1.本发明属于生物技术领域，涉及一种核酸完整性评估试剂盒及评估方法。


背景技术：

2.在分子生物学基因检测中，核酸完整性是极重要的质控指标之一，如全基因组测序、全外显子测序以及pcr扩增等，都要求核酸完整，否则实验会面临检测结果较差甚至失败的风险。对于基因检测，常用的石蜡包埋组织样本、放置很久的血液样本，法医鉴定取得的降解严重的样本，其核酸完整性往往都比较差，会导致后续的检测结果较差甚至失败。因此，在进行核酸样本检测前，需要对核酸完整性进行评估，所以需要一种准确且高灵敏度的核酸完整性评估方法。
3.目前检测核酸完整性的方法主要有nanodrop法、qubit法、q-pcr法和凝胶电泳法等。nanodrop法为利用分光光度计检测核酸的浓度，原理为核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光，rna和核酸的紫外吸收峰在260 nm波长处，此法操作简便，迅速，但若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测量误差较大，且nanodrop及其它紫外分光光度计均采用紫外吸光度进行检测，它无法区分出完整核酸、降解核酸、游离核苷酸及其它一些杂质；qubit是新一代的核酸和蛋白定量仪器，它可以采用荧光染料检测特定目标分子的浓度，染料只有与核酸、rna或蛋白结合后才能发出荧光，即使有游离核苷酸或降解核苷酸时也是如此，所以缺点就是对于降解的核酸，只要是有双链结构就会发出荧光，会导致有效浓度产生偏差；q-pcr大部分是设计几对内参引物探针，分别对样本进行扩增，根据标准品检测未知样本浓度，缺点是反应个数非常多；凝胶电泳是将样本进行电泳，根据电泳条带判断样本降解程度，凝胶电泳法判断样本浓度比较粗糙，人为判读误差较大，且灵敏度非常低，只有在大于10 ng时条带才能比较明显。
4.综上所述，如何提供一种能够准确、快速评估核酸完整性的产品及方法，是分子生物学领域亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种核酸完整性评估试剂盒及评估方法，能够有效评估样本中核酸完整性，灵敏度高，准确性好。
6.为达上述目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种核酸完整性评估试剂盒，所述试剂盒包括引物混合液、pcr酶、pcr缓冲液、内参和校准品，所述引物混合液包括扩增4种管家基因的引物对，所述引物对扩增的pcr产物的长度不同，4个pcr产物长度相差分别不小于90bp，且长度范围分布在50bp-1000bp之间，所述内参包括所述4种管家基因的核酸片段，所述内参的核酸片段的序列较原管家基因核酸片段序列增加至少2 bp，且增加位置在所述引物对扩增片段内的非引物结合区，所述校准品包括人标准基因组dna。
7.本发明的核酸完整性评估试剂盒，分别对待测样本和校准品的4种管家基因（例如
gapdh基因、tbxas1基因、af4基因和plzf基因）进行pcr扩增，同时内参也在同一体系中进行pcr扩增，然后对所有pcr产物进行毛细管电泳，来评估核酸完整性。毛细管电泳结果可分别得到待测样本管中待测样本各基因的峰高和内参相应基因的峰高，以及校准品管中校准品各基因的峰高和内参相应基因的峰高，从而可计算出待测样本和校准品中各基因与其内参相应基因的峰高比，即待测样本各基因峰高/相应基因内参峰高以及校准品各基因峰高/相应基因内参峰高。将待测样本中各基因的峰高比与校准品中对应基因的峰高比进行比较，即可判断样本核酸完整性。其中，内参中各管家基因的核酸片段设计增加了至少2 bp，使其出峰位置与样本不同，作为体系内部对照，用于校正操作误差及毛细管运行之间的差异，及样本或体系中可能存在的抑制剂的影响产生的差异，可显著提高检测的准确性。
8.本发明中，在细胞中稳定表达管家基因均适用于本发明的技术方案。
9.优选地，所述4种管家基因包括gapdh基因、tbxas1基因、af4基因和plzf基因。
