本发明涉及肽或蛋白质或拟肽的化学反应，并且更具体而言，涉及由双官能分子、特别是由α、β或γ-氨基酸和/或α、β或γ-羟基酸和/或α、β或γ-巯基酸来化学合成肽或蛋白质或拟肽。
更具体而言，本发明涉及用于在溶液中制造肽或蛋白质或拟肽的方法。该方法不在α、β或γ-氨基酸的胺官能团上使用诸如叔丁氧羰基(Boc)或芴甲氧羰基(Fmoc)之类的常规保护基。同样地，不需要在α、β或γ-羟基酸的羟基官能上、或在α、β或γ-巯基酸的硫醇基官能团上使用保护基。
该方法基于使用活化的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸，并且使用锚定分子家族，即聚烯烃(polyolefins)或聚烯烃低聚物或聚烯烃类(polyalkenes)的衍生物，其中活化的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸分别为如下形式：2,2-双(三氟甲基)-1,3-噁唑烷-5-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-噁嗪-6-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧代氮杂烷-7-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧戊环-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二噁烷-4-酮,或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧杂环庚烷-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环戊烷-5-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环己烷-6-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环庚烷-7-酮或其衍生物。锚定分子与具有至少两个亲电官能团和/或亲核官能团的分子结合，特别是与第一α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸结合，然后其将成为连续延伸/迭代步骤的目标物以产生肽或蛋白质或拟肽。
该方法能够以更有效(也就是说步骤数量减少)、更快的方式获得肽或蛋白质或拟肽，这与在固体支撑物上或在溶液中的现有方法相比更纯或更容易纯化。该方法易于自动化。
背景技术
过去十年以来，治疗性肽或蛋白质或拟肽的开发显著增长，使得市场上有了大量批准的新分子(参见出版物J.Med.Chem.,2018,22,1382-1414,Bioorg.Med.Chem.,2018,26,2700-2707)；因此，基于肽或蛋白质或拟肽的治疗已经成为制药工业中最有活力的部分之一。癌症、新陈代谢疾病和中枢神经系统疾病是加速对新的肽或蛋白质或治疗性拟肽的需求的主要治疗领域。
然而，许多障碍阻碍了肽或蛋白质或拟肽在治疗中的广泛应用。可以列举的是(例如)肽或蛋白质或拟肽的较短的新陈代谢半衰期以它们的亲水性。另一关键因素、并且到目前为止最重要的是，肽或蛋白质或拟肽的制造模式阻碍了其治疗应用的发展。
一个世纪以前，E.Fisher和E.Fourneau进行了第一次液相肽合成(Ber.Dtsch.Chem.Ges.1901,34,2868-2879)。自那时起，许多化学家进行了改进；这些改进有：Bodansky和du Vigneaud(J.Am.Chem.Soc.,1959,51,5688-5691)、Beyerman等人(Rec.Trav.Chim.,Netherlands 1973,92,481-492)、R.K.Sharma和R.Jain(Synlett 2007,603-606)、Nodal等人(Nature Chemistry 2017,9,571-577)、Liu等人(Org.Lett.,2018,20,612-615)，以及Muramatsu等人(ACS Catal.,2018,8,2181-2187)。
最常用的肽或蛋白质或拟肽合成途径涉及氨基酸的胺官能团(Nα)的暂时保护。如今，所用的主要保护基为叔丁氧羰基(这种方法通常称为“Boc”策略)和芴甲氧羰基(这种方法通常称为“Fmoc”策略)。这两种肽合成途径是本领域技术人员已知的(参见D.Voet和J.G.Voet的“Biochemistry”手册的第7-5节，第2版，Brussels 2005)。实际上，所提供的氨基酸处于胺官能团(Nα)由Fmoc或Boc基团保护的状态，并且氨基酸直接参与活化/偶联反应。
氨基酸可用于液相或固体支撑物；在用于固体支撑物的情况下，胺官能团受到保护的氨基酸(Nα)与不溶于有机溶剂的树脂连接，这是Merrifield合成(J.Am.Chem.Soc.,1963,85,2149-2154)。这是一种良好控制的方法，然而其具有一些缺点，例如：过量使用的试剂的成本以及合成的肽的同质性不够高。认为该体系不纯(degenerate)，这造成了通过制备型高效液相色谱进行纯化的额外成本。
在液相肽合成(LPPS)过程中，全部反应都在均相溶液中进行。Bodansky和du Vigneaud(J.Am.Chem.Soc.,1959,51,5688-5691)描述了这种方法。起始氨基酸的羧酸官能团(C端)以甲酯的形式受到保护，并且随后的氨基酸在其胺官能团(Nα)受苄氧羰基(缩写为Cbz)保护随后其羧酸官能团(C端)被硝基苯基酯活化之后进行连续缩合。通过沉淀或用水洗涤(萃取)来纯化全部合成中间体。这种肽合成方法冗长且繁琐，并且生成肽的收率低。例如，可以列举的是如Schwyzer和Sieber(Helv.Chim.Acta 1966,49,134-158)所述，ACTH合成的总收率为约7％。
Beyerman等人(Rec.Trav.Chim.Netherlands 1973,92,481-492)报道了对该方法的改进。其包括以苄基酯的形式保护氨基酸或肽的羧酸官能团(C端)，并在过量的Nα-保护氨基酸酐的存在下进行偶联(或缩合)反应，以提高收率。最终，尽管偶联反应的收率得到提高，但当所得肽达到约五个氨基酸时，有机相中的肽的溶解度降低。
已经开发了使氨基酸溶解以促进肽合成的其他策略。可以列举的是，Narita的工作(Bull.Chem.Soc.Jap.,1978,51,1477-1480)、Bayer和Mutter在聚二乙醇作为溶解助剂方面的工作(Nature 1972,237,512-513)，以及溶解锚定分子方面的专利EP 0 017 536(Sanofi)以及EP 2 612 845 A1和US 2014/0296483(Ajinomoto Co.,Inc.)。
还已知使用双官能团的肽合成策略，双官能团即为能够同时活化羧酸官能团(C端)并保护氨基酸的胺官能团(Nα)的基团，从而形成高度反应性的中间体环状结构。其示例有N-羧基酸酐(缩写为NCA)的情况(参见Ber.Dtsch.Chem.Ges.,1906,39,857-861；Ber.Dtsch.Chem.Ges.,1907,40,3235-3249；Ber.Dtsch.Chem.Ges.,1908,41,1721-172；J.Am.Chem.Soc.,1957,79,2153-2159；J.Am.Chem.Soc.,1947,69,1551-1552)。由氨基酸和二氯二甲基硅烷衍生物合成反应性中间体(参见S.H.van Leeuwen等人,Tetrahedron Letters 2002,43,9203-9207以及WO 00/37484A1)。发明了用于合成肽的由三氟化硼醚化物活化的氨基酸衍生物(参见S.H.van Leeuwen等人,Tetrahedron Letters 2005,46,653-3656)。也已经描述了在六氟丙酮的存在下活化氨基酸(参见Chem.Ztg.,1990,114,249-251以及J.Spengler等人,Chem.Rev.,2006,106,4728-4746)。
