1.本发明涉及生物工程技术领域，具体而言，本发明涉及利用多种酶从小麦中提取低聚肽的方法。


背景技术：

2.小麦低聚肽是从天然食品-小麦蛋白粉中提取的蛋白质，再经过定向酶切及特定小肽分离技术获得的小分子多肽物质。所述低聚肽可抑制胆固醇上升的作用。小麦低聚肽能促进胰岛素分泌作用，其功能物质是低聚蛋氨酸，可用于调节人的血糖，改善糖尿病症状。小麦肽能阻碍血管紧张素酶的作用，因而有降血压作用。小麦低聚肽的特点之一是含高谷酰胺，能够有效调节神经，也可作肠功能障碍时的特殊营养物质。具有ace抑制作用、免疫调节、抗氧化等多种生物活性，能够刺激机体淋巴细胞增殖，增强巨噬细胞吞噬功能，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率等。小麦低聚肽是小麦蛋白酶解产物，能抑制血管紧张素转化酶的活性，使血管紧张素原不能转变成能使血压升高的血管紧张素ⅱ，从而生理地降低血压，而对正常血压不起用。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种多酶协同法生产小麦低聚肽的方法，为达到上述目的，本技术采用下述技术方案：
4.一种多酶协同法生产小麦低聚肽的方法，其包括下述步骤：调浆、二次酶解、超滤、纳滤、干燥。
5.所述调浆步骤包括，在调配罐内加入调整ph值的纯水，从生产过程中分离的湿谷朊直接送入调配罐，边进料边搅拌，成乳浊液后，打入酶解罐中。
6.所述二次酶解步骤包括，接收调浆步骤中的的乳浊液，第一次酶解：边搅拌边加入复配后的1号酶液，在一定ph值和温度下水解；第二次酶解：边搅拌边加入2号复配酶液，在一定ph值和温度下水解。
7.所述1号酶液中的酶选自alcalase蛋白酶、中性蛋白酶as1398、动植物蛋白水解酶、中性蛋白酶nutrase、胃蛋白酶。
8.所述1号酶液中的酶选自alcalase蛋白酶。
9.第一次酶解的ph值为7-9，温度为40-60℃，水解时间为2-6小时。
10.所述2号酶液中的酶选自alcalase蛋白酶、中性蛋白酶as1398、动植物蛋白水解酶、中性蛋白酶nutrase、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶中的一种或多种。
11.第二次酶解的ph值为6-7，温度为40-50℃，水解时间为3-5小时。
附图说明
12.图1是酪氨酸浓度与吸光值关系的标准曲线图；
13.图2是甘氨酸溶液浓度与吸光值的关系标准曲线图；
14.图3是水解度(dh)与时间的关系曲线图；
15.图4(a)是ph与耗碱量的关系图；
16.图4(b)是酶浓度与耗碱量的关系图；
17.图4(c)是时间与耗碱量的关系图；
18.图4(d)是温度与耗碱量的关系图；
19.图5是电泳图谱。
实施例
20.下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
21.材料与方法：
22.小麦谷朊粉 本淀粉厂生产
23.碱性丝氨酸蛋白酶alcalaes蛋白酶 丹麦诺维信(中国)公司
24.碱性蛋白酶 海宁市金潮实业有限公司
25.胃蛋白酶 上海华舜生物工程有限公司
26.中性蛋白酶as1398 无锡酶制剂厂
27.中性蛋白酶nutrase 丹麦诺维信(中国)公司
28.动植物蛋白水解酶 广西南宁龙博生物工程有限公司
29.木瓜蛋白酶 北京生化制品有限公司
30.风味蛋白酶 吉宝(青岛)生物科技有限公司
31.盐酸、氢氧化钠、赖氨酸等均为市售分析纯级。
32.uv紫外分光光度计 北京瑞利分析仪器公司
33.日立835-50氨基酸自动分析仪 同济大学机电厂
34.101-2a数显式电热鼓风干燥箱 上海实验仪器有限公司
35.jj-1电动搅拌器 常州国华电器有限公司
36.精密ph计 上海雷磁仪器厂
37.恒温水浴锅 余姚市东方电工仪器厂
38.高速离心机 北京离心机厂
39.恒温干燥箱 上海奈斯特仪器厂
40.电子天平 上海梅特勒-托利多仪器厂
41.消化炉 上海纤检仪器有限公司
42.制备方法：
43.以小麦谷朊粉为原料，比较了6种蛋白酶对谷朊粉的水解程度，选择了碱性蛋白酶作为第一步酶解的用酶，确定了其最适水解条件和用量；并采用木瓜蛋白酶和风味蛋白酶进一步酶解。产物经离心、微滤、超滤、喷雾干燥，得到寡肽混合物。
