一种
β-葡萄糖苷酶荧光底物cfmu-glu及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶荧光底物cfmu-glu及其制备方法和应用。
背景技术：
2.肠球菌是一种能够适应多种恶劣环境条件的革兰氏阳性、兼性厌氧菌。它是一种条件致病菌，在一定条件下可导致多种严重的人类疾病，例如尿路、腹腔内、盆腔和软组织感染，菌血症，感染性心内膜炎以及牙髓感染等。近些年来，肠球菌已成为医疗相关感染的第二大致病菌；其中，原被称为粪链球菌的粪肠球菌导致了大多数的肠球菌感染。因此，检测肠球菌尤其是粪肠球菌具有重要意义。
3.酶可作为检测目标菌的重要生物标记物或指示物。利用酶探针检测酶活性以检测目标菌的方法已引起了人们广泛的关注。其中，显色底物和荧光底物通常是最广泛应用的两类酶探针。已有研究表明荧光底物能给出比显色底物更高的检测灵敏度。目前，已被报道应用于检测肠球菌的荧光底物一般是4-甲基伞形酮基-β-d-葡萄糖苷(mu-glu)。然而，由于mu-glu产生的荧光物4-甲基伞形酮(mu)具有较高的酸度系数(pka)值(约7.8)，在生理ph值条件下只是部分离子化而导致产生的荧光信号强度会显著减弱，致使检测灵敏度降低；若加碱调高ph值，则会导致酶与底物的反应淬灭，从而不利于持续可视化监测、或者不利于获得更低的检测限。
4.在检测肠球菌时，仅仅依靠β-葡萄糖苷酶探针，是难以获得高的检测特异性的。尽管结合选择性培养基是一种有效策略，但如何获得高的检测特异性和高的检测灵敏度，却是有待解决的。另外，在使用液体培养基培养细菌时，通常采取的是用试管装入较多的单倍料液体培养基和加入相对少量的待测样液，这种做法存在的不足包括：试剂耗用量和占用空间都较大，不便于大批量样品检测等。
技术实现要素：
5.本发明的目的在于提供一种β-葡萄糖苷酶荧光底物cfmu-glu及其制备方法，和cfmu-glu在制备检测肠球菌的检测试剂或检测试剂盒中的应用，以及提供一种应用cfmu-glu的肠球菌检测方法，以实现肠球菌的特异、灵敏和快速检测。
6.本发明通过以下技术方案来实现：
7.本发明的第一个目的是提供一种β-葡萄糖苷酶荧光底物cfmu-glu，其结构式如式(i)所示：
[0008][0009]
本发明的第二个目的是提供一种上述β-葡萄糖苷酶荧光底物cfmu-glu的制备方法，包括以下步骤：
[0010]
(1)向4-氯间苯二酚与三氟乙酰乙酸乙酯的混合物中加入甲烷磺酸，室温或加热下搅拌反应一段时间，然后加入冰冷水搅拌，过滤，热水洗涤，将所得固体用等体积比的乙醇-水混合液进行重结晶，得到白色结晶体目标产物cfmu；
[0011]
(2)向上述所得目标产物cfmu与碳酸铯的混合物中加入乙腈，室温下搅拌，加入四乙酰溴代-α-d-葡萄糖，于室温下继续搅拌反应，旋蒸去除溶剂，加入二氯甲烷提取，依次用稀氢氧化钠溶液、水、饱和食盐水洗涤，分液，用无水硫酸钠干燥有机相，旋蒸去除溶剂，将所得固体用等体积比的乙醇-水混合液热浸泡，冷却后过滤，得到白色固体目标物acfmu-glu；
[0012]
(3)向acfmu-glu的无水甲醇悬浊液中加入催化量的氢氧化钾-甲醇溶液，室温下搅拌反应，然后旋蒸浓缩，过滤，用冷甲醇洗涤，即可得到白色固体目标荧光底物cfmu-glu。
[0013]
进一步地，步骤(1)中，所述的4-氯间苯二酚与三氟乙酰乙酸乙酯的摩尔比为1:1；所述的甲烷磺酸体积用量相对于4-氯间苯二酚质量为3～15ml/g。
[0014]