用于在溶液中或在固体支撑物上合成肽或蛋白质或拟肽的全部这些方法具有至少一个或多个以下缺点：保护基的使用、过量试剂的使用、存在外消旋作用的可能性、合成期间肽在有机溶剂中的低溶解度、肽尺寸的限制、纯化昂贵且具有污染性、复杂的实验方案或存在聚合的可能性。通常，对肽合成领域中可获得的大量文献的研究表明，难以以低成本、低生态足迹和高收率制造高纯度的肽或蛋白质或拟肽。
本申请要解决的问题是设计一种用于合成肽或蛋白质或拟肽的新方法，其能够消除现有技术中留下的与它们的获得或制造相关的障碍。
技术实现要素：
根据本发明，通过在液相中合成肽或蛋白质或拟肽的方法解决了上述问题，该方法包括下面详述的两个基本特征的组合。
本发明的第一个目的是通过连续延伸Qa-E-Qb型分子的第二末端从而合成肽或蛋白质或拟肽的方法，其中Qa和Qb可以相同或不同，并代表亲电官能团和/或亲核官能团，并且E表示间隔基。所述第二末端可以特别是α、β、γ或δ-氨基酸、或者α、β、γ或δ-羟基酸、或者α、β、γ或δ-巯基酸或肽或蛋白质或拟肽的伯胺或仲胺、羟基或硫醇基，其特征在于，所述单元选自由以下组成的组：(天然或非天然或合成的)α、β、γ或δ-氨基酸、或者α、β、γ或δ-羟基酸、或者α、β、γ或δ-巯基酸。此外，所述Qa-E-Qb型分子(例如，所述α、β、γ或δ-氨基酸、或者α、β、γ或δ-羟基酸、或者α、β、γ或δ-巯基酸)或者所述肽或蛋白质或拟肽的第一末端与可溶于有机溶剂的锚定分子连接，该有机溶剂例如为卤代溶剂(二氯甲烷、氯仿)、乙酸乙酯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、异辛烷、环己烷、己烷、甲基环己烷、甲基叔丁基醚、或者诸如苯或甲苯之类的芳族溶剂或任何其它合适的溶剂。
第一基本特征是使用特异性锚定分子家族。根据本发明，锚定分子是聚烯烃或聚烯烃低聚物或聚烯烃类。根据本发明的方法提供了获得高纯度(天然或非天然或合成)肽或蛋白质或拟肽的途径。由于不使用保护基(在主链的胺、羟基或硫醇基官能团上不使用保护基)和偶联剂，该方法节省了步骤和原子，由此节省了财政成本。最后，该方法对环境更加尊重。
第二基本特征是使用双官能Qa-E-Qb型分子，其中Qa和Qb可以相同或不同，并且选自亲电基团和/或亲核基团，并且E表示间隔基。有利地，Qa和Qb选自由以下化学官能团组成的组，例如：醇、醛、伯胺、仲胺、叠氮化物、乙炔类、卤素、硫醇、乙烯基，并且/或者间隔基E选自由以下结构单元组成的组，例如：芳族化合物、杂芳族化合物、饱和烷基链(具有支链或不具有支链)、不饱和烷基链(具有支链或不具有支链)、二醇(并且优选聚乙二醇)。
在使用Qa-E-Qb型分子、α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸作为双官能分子的有利情况下，这些化合物以其活化形式使用，即2,2-双(三氟甲基)-1,3-噁唑烷-5-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-噁嗪-6-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧代氮杂烷-7-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧戊环-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二噁烷-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧杂环庚烷-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环戊烷-5-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环己烷-6-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环庚烷-7-酮或其衍生物。
图示1示出了这些活化形式的结构。这些活化形式由相应的α、β或γ-氨基酸(该表述在本文中是指α-氨基酸、β-氨基酸或γ-氨基酸)、或者α、β或γ-羟基酸(该表述在本文中是指α-羟基酸、β-羟基酸或γ-羟基酸)或者α、β或γ-巯基酸(该表述在本文中是指α-巯基酸、β-巯基酸或γ-巯基酸)制备。
[化学式1]
X＝NH、N-烷基、N-芳基、O、S
R1、R2、R3、R4、R5、R6＝烷基或芳基图示n°1：活化形式的结构
迄今为止，从未证实能够使用2,2-双(三氟甲基)-1,3-噁唑烷-5-酮形式的活化氨基酸衍生物在溶液中容易地制备出由超过四种不同或相同的氨基酸组成的肽的可能性。
本发明的确切目的是提出在锚定分子的存在下，使用2,2-双(三氟甲基)-1,3-噁唑烷-5-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-噁嗪-6-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧代氮杂烷-7-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧戊环-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二噁烷-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧杂环庚烷-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环戊烷-5-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环己烷-6-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环庚烷-7-酮或其衍生物形式的活化的酸，从而在液(或溶液)相中制造高纯度的肽或蛋白质或拟肽。
通过连续延伸肽或蛋白质或拟肽链的第二末端(伯胺或仲胺、羟基或硫醇基)从而进行根据本发明的用于合成肽或蛋白质或拟肽的方法，其中肽或蛋白质或拟肽链的第一末端与可溶于有机溶剂的锚定分子连接。所述锚定分子包括具有至少10个单体单元、优选15个至350个之间的单体单元的聚烯烃链或聚烯烃或聚烯烃类低聚物。
在一个有利的实施方案中，所述聚烯烃链为聚异丁烯(PIB)链。特别地，所述锚定分子可为聚烯烃。聚烯烃链的至少一个末端可官能化。或者，聚烯烃链或聚烯烃或聚烯烃类低聚物所含的不饱和碳-碳键的数量可以不超过5％，并且优选不超过3％，并且/或者锚定分子的重均分子量可在600至20000之间，并且优选在700至15000之间。
在一个具体实施方案中，所述锚定分子包括由选自由以下组成的组中的至少一个基团封端的聚烯烃链(或者所述锚定分子是聚烯烃链)：
ο官能团-Xa，其中Xa选自由以下组成的组：-OH、-NH2、-NHRa(Ra＝烷基或芳基)、-SH；
