一株根瘤菌gl-1803及其在制备不溶性
β-葡聚糖中的应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株根瘤菌gl-1803及其在制备不溶性β-葡聚糖中的应用。


背景技术：

2.β-1,3-葡聚糖是一类主链由β-1,3-糖苷键连接而成的多聚糖，是天然无害的高分子物质，通常因来源不同而含有不同比例和大小的β-1,2-糖苷键、β-1,4-糖苷键、β-1,6-糖苷键连接的支链。
3.β-1,3-葡聚糖具有能增强免疫活力、抗肿瘤、抗氧化、抗细菌、抗病毒、抗真菌、降低胆固醇、降血脂等生物活性，是一种良好的生物效应调节剂。同时，还具有保湿、抗炎、抗衰老、去皱、去头屑、退黄、加快修复、增加皮肤弹性等功效，广泛应用在医药、食品、化妆品、动物饲料添加剂等多个领域。
4.目前，β-1,3-葡聚糖主要来源于酵母、食用真菌和植物（如香菇、燕麦、青稞），受限于技术的复杂和成本的高昂，β-1,3-葡聚糖主要为低纯度的粗产物，生产过程产生的副产物也较多，产量受原材料成本制约。利用微生物发酵生产β-1,3-葡聚糖，具有不受季节限制、原料来源稳定易得、过程无副产物产生、批次间质量稳定的优点。
5.因此，开展高效生产β-1,3-葡聚糖菌株的筛选研究工作极为必要。中国专利申请cn106434495a公开了一种菩萨根瘤菌，保藏编号为cgmcc no.12954，该菌株发酵生产水溶性β-1,3-葡聚糖；中国专利申请cn112358985a公开了一株普沙根瘤菌，保藏编号为cgmcc no.19764，同样该菌株发酵生产水溶性β-1,3-葡聚糖。


技术实现要素：

6.根据以上所述问题，本发明主要目的是提供一株新的、能够高产β-1,3-葡聚糖的菌株。
7.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供一株根瘤菌gl-1803，所述根瘤菌(rhizobium sp.)gl-1803已于2021年09月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no.23416，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
8.本发明从济南黄河湿地公园潮湿土壤、草丛，邻近树木根部腐殖土的地表以下10cm处采集土壤样品中筛选得到高产β-1,3-葡聚糖的菌株gl-1830，所述菌株gl-1803可以将蔗糖转化为不溶于水的β-1,3-葡聚糖，转化率高达70%以上。对该菌株进行鉴定：形态学鉴定：gl-菌株菌落呈圆形，杆状菌白色，边缘整齐，湿润粘稠，富有弹性。
9.生理生化鉴定：革兰氏阴性菌。
10.16srdna的扩增与测序：菌株gl-1830 16srdna序列如seq id no.1所示。测序得到的16srdna序列在genbank中进行blast比对，与genbank中已发表的根瘤菌相关片段序列100％同源性。综合生理生化鉴定结果和16s rrna序列分析鉴定结果，鉴定本发明的菌株
gl-1803为根瘤菌(rhizobium sp.)。
11.本发明还提供根瘤菌gl-1803发酵培养基，所述发酵培养基包括以下组分：以质量百分比计，蔗糖5.0%，(nh4)2hpo
4 0.1%～1.0%，kh2po
4 0.15%～0.25%，mgso4•
7h2o 0.1%，caco
3 0.15%～0.3%，玉米浆粉0.1%～0.5%，余量为水，ph调节至7.0。
12.本发明还提供根瘤菌gl-1803在制备不溶性β-葡聚糖中的应用。本发明所述根瘤菌gl-1803不仅能够高产β-1,3-葡聚糖，而且所得β-1,3-葡聚糖为不溶性β-1,3-葡聚糖。
13.与现有技术相比，本发明具有以下优势：本发明筛选得到一株新的根瘤菌gl-1803，该菌株能够将蔗糖转化为β-1,3-葡聚糖，转化率高达70%以上。该菌株发酵所得β-1,3-葡聚糖不溶于水，为不溶性β-1,3-葡聚糖。本发明进一步丰富了通过微生物发酵生产所得β-1,3-葡聚糖的种类。
