dna纳米球检测探针及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物传感技术领域，更具体地，涉及一种dna纳米球检测探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.端粒是一段具有重复序列(ttaggg)的dna序列，通常存在于细胞染色体的末端。在细胞分裂过程中，染色体的复制会导致端粒的不断缩短。而端粒酶作为体内广泛存在的一种逆转录酶，在维持端粒长度以及细胞生长、分化过程中起到非常关键的作用。端粒酶通过在端粒的3'端不断的复制ttaggg的重复序列达到维持端粒长度以及细胞活性的目的。2009年，elizabetn等发现了端粒酶以及端粒对于细胞活性的保护机制而获得了诺贝尔医学奖。此后，许多研究表明端粒酶的活性过高可能会诱导细胞的永久性存活，甚至引发癌症。但是，端粒酶活性过低又会加速细胞衰老，甚至凋亡。在正常人的体细胞中，端粒酶处于抑制的状态，研究发现在包括胃癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌等大多数癌症细胞中，端粒酶的活性明显高于正常水平。因此，端粒酶活性检测在癌症的诊疗等方面具有重大的研究意义。越来越多的研究者发现端粒酶可以作为重要的靶点在癌症的诊断，治疗方面发挥作用。因此，如何准确、灵敏、快速地获得端粒酶活性成为了在临床诊断和治疗方面的一大热点。
3.传统的端粒酶检测方法包括端粒重复序列扩增法、端粒重复序列延伸法、荧光素标记的端粒酶重复序列扩增法等，这些方法存在样本需要量大、检测时间长、操作复杂、假阳性、价格昂贵，不能可视判断等缺点。


技术实现要素：

4.本发明为克服上述现有检测方法效果不好的缺陷，提供一种dna纳米球检测探针。
5.本发明的另一目的在于提供所述dna纳米球检测探针的制备方法。
6.本发明的另一目的在于提供所述利用dna纳米球检测探针检测端粒酶活性的方法。
7.本发明的另一目的在于提供所述dna纳米球检测探针的应用。
8.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
9.一种dna纳米球检测探针，其特征在于，包括单链探针a、单链探针b和单链探针c，所述单链探针a、单链探针b和端粒酶引物序列均至少含有一段回文序列的粘性末端，所述单链探针c还具有用于端粒酶反应的引物序列，在端粒酶作用下，单链探针c的末端会延伸出端粒重复序列(ttaggg)n，得到端粒酶产物链d-stp；其中，n为大于等于1的整数；所述单链探针a、单链探针 b和dna端粒酶产物链d-stp的端粒重复序列部分互补，以形成y型结构dna，所述y型结构dna以粘性端连接，依次放大排列得到所述dna纳米球检测探针，所述dna纳米球检测探针的直径为10～100nm。
10.所述回文序列是指核苷酸片段在其中一条链上按5'到3'读取的序列与其互补链上按相同的5'到3'读取的序列一致。
11.本发明提供了一种dna纳米球检测探针，所述dna纳米球检测探针稳定且具有单分散结构，直径在10～100nm。
12.优选地，所述单链探针a如序列表中的seq id no.1、2或3所示，所述单链探针b如序列表中的seq id no.4、5或6所示，所述单链探针c的核苷酸序列如序列表中的seq id no.7、8或9所示。
13.优选地，所述单链探针a如序列表中的seq id no.1所示、所述单链探针b 如序列表中的seq id no.4所示，所述单链探针c的核苷酸序列如序列表中的 seq id no.7所示。
14.优选地，所述dna纳米球检测探针的直径为80～95nm。
15.所述dna纳米球检测探针在检测端粒酶活性中的应用。
16.所述dna纳米球检测探针在比色传感器中的应用。
17.所述dna纳米球检测探针的制备方法，包括如下步骤：