10.优选地，所述gapdh基因的引物对的核酸序列包括seq id no.5~seq id no.6所示的序列。
11.优选地，所述tbxas1基因的引物对的核酸序列包括seq id no.7~seq id no.8所示的序列。
12.优选地，所述af4基因的引物对的核酸序列包括seq id no.9~seq id no.10所示的序列。
13.优选地，所述plzf基因的引物对的核酸序列包括seq id no.11~seq id no.12所示的序列。
14.优选地，所述引物对中至少一条引物具有荧光基团修饰，所述荧光基团包括fam、vic、hex、rox、cy3、cy5、pet、tamra或ned。
15.优选地，所述gapdh基因的pcr产物的长度为100~120 bp（包括但不限于101 bp、102 bp、103 bp、104 bp、105 bp、110 bp、112 bp、113 bp、115 bp、116 bp、117 bp、118 bp或119 bp），所述tbxas1基因的pcr产物的长度为180~200 bp（包括但不限于181 bp、182 bp、183 bp、184 bp、185 bp、190 bp、192 bp、193 bp、195 bp、196 bp、197 bp、198 bp或199 bp），所述af4基因的pcr产物的长度为280~300 bp（包括但不限于281 bp、282 bp、283 bp、284 bp、285 bp、290 bp、292 bp、293 bp、295 bp、296 bp、297 bp、298 bp或299 bp），所述plzf基因的pcr产物的长度为380~400 bp（包括但不限于381 bp、382 bp、383 bp、384 bp、385 bp、390 bp、392 bp、393 bp、395 bp、396 bp、397 bp、398 bp、399 bp或400bp）。
16.本发明中，针对gapdh基因、tbxas1基因、af4基因和plzf基因这4个基因分别设计不同长度的pcr产物，覆盖100～400 bp，在常规的q-pcr、数字pcr(ddpcr)、ngs建库等检测中的产物长度一般不超过400 bp，所以设计以上长度的片段能满足绝大多数的检测实验要求，覆盖比较全面。1）plzf基因的pcr产物的长度为380~400 bp，能够考察样本中400 bp以内核酸的完整性，若待测样本中plzf基因与相应内参的毛细管电泳峰高比不低于校准品中plzf基因的峰高比，表明该样本的核酸完整性非常好，评分10分，可安全用于后续q-pcr、ddpcr、ngs等检测；2）af4基因的pcr产物的长度为280~300 bp，能够考察样本中300 bp以内核酸的完整性，若待测样本中plzf基因与相应内参的毛细管电泳峰高比小于校准品的峰高比，而af4基因与相应内参的毛细管电泳峰高比大于等于校准品的峰高比，表明该样本的核酸完整性良好，评分8分，用于后续q-pcr、ddpcr、ngs等检测无风险或风险较小；3）tbxas1基
因的pcr产物的长度为180~200 bp，能够考察样本中200 bp以内核酸的完整性，若待测样本中plzf基因和af4基因与其相应内参的毛细管电泳峰高比小于校准品的峰高比，而tbxas1基因峰高比不低于校准品中tbxas1基因的峰高比，表明该样本的核酸存在一定程度的降解，评分6分，建议后续只用于不大于200bp片段的检测，如一定要进行大于200bp片段的检测，需要相应的提高上样量，以提高检测成功率；4）gapdh基因的pcr产物的长度为100~120 bp，能够考察样本中100 bp以内核酸的完整性，若待测样本中plzf基因、af4基因和tbxas1基因与其相应内参的毛细管电泳峰高比小于校准品的峰高比，而gapdh基因峰高比不低于校准品的峰高比，表明该样本的核酸存在比较严重的降解，评分4分，建议只用于不大于100bp片段的检测，如一定要进行大于100bp片段的检测，需要相应的提高上样量，以提高检测成功率；5）若待测样本中plzf基因、af4基因、tbxas1基因和gapdh基因与其相应内参的毛细管电泳峰高比均小于校准品的峰高比，表明该样本的核酸存在非常严重的降解，评分0分，核酸完整性评估为不合格，不建议用于后续q-pcr，ddpcr，ngs等分子生物学技术的检测。