具体实施方式
14.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
15.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”、“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作以及它们的组合。
16.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
17.实施例1根瘤菌gl-1803的筛选及鉴定：（一）菌株gl-1803的筛选步骤：步骤一、富集：从济南黄河湿地公园潮湿土壤、草丛，邻近树木根部腐殖土的地表以下10cm处采集土壤样品各20g左右，将采集的土壤样品放入烘箱中烘干，将烘干土壤过100目筛，以无菌方式准确称取1g过100目筛的土壤于9ml无菌水中，静置30min后在室温条件下摇床振荡30min，得到稀释度为10-1
的土壤悬液；从上述土壤悬液中吸出1ml，加入9ml无菌水中，充分混匀，制得稀释度为10-2
的土壤悬液；从稀释度为10-2
土壤悬液中吸出1ml，加入9ml无菌水中，充分混匀，制得稀释度为10-3
的土壤悬液；步骤二、初筛和纯化：取步骤一中稀释度为10-3
的土壤悬液0.1ml采用涂布平板法涂布于苯胺蓝筛选培养基中，置于28℃恒温培养箱内倒置培养5天～7天，将菌落周围出现蓝色圈的菌株视为有β-1,3-葡聚糖生产能力的菌株，挑取周围有蓝色圈的菌株在苯胺蓝筛选培养基进行多次划线分离纯化，以纯化得到形态一致的纯化菌株（共10株），将纯化菌株转接到营养琼脂培养基上，于4℃冰箱中保存待用；并将保存的菌株分别标记为gl1801-gl1810；所述苯胺蓝培养基的组成为：蔗糖20g，酵母膏3g，蛋白胨5g，氯化钠2g，苯胺蓝1g，琼脂粉20g，加入蒸馏水至1000ml，培养基ph为7.0；所述营养琼脂培养基的组成为：蔗糖20g，酵母膏3g，蛋白胨5g，氯化钠2g，琼脂粉20g，加入蒸馏水至1000ml，培养基ph为7.0。
18.步骤三、复筛：将步骤二中保存的菌株活化得到菌悬液，将菌悬液滴加到苯胺蓝筛
选培养基上，30℃培养3天，以1μl无菌水为对照，测量菌株产生的蓝色圈直径d和菌落直径d，并根据d/d值的大小初步确定菌株的产β-1,3-葡聚糖能力，结果见表1。
19.表1 显色圈法测定10株菌株的产β-1,3-葡聚糖能力 蓝色圈直径d/mm菌落直径d/mm比值d/dgl-1801菌株26241.08gl-1802菌株26251.04gl-1803菌株28241.17gl-1804菌株25241.04gl-1805菌株26251.04gl-1806菌株27261.04gl-1807菌株27241.13gl-1808菌株27251.08gl-1809菌株27241.13gl-1810菌株26241.08无菌水000由表1可知，筛选得到的具有产β-1,3-葡聚糖能力的10株菌株中gl-1803菌株的蓝色圈最大，d/d值达到1.17，故gl-1830菌株产β-1,3-葡聚糖能力最强。
20.（二）菌株gl-1803的鉴定（1）形态学鉴定：将筛选出来的gl-1803菌株在培养基上活化，观察细菌菌落生长特征；用接种环挑取单菌落进行革兰氏染色，镜检，记录结果。
21.结果：gl-菌株菌落呈圆形，杆状菌白色，边缘整齐，湿润粘稠，富有弹性。
22.（2）生理生化鉴定：革兰氏阴性菌。
23.（3）16srdna的扩增与测序：该菌种的鉴定由中国科学院微生物研究所完成。
24.菌种的鉴定过程包括菌株dna的提取，pcr扩增，凝胶电泳，纯化回收，连接，感受态细胞的制备，连接产物转化，质粒提取与测序，经纯化后16s rrna序列在核糖体数据库上比对；其中pcr扩增的引物序列为：上游引物：5
’‑