步骤(2)中，所述的cfmu、碳酸铯和四乙酰溴代-α-d-葡萄糖的摩尔比为1.0:(1.1～2.5):(1.0～2.0)。
[0015]
步骤(3)中，所述的acfmu-glu和氢氧化钾的摩尔比为1.0:(0.1～0.2)。
[0016]
步骤(1)中，所述的反应一段时间即为反应≤16h；步骤(2)中，所述的于室温下继续搅拌反应的反应时间为3h；步骤(3)中，所述的室温下搅拌反应的反应时间为1h。
[0017]
本发明的第三个目的是提供上述的β-葡萄糖苷酶荧光底物cfmu-glu在制备检测肠球菌的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
[0018]
本发明的第四个目的是提供一种检测肠球菌的检测试剂或检测试剂盒，该检测试剂或检测试剂盒含有上述的β-葡萄糖苷酶荧光底物cfmu-glu。
[0019]
本发明的第五个目的是提供一种用于检测肠球菌的选择性荧光肉汤培养基，该培养基含有50～400μmβ-葡萄糖苷酶荧光底物cfmu-glu、10～150万iu/l多粘菌素b、0.2～0.5g/l叠氮化钠和1～20g/l柠檬酸钠。
[0020]
本发明的第六个目的是提供一种应用β-葡萄糖苷酶荧光底物cfmu-glu的肠球菌检测方法，将β-葡萄糖苷酶荧光底物cfmu-glu与至少包含多粘菌素b、叠氮化钠以及柠檬酸钠在内、但不含红四氮唑的物质配伍成选择性荧光肉汤培养基以用于检测肠球菌。
[0021]
所述检测时β-葡萄糖苷酶荧光底物cfmu-glu、多粘菌素b、叠氮化钠、柠檬酸钠在含待测样品的共孵育体系中的终浓度范围分别为50～400μm、10～150万iu/l、0.2～0.5g/l、1～20g/l。
[0022]
所述检测时将上述选择性荧光肉汤培养基置于最大容积超过1ml的小型离心管或
多孔板中并在振荡培养下进行。
[0023]
所述检测时采取将双倍料的上述选择性荧光肉汤培养基与待测样液以等体积比混合。
[0024]
本发明的有益效果：
[0025]
(1)所述荧光底物cfmu-glu的合成方法简单，该荧光底物释放的荧光团具有较低的pka值，在中性、偏酸性条件下被目标酶水解后能够产生相对较强的荧光信号，便于持续可视化监测或获得更低的检测限；
[0026]
(2)所述选择性荧光肉汤培养基对肠球菌或粪肠球菌具有高的检测特异性和灵敏度；
[0027]
(3)所述检测方法比较节省试剂和节省占用空间，也便于操作。
附图说明
[0028]
图1为β-葡萄糖苷酶荧光底物cfmu-glu的合成路线。
[0029]
图2为荧光团cfmu(10μm)在不同ph值pbs(0.1m，0.1％dmso)中的紫外-可见(uv-vis)吸收光谱。
[0030]
图3为粪肠球菌在不同ph值下对荧光底物cfmu-glu的水解作用表现(虚线、实线分别表示有、无目标菌的情况)。
[0031]
图4为有无多粘菌素b对本发明的选择性荧光肉汤培养基检测影响。图中，1表示不含菌的空白对照，2至11依次为(2)粪肠球菌atcc 29212、(3)阪崎肠杆菌atcc 29544、(4)肺炎克雷伯氏菌cmcc 46117、(5)大肠杆菌atcc 25922、(6)产气肠杆菌cmcc 45103、(7)弗氏柠檬酸杆菌atcc 43864、(8)粘质沙雷氏菌atcc 8100、(9)溶藻弧菌atcc 33787、(10)蜡样芽胞杆菌atcc 14579、(11)金黄色葡萄球菌atcc 29213。
[0032]