17.本发明中，所述gapdh基因、tbxas1基因、af4基因和plzf基因的pcr产物长度，可根据实际需求选择和设计。
18.优选地，所述gapdh基因的pcr产物的长度为102 bp，所述tbxas1基因的pcr产物的长度为195 bp，所述af4基因的pcr产物的长度为297 bp，所述plzf基因的pcr产物的长度为400 bp。
19.本发明一具体实施例中，毛细管电泳结果会出现gapdh基因、tbxas1基因、af4基因和plzf基因产物的特征峰，分别对应102 bp、195 bp、297 bp和400bp pcr产物的特征峰，对比待测样本与内参相应基因峰高比和校准品与内参相应基因的峰高比，可进行核酸完整性评估。1）若待测样本4个长度的pcr产物对应的毛细管电泳峰高比均大于等于校准品的标准峰高比，表明该样本核酸完整性非常好，评分10分，可安全用于后续pcr，ngs等技术的检测；2）若4个长度的片段，待测样本只有102 bp、195 bp和297 bp长度的pcr产物的峰高大于等于校准品的峰高比，表明该样本核酸完整性良好，评分8分，用于后续pcr，ngs等检测无风险或风险较小；3）若4个长度的片段，待测样本只有102bp、195 bp长度的pcr产物与内参的毛细管电泳峰高大于等于校准品的峰高比，表明该样本核酸存在一定程度的降解，评分6分，建议只用于不大于200bp片段的检测，如一定要进行大于200bp片段的检测，需要相应的提高上样量，以提高检测成功率；4）若4个长度的片段，待测样本只有102bp长度的pcr产物与内参的毛细管电泳峰高大于等于校准品的峰高比，表明该样本核酸存在较严重的降解，评分4分，建议只用于不大于100bp片段的检测，如一定要进行大于100bp片段的检测，需要相应的提高上样量，以提高检测成功率；5）若4个片段长度的pcr产物对应的毛细管电泳峰高比都小于校准品产生的标准峰高比，表明该样本核酸存在非常严重的降解，评分0分，核酸完整性评估为不合格，不建议用于后续pcr，ngs等分子技术的检测。
20.优选地，所述内参中gapdh基因片段的核酸序列包括seq id no.1所示的序列。
21.优选地，所述内参中tbxas1基因片段的核酸序列包括seq id no.2所示的序列。
22.优选地，所述内参中af4基因片段的核酸序列包括seq id no.3所示的序列。
23.优选地，所述内参中plzf基因片段的核酸序列包括seq id no.4所示的序列。
24.seq id no.1：
cttttgcgtcgccaggtgaagattcgggcggagagaaacccgggaggctagggacggcctgaaggcggcaggggcgggcgcaggccggatgtgttcgcgccgct。
25.seq id no.2：aatggtcctggatgcccgacttattctgcaagtcccatgggcgtgcaagactttgacatcgtcagagacgttttctcctctactgggtgcaagccgaacccttcccggcaacaccagcccagccctatggccaggcctttgactgtggatgagattgtgggccaggccttcatcttcctcatcgctggctatgaaatcatcacca。
26.seq id no.3：cagtagccacgctagtccattccttcagaaggaaatttttttttttaacaatgacttttggtaaagggttttgtggatgattttttttcttttgagttttgggagaaatatttgtttagtaacttctaatggccatctgtaaaccataagtaatgaaggactccactgtgccccactttctgccaatgaacagtggcttgataataccaagtattgttgtaatttataaaattgaaggcaacccccgctcctgccgcccccaatctccccattgcctagagcgctgcacattgaccccagctctgactt。