44.选择了六种不同的蛋白酶进行水解。将谷朊粉配成5％的溶液，取100ml按2000u/g蛋白加入碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和动植物蛋白水解酶，按资料拟定各酶的适宜温度、ph值，水解5h后测定水解度和蛋白质转化率，比较各酶的水解能力，并测定了水解液
游离氨基酸的含量，综合以上指标，最后确定最佳的蛋白酶。
45.第一次酶解：根据预备实验及相关资料，对水解反应温度、ph值、酶用量、底物浓度四个因素进行l9(34)正交试验，见表1，根据水解度来确定最佳水解条件。
46.表1正交试验因素水平表
[0047][0048]
按照上表选择出的水解条件进行水解，选定不同水解时间，以水解度(茚三酮法)为指标来确定最佳水解时间。
[0049]
为了制备特殊氨基酸组成的高f值低聚肽，即芳香族氨基酸含量较低，而支链氨基酸含量较高的产品，因此，第二次酶解需用蛋白酶切下肽链末端的芳香族氨基酸，使芳香族氨基酸游离，并希望脱芳彻底。释放芳香族氨基酸的蛋白酶首选肌动蛋白酶，其次是木瓜蛋白酶，但是肌动蛋白酶价格昂贵，不适合工业化生产，故从实际生产角度考虑选用木瓜蛋白酶和风味蛋白酶进行酶解，添加风味蛋白酶，可以除去肽的苦味，同时使其水解度增加。影响酶解效果的主要因素有：ph(a)、酶用量[e]/[s]％(b)、时间(c)、温度(d)。采用正交试验法并以耗碱量为考查指标确定出最佳工艺条件，因素水平见表2。反应结束后，将ph调到2.8，酶解液加热至90℃，保温10min进行灭酶。然后迅速冷却至室温，将水解液离心15min(4000r/min)。
[0050]
表2复合酶水解工艺正交试验设计
[0051][0052]
水解度的测定采用茚三酮法和ph-stat法；氨基态氮的测定采用甲醛电位滴定法；支链氨基酸在220nm处有最大吸收峰，用紫外分光光度计进行检测；芳香族氨基酸在280nm处有最大吸收峰，用紫外分光光度计进行检测；氨基酸成分采用氨基酸自动分析仪；高f值低聚肽混合物分子量分布采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(sds-apge)电泳法；酶活力的测定采用福林—酚试剂法。
[0053]
蛋白质转化率的测定采用下述方法：
[0054]
根据mannheim介绍的方法，取水解、离心后得到的蛋白水解液10ml，加入10ml10％的三氯乙酸(tca)，混匀后静置30min，用离心机以4000r/min离心10min，取离心后的上清液5ml消化，消化后的溶液用100ml的容量瓶定容。最后用凯氏定氮法测定蛋白质含量。计算蛋白质转化率。
[0055]
计算公式：
[0056][0057]
x—蛋白质的转化率；
[0058]
p—酶解液中溶于10％tca；
[0059]
p0—未酶解液中溶于10％tca；
[0060]
s0—底物蛋白质的总氮含量。
[0061]
酪氨酸浓度与吸光值的关系如表3所示：
[0062]
表3酪氨酸浓度与吸光值的关系
[0063][0064]
以吸光值为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线如图1所示，a与c的关系为：c＝100.03a－1.0006(r2＝0.9988)。
[0065]
水解时间t＝10min时吸光值的测定结果及酶活力计算结果见表4。
[0066]
表4各种蛋白酶的活力
[0067][0068]
第一次酶解的条件的确定：
[0069]
水解度标准曲线绘制见表5和图2。
[0070]
表5甘氨酸溶液浓度与吸光值的关系
[0071][0072]
以吸光值为纵坐标，甘氨酸浓度为横坐标，制标准曲线，如图2。
[0073]
因甘氨酸的分子量为75.07，所以可以将其换算成-nh2基的μmol数：
[0074]
c＝0.3162a+7.73
×
l0-5
(r2＝0.9956)
[0075]
测定水解液的吸光值，从而计算出-nh2基的μmol数。
[0076]
最佳蛋白酶的筛选：选择了六种不同的酶，比较各种酶对谷朊粉的水解程度，试验结果见表6。对水解物中氨基酸进行了分析，几种蛋白酶水解谷朊粉的游离氨基酸含量见表7，综合以上两个指标来确定最佳用酶。
[0077]
表6不同蛋白酶水解谷朊粉的水解度
[0078][0079]