ο官能团-Y-C6H4Xb，其中
■Y为O、S、CH2或不存在，
■Xb选自由以下组成的组：-OH、-NH2、-NHRa、-SH、-CXaRaRb、-C6H3Rc(CRaXa)，
其中Rb选自由以下组成的组：-H、-芳基、-杂芳基、-烷基，并且
Rc选自由以下组成的组：-H、-烷基、-O-烷基、-芳基、-O-芳基、-杂芳基、-O-杂芳基；
ο官能团-CRd＝CH-CHXa或官能团-CRdH-CH＝CH-CHXa，其中Xa具有上述定义，并且Rd为甲基或乙基。
特别地，Xa可为伯或仲胺官能团、醇、硫醇或酚。
在一个有利的实施方案中，除了末端官能团(例如如上定义的-Xa、-Z-C6H4Xb或-CRd＝CH-CHXa)之外，锚定分子的重均分子量在600和20000之间，优选在700和15000之间。重均分子量大于约20000时，这些分子可能具有过高的粘度，这将带来限制它们在用于偶联/延伸或迭代步骤的有机溶剂中的溶解度的风险。
本发明上下文中使用的作为均相催化的配体的一些PIB衍生物是市售的。例如，可以使用2-甲基-3-[聚异丁基(12)]丙醇(重均分子量757，包括末端官能团)或4-[聚异丁基(18)]苯酚(重均分子量1104，包括末端官能团)，其分别由Strem Chemicals公司以编号06-1037和06-1048销售。这两种分子为链分别被基团-CH2-C(CH3)(H)-CH2-OH(即异丙醇)和基团-CH2-C(CH3)2-C6H4-OH(即苯酚)封端的聚异丁烯衍生物。
根据本发明的一个特征，通过使用如上所述的可溶于有机溶剂的锚定分子(并且更特别地是使用聚烯烃)，还能够作为液体载体或α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸或具有至少两个官能团的任何其他分子的羧酸官能团(C端)或任何其他化学官能团(侧链)的保护基。其还使得锚定的肽或蛋白质或拟肽在有机溶液(卤代溶剂和/或非卤代溶剂)中溶解并进行肽或蛋白质或拟肽的合成。
根据本发明的其他特征，通过使用如上所述的可溶于有机溶剂(并且更特别地是使用聚烯烃)并且不溶于一些极性溶剂(例如水和/或乙醇和/或乙腈)的锚定分子，有助于通过简单萃取(洗涤)或在二氧化硅上的简单过滤从而将锚定的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸或肽或蛋白质或拟肽纯化。因此，通过简单萃取或简单过滤，能够获得具有高化学纯度的锚定的肽或蛋白质或拟肽。
根据本发明的另一特征，使用了市售锚定分子，或者可以直接由市售前体简单合成得到的锚定分子，特别是一些聚异丁烯(PIB)衍生物。
根据本发明的另一特征，在适当的溶剂(或溶剂的混合物)中并且在锚定分子的存在下，在-20℃至150℃之间的温度下，α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸分别以其如下的活化形式进行反应：2,2-双(三氟甲基)-1,3-噁唑烷-5-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧戊环-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环戊烷-5-酮、或(2,2-双(三氟甲基)-1,3-噁嗪-6-酮、2,2-双(三氟甲基)-1,3-二噁烷-4-酮、2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环己烷-6-酮、2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧代氮杂烷-7-酮、2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧杂环庚烷-4-酮、2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环庚烷-7-酮及其衍生物。在一个实施方案中，在能够溶解试剂的任何惰性液体溶剂(或混合物)中进行反应。适用的溶剂包括(但不限于)卤代烃或非卤代烃。优选的溶剂是四氢呋喃、乙酸乙酯、2-甲基四氢呋喃、碳酸丙烯酯或能够溶解这两种化学物质的任何其他溶剂或溶剂的混合物。
根据本发明的另一特征，PIB衍生物与活化的α、β或γ-氨基酸或者活化的α、β或γ-羟基酸或者活化的α、β或γ-巯基酸之间的反应以间歇式的化学方式(特别是在烧瓶或容器中)进行，但优选地，该反应以流动化学(也称为连续流动化学)的方式进行。
根据本发明的另一特征，对于具有与锚定/延伸或迭代的反应条件不相容的侧链的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸，可以由适当的保护基暂时掩蔽。所述保护基可以特别地选自由以下组成的组：
-叔丁氧羰基(缩写为Boc)，
-芴甲氧羰基(缩写为Fmoc)，
-苄基(缩写为Bzl)，
-三苯甲基(缩写为Trt)，
-苄氧羰基(缩写为Cbz)，
-2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(缩写为Pbf)，
-4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基(缩写为Mtr)。
也可使用与本发明方法相容的任何其他保护基。
根据本发明的另一特征，所述锚定分子与第一个活化的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸(在本文中缩写为AAA1)反应，从而在α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸和锚定分子之间产生共价键。
根据本发明的另一特征，所述肽或蛋白质或拟肽链由n个单元的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸形成；所述肽或蛋白质或拟肽链的第二末端是α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸的另一单元，在本文中缩写为AAAn。在该方法的过程中，肽或蛋白质或拟肽链通过延伸或连续迭代而延长，并且在这些步骤的每一个步骤中，将另一个单元的活化的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸(在本文中缩写为AAA(n+1))增加到所述第二末端(伯胺或仲胺、醇或游离硫醇)上。该反应顺序示于以下反应图示n°2中。
[化学式2]
Z＝NH、N-烷基、N-芳基、O、S
R1、R2、R3、R4＝H和/或烷基和/或芳基
n＝0.1
反应图示n°2：用于获得肽的一般方法
根据本发明的另一特征，能够在所述肽或蛋白质或拟肽链中使用天然的和/或非天然的和/或合成的α、β或γ-氨基酸和/或α、β或γ-羟基酸和/或α、β或γ-巯基酸。
根据本发明的另一特征，可在所述拟肽链中使用Qa-E-Qb型分子的一个或多个单元，该Qa-E-Qb型分子具有至少两个相同或不同的官能团，并且该官能团选自亲电基团和/或亲核基团，并且所述官能团由间隔基单元E隔开。基团Qa和/或Qb可以是末端基团或可以不是末端基团。间隔基E可以是选自由以下组成的组中的基团：
-脂族链(具有支链或不具有支链，不饱和或饱和)；
-芳基或杂芳基(取代或未被取代)。
有利地，Qa-E-Qb型分子携带选自由伯胺官能团、仲胺官能团、羟基官能团或硫醇基官能团组成的组中的末端官能团。