agtttgatcmtggctcag-3’下游引物：5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’pcr扩增的反应体系中，各物质的加入量如下：模板0.5μl，其中基因组dna浓度为20ng/nl～50ng/nl；10x buffer 2.5μl，浓度为2.5mm的dntp 1μl，酶0.2μl，10μm的f各1μl，10μm的r1μl，加入双蒸水定容至25μl；扩增程序：94℃预变性4min，94℃变性45s；55℃退火45s；72℃延伸1min；30个循环后在72℃延伸10min，在4℃下终止反应。
25.gl-1803菌株16srdna序列分析及比对：pcr扩增的产物的片段大小1403pb，菌株gl-1830 16srdna序列如seq id no.1所示。将测序得到的16srdna序列在genbank中进行blast比对，与genbank中已发表的根瘤菌相关片段序列100％同源性。综合生理生化鉴定结果和16s rrna序列分析鉴定结果，鉴定本发明的菌株gl-1803为根瘤菌（rhizobium sp.）。
26.实施例2在500ml三角瓶中加入100ml发酵培养基，经高温高压灭菌，然后将gl-1803菌株按
照5％的比例接种到发酵培养基中，在30℃、220r/min的条件下摇床培养5天后置于离心机中离心，其中离心机转速8000r/min，离心时间20分钟，取离心后的沉淀加纯化水100ml，混匀，混匀后的悬浮液置于离心机中离心，其中离心机转速8000r/min，离心时间20分钟，取离心后的沉淀放入烘箱烘干，其中烘箱温度为45℃，烘干后研磨成粉末。取0.1000g粉末放入100ml容量瓶，加入约90ml 0.1mol/l 氢氧化钠溶液，摇匀溶解后，加入0.1mol/l氢氧化钠溶液定容至100ml，取5.0ml溶液放入100ml容量瓶中，加入纯化水定容至100ml，取1.0ml稀释液放入比色管中，加入1.0ml 5%苯酚溶液，再加入5.0ml浓硫酸，混匀后冷却至常温，以0.1ml纯化水为空白，以干燥葡萄糖粉末为对照，于490nm处测定吸光度并确定葡萄糖总量。
27.所述发酵培养基的组成为，以质量百分比计：蔗糖5%，(nh4)2hpo
4 0.2%，kh2po
4 0.2%，mgso4•
7h2o 0.1%，caco
3 0.2%，玉米浆粉0.2%，余量为蒸馏水，培养基ph为7.0。
28.gl-1803菌株将蔗糖转化为不溶于水的β-1,3-葡聚糖，转化率为72.08%。
29.实施例3与实施例2相比，区别在于所述发酵培养基的组成为：以质量百分比计：蔗糖5%，(nh4)2hpo
4 0.22%，kh2po
4 0.2%，mgso4•
7h2o 0.1%，caco
3 0.2%，玉米浆粉0.2%，余量为蒸馏水，培养基ph为7.0。其它步骤均与实施例2相同。
30.gl-1803菌株将蔗糖转化为不溶于水的β-1,3-葡聚糖，转化率为71.93%。
31.实施例4与实施例2相比，区别在于所述发酵培养基的组成为：以质量百分比计，以质量百分比计：蔗糖5%，(nh4)2hpo
4 0.2%，kh2po
4 0.22%，mgso4•
7h2o 0.1%，caco
3 0.2%，玉米浆粉0.2%，余量为蒸馏水，培养基ph为7.0。其它步骤均与实施例2相同。
32.gl-1803菌株将蔗糖转化为不溶于水的β-1,3-葡聚糖，转化率为72.09%。
33.实施例2-实施例4所述gl-1803菌株产β-1,3-葡聚糖的测定结果，具体如下表2所示。
34.表2 gl-1803菌株产β-1,3-葡聚糖的测定结果 蔗糖含量，g/l葡聚糖粗品产量，g/l490nm吸光值葡聚糖含量，%转化率，%对照
ꢀꢀ
0.509100 实施例25044.90.45480.2772.08实施例35045.10.45179.7471.93实施例45045.40.44979.3972.09
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。