一种猪链球菌重组蛋白抗原pul及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种猪链球菌重组蛋白抗原pul及其应用。


背景技术：

2.猪链球菌是一种具有荚膜的革兰氏阳性椭球菌，其自然定植部位位于猪的上呼吸道，特别是鼻腔和扁桃体，亦包括消化道和生殖道，属于条件性致病菌。感染猪、康复猪或健康猪均可携带病原体。病原可通过口、鼻和伤口传染，常引起断奶仔猪或育肥猪呼吸困难、发绀或消减等症状，病程发展严重后，以脑膜炎、肺炎、关节炎、败血症等为主要的临床特征，给全世界的养猪业造成了巨大的经济损失。猪链球菌也能通过伤口或消化道感染人，导致脑膜炎、心内膜炎、化脓性关节炎或中毒性休克综合症等，危害公共健康。
3.apua是锚定在猪链球菌细胞壁外的唯一的双功能淀粉酶(amylopullulanase)，具有切割α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键的双重活性，可水解胞外α-葡聚糖，为猪链球菌提供葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖等麦芽糊精等碳水化合物。apua由猪链球菌的apua基因编码，含有2094个氨基酸(aa)，分子量大小约为230kda。其蛋白质n端有典型的α-淀粉酶结构域，可识别并切割α-1,4-糖苷键；中段有普鲁兰酶结构域，可识别并切割α-1,6-糖苷键；蛋白质c端具有保守的lpntg基序，为细胞壁锚定序列。实验表明，apua可促进猪链球菌对人喉癌上皮细胞(hep-2)、猪气管上皮细胞(nptr)和粘膜的粘附作用(ferrando et al,microbiology,2010)，是猪链球菌重要的粘附素之一(marielaet al,febs letters,2016)。apua可与人补体蛋白c3b相互作用，干扰宿主补体系统的功能从而抑制宿主对病原菌的清除，实现免疫逃逸。在本技术发明人的研究中，发现apua也是猪链球菌的重要毒力因子，缺失apua基因的猪链球菌2型菌株，对小鼠脑部、肺部的组织病理损伤情况较野生株明显减轻(一株2型猪链球菌apua基因敲除突变株及其应用，专利申请号：201910227948.3)。
4.apua介导猪链球菌粘附和侵入宿主、帮助细菌在体内获取碳水化合物，以及作为免疫逃逸因子、毒力因子的作用机理，有待深入研究。apua作为锚定在猪链球菌细胞壁外的功能性蛋白，也是亚单位疫苗候选蛋白之一。此外，作为少有的双功能淀粉酶，apua在酶学方面的功能和应用潜力也值得深入发掘。因此，制备apua蛋白的抗体意义重大，不仅可为apua在细菌致病性机制方面的功能研究提供支撑，同时也为开发apua蛋白质的酶活功能、研发亚单位疫苗奠定基础。然而，apua基因有6285个碱基对(bp)，序列长度过长，比pet系列表达质粒长约900bp左右。因此，若想用apua全长蛋白来免疫动物获得抗体，在构建表达质粒、诱导蛋白表达和纯化的过程中，必须面对基因片段过长导致的pcr扩增条件高、载体构建效率低、蛋白质纯度不高等问题，耗时费力，增加成本；针对apua设计的多肽抗原特异好，但多肽抗原制备的多克隆抗体，主要应用于elisa和western blot，在识别蛋白质的天然结构方面，效果通常不太理想，不适用于下游多种分子技术应用。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种猪链球菌重组蛋白抗原pul及其应
用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
6.本发明根据重组蛋白抗原易于表达纯化、所产生的的抗体易识别天然蛋白等优点，设计、实施并选择针对apua蛋白的重组蛋白抗原，以期解决上述难点问题。
7.本发明是这样实现的，一种猪链球菌重组蛋白抗原pul，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
8.本发明还提供了如上述的猪链球菌重组蛋白抗原pul在制备多克隆抗体中的应用。
9.本发明还提供了如上述的猪链球菌重组蛋白抗原pul在制备能够识别天然apua结构的试剂中的应用。
10.本发明还提供了如上述的猪链球菌重组蛋白抗原pul在制备用于检测apua蛋白的elisa、westernblot、免疫荧光检测试剂中的应用。
11.进一步地，首先利用猪链球菌重组蛋白抗原pul作为抗原制备抗体，将所获得的抗体用于elisa、western blot、免疫荧光检测试剂。
12.进一步地，所获得的抗体为多克隆抗体。