可以容易地看出，所述α、β或γ-氨基酸、所述α、β或γ-羟基酸和所述α、β或γ-巯基酸代表了Qa-E-Qb型双官能分子的具体情况。这同样适用于所述δ-氨基酸、所述δ-羟基酸和所述δ-巯基酸，然而与不是α、β或γ-氨基酸、α、β或γ-羟基酸或α、β或γ-巯基酸的其他双官能分子一样，所述δ-氨基酸、所述δ-羟基酸和所述δ-巯基酸不一定以其活化形式参与反应。
双官能分子Qa-E-Qb可以具有特别选自环氧化物、氮丙啶、硫杂环丙烷的分子结构。因此，根据本发明，可以制备包含环氧琥珀酸基团的拟肽，如肽E-64，或者氮丙啶(azirido)肽，如Miraziridine。
本文给出了一些可用于本发明上下文的双官能Qa-E-Qb型分子的实例：肌氨酸、2-(1-氨基乙基)-1,3-噁唑-4-羧酸和(2R,3R,4R)-3-羟基-2,4,6-三甲基-庚酸。
所述双官能分子Qa-E-Qb可以特别是根据下面给出的定义的氨基酸。它还可以是肽，例如二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽或甚至更长的肽。
这些双官能分子可以通过已知的化学反应引入到肽或蛋白质或拟肽链中。它们在选自由伯胺官能团、仲胺官能团、羟基官能团或硫醇基官能团组成的组中的末端官能团上不携带保护基。例如，如果所述双官能分子是氨基酸或肽，那么其不携带N端保护；可保护其侧链或侧官能团在肽的延伸过程中不被改变。
如上所述，优选的是，所述α、β或γ-氨基酸、所述α、β或γ-羟基酸和所述α、β或γ-巯基酸以其活化形式使用。
对于衍生自不选自α、β或γ-氨基酸、α、β或γ-羟基酸和α、β或γ-巯基酸的双官能分子的单元，其可以有利地连接至所述拟肽的C端，或处于末端上(特别是通过伯胺或仲胺、羟基或硫醇基官能团的官能化)，或处于侧链上(至少一个α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸的侧链)，或位于选自α、β或γ-氨基酸、α、β或γ-羟基酸和α、β或γ-巯基酸的两个单元之间。
根据一个有利的实施方案，由不选自α、β或γ-氨基酸、α、β或γ-羟基酸和α、β或γ-巯基酸的双官能分子得到的单元的数量不超过50数量％，并且优选不超过25数量％。
根据本发明的另一特征，具有至少一个步骤，其中所述肽或蛋白质或拟肽链与所述锚定分子连接，并通过在与水(或水/乙醇混合物或水/乙腈混合物)不混溶的有机溶剂(例如环己烷、庚烷或任何其他合适的溶剂)中萃取或通过在二氧化硅上过滤而从反应介质中进行纯化。
根据本发明的另一特征，在侧链去保护(如果需要的话)，然后在最后的迭代步骤之后分离其锚定分子之后，可以获得高纯度的肽或蛋白质或拟肽，并根据其目的用作(例如)用于临床前试验、临床护理或任何其他应用的活性成分。
根据本发明的另一特征，在根据本发明的方法中，锚定分子可以再利用(再循环)。
本发明的第二目的是能够通过根据本发明的方法获得的分子。所述分子包括连接至锚定分子的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸或肽或蛋白质或拟肽。
具体实施方式
1.定义
在本发明的上下文中，“氨基酸”是指：天然氨基酸和非天然或合成的氨基酸。“天然”氨基酸包括可以在天然来源的蛋白质中发现的称为标准蛋白原氨基酸的L型蛋白原氨基酸，即：丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。天然氨基酸还包括其他蛋白原氨基酸，并且特别是吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。
“非天然”氨基酸包括以上定义的D型天然氨基酸、某些天然氨基酸(例如：精氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和丝氨酸)的同型以及正亮氨酸和正缬氨酸。
“非天然”氨基酸也包括所有合成的氨基酸。它们还包括非天然氨基酸，例如：
Abu＝2-氨基丁酸CH3-CH2-CH(COOH)(NH2)；
iPr＝异丙基-赖氨酸(CH3)2C-NH-(CH2)4-CH(COOH)(NH2)；
Aib＝2-氨基异丁酸；
F-trp＝N-甲酰基-色氨酸；
Orn＝鸟氨酸；
Nal(2')＝2-萘基丙氨酸。
该列表显然不是穷举的。
还可使用天然或非天然的不饱和α氨基酸和β氨基酸。
在本发明的上下文中，本文所用的术语“活化的氨基酸”表示分别为如下形式的活化的α、β或γ-氨基酸：2,2-双(三氟甲基)-1,3-噁唑烷-5-酮、或(2,2-双(三氟甲基)-1,3-噁嗪-6-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧代氮杂烷-7-酮及其衍生物的形式，其中在侧链上可能存在或不存在保护基。
本发明也适用于拟肽的合成。用于该合成的前体定义如下：
本文中根据IUPAC的术语规则所用的术语“α、β或γ-羟基酸”是本领域技术人员已知的。实例是在自然界发现的诸如乳酸、苹果酸、酒石酸、水杨酸或γ是羟基丁酸之类的化合物。在本发明的上下文中，也可使用所有的“非天然”α、β或γ-羟基酸，其还包括所有合成的α、β或γ-羟基酸。
术语“活化的α、β或γ-羟基酸”是指所有天然和/或非天然和/或合成的α、β或γ-羟基酸，它们分别以2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧戊环-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二噁烷-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧杂环庚烷-4-酮及其衍生物的形式活化，其中在侧链上可能存在或不存在保护基。
本文中根据IUPAC的术语规则所用的术语“α、β或γ-巯基酸”是本领域技术人员已知的。实例是诸如巯基乙酸、3-巯基丙酸、巯基丁酸之类的化合物。在本发明的上下文中，也可使用所有的“非天然”α、β或γ-巯基酸，其也包括所有合成的α、β或γ-巯基酸。
术语“活化的α、β或γ-巯基酸”是指由以如下形式的(天然的、非天然或合成的)α、β或γ-巯基酸活化得到的全部化合物：2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环戊烷-5-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环己烷-6-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环庚烷-7-酮及其衍生物，其中在侧链上可能存在或不存在保护基。
本领域技术人员已知在上下文中，名称α、β、γ和δ是指对于羧酸官能团(C端)的碳，被(伯或仲)胺或羟基或硫醇基官能团取代的碳的位置。
根据现有技术所使用的术语“拟肽”作为能够模拟或阻断肽与特异性受体的相互作用的分子的功能性术语。特别地，拟肽可以包含不是氨基酸的单元。
化学家公知的缩写“DMF”、“DMSO”和“THF”分别表示二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和四氢呋喃。
2.具体描述