图5为传统的catc肉汤培养基和肠球菌肉汤培养基对粪肠球菌和非粪肠球菌背景菌的检测效果。上为传统的catc肉汤培养基，下为传统的肠球菌肉汤培养基。图中，从左至右，第1管表示不含菌的空白对照，第2至第11管依次为(2)粪肠球菌atcc 29212、(3)阪崎肠杆菌atcc 29544、(4)肺炎克雷伯氏菌cmcc 46117、(5)大肠杆菌atcc 25922、(6)产气肠杆菌cmcc 45103、(7)弗氏柠檬酸杆菌atcc 43864、(8)粘质沙雷氏菌atcc 8100、(9)溶藻弧菌atcc 33787、(10)蜡样芽胞杆菌atcc 14579、(11)金黄色葡萄球菌atcc 29213。
[0033]
图6为不同选择性肉汤对不同浓度粪肠球菌的可视化检测效果。图中，a为本发明选择性荧光肉汤培养基，b为传统catc肉汤培养基，c(c1和c1)为传统肠球菌肉汤培养基。自左向右，a、b和c(c1和c1)中第1至第12管依次为(1)1
×
108cfu/ml、(2)5
×
107cfu/ml、(3)2.5
×
107cfu/ml、(4)1
×
107cfu/ml、(5)5
×
106cfu/ml、(6)2.5
×
106cfu/ml、(7)1
×
106cfu/ml、(8)5
×
105cfu/ml、(9)2.5
×
105cfu/ml、(10)1
×
105cfu/ml、(11)5
×
104cfu/ml、(12)不含菌的空白对照；a中最后边管(第13管)为不含cfmu-glu的空白对照。c1和c2分别表示在可见光、365nm紫外光下观察结果。
[0034]
图7为使用荧光酶标仪测定的粪肠球菌定量检测标准曲线及其方程。
具体实施方式
[0035]
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。c17h15
clf3o8:471.03004；found,471.03073.
[0047]
实施例2荧光团cfmu酸度系数(pka)测定
[0048]
荧光团cfmu(10μm)在不同ph值pbs(0.1m，0.1％dmso)中的紫外-可见(uv-vis)吸收光谱如图2所示。采用单波长分光光度法(a
370 nm
)并按照公式pka＝ph-lg[(a-a
hb
)/(a
b-a)]求解(a
hb
和ab分别表示cfmu完全以分子型、离子型存在时的吸光度；选择三个ph在pka附近的溶液，分别测定其吸光度，即为a)。由图2结果可知a
hb
和ab分别可等于ph值2.50～3.00、8.00～9.00时的吸光度)，分别测定ph值为5.00、5.50、6.00溶液的吸光度，按照上述公式计算得到ph值为5.00、5.50、6.00时的pka值分别为5.62
±
0.01(n＝4)、5.60
±
0.01(n＝4)、5.62
±
0.02(n＝4)，平均值为5.61
±
0.01，由此可见，cfmu的pka值是较低的。
[0049]
实施例3粪肠球菌在不同ph值下对荧光底物cfmu-glu的水解作用表现
[0050]
在黑底96孔板中加入已过滤除菌、含荧光底物cfmu-glu(50μm)的不同ph值pbs(0.1m；0.1％dmso；每孔200μl)，再分别加入粪肠球菌(atcc 29212)生理盐水悬浊液(麦氏浓度mcf为5.0；每孔20μl)、无菌生理盐水(每孔20μl；作为空白对照)，然后将96孔板置于37℃200rpm振荡培养2.5h，紧接着用荧光酶标仪测定(λ
ex
＝387nm，λ
em