18.s11.将dna端粒酶产物链d-stp与单链探针a混合，并在室温下反应20～30 分钟，得到混合液，所述单链探针a的浓度为25～125nm；
19.s12.将单链探针b加入到步骤s11中的混合液中室温下反应120～180分钟；所述单链探针b的浓度为25～125nm，得dna纳米球检测探针。
20.优选地，所述dna端粒酶产物链d-stp是通过单链探针c在活性端粒酶的作用下，进行延伸反应得到。
21.所述活性端粒酶是从hela细胞、人肺癌细胞(a549)和人乳腺癌细胞(mcf-7和mda-mb-231)中提取的。
22.所述提取工艺为：收集指数期生长的细胞并计数，将细胞转移到离心管中，在离心机中用磷酸盐缓冲液洗涤两次，离心。立即将细胞重悬于chaps裂解缓冲液中，孵育，离心。所得提取物立即用于端粒酶延伸反应。
23.所述dna纳米球检测探针检测端粒酶活性的检测方法，包括如下步骤：
24.s21.取权利要求7所制备的dna纳米球检测探针，加入0.31～0.48μm的 sybr greenⅰ反应15～20分钟；
25.s22.将4～10nm的金纳米粒子加入到步骤s21中，观察颜色。
26.本发明首先制备成dna纳米球，能够为sybr greenⅰ(sg)的插入提供了大量的位点，导致溶液中游离的sybr greenⅰ极为少量，无法诱导金纳米粒子聚集，使溶液呈红色。在不存在端粒酶的情况下，端粒酶延长的反应不会被激活，因此单链探针a和单链探针b在反应系统中保持完整的单链。sybr greenⅰ无法插入到位点中，金纳米粒子通过静电吸引而形成聚集状态，使溶液由红色快速变为蓝色。因此，不需要任何复杂的仪器，就可以用肉眼轻松地通过dna纳米球检测探针快速的检测端粒酶活性。
27.优选地，所述金纳米粒子的平均粒径为11.7～14.2nm。当所述的金纳米粒子的平均粒径为11.7～14.2nm时，效果更好。
28.所述金纳米粒子可以通过购买得到，也可以根据文献方法制备得到。
29.作为一种实施方式，所述金纳米粒子通过下述方法制备得到：
30.将haucl4在剧烈搅拌下加热至沸腾，在搅拌下加入柠檬酸三钠，继续沸腾，自然冷却至室温，然后存放在4℃的冰箱中备用。紫外可见吸收光谱通过uv1800 分光光度计进行监测，在520nm处发现一个吸收峰，吸光度为2.7，根据朗伯
‑ꢀ
比尔定律计算浓度。
31.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
32.本发明首先利用回文序列的特有结构，实现普通杂交与回文相互作用的协同作用，在没有任何酶促反应的情况下完成了探针之间的自组装，制备了一种新型的dna纳米球。另一方面，我们以dna纳米球为基础，开发了一种新型无标记比色传感方法，可以准确地检测端粒酶在不同细胞系中的活性。所述方法具有灵敏度、检测限低、快速识别等优点。
附图说明
33.图1为本发明dna纳米球探针检测端粒酶活性原理示意图；
34.图2为本发明dna纳米球探针检测hela细胞数的紫外-可见吸收光谱图；
35.图3为实施例1的dna纳米球探针的原子力显微镜图；
36.图4为应用实施例2～4和对比例1～3的端粒酶检测图。
具体实施方式
37.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，但本发明的实施方式不限于此。
38.本发明所采用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
39.以下实施例及对比例中采用的原料如下：
40.所有核酸链均购于上海生物工程技术有限公司(上海，中国)；
41.细胞来源：所有细胞系均从中国科学院上海生物科学研究所细胞资源中心获得。人正常肝细胞l02在含10％胎牛血清、青霉素(100μg
·
ml-1
)、链霉素(100 μg
·
ml-1