根据本发明方法的第一基本特征是在可溶于有机溶剂的锚定分子的存在下，使用分别为如下形式的活化的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸：2,2-双(三氟甲基)-1,3-噁唑烷-5-酮、或(2,2-双(三氟甲基)-1,3-噁嗪-6-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧代氮杂烷-7-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧戊环-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二噁烷-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧杂环庚烷-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环戊烷-5-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环己烷-6-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环庚烷-7-酮、或其衍生物。本文中的“有机溶剂”是指能够(冷和/或热)溶解反应物的任何惰性液体溶剂(或混合物)。适用溶剂包括(但不限于)卤代烃或非卤代烃。
根据已知方法，由天然或非天然(具有侧链(受保护或未受保护))的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸和六氟丙酮制备形式分别为如下形式的活化的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸：2,2-双(三氟甲基)-1,3-噁唑烷-5-酮、或(2,2-双(三氟甲基)-1,3-噁嗪-6-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧代氮杂烷-7-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧戊环-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二噁烷-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧杂环庚烷-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环戊烷-5-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环己烷-6-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧代氮杂烷-7-酮及其衍生物。反应图示n°3表示不同酸的活化，已知该反应如下：
[化学式3]
X＝NH、N-烷基、N-芳基、O、S
R1、R2、R3、R4、R5、R6＝烷基或芳基
反应图示n°3：α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸的活化。
根据将在下面更详细描述的本发明的一个特征，锚定分子(或保护基或溶解分子)是聚烯烃，或者更具体而言为聚烯烃低聚物(聚烯烃也称为聚烯烃类)及其衍生物，也就是说锚定分子是官能化的。
根据本发明的另一特征，在液相中合成肽或蛋白质或拟肽(在其侧链上受保护或不受保护)的方法的特征在于，使用锚定分子和分别为如下形式的活化的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸：2,2-双(三氟甲基)-1,3-噁唑烷-5-酮、或(2,2-双(三氟甲基)-1,3-噁嗪-6-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧代氮杂烷-7-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧戊环-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二噁烷-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧杂环庚烷-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环戊烷-5-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环己烷-6-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环庚烷-7-酮或其衍生物。然后在这两种分子之间形成共价键。延伸/迭代步骤包括添加或缩合以下活化的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸，这些活化的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸任选地在其侧链上受保护(为酯、醚、硫酯、硫醚或与本方法相容的任何其他化学官能团的形式)。因此，锚定分子起到第一个α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸的羧酸官能团(C端)的保护基的作用。
根据本发明的另一特征，可以使用适当保护的肽或蛋白质或拟肽的片段和锚定在PIB分子上的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸或肽或蛋白质或拟肽从而进行这种合成肽或蛋白质或拟肽的方法，使得在偶联后获得更长的肽或蛋白质或拟肽。
根据本发明的另一特征，可以使用具有至少两个官能团Qa和Qb的分子Qa-E-Qb进行这种合成肽或蛋白质或拟肽的方法，其中所述官能团相同或不同，并且选自亲电和/或亲核化学官能团。这些结构的实例为氧化苯乙烯、氨基苯硫酚类或1-叠氮基-4-(溴甲基)苯。这些分子可以直接连接至锚定分子，或者在合成过程中引入(伯或仲)胺官能团或羟基或硫醇基、α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸或锚定的肽或蛋白质或拟肽。
可以在能够溶解(卤代或非卤代)反应物的任何惰性液体溶剂(或混合物)中，在通常在约-20℃至约150℃之间的温度，在反应器中(以间歇或流动的方式)进行根据本发明的方法。
根据本发明的另一特征，锚定在PIB分子上的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸或者肽或蛋白质或拟肽的特征在于，所述α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸或者肽或蛋白质或拟肽或任何其他具有至少两个官能团的分子的末端官能团通过共价键(酯、醚、酰胺、硫酯或任何其他化学官能团)结合，从而在水中的溶解度非常低(＜30mg/ml)。在这种意义上，PIB衍生物起到了合成肽或蛋白质或拟肽的液体载体或溶解分子的作用。
作为说明，反应图示n°4示出了2,2-双(三氟甲基)-1,3-噁唑烷-5-酮形式的活化的氨基酸与被苯酚官能团封端的聚异丁烯衍生物(缩写为PIB)的反应。在这种情况下，α-氨基酸是L-苯丙氨酸(Phe)。
[化学式4]
反应图示n°4：锚定至液体载体
因此，将要形成的肽的第一个α-氨基酸经由酯型共价键与锚定分子连接。
反应图示5示出了延伸或迭代步骤，即，第二个氨基酸单元与已连接至锚定分子的第一氨基酸连接。在这种情况下，第二个α-氨基酸是L-色氨酸(Trp)。
[化学式5]
反应图示n°5：延伸
