l0.1mol/l柠檬酸溶液混合而成。
35.(2)将胶原粗提液用10％的氢氧化钠ph调至7，然后加入氯化钠并搅拌形成盐析液，氯化钠终浓度为4mol/l，然后层析冰柜中放置24h，过滤盐析液即得自体胶原蛋白沉淀。
36.对比例1
37.不采用步骤(1)酶解液进行酶解，其余步骤与参数与实施例3相同。
38.对比例2
39.不采用步骤(2)中性盐进行盐析，其余步骤与参数与实施例3相同。
40.对比例3
41.采用现有技术中的技术方案：1l血液经离心后进入全血分离器，并在全血分离器内进行二次离心，全血离心分为三层，自上而下依次为血浆层、白膜层和红细胞层，将血浆
层、白膜层和红细胞层的液体分别通过导管导入不同的储存单元分开存放，由储存单元取出适量血浆层和白膜层液体按1:1混合，并经层析单元进行初步纯化、透滤单元进一步纯化即得自体胶原蛋白。
42.对比例4
43.直接将1l血液常温下静置30h，过滤，得到自体胶原蛋白。
44.采用现有技术对提取率和纯度进行检测，实施例1-3和对比例1-3的相应提取率和纯度数据见表1；
45.表1实施例1-3和对比例1-3的提取率和纯度
[0046][0047][0048]
由上可知，通过采用盐析法和酶解法进行联合，对血液中的自体胶原蛋白进行提取，所获取的胶原蛋白提取率高，纯度高，具有显著的进步。
[0049]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
技术特征：
1.一种自体胶原蛋白的提取方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)向血液中加入酶解液进行酶解，反应结束后，得到自体胶原粗提液；(2)将所述胶原粗提液的ph调至6.5-7.5，然后加入中性盐并搅拌形成盐析液，静置、过滤所述盐析液即得自体胶原蛋白沉淀。2.根据权利要求1所述的一种自体胶原蛋白的提取方法，其特征在于，所述酶解液由0.1-2g胃蛋白酶与1-2l酸性溶液混合而成。3.根据权利要求2所述的一种自体胶原蛋白的提取方法，其特征在于，所述酸性溶液的浓度为0.1-0.2mol/l。4.根据权利要求2所述的一种自体胶原蛋白的提取方法，其特征在于，所述酸性溶液为乙酸、柠檬酸、酒石酸和亚酒石酸中的任意一种。5.根据权利要求1所述的一种自体胶原蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述反应的条件为：酶解液加入后，保持ph为2-3，在5-10℃下反应5-6h。6.根据权利要求1所述的一种自体胶原蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(2)所述ph通过氢氧化钠、氢氧化钾和碳酸氢钠中的任意一种调节。7.根据权利要求1所述的一种自体胶原蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(2)所述中性盐为氯化钠或者氯化钾。8.根据权利要求1所述的一种自体胶原蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(2)所述中性盐的终浓度为3-5mol/l。9.根据权利要求1所述的一种自体胶原蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(2)所述静置为在层析冰柜中放置12-24h。
技术总结
本发明公开了一种自体胶原蛋白的提取方法，具体包括以下步骤：(1)向血液中加入酶解液进行酶解，反应结束后，得到自体胶原粗提液；(2)将所述胶原粗提液的pH调至6.5-7.5，然后加入中性盐并搅拌形成盐析液，静置、过滤所述盐析液即得自体胶原蛋白沉淀。本发明通过采用盐析法和酶解法进行联合，对血液中的自体胶原蛋白进行提取，所获取的胶原蛋白提取率高，纯度高。高。
技术研发人员：李广
受保护的技术使用者：李广
技术研发日：2021.11.10
技术公布日：2022/1/21