由表6可见，几种酶水解谷朊粉的能力依次为：alcalase》碱性蛋白酶(国产)》中性蛋白酶as1398》动植物蛋白水解酶》中性蛋白酶nutrase》胃蛋白酶。
[0080]
碱性蛋白酶alcalase催化谷朊粉的水解度较大，这是因为谷朊粉在碱性溶液中的溶解性较大，从而酶和蛋白能充分地接触并进行水解。另外，碱性蛋白酶alcalase属于丝氨酸蛋白酶，是一种非特异性蛋白质肽键内切酶，主要作用于含有酪氨酸、苯丙氨酸及色氨酸的肽键，它能从肽链的内部将肽链裂开，生成二个肽，较好地分解天然蛋白质及肽。胃蛋白酶水解谷朊粉的水解度比较小，虽然胃蛋白酶能迅速地水解苯丙氨酸残基形成的肽链，但是由于谷朊粉醇溶蛋白很难分散于酸性水溶液中，所以胃蛋白酶不能充分发挥催化作用。
[0081]
表7游离的bcaa和aaa在总游离氨基酸中的比例
[0082][0083][0084]
此外，从表7中可以看出，各种酶水解谷朊粉生成的游离氨基酸有很大的差别，由于本试验想得到的是支链氨基酸含量较高、芳香族氨基酸含量较低的肽溶液，所以在水解时应尽可能地保留支链氨基酸使其以肽键的形式存在，而使芳香族氨基酸最多的游离出来。在这几种酶中，alcalase作用谷朊粉蛋白后生成的游离支链氨基酸相对较少，游离芳香族氨基酸相对较多。综合以上的试验结果，考虑到水解物的产率和经济效益，本试验选择了alcalase蛋白酶作为试验用酶。
[0085]
最佳水解条件的确定：蛋白酶水解蛋白质的工艺条件，不但对蛋白质水解效果具有很大的影响，对最后蛋白质水解液中的肽的含量也有影响，因此，合理确定蛋白质的水解条件具有重要的意义。jens ader-missen指出，对于任何一个蛋白酶水解蛋白质的反应，当
酶和底物确定后，要确定一个酶解反应程度，仍需确定以下的水解参数ph值、温度(t)、酶浓度和底物浓度之比(e/s)、底物浓度(s)。根据单因素实验的结果及有关资料，进行了四因素三水平的正交试验，以水解度来评价水解效果。试验结果见表8。
[0086]
表8 l9(34)alcalase酶水解谷朊粉正交试验结果
[0087][0088][0089]
从表8和可以看出各因素对水解程度影响的大小顺序为：ph》温度》酶与底物浓度比》底物浓度。所以最终确定水解条件的最优组合为a1b1c2d1，且考虑到综合效益，确定ph值为8.0，温度55℃，酶与底物浓度比为0.3
‰
，底物浓度7.5％。经验证性试验得出，在此条件下得到的水解度为12.62％。
[0090]
水解时间的选择：研究了不同时间对谷朊粉水解效果的影响，结果见图3。由图3可以看出，随着水解时间的延长，水解程度在不断地增大。在最初的一小时内水解度增加的幅度比较大，当水解时间达4h左右时，水解度的增加趋势较为缓慢，综合考虑选择较佳水解时间为4h。这是因为在底物蛋白中包含可溶性蛋白和不溶性蛋白，可溶性蛋白水解时，最初阶段敏感性肽键快速断裂，不敏感性肽键在后来阶段断裂；在不溶性底物蛋白的酶水解中，酶吸附在不溶性蛋白表面，首先水解疏松地结合在不溶性蛋白上的聚合肽链，然后再慢慢水解紧密的蛋白质中心的肽键。而且反应混合物中可溶性肽的浓度升高，又反过来抑制水解
速度。因此开始时，大量的肽键被水解，水解速度很快，一段时间后酶水解速度降低，并达到一个平衡状态。
[0091]
第二次酶解最佳条件的确定
[0092]
由表9的正交试验极差分析中可知，各因素对木瓜蛋白酶和风味蛋白酶复合酶解效果的影响程度大小依次为a》b》c》d，即ph值》酶用量》时间》温度，最终确定酶解条件的最优组合为：a2b3c3d2。
[0093]
表9复合酶水解谷朊粉正交试验结果与分析
[0094][0095]
图4直观地反映了ph值、酶用量、温度、时间对耗碱量的影响，得出了本工艺的最佳条件即ph值6.5，酶用量[e]/[s]为0.3
‰
，时间5h，温度45℃，耗碱量为1.6l ml。
[0096]
ph值对耗碱量的影响：ph值是影响酶解反应的主要因素之一。酶分子是一种特殊的蛋白质分子，具有一个或若干个活性部位，酶的活性部位由结合位和催化部位组成。结合部位的功能是直接与底物相结合，而催化部位则催化底物进行特定的反应。活性部位中的基团在蛋白质的一级结构所在处的位置通常相距较远，也许可能位于不同的肽链上，但是它们在酶的空间结构却必须按一定的相对位置靠近在一起，形成活化中心(活性部位)。因此酶的活性部位只有在酶蛋白保持一定空间构想时才能存在，并发挥其催化作用。结合部