可以容易地看出，在合成过程中，该方法能够通过连续的迭代，从而向连接至PIB衍生物的最后一个α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸或者肽或蛋白质或拟肽上添加α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸的单元，以获得具有所需序列的肽或蛋白质或拟肽。肽或蛋白质或拟肽以化学方式结合至锚定分子，可以在任何时间、并且特别是在最后的迭代步骤之后，通过在有机溶剂(如己烷或环己烷)和水或在水/乙醇或水/乙腈混合物中萃取，从而将肽或蛋白质或拟肽与全部极性产物分离。在该迭代序列的重点，并且任选地在侧链去保护之后，肽或蛋白质或拟肽可以与锚定分子分离；因此，肽或蛋白质或拟肽在非极性溶剂中的溶解度下降，并且可以与锚定分子分离，从而根据其预期目的进行使用。
根据本发明的另一特征，通过用PIB衍生物衍生(或锚定)α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸或者肽或蛋白质或拟肽(在其侧链上受保护或未受保护)，确实使得锚定后的所述α、β或γ-氨基酸、或者α、β酸或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸或者肽或蛋白质或拟肽在有机液相中的溶解度显著增加。更具体而言，这些锚定至PIB衍生物的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸或者肽或蛋白质或拟肽可溶于有机溶剂，例如卤代溶剂(二氯甲烷、氯仿)、乙酸乙酯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、异辛烷、环己烷、己烷、甲基环己烷、甲基叔丁基醚、碳酸丙烯酯、或诸如苯或甲苯之类的芳族溶剂、或任何其他合适的溶剂。因此，锚定至PIB衍生物的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸或者肽或蛋白质或拟肽在萃取/倾析过程中对有机相具有高分配系数，从而能够简单且快速地纯化。同时，它们在诸如水或水/乙醇或水/乙腈混合物之类的溶剂中的溶解度非常低。
根据本发明的另一特征，通过PIB衍生物和任选地具有受保护或未受保护的侧链(酯、酰胺、硫酯或任何其他化学官能团)的第一个活化的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸之间的反应，得到在水中溶解度低的产物(＜30mg/ml)。
因此，当α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸或者肽或蛋白质或拟肽与PIB衍生物连接时，PIB衍生物起到液体载体(或锚定分子或溶解分子)的作用，这是因为该反应的产物可溶于有机溶剂，但保持不溶于诸如水或水/乙醇或水/乙腈混合物之类的溶剂；这使得可以通过相分离将其与反应混合物分离。
反应图示n°6示出了将具有Phe-Tpr-Cys(Bzl)-Trp-Cys(Bzl)-Trp-Trp-Cys(Bzl)-NH2序列的八肽与锚定分子(由苯酚官能团封端的PIB衍生物)分离的步骤的实例，其中肽通过L-苯丙氨酸的羧酸官能团(C端)锚定在该锚定分子上。L-半胱氨酸残基的侧链受苄基(Bzl)保护。游离肽不溶于非极性溶剂(即环己烷、己烷)，这使得游离肽易于与锚定分子分离。锚定分子可以回收并在该方法中再利用。
[化学式6]
反应图示n°6：八肽与锚定分子的分离
肽在以下溶剂中沉淀，该溶剂例如为：乙醚、环己烷或任何其他合适的溶剂。然后可以根据其预期目的使用。
现在将描述根据本发明制备肽或蛋白质或拟肽的方法的第二基本特征，即使用可溶于以下一些有机溶剂中的锚定分子，该有机溶剂例如为：乙酸乙酯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、异辛烷、环己烷、己烷、甲基环己烷、甲基叔丁基醚或卤代溶剂。
有利地，根据本发明的方法在液相中使用聚烯烃、或更具体而言使用聚烯烃低聚物(聚烯烃也称为聚烯烃类)及其衍生物，以作为α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸或者肽或蛋白质或拟肽的羧酸官能团(C端)的锚定分子或液体载体或保护基，或是作为所述α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸或者肽或蛋白质或拟肽(以酯、酰胺、醚、硫酯、硫醚或任何其他合适的化学官能团的形式)的侧链的羧酸官能团的锚定分子或液体载体或保护基。聚烯烃分子包含通过单键结合在一起的碳原子链。聚烯烃分子可以包含由相同或不同烷基构成的支链，但优选包含由相同的烷基构成的支链。优选地，聚合物由至少10个单体单元、并且优选由15个至350个单体单元组成。均聚物是优选的，但也可以使用(饱和或不饱和的)共聚物。在不饱和聚合物或共聚物的情况下，有利地，碳原子链中不饱和键的数量不超过5％，并且优选不超过3％。
优选地，其为聚异丁烯(PIB)的衍生物，这是一类自上世纪的二十世纪三十年代以来已知的聚合物，但也可使用聚丙烯的衍生物。
这些锚定分子优选以官能化的衍生物的形式用于根据本发明的方法中，这将在下面更详细地说明。图示7示出了许多官能化的PIB衍生物，它们适合作为实施本发明的液体载体。
[化学式7]
图示n°7：锚定分子的一般结构
在这些化学式中：
·Xc是选自由-OH、-NH2、-NHRa(Ra＝烷基或芳基)、-SH组成的组中的基团；
·Ar为被取代或未被取代的芳族或杂芳族基团；
·A不存在或为选自由CH2、CH2-CH2、S组成的组中的基团；
·Rf为选自由以下组成的组中的基团：H、芳基、杂芳基、烷基、O-烷基、O-芳基、O-杂芳基；
·Rq为选自由以下组成的组中的基团：H、烷基、O-烷基、芳基、杂芳基、O-芳基、O-杂芳基；
·数字n是通常大于10的整数，并且有利地在15至350之间。
数字m是0或1。特别地，基团Xc可为伯胺或仲胺、醇、硫醇或苯酚中的官能团。
根据本发明，这些锚定分子经由共价键与α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸的羧酸官能团(C端)或者与具有至少两个官能团的分子的全部化学官能团结合。这假定锚定分子以适当的官能化形式(本说明书中称为“PIB衍生物”)结合。该术语还包括这样的锚定分子的衍生物，其不是聚异丁烯的衍生物，而是如上定义的其他聚烯烃的衍生物；它特别包括聚烯烃低聚物的衍生物。锚定分子的这种官能化通常是末端官能化，优选在碳原子链的一个端部的末端官能化；下面将对其进行描述。
根据本发明，可以用PIB衍生物(其形式为酯、醚、硫醚、硫酯或与本发明方法相容的任何其他化学官能团)在α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸或者肽或蛋白质或拟肽的侧链上官能化。这相当于赋予了PIB衍生物作为所述α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸或者肽或蛋白质或拟肽的侧链的保护基的作用。
用作锚定分子的聚烯烃或聚烯烃低聚物或聚烯烃类的链通常以重均分子量表征，但也能够使用称为“均相”链的聚烯烃或聚烯烃低聚物或聚烯烃类的链，其包括具有给定链长的相同分子。