27.seq id no.4：tcctcttccaccgcaatagtcaacactttatactttggacttcctctcgccaaagaccttccagcagattctggagtatgcatatacagccacgctgcaagccaaggcggaggacctggatgacctgctgtatgcggccgagatcctggagatcgagtacctggaggaacagtgcctgaagatgctggagaccatccaggcctcagacgacaatgacacggaggccaccatggccgatggcggggccgaggaagaagaggaccgcaaggctcggtacctcaagaacatcttcatctcgaagcattccagcgaggagagtgggtatgccagtgtggctggacagagcctccctgggcccatggtggaccagagcccttcagtctccacttcatttggtctttcagcc。
28.seq id no.5：cttttgcgtcgccaggtgaaga。
29.seq id no.6：agcggcgcgaacacatcc。
30.seq id no.7：aatggtcctggatgcccgac。
31.seq id no.8：tggtgatgatttcatagccagcgat。
32.seq id no.9：cagtagccacgctagtccattcc。
33.seq id no.10：aagtcagagctggggtcaatgtg。
34.seq id no.11：cttccaccgcaatagtcaacact。
35.seq id no.12：ggctgaaagaccaaatgaagtgg。
36.优选地，所述人标准基因组dna泛指完整度能够完全满足相应实验要求的dna样本，通常意义上，从正常人新鲜二倍体细胞或新鲜组织中提取的，溶解在te或类似缓冲溶液中，无蛋白、rna、多糖等污染，且经过严格的qubit或类似基于荧光染料精确定量的dna。
37.优选地，所述内参包括含有gapdh基因、tbxas1基因、af4基因和plzf基因片段的质粒，所述gapdh基因、tbxas1基因、af4基因和plzf基因片段在同一质粒中，或者，所述gapdh基因、tbxas1基因、af4基因和plzf基因片段分别在不同质粒中。
38.本发明中，将所述gapdh基因、tbxas1基因、af4基因和plzf基因的引物对相应的核酸片段插入质粒中，以质粒模板的形式作为内参，便于储存，插入方式可根据需求进行选择，可以将四个基因插入同一质粒，也可以分别将四个基因单独插入质粒。
39.优选地，所述pcr酶包括taq核酸聚合酶。
40.本发明中，市售常规pcr扩增的聚合酶和缓冲液均适用。
41.第二方面，本发明提供一种第一方面所述的核酸完整性评估试剂盒在检测核酸完
整性中的应用。
42.第三方面，本发明提供一种核酸完整性评估方法，所述核酸完整性评估方法包括：利用第一方面所述的核酸完整性评估试剂盒，分别以待测样本和所述校准品为模板，进行pcr，将pcr产物进行毛细管电泳，比较待测样本和所述校准品中4种管家基因的峰高比，判断待测样品核酸完整性。
43.分别对待测样本和校准品的4种管家基因进行pcr扩增，同时内参也在同一体系中进行pcr扩增，然后对所有pcr产物进行毛细管电泳，来评估核酸完整性。毛细管电泳结果可分别得到待测样本管中待测样本各基因的峰高和内参相应基因的峰高，以及校准品管中校准品各基因的峰高和内参相应基因的峰高，从而可计算出待测样本和校准品中各基因与其内参相应基因的峰高比，即待测样本各基因峰高/相应基因内参峰高，校准品各基因峰高/相应基因内参峰高。将待测样本中各基因的峰高比与校准品中对应基因的峰高比进行比较，即可判断样本核酸完整性。