13.本发明还提供了如上述的多克隆抗体在制备用于检测apua蛋白的elisa、western blot、免疫荧光检测试剂中的应用。
14.用于扩增如上述的猪链球菌重组蛋白抗原pul的引物序列如seq id no.2和seq id no.3所示。
15.本发明通过以下技术方案实现：
16.一、重组蛋白抗原的预测与获得
17.利用生物信息学方法对猪链球菌apua蛋白质的氨基酸序列进行分析，预测抗原表位，选择评分较高的4个片段作为免疫原，设计特异性引物，pcr扩增目的条带，构建表达载体，诱导4种重组蛋白表达并进行纯化。
18.二、制备多克隆抗体
19.用4种重组蛋白抗原分别免疫spf级昆明小鼠，免疫程序包括初次免疫和二次加强免疫。通过眼眶采血的方法，获取免疫小鼠和阴性小鼠的全血，制备血清并进行纯化。
20.三、比较重组蛋白抗原的免疫原性
21.通过elisa的方法，检测4种多克隆抗体对全长apua蛋白的灵敏度。根据蛋白质纯化效果、elisa效价检测结果，最终选择885-1262aa的片段(pro1)作为最佳重组蛋白免疫原，命名为pul。
22.四、对抗体的进一步检测
23.用westernblot进一步确定重组蛋白抗原pul的多克隆抗体是否能识别全长apua和重组蛋白pul，并用免疫荧光试验检测该抗体是否能识别天然apua结构、是否能实现apua在菌体上的定位、是否能对猪链球菌进行标记。试验结果表明，本发明中用重组蛋白pul制备的多克隆抗体，可用于全长apua蛋白或包含这一区域的重组蛋白的westernbolt鉴定，可用于apua或猪链球菌标记等免疫荧光试验。
24.综上所述，本发明的优点及积极效果为：
25.(1)本发明通过对猪链球菌apua蛋白质氨基酸序列的二级结构、亲疏水性和抗原表位等进行分析，并通过试验筛选出的重组蛋白抗原pul具有易获得、成本低、纯度高、疫原
性佳、抗体能够识别apua天然结构等特点。
26.(2)依据本发明提供的猪链球菌重组蛋白抗原pul所制备的多克隆抗体，可用于elisa、western blot和免疫荧光等生物学实验，为进一步研究猪链球菌apua蛋白在粘附宿主、致病、免疫逃逸、酶活等方面的功能提供了技术支撑，也为研发apua蛋白的亚单位疫苗奠定基础。
27.(3)依据本发明提供的猪链球菌重组蛋白抗原pul所制备的多克隆抗体，可用于识别猪链球菌菌体等相关的生物学试验中。
28.(4)依据依据本发明提供的猪链球菌重组蛋白抗原pul所制备的多克隆抗体，对猪链球菌apua蛋白没有特异性，可能也适用于检测各细菌种属中同源型较高的普鲁兰酶，特别是猪链球菌和其他链球菌属。
附图说明
29.图1是apua蛋白二级结构、亲疏水性及抗原性的分析结果；
30.图2是sds-page检测纯化后的重组蛋白；
31.图3是sds-page检测纯化后的apua蛋白；
32.图4是westernblot检测结果；
33.图5是激光共聚焦显微镜观察免疫荧光结果(200倍)；
34.图6是阴性对照(200倍)；
35.图7是n-sim观察免疫荧光结果(白色标尺：2μm)。
具体实施方式
36.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
37.根据本技术包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
38.为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本技术中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
39.本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
40.本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。
41.本发明披露了一种猪链球菌重组蛋白抗原pul及其应用。除特殊说明外，分子生物实验的具体操作采用本领域的常规技术手段进行。
42.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
43.实施例1猪链球菌apua重组蛋白抗原的设计与获得
44.1.获取genbank数据库中猪链球菌2型apua蛋白的氨基酸序列(登录号：caz52647.1)及相关信息，该蛋白长度为2094个氨基酸残基，其编码基因长度为6285个碱基对。
45.2.用iedb软件对apua蛋白的氨基酸序列进行二级结构、亲疏水性和抗原性等分析，选择4个综合评价较高的区域片段(图1)，分别命名为：pro1、pro2、pro3和pro4，其详细信息如表1所示。