＝500nm)。其结果如图3所示，由图3可知粪肠球菌在中性和微酸性条件下对荧光底物cfmu-glu的水解作用效果最佳。因此，采用基于较低pka值荧光团的荧光底物在中性或微酸性条件下检测肠球菌或粪肠球菌是有利的。
[0051]
实施例4多粘菌素b对应用荧光底物cfmu-glu检测粪肠球菌的影响
[0052]
以不含琼脂和红四氮唑(ttc)的柠檬酸盐叠氮化物吐温碳酸盐(catc)液体选择性培养基作为基础培养基，加入多粘菌素b和荧光底物cfmu-glu制成选择性荧光肉汤培养基，选择性荧光肉汤培养基(单倍料)具体组成为：每1升水中含胰蛋白胨15.0g/l,酵母提取粉5.0g/l,kh2po
4 5.0g/l,柠檬酸钠15.0g/l,吐温80 1.0g/l,na2co
3 2.0g/l,nan30.4g/l,多粘菌素b 30万iu/l,cfmu-glu 0.25mm(ph 7.0)，配制方法为：将上述物质溶于水，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。对比培养基有：无多粘菌素b的选择性荧光肉汤培养基(与选择性荧光肉汤培养基(单倍料)的区别在于不含多粘菌素b，其余组成不变)、不含琼脂但含ttc的catc肉汤培养基(catc肉汤(单倍料))，其具体组成为：每1升水中含胰蛋白胨15.0g/l,酵母提取粉5.0g/l,kh2po
4 5.0g/l,柠檬酸钠15.0g/l,吐温80 1.0g/l,na2co
3 2.0g/l,nan
3 0.4g/l,ttc 0.1g/l(ph 7.0)，配制方法为：将上述物质溶于水，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得，以及常用肠球菌肉汤培养基(购自于广东环凯微生物科技有限公司，货号为028960)。
[0053]
使用上述的四种培养基分别对粪肠球菌、非粪肠球菌细菌进行检测，具体为：
[0054]
将0.1ml无菌生理盐水或含菌生理盐水稀释液(非粪肠球菌细菌浓度为1
×
108cfu/ml，粪肠球菌浓度为1
×
106cfu/ml)与0.1ml双倍料选择性荧光肉汤培养基(双倍料情况下，cfmu-glu浓度为0.5mm，多粘菌素b存在时其浓度为60万iu/l)或双倍料无多粘菌素b的选择性荧光肉汤培养基(与双倍料选择性荧光肉汤培养基比较，不含多粘菌素b，其余成分不变)或双倍料catc肉汤培养基或双倍料肠球菌肉汤培养基混合于无菌的1.5ml离心管(或1.2ml圆孔96孔透明圆底深孔板)中(双倍料培养基中各成分浓度均为单倍料培养基中各成分浓度的2倍)，然后将离心管封盖(或用耐高温封膜密封多孔板)并置于37℃200rpm下振荡培养4h，紧接着于100℃下加热2min淬灭反应，冷却后用荧光酶标仪测定荧光(λ
ex
＝
387nm，λ
em
＝500nm)。结果见图4和图5。
[0055]
由图4可知，无多粘菌素b时，选择性荧光肉汤培养基的检测特异性会大大降低；而含有多粘菌素b时，本发明的肠球菌选择性荧光肉汤对受试背景菌均无假阳性反应，不仅检测特异性大幅提高，而且检测目标菌的荧光信号强度也显著提高。
[0056]
由图5可知，传统的catc肉汤培养基与肠球菌肉汤培养基对受试背景菌均存在一定的假阳性。对比图4和图5结果可知，在检测特异性上，本发明的肠球菌选择性荧光肉汤要高于上述两种传统的肠球菌培养基。
[0057]
实施例5本发明的选择性荧光肉汤可视化检测灵敏度
[0058]