更具体而言，根据本发明的在液相(溶液)中合成侧链任选地受保护的肽或蛋白质或拟肽的方法的特征在于，通过与α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸、或者肽、或蛋白质、或拟肽、或具有至少两个官能团的任何其他分子的羧酸官能团结合的PIB衍生物，从而使α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸、或者肽、或蛋白质、或拟肽溶解在有机介质中。PIB衍生物起到α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸、或者肽、或蛋白质、或拟肽、或具有至少两个官能团的任何其他分子的锚定分子(本文也称为“液体载体”或“溶解分子”)的作用。通过使α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸、或者具有至少两个官能团的任何其他分子连续地连接在最后一个α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸、或者具有至少两个官能团的任何其他分子上，从而合成连接至该锚定分子的所述肽或蛋白质或拟肽。因此，在肽或蛋白质或拟肽的连续迭代的合成过程中，锚定分子也起到羧酸官能团(C端)的保护基的作用。
侧链任选地受保护的所述α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸、或者肽、或蛋白质、或拟肽的羧酸官能团(C端)通过酯、酰胺、硫酯的共价键或任何其他共价化学键与亲脂性PIB衍生物结合，从而得到非常低的在水中的溶解度(＜30mg/ml)。在这种意义上，PIB衍生物起到了合成肽或蛋白质或拟肽的液体载体或溶解分子的作用。
α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸、或者肽、或蛋白质、或拟肽(其侧链上受保护或不受保护)与PIB衍生物的这种衍生物显著增加了锚定的所述α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸、或者肽、或蛋白质、或拟肽在有机液相中的溶解度。更具体而言，这些锚定至PIB衍生物的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸、或者肽、或蛋白质、或拟肽可溶于有机溶剂，例如：卤代溶剂(二氯甲烷、氯仿)、乙酸乙酯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、异辛烷、环己烷、己烷、甲基环己烷、甲基叔丁基醚、或诸如苯或甲苯之类的芳族溶剂、或任何其他合适的溶剂。其结果是，在环己烷或己烷以及水或水/乙醇或水/乙腈混合物的存在下，在萃取/倾析过程中，与PIB衍生物连接的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸、或者肽、或蛋白质、或拟肽对有机相具有高分配系数，从而使其纯化简单且快速。
在根据本发明的在液相中合成肽或蛋白质或拟肽(在其侧链上受保护或不受保护)的方法的一个实施方案中，起点是分别为以下形式的具有至少两个官能团的分子、或者活化的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸：2,2-双(三氟甲基)-1,3-噁唑烷-5-酮、或(2,2-双(三氟甲基)-1,3-噁嗪-6-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧代氮杂烷-7-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧戊环-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二噁烷-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧杂环庚烷-4-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环戊烷-5-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环己烷-6-酮、或2,2-双(三氟甲基)-1,3-氧硫杂环庚烷-7-酮或其衍生物，这些分子将经由共价键与上述定义的锚定分子中的一者结合，并且通过连续迭代而添加这些分子，或者使具有至少两个官能团的分子、或者α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸(其被活化并任选地在其侧链上受保护)缩合。
可以使用在其侧链上适当受保护的肽或蛋白质或拟肽的片段、以及锚定至PIB分子的肽或蛋白质或拟肽序列来进行根据本发明的合成肽或蛋白质或拟肽的方法，从而在偶联后获得更长的肽或蛋白质或拟肽。
可以使用具有至少两个官能团的分子来进行根据本发明的合成肽或蛋白质或拟肽的方法，上述官能团即为基团Qa和基团Qb，基团Qa和基团Qb可以相同或不同、并且选自亲电基团和/或亲核基团。例如，在第一实施方案中，Qa可为亲电基团，并且Qb可为亲核基团，或者在第二实施方案中，Qa可为第一亲电基团，并且Qb为第二亲电基团，或者在第三实施方案中，Qa可为第一亲核基团，并且Qb可为第二亲核基团；在变体中，Qa和Qb也可以表示相同的亲电基团，或者表示相同的亲核基团。这些具有至少两个官能团的分子可以直接锚定至锚定分子，或者在合成过程中引入到(伯或仲)胺官能团或羟基或硫醇、α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸、或者肽、或蛋白质、或锚定的拟肽中。
有利地，在各个锚定、延伸和/或迭代步骤期间，使用稍微化学计量过量的活化的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸。
这些双官能分子可以通过已知的化学反应引入到肽或蛋白质或拟肽链中。如果需要，这些双官能分子可以(通过已知的反应，在其亲核官能团或任何其他需要亲核官能团的化学官能团上)受保护或掩蔽，并通过已知的技术活化。
对于衍生自不选自α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸的双官能分子的单元，其可以有利地连接至所述肽或蛋白质或拟肽的C端，或者连接在N端、O端或S端上(特别是通过胺、羟基或硫醇基官能团的官能化)，或者连接在侧链上，或者连接在选自α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸的两个单元之间。
根据一个有利的实施方案，衍生自不选自α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸的双官能分子的单元的数量不超过50单元数％，并且优选不超过25单元数％，并且甚至更优选不超过10单元数％。
例如，可以使用根据本发明的方法制备索马鲁肽(semaglutide)，其为在侧链上包含α-氨基丁酸单元的拟肽。
除了上文已经提及的氨基酸，这里列出了α、β、γ或δ-氨基酸型的分子，其可以用作根据本发明的方法的上下文中的单元：δ-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸、β-氨基丁酸(也缩写为BABA)、β-丙氨酸、β-赖氨酸、β-氨基异丁酸、β-N-甲基氨基-L-丙氨酸、(2S,3S,8S,9S)-3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基癸-4,6-二烯酸((2S,3S,8S,9S)-3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4,6-dienoic acid，也称为ADDA)、(2R)-2-(甲基氨基)丁二酸(也称为NMDA)和4-氨基-3-羟基丁酸。