46.表1经预测的4个重组蛋白的信息
47.重组蛋白名称氨基酸区域编码序列区域氨基酸序列长度预测重组蛋白质量pro1885-1262aa2653-3786bp378aa42kdapro2338-571aa1012-1713bp234aa26kdapro3728-870aa2182-2610bp143aa16kdapro41583-1922aa4747-5766bp340aa38kda
48.3.根据重组蛋白抗原对应的基因编码序列区域，设计4对扩增引物(表2；tm值均为56℃)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
49.表2引物
[0050][0051]
4.准备猪链球菌2型sc19菌株的新鲜菌液，用omega bio-tek公司的的bacterial dna kit，按照说明书步骤提取细菌基因组。以sc19基因组为模板，根据表2中的4对引物，pcr扩增4个重组蛋白的相应的基因编码区域，pcr扩增配制体系见表3。pcr反应条件为：95℃预变性5min；95℃30sec，56℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃延伸5min。所得pcr产物经1％琼脂糖电泳检测后，用gel extraction kit(trans)回收扩增产物，方法参照说明书。
[0052]
注：猪链球菌sc19是猪链球菌2型强毒株，于2005年分离自四川省ss2疫区的感染猪，已有多篇相关研究文献发表(tan mf et al.,2017,microbiologyopen；tan mf et al.,2015,plos one；zhang tf et al.,2016,scientific reports等)。
[0053]
表3 pcr扩增体系配置表(50μl)
[0054]
试剂名称加样体积2
×
taq pcr buffer(mg2+plus)25.0μldntp mixture(2.50mm each)4.0μl上游引物(10.00μm)1.0μl下游引物(10.00μm)1.0μl
dna模板2.0μltaq dna polymerase(5u/μl)0.5μlddh2o16.5μl
[0055]
5.用ecori和xhoi对pcr产物和pet-28a质粒分别进行双酶切，酶切体系和条件参照takara限制性内切酶使用说明书。酶切后的pcr产物经gel extraction kit回收后，使用takara t4 dna ligase连接至pet-28a载体上，然后转入在大肠杆菌dh5α菌株中并进行鉴定。阳性重组质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
[0056]
6.将鉴定过的阳性重组质粒转化至bl21(de3)大肠杆菌感受态中。挑取阳性菌落转接至5ml lb液体培养基中，加入卡那霉素(终浓度50μg/ml)，37℃震荡培养过夜。然后将菌液1:100转接至100ml lb液体培养基中，加入卡那霉素，37℃震荡培养至od600约为0.6-0.8时，加入100μl 10.0mg/ml的iptg。将菌液分为两组，一组在37℃震荡培养4h，另一组在18℃震荡培养过夜。分别收集两组菌体，用高压破碎仪裂解细菌后，将全菌蛋白、上清和沉淀等进行sds-page电泳检测。结果显示，4个重组蛋白在18℃和37℃条件下都能可溶性表达。
[0057]
7.按照ni-nta purification system(invitrogen)说明书中的可溶性蛋白纯化方案，分别对4个重组蛋白进行大量纯化。收集蛋白样品，进行sds-page检测。结果如图2所示，纯化后的pro1、pro3蛋白条带清晰、无杂带；pro2和pro4蛋白质条带清晰，但均含有杂带。4个重组蛋白纯化后的纯净度顺序为：pro1＝pro3＞pro4＞pro2。
[0058]
8.作为对照，也将全长apua蛋白进行载体构建、诱导表达和纯化，引物和操作步骤参考朱嘉琪硕士毕业论文“猪链球菌表面蛋白apua与c3b相互作用逃逸补体监视的机制(2018)”进行。因apua全长基因过长，需要使用primerstar hs dna polymerase完成pcr扩增，费用昂贵；将酶切后的基因片段克隆至表达载体的过程中，阳性克隆检出率低；通过测序来检测扩增产物的正确性时，需要专门设计引物，才能对克隆的基因片段完成测序。另外对纯化的apua进行sds-page检测，结果见图3，可见纯化后的apua分子量与预测结果(230kda)有差异，且蛋白杂带较多，纯度较低。
[0059]
实施例2鼠源多克隆抗体的制备
[0060]