44.本发明中，所述pcr的反应体系中，校准品人标准基因组dna的浓度根据具体实验对待测样本中核酸的浓度要求进行添加，因此，将待测样本与校准品比较，即可判断待测样本核酸的完整性是否符合要求。
45.本发明中，石蜡包埋组织核酸样本、血液核酸样本、新鲜组织核酸样本、冰冻组织核酸样本和法医鉴定取得的室外的降解严重的样本等可能存在降解的样本均可用本发明方法进行核酸完整性评估。
46.优选地，所述待测样本包括石蜡包埋组织核酸样本。
47.优选地，所述pcr包括多重荧光pcr。
48.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）本发明的试剂盒一管反应可对多个基因多种核酸模板长度同时检测，覆盖长度全面，反应个数少，检测周期短，可更简单快速的检测待测样本中dna的降解程度和完整性；（2）本发明的试剂盒中设置了不同长度基因片段对应的内参质粒作为内对照，同时进行扩增，经过与内参的比较，可以减少实验操作和毛细管电泳过程带来的误差，以及由样本或体系中抑制剂影响造成的差异；（3）本发明检测灵敏度较高：可检测低至0.2 ng的基因组dna，且峰高完全达到有效峰的标准；准确性良好：经过本发明评估完的核酸样本再进行其它目标体系的检测，结果符合预期。
附图说明
49.图1为本发明实施例2中0.2ng核酸完整性检测结果图；图2为本发明中校准品完整性检测结果图；图3为本发明实施例2中ffpe1样本完整性检测结果图；图4为本发明实施例2中ffpe2样本完整性检测结果图；图5为本发明实施例3中校准品msi体系结果图；图6为本发明实施例3中ffpe3样本完整性检测结果图；图7为本发明实施例3中ffpe3样本msi体系结果图；
图8为本发明实施例3中ffpe4样本完整性检测结果图；图9为本发明实施例3中ffpe4样本msi体系结果图；图10为本发明对比例1中校准品完整性检测结果图；图11为本发明对比例1中校准品完整性检测结果图。
具体实施方式
50.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
51.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
52.实施例1核酸完整性评估试剂盒的设计与建立本发明提供一种核酸完整性评估试剂盒，所述核酸完整性评估试剂盒中含有引物混合液、pcr酶、pcr缓冲液、内参、校准品和纯化水。
53.1.引物的设计所述引物混合液包括gapdh引物对seq id no.5（5’端fam修饰）和seq id no.6，tbxas1引物对seq id no.7（5’端fam修饰）和seq id no.8，af4引物对seq id no.9（5’端fam修饰）和seq id no.10，plzf引物对seq id no.11（5’端fam修饰）和seq id no.12。
54.2.内参的制备所述内参为分别含有如seq id no.1~seq id no.4所示的gapdh基因、tbxas1基因、af4基因和plzf基因核酸片段的4种质粒，制备方法如下：1）根据已知序列设计pcr引物，对目标片段进行pcr扩增；2）扩增产物进行纯化；3）通过同源重组，酶切连接等方法将目标基因插入载体中，转化大肠杆菌感受态细胞，涂板培养，挑取单克隆；4）对单克隆进行测序验证，选择插入目标片段的克隆进行摇菌；5）质粒核酸抽提，定量，-20℃储存备用。
55.3.校准品的制备所述校准品为人标准基因组dna，来源于人类细胞系（k562细胞系，购自国家细胞资源库），将细胞定量到106/管进行抽提，采用天根的血液/组织/细胞dna抽提试剂盒进行抽提，抽提完的dna进行nanodrop测定纯度，qubit测定浓度，然后将细胞系dna定量至10ng/μl作为试剂盒中的校准品。
56.4.试剂盒其它组份所述pcr酶为takara ex taq
®ꢀ
hot start version，所述pcr缓冲液为10
×
ex taq buffer (mg
2+ plus) (20 mm)。
57.实施例2试剂盒性能检测分析本实施例对实施例1中核酸完整性评估试剂盒的性能参数进行分析。