)的rmi-1640培养基(corning)中培养。人乳腺癌细胞株mda-mb-231在添加10％胎牛血清的dulbecco's modified eagle培养基(dmem)中培养。人宫颈癌hela细胞、人乳腺癌mcf-10a细胞、mcf-7细胞和人肺腺癌a549细胞在添加10％胎牛血清(fbs)、100u
·
ml-1
青霉素和100μg
·
ml-1
链霉素的dulbecco's modified eagle培养基(dmem)中培养。所有细胞在37℃、5％co2的空气中培养。
42.所有的dna探针均用tae/mg
2+
缓冲液(40mm tris，20mm醋酸，2.0mmedta和12.5mm mgac2，ph 8.0)保存，得到10μm的储备液。脱氧核苷酸溶液混合物(dntps)、苯甲基磺酰氟(pmsf)、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸水合物(chaps)、乙二醇双氨乙基醚四乙酸(egta)、sybr green i、溴化乙锭(etbr)购自上海生物工程技术有限公司(上海，中国)。巯基乙醇(mch) 购自麦克林生化科技有限公司(上海，中国)。氯金酸、柠檬酸钠、三(羟甲基) 氨基甲烷(tris)、醋酸、乙二胺四乙酸、醋酸镁均购于国药集团化学试剂有限公司(北京，中国)。所有试剂均为分析纯。超纯水来自实验室超纯水系统系列 (millipore),电阻率≥18.2mω.cm-1
。
[0043]
实施例1
[0044]
实施例1提供一种dna纳米球检测探针，具体制备方法包括如下步骤：
[0045]
首先，在端粒酶的作用下，单链探针c进行延伸反应，得到dna端粒酶产物链d-stp；
[0046]
s11.将10μl dna端粒酶产物链d-stp与单链探针a混合，并在室温下反应30分钟，得到混合液，所述单链探针a的浓度为75nm；
[0047]
s12.将单链探针b加入到步骤s11中的混合液中室温下反应180分钟；所述单链探针b的浓度为75nm，得dna纳米球检测探针。
[0048]
所述单链探针a如序列表中的seq id no.1所示、所述单链探针b如序列表中的seq id no.4所示，所述单链探针c的核苷酸序列如序列表中的seq idno.7所示。
[0049]
实施例2
[0050]
实施例2的制备方法同实施例1，区别仅在于，所述单链探针a如序列表中的seq id no.2所示、所述单链探针b如序列表中的seq id no.5所示，所述单链探针c的核苷酸序列如序列表中的seq id no.8所示。
[0051]
实施例3
[0052]
实施例3的制备方法同实施例1，区别仅在于，所述单链探针a如序列表中的seq id no.3所示、所述单链探针b如序列表中的seq id no.6所示，所述单链探针c的核苷酸序列如序列表中的seq id no.9所示。
[0053]
应用实施例1
[0054]
本实施例将制备实施例1制备好的dna纳米球检测探针用于检测hela细胞，具体步骤如下：
[0055]
s21.取实施例1中的dna纳米球检测探针，加入0.38μm的sybr green
ꢀⅰ
(sg)反应20分钟；
[0056]
s22.将10nm的金纳米粒子加入到步骤s21中，充分混合，观察颜色。
[0057]
应用实施例1的hela细胞提取物中端粒酶活性检测：
[0058]
采用紫外光谱测试一系列已知浓度的hela细胞，如图3所示，随着hela细胞数从30个增加到3600个，680nm处的吸收峰显著减小，520nm处的宽吸收峰缓慢增大。当细胞数量超过3600个时，反应是饱和的。吸光度比(a520/a680) 用于定量hela细胞数(图3b)，显示吸光度比与hela细胞数之间具有良好的线性相关性(r2＝0.9912)，检测范围从30到2400hela细胞。线性方程为 a520/a680＝0.00146
×