1.弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自sigma公司。实验动物为25只6周龄的雌性spf级昆明小鼠，随机分为5组，每组5只。取1组未经免疫的小鼠全血，制备阴性血清；另外4组小鼠用于制备4种多克隆抗体。
[0061]
2.初次免疫：用pbs将4种重组蛋白分别稀释到300μg/ml，每种蛋白取出1.5ml与1.5ml弗氏完全佐剂按1:1混合，充分乳化。每只小鼠皮下多点注射300μl抗原，即每只小鼠免疫45μg蛋白质。
[0062]
3.第一次加强免疫：初次免疫14天后，用pbs将重组蛋白稀释到300μg/ml，取出1.5ml与1.5ml弗氏不完全佐剂按1:1混合，充分乳化。每只小鼠皮下多点注射300μl抗原，即每只小鼠免疫45μg蛋白质。
[0063]
4.第二次加强免疫：第一次加强免疫14天后，每只小鼠腹腔注射200μg不加佐剂的蛋白质溶液。
[0064]
5.第二次加强免疫7天后，对小鼠眼眶采血并分离阳性血清。
[0065]
6.使用protein a亲和层析填料(merck millipore)，根据说明书提供的步骤将小
rad western blot半干转膜仪，通过半干转的方法进行蛋白转印操作。
[0085]
3.漂洗：将电转后的pvdf膜用tbs-t缓冲液(0.01m tbs，ph7.5)漂洗3次，每次5分钟。
[0086]
4.封闭：按0.1-0.15ml/cm2的pvdf膜面积加入封闭液(含5％脱脂奶粉的tbs-t缓冲液)，4℃静置过夜。
[0087]
5.一抗孵育：用tbs-t缓冲液将纯化后的pul抗体阳性血清稀释1000倍，按0.1-0.15ml/cm2的pvdf膜面积加入，37℃摇动孵育2小时。
[0088]
6.漂洗：将一抗孵育后的pvdf膜用tbs-t缓冲液漂洗4-6次，每次5分钟。
[0089]
7.二抗孵育：加入10ml用tbs-t缓冲液5000倍稀释的羊抗小鼠igg/hrp，37℃摇动孵育1小时。
[0090]
8.漂洗：将二抗孵育后的pvdf膜用tbs-t缓冲液漂洗4-6次，每次5分钟。
[0091]
9.显色：用bio-rad ecl显色试剂盒对pvdf膜进行显色，对结果进行拍照。
[0092]
实验结果如图4所示，apua蛋白和pul蛋白的检测条带清晰明确，说明本发明中用重组蛋白pul制备的多克隆抗体，可用于全长apua蛋白或包含这一区域的重组蛋白的western bolt鉴定。
[0093]
实施例5免疫荧光鉴定
[0094]
apua是猪链球菌细胞外壁锚定的蛋白质。为了鉴定用pul重组蛋白抗原制备的小鼠多克隆抗体，是否能用于apua在猪链球菌菌体上的定位，或者该抗体是否能识别天然apua结构，从而进行猪链球菌的免疫荧光实验：
[0095]
1.菌体制备：将猪链球菌2型sc19菌株培养至对数生长期(od600值约为0.6)，用预冷的pbs重悬、洗涤菌体3次；将菌体用100％甲醛在-20℃条件下孵育20分钟，再用80％甲醛在28℃条件下孵育1小时；用80％甲醇清洗菌体1次后，用pbs清洗菌体。
[0096]
2.抗体孵育：在37℃条件下用5％bsa封闭菌体30分钟后，用纯化过的鼠抗pul阳性血清(1:100)孵育菌体，于37℃作用2小时；pbs清洗菌体，然后用羊抗小鼠igg h&l fttc荧光二抗(1:200)孵育菌体，于37℃作用1小时。另用小鼠阴性血清作为试验对照。
[0097]
3.制片：将清洗后的菌体转移至显微镜载玻片上，用融化冷却的1％琼脂糖凝胶覆盖，常温避光静置10分钟。
[0098]
4.用激光共聚焦显微镜(zeiss)观察菌体，阳性血清处理的菌体观察结果如图5所示，阴性血清处理的菌体观察结果如图6所示。进一步用尼康结构化照明超高分辨率显微成像系统(n-sim，nikon)观察菌体，结果如图7所示。结果表明，用pul重组蛋白抗原制备的小鼠多克隆抗体，适用于识别天然apua结构、实现apua在菌体上的定位、并且对猪链球菌进行标记，可用于apua或猪链球菌标记等免疫荧光试验。
[0099]
实施例6同源蛋白质说明
[0100]
pul属于apua蛋白的885-1262aa区域，该区域与apua蛋白普鲁兰酶结构域(921-1962aa)重叠长度为342aa。普鲁兰酶在细菌中广泛存在，或定位于胞内，或定位于胞壁外。因此本发明中由pul制备的多克隆抗体，对猪链球菌apua蛋白具有非特异性，可能也适用于检测各细菌种属中同源型较高的普鲁兰酶，特别是猪链球菌和其他链球菌属。
[0101]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。