58.1.灵敏度分析
利用所述试剂盒对不同量的核酸（0.1 ng、0.2ng、0.3 ng、0.5 ng和1 ng）进行pcr及毛细管电泳，pcr反应体系如表1所示，反应条件如表2所示，毛细管电泳上机体系如表3所示，上机仪器为abi3500dx，上机程序如表4所示。
59.表1表2表3表4当核酸总量≥0.2ng时即可得到有效峰高，如图1所示，即最低可检测0.2 ng核酸，表明本发明试剂盒灵敏度较高。
60.2.准确性分析
使用所述试剂盒对两例已知不同降解程度的石蜡包埋组织核酸样本（ffpe1和ffpe2）进行检测，其中ffpe1样本降解较严重，ffpe2样本完整性良好。pcr反应体系如表5所示，反应条件如表2所示，毛细管电泳按上述灵敏度分析中描述进行，结果如图2-图4所示。
61.表5由图2和图3可知，ffpe1样本在102 bp峰高比大于校准品中峰高比，在195 bp，297bp和400bp峰高比小于校准品峰高比，评分4分，表明该例样本可进行小于102 bp产物的pcr扩增，大于102 bp扩增有风险；由图2和图4可知，ffpe2样本在102 bp、195 bp、297 bp和400 bp峰高比大于校准品峰高比，评分10分，表明核酸完整性良好，检测结果与样本已知降解情况一致，表明本发明试剂盒准确性良好。
62.实施例3 本发明试剂盒应用于人肿瘤样本微卫星不稳定性(msi)检测前的样本评估本实施例利用实施例1所述试剂盒对3例核酸进行检测，其中1例为校准品，2例为ffpe样本（ffpe3和ffpe4）。
63.采用迈杰转化医学研究（苏州）有限公司的石蜡组织dna提取试剂盒（货号n032a01）进行核酸提取，然后使用本发明试剂盒按实施例2描述的方法对核酸进行检测评估，核酸完整性评估体系检测结果如图2，图6，图8所示，图2为校准品结果，由图6可知ffpe3样本在102 bp峰高比大于校准品中峰高比，在195 bp峰高比略小于校准品中峰高比，在297bp和400bp峰高比小于校准品峰高比，评分4分，建议后续只用于不大于100bp片段的检测，如一定要进行大于100bp片段的检测，需要相应的提高上样量，以提高检测成功率；由图8可知ffpe4样本在102 bp峰高比大于校准品中峰高比，在195 bp、297bp和400bp峰高比小于校准品峰高比，评分4分，表明该样本的核酸存在比较严重的降解，建议只用于不大于100bp片段的检测，如一定要进行大于100bp片段的检测，需要相应的提高上样量，以提高检测成功率；然后将上述提取的核酸样本进行msi检测，检测方法具体见专利号cn201810581074.7，结果如图5，图7，图9所示，图5为校准品msi检测结果，100 bp~300bp片段扩增良好，峰高没有降低趋势。由图7 ffpe3样本msi检测结果显示出100 bp以后，在200 bp附近片段峰高明显降低，300 bp附近条带未扩增出。由图9 ffpe4样本msi检测结果显示出100 bp附近条带能扩增出，大于100 bp条带几乎未扩增出。比较可知，根据核酸完整性评估试剂盒检测过的样本在进行msi检测时对片段降解程度的预测结果一致。
64.对比例1本对比例提供一种检测体系，与实施例1相比，区别仅在于不含有内参，其它与实施例1相同，并使用该检测体系对ffpe样本中核酸进行检测。结果显示不加内参的情况下，同一样本进行多次重复实验，同一位点峰高差异较大，没有可比性，毛细管电泳结果如图10和图11所示，这种差异可能来自于实验操作误差，或不同孔对应的毛细管运行误差等。
65.综上所述，本发明的核酸完整性评估试剂盒能够有效应用于检测核酸完整性，操作简单，检测灵敏度较高，可检测低至0.2 ng的基因组dna；引入了内参质粒同时扩增作为内对照，减少了实验操作和毛细管电泳过程带来的误差以及样品或体系中可能存在的抑制剂影响带来的误差，准确性良好，本试剂盒评估完的样本核酸再进行目标体系扩增，结果一致。
66.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。