c+0.98233。其中c是hela细胞个数。从基线速率的标准偏差的三倍确定了4个细胞的检测限。随着hela细胞数从30个增加到3600个，样品颜色从蓝色逐渐变为红色，与紫外结果对应，允许目视检测低至60个hela 细胞。
[0059]
应用实施例2～4
[0060]
应用实施例2～4的测试方法与应用实施例1一致，其区别仅在于，应用实施例2中检测的是人肺癌细胞a549，应用实施例3中检测是人乳腺癌细胞mcf-7，应用实施例4人乳腺癌细胞mda-mb-231。
[0061]
对比例1～3
[0062]
对比例1～3的检测方法与应用实施例1一致，其区别仅在于，对比例1中使用的hela细胞是经过95℃加热后的；对比例2中检测的是人肝细胞l02；对比例3中检测的是人乳腺上皮细胞mcf-10a。
[0063]
图1为本发明dna纳米球探针检测端粒酶活性原理示意图；具体为在端粒酶的作用下，端粒酶识别序列延伸出ttaggg重复序列，得到产物链d-stp，与部分互补的另外两个单链探针组装。y形dna以黏性端部连接形成单体，然后依次放大排列。所得dna纳米球显示稳定且单分散的球形结构，具有纳米级精度。在多分子插入2p-dna ns螺旋中后，溶液中游离的sg极为少量，无法诱导金纳米粒子聚集，金纳米粒子保持其分散的红色。在不存在端粒酶
的情况下，端粒酶延长的反应不会被激活，因此单链探针a和单链探针b在反应系统中保持完整的单链。金纳米粒子将经历sybr greenⅰ诱导的静电吸附而发生聚集，这会导致红色到蓝色的快速变化，因此，不需要任何复杂的仪器，就可以用肉眼轻松地通过组装的dna纳米球快速检测端粒酶活性。
[0064]
图2为实施例1制备的dna纳米球的原子力显微镜图，从图2的原子力显微镜分析，进一步证实，该分析表明自组装的dna纳米球是离散的纳米级球形结构，直径为80～95nm。
[0065]
图3本发明的应用实施例1采用dna纳米球探针检测hela细胞数的紫外
‑ꢀ
可见吸收光谱图；如图3所示，随着hela细胞数从30个增加到3600个，680nm 处的吸收峰显著减小，520nm处的宽吸收峰缓慢增大。当细胞数量超过3600个时，反应是饱和的。吸光度比(a520/a680)用于定量hela细胞数(图3b)，显示吸光度比与hela细胞数之间具有良好的线性相关性(r2＝0.9912)，检测范围从30到2400hela细胞。线性方程为a520/a680＝0.00146
×
c+0.98233。其中c是hela细胞个数。从基线速率的标准偏差的三倍确定了4个hela细胞的检测限。随着hela细胞数从30个增加到3600个，样品颜色从蓝色逐渐变为红色，与紫外结果对应，并且sg诱导的组装策略允许目视检测低至60个hela细胞。
[0066]
图4为本技术的应用实施例2～4和对比例1～3对端粒酶活性的检测数据图，分别用于检测人肝细胞l02，人乳腺上皮细胞mcf-10a，hela细胞，人肺癌细胞a549和人乳腺癌细胞mcf-7和人乳腺癌细胞mcf-7mda-mb-231的端粒酶活性。结果表明，dna纳米球探针测定法对在这些正常或癌细胞系中，端粒酶的表达水平不同，且dna纳米球探针检测癌症细胞的信号要远强于正常细胞。
[0067]
从照片和数据上看，人乳腺上皮细胞mcf-10a、轻度恶性肿瘤mcf-7和恶性乳腺癌mda-mb-231显示出明显的差异。在mcf-10a细胞中观察到的吸光度信号类似于对比例1。用mcf-7细胞处理的dna纳米球系统证明a520/a680 比率比mcf-10a细胞增加了4.1倍，表明端粒酶的表达水平更高。mda-mb-231 细胞表现出更高的a520/a680比和鲜红色，表明mda-mb-231细胞具有比 mcf-7细胞更高的端粒酶活性。结果证明了dna纳米球系统在多种乳腺癌表型诊断中的可行性。
[0068]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。