位和催化部位的基团对反应体系的ph的变化比较敏感，其解离状态随ph的变化而变化，这些变化影响了酶分子的特殊构象。另外，体系中作为底物的alaclase酶水解液随着ph值的变化也表现出不同的结离状态。每个酶催化反应体系都有一个最适宜的ph值，因此ph值直接影响了酶与底物的结合和催化，是酶解反应的主要因素之一。
[0097]
从图4(a)可以看出，ph为6.5时，酶解效果最好，耗碱量最大，此值是木瓜蛋白酶和风味蛋白酶复合酶作用于alaclase酶水解液的最适ph。当偏离此ph值时，酶的空间构象就会改变，酶活力会降低。
[0098]
酶用量对耗碱量的影响：在底物浓度一定时，底物的转化率取决于酶浓度。因此，酶浓度对酶解作用影响较大，从图4(b)可以看出，酶浓度越大，耗碱量越大。原因是酶分子越多，与肽链接触几率越多，在规定时间内释放芳香族氨基酸的数量越多，酶解效果就越好。
[0099]
时间对耗碱量的影响：由图4(c)可以看出，随着酶解反应的进行，暴露出较多的酶切位点，使复合酶在酶解的耗碱量随时间的增加而增加，水解时间为5h时，耗碱量最大，在此时间条件下，酶解效果最好。
[0100]
温度对耗碱量的影响：各种酶催化的反应都有最适的温度，此时，酶的反应速度最快。温度对酶解反应的影响包括两个方面：一方面是当温度升高时，酶解反应速度也加快，这与一般化学反应一样；另一方面，随温度升高而使酶逐渐变性，即通过减少有活性的酶而降低酶解反应速度。最适反应温度是指在特定反应体系下酶催化反应速度达到最大时的温度，它是这两种过程的平衡的结果，在低于最适温度时，前一种效应为主，在高于最适温度时，则以后一种效应为主，因而酶活性迅速降低，反应速度很快下降。最适反应温度不是酶的特征物理常数，在一定的作用时间里，在一定的反应体系下，酶解反应才存在最适反应温度。从图4(d)可以看出，45℃是酶解反应的最适温度，此温度条件下酶解的效果最好，耗碱量最大。
[0101]
高f值低聚肽的氨基酸组成分析：用氨基酸自动分析仪对制得的高f值低聚肽溶液进行了氨基酸组成和含量的测定，其结果见表10。
[0102]
表10高f值低聚肽混合物氨基酸的组成
[0103][0104]
根据上表氨基酸摩尔数按下面公式计算f值及高f值低聚肽的得率：
[0105][0106][0107]
注：谷朊粉中除蛋白质外，有其它少量非蛋白成份，本试验中忽略不计。
[0108]
经sds—page电泳法测定高f值低聚肽的分子量小于1000da，如图5所示。
[0109]
通过对六种蛋白酶进行了筛选工作。结果表明，碱性蛋白酶alcalase是水解谷朊粉的较佳酶选。
[0110]
采用四因素三水平采用l9(34)正交试验设计确定alcalase蛋白酶水解谷朊粉的最佳条件为：ph值8.0，温度55℃，酶与底物浓度比0.3
‰
，底物浓度5％；对水解时间与水解度的关系的研究表明，较佳的水解时间为4h。
[0111]
采用l9(34)正交试验设计确定木瓜蛋白酶和风味蛋白酶复合酶的最佳水解条件：ph值6.5，酶用量[e]/[s]为0.3
‰
，时间5h，温度45℃，耗碱量为1.61ml。
[0112]
制得的高f值低聚肽色泽为淡黄色，无味，分子量《1000da。f值为45.2，产品得率42.3％。
[0113]
中试放大生产：
[0114]
(1)调浆：在调配罐内加入一定量的调整ph的纯水，从生产过程中分离的湿谷朊(干基重40kg)直接送入调配罐，边进料边搅拌，成乳浊液后，打入500l的酶解罐中。
[0115]
(2)接收调配工段的乳浊液，经两次酶解，第一次酶解：边搅拌边加入复配后的1号酶液(碱性蛋白酶干基重0.12kg)；控制ph值8.0，温度55℃，水解时间为4h；
[0116]
(3)第二次酶解：边搅拌边加入2号复配酶液(木瓜蛋白酶和风味蛋白酶，干基重0.12kg)；控制ph值6.5，温度45℃，时间5h。
[0117]
(4)二次酶解液过超滤膜，去除大分子蛋白。
[0118]
(5)超滤液过纳滤膜，去除小分子盐和低于100da的低聚肽物。
[0119]
(6)产物喷雾干燥，最终得到含水量为7％的水溶性低聚肽混合物产品16.92kg。
[0120]
表11放大生产数据表
[0121][0122]
中试产品灰白色，粉末状，无不良气味，其它指标通过q/hnft05-2013标准检测，各项指标均符合标准要求。