将0.1ml无菌生理盐水或含粪肠球菌atcc 29212生理盐水稀释液分别与0.1ml双倍料的(a)本发明选择性荧光肉汤培养基、(b)传统catc肉汤培养基和(c)传统肠球菌肉汤培养基混合于无菌的1.5ml离心管(或1.2ml圆孔96孔透明圆底深孔板)中，然后将离心管封盖(或用耐高温封膜密封多孔板)并置于37℃200rpm下振荡培养4h，紧接着于100℃下加热2min淬灭反应(为更好地拍照和观察结果，深孔板中已淬灭的检测液转移至离心管中)。结果见图6。
[0059]
由图6可知，在4h快速检测情况下，本发明的选择性荧光肉汤培养基荧光可视化检测粪肠球菌的最低浓度可低至1
×
105cfu/ml，而传统的catc肉汤培养基与肠球菌肉汤培养基可视化检测粪肠球菌的最低浓度仅仅可低至2.5
×
106cfu/ml。由此可见，本发明的肠球菌选择性荧光肉汤培养基具有高的可视化检测灵敏度。
[0060]
实施例6本发明的肠球菌选择性荧光肉汤对人工污染实际样品的检测效果
[0061]
1、实际样品中粪肠球菌的检测回收率
[0062]
根据实施例5中用本发明肠球菌选择性荧光肉汤培养基对不同浓度粪肠球菌atcc 29212的荧光检测值，建立了如图7所示的标准曲线及其方程。
[0063]
取1ml待测样液置于1.5ml离心管中，4℃下10000
×
g离心5min，弃掉上清液，用无菌生理盐水洗涤并再离心和弃上清，最终剩余至0.1ml(对于奶样，每次离心10min，弃掉上清液和脂肪层，用无菌生理盐水洗涤和离心后，再重复一次洗涤和离心)，加入0.1ml双倍料本发明选择性荧光肉汤培养基，将离心管封盖并置于37℃200rpm下振荡培养4h，紧接着于100℃下加热2min淬灭反应。然后，用荧光酶标仪测定，将测得的荧光检测值代入标准方程，求得实际样品中粪肠球菌的检测回收率。结果见表1。
[0064]
表1.实际样品中粪肠球菌的检测回收率(n＝3)
[0065]
[0066][0067]
如表1所示，应用本发明的肠球菌选择性荧光肉汤培养基和操作方法，对人工污染实际样品瓶装矿泉水、王老吉凉茶、纯牛奶中粪肠球菌的检测回收率为99.21％～111.09％，相对标准偏差为3.59％～4.98％，这表明本发明的检测方法回收率和稳定性良好。
[0068]
2、实际样品中低浓度粪肠球菌的检测
[0069]
取1ml待测样液置于1.5ml离心管中，4℃下10000
×
g离心5min，弃掉上清液，用无菌生理盐水洗涤并再离心和弃上清，最终剩余至0.1ml(对于奶样，每次离心10min，弃掉上清液和脂肪层，用无菌生理盐水洗涤和离心后，再重复一次洗涤和离心)，加入0.1ml双倍料本发明选择性荧光肉汤培养基，然后将离心管封盖并置于37℃200rpm下振荡培养至一定时间，紧接着于100℃下加热2min淬灭反应。然后，用荧光酶标仪测定，结果见表2。
[0070]
表2.实际样品中低浓度粪肠球菌的检测(n＝3)
[0071][0072]
如表2所示，应用本发明的肠球菌选择性荧光肉汤培养基和操作方法，在用离心管处理样品后，便可直接将所用的离心管用于进一步的孵育和可视化检测，从而尽量减少或避免再从离心管转移样品操作造成的低浓度目标菌损失。对人工污染实际样品瓶装矿泉水、王老吉凉茶、纯牛奶中低浓度8cfu/ml粪肠球菌的检测用时可短至10h。由此可见，本发明的检测方法具有灵敏、操作简单、可节省试剂和占用空间等优点。
[0073]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。