本文列出了α、β、γ或δ-羟基酸型分子，其可以用作根据本发明的方法的上下文中的单元：4-羟基丁酸、2-(羟基甲基)-3-甲基丁酸和(2R,3R,4R)-3-羟基-2,4,6-三甲基庚酸。
在此列出了α、β、γ或δ-巯基酸型分子，其可以用作根据本发明的方法的上下文中的单元：4-硫烷基丁酸、2-环丙基-3-硫烷基丙酸、2-环丁基-3-硫烷基丙酸和2-(2-硫烷基苯基)丁酸。
根据本发明的方法具有许多优点。
第一个优点在于本发明的方法能够在有机液相中产生与锚定分子结合的肽或蛋白质或拟肽(在其侧链上受保护或不受保护)。
第二个优点在于本发明的方法通过在非极性有机溶剂中用水洗涤或在水/乙醇或水/乙腈混合物中简单洗涤(萃取)，或者通过过滤，从而除去未与聚烯烃或聚烯烃低聚物或聚烯烃类的衍生物(如过量试剂)结合的副产物(盐、酸或任何其他分子)，从而能够获得高纯度的锚定的肽或蛋白质或拟肽(在其侧链上受保护或未受保护)。诸如环己烷、庚烷、己烷之类的闪点<15℃的有机溶剂适于在萃取或洗涤过程中溶解聚烯烃或聚烯烃低聚物或聚烯烃类的衍生物。因此，根据本发明的方法能够减少现有技术方法中所需的纯化步骤。
第三个特别重要的优点在于，根据本发明的方法能够通过调节聚烯烃或聚烯烃低聚物或聚烯烃类的衍生物的长度，即通过使其更具亲脂性，从而合成肽或蛋白质或拟肽。
第四个优点是通过取等分试样，然后通过本领域技术人员已知的各种技术(例如质谱、高效液相色谱法、质子核磁共振或碳-13核磁共振)进行分析，可以在合成过程中的任何时间控制肽或蛋白质或拟肽的纯度。
第五个优点在于，不需要为α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸的(伯或仲)胺官能团、或羟基、或巯基使用保护基，其中使用保护基通常需要两个步骤(保护和去保护)。更通常地，根据本发明的方法具有最佳的原子经济性，这是因为该方法不涉及相应酸的(伯或仲)胺或羟基或硫醇基官能团的保护基团，也不涉及偶联剂。根据本发明的方法的原子和步骤的经济性在现实工业中经济节约，同时减少了废物的产生，这是不同于现有方法的有利的环境因素。
本发明的第六个优点在于，羧酸官能团(C端)的活化与(伯或仲)胺或羟基或硫醇基官能团的保护同时进行，因此减少了步骤的数量。
本发明的第七个特别令人感兴趣的优点在于，在切割侧链的保护基并随后切割锚定分子，从而获得高纯度的肽或蛋白质或拟肽。这避免了合成的肽或蛋白质或拟肽的纯化。其结果是，产生了优于已知方法的额外的节省。这进一步限制了肽或蛋白质或拟肽制造的环境影响。
本发明的第八个优点在于，通过调节液体载体的尺寸或通过将其引入活化的α、β或γ-氨基酸、或者α、β或γ-羟基酸、或者α、β或γ-巯基酸的一个或多个侧链上，存在获得较大尺寸的肽或蛋白质或拟肽的可能性。
其他优点是存在根据本发明的方法的自动化的可能性以及萃取溶剂和锚定分子(聚烯烃或聚烯烃低聚物或聚烯烃类)的循环使用的可能性。实际上，当完成了获得靶标肽或蛋白质或拟肽的序列的一系列迭代时，肽或蛋白质或拟肽脱去侧链的保护基的保护，并且最终通过肽合成中常用的反应(例如水解、皂化、氢解或与本方法相容的其他任何反应)中的一种反应而脱去锚定分子。
由于通过该方法制造的肽或蛋白质或拟肽的纯度高，因此其可以用作药物制品(药品和疫苗)、化妆品、植物检疫制品、食品制品，或作为用于合成这些制品的中间体。
实施例
使用根据本发明的方法制备八肽。
在第一步骤中，活化以下氨基酸：活化的L-苯丙氨酸(本文命名为AAA1)、活化的L-色氨酸(本文命名为AAA2)和活化的L-半胱氨酸(由苄基(Bzl)保护基保护)(本文命名为AAA3)。该反应对应于上述反应图示n°3。
在室温向配备有干冰气体冷凝器和鼓泡器的氨基酸(10mmol)的N-N-二甲基甲酰胺(5mL)溶液中，使过量(＞2当量)的六氟丙酮浓缩。在室温搅拌十六小时后，将反应混合物浓缩至干燥，并将残余物冻干。将获得的粗产物溶解在二氯甲烷中，过滤，然后减压除去溶剂并冻干(三次)。获得油状或固体形式的2,2-双(三氟甲基)-1,3-噁唑烷-5-酮或活化的氨基酸，收率在80％至95％之间。在以下图示n°8中给出它们的配方。
[化学式8]
图示n°8：活化的氨基酸的结构
在第二步骤中，将活化的氨基酸(活化的L-苯丙氨酸，在本文中称为AAA1)偶联至锚定分子，在这种情况下锚定分子为PIB衍生物。该反应对应于上述反应图示n°4。
将PIB衍生物(31.1mg，0.028mmol)和活化的氨基酸(在本文中为AAA1)(9.8mg，0.031mmol)的四氢呋喃/六氟异丙醇混合物(2mL)溶液加热至50℃，持续2小时，然后冷却至室温。向反应介质中添加饱和碳酸氢钠水溶液(2mL)，并将混合物在室温搅拌三十分钟。将反应介质用环己烷萃取三次，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，以得到H2N-Phe-PIB衍生物。
在第三步骤中，通过连接另一活化的氨基酸(在本文中为AAA2)以使肽延伸。该反应对应于上述反应图示n°5。
将H2N-Phe-PIB衍生物(1当量)和下列活化的氨基酸(AAA2)(1.1当量)的四氢呋喃/六氟异丙醇(2mL，9/1)溶液加热至50℃，持续2小时，然后冷却至室温。如前所述处理反应混合物，以得到相应的锚定二肽(H2N-Trp-Phe-PIB)，等等。在这种情况下，在相同条件下用活化的氨基酸AAA3重复迭代，以获得相应的锚定的三肽(H2N-Cys(Bzl)-Trp-Phe-PIB)。
然后进行进一步的迭代，直到获得序列为H2N-Cys(Bzl)-Trp-Trp-Cys(Bzl)-Trp-Cys(Bzl)-Trp-Phe-PIB的锚定的八肽。
在最后的步骤中，肽与锚定分子分离。该反应对应于上述反应图示n°6。
在室温将氢氧化锂溶液(1M，2mL)添加到锚定的八肽(H2N-Cys(Bzl)-Trp-Trp-Cys(Bzl)-Trp-Cys(Bzl)-Trp-Phe-PIB)(8mg)的四氢呋喃/水混合物(8:2)溶液(2mL)中。将反应混合物在室温搅拌16小时。用二噁烷/HCl溶液稀释反应介质，并用环己烷洗涤沉淀物。
SEQUENCE LISTING
<110> 斯特兰化学公司
<120> 肽或蛋白质或拟肽的制造方法
<130> BR 2836 FR
<140> FR1904604
<141> 2019-05-02
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 此序列在未决请求中作为实例提供。
<220>
<221> 肽
<222> (1) .. (8)
<223> Xaa3、Xaa5和Xaa8表示侧链受苄基保护的L-半胱氨酸残基（Bzl）。
<400> 1
Phe Trp Xaa Trp Xaa Trp Trp Xaa
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 此序列在未决请求中作为实例提供。
<220>
<221> 肽
<222> (1) .. (8)
<223> Xaa3、Xaa5和Xaa8表示侧链受苄基保护的L-半胱氨酸残基（Bzl）。
Xaa1 表示由 PIB 的衍生物修饰的 Phe 残基
<400> 2
Xaa Trp Xaa Trp Xaa Trp Trp Xaa
1 5