一种特异性t细胞的培养方法
技术领域
1.本发明是一种特异性t细胞的培养方法，属于细胞培养技术领域。
背景技术：
2.哺乳动物包括独特的免疫系统，用不同方式起到防御细菌、病毒、毒素以及其他非宿主物质入侵宿主的作用，其中t淋巴细胞起到主要作用。t淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞，在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前t细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化并发育成熟，成为具有免疫活性的t细胞，通过淋巴和血液循环而分布到全身的免疫器官和组织中发挥免疫功能。
3.t细胞由于具有较多功能和不同的发育阶段，可分为若干亚群，最主要的种类有辅助性t细胞、抑制性t细胞、效应t细胞、细胞毒性t细胞、迟发性变态反应t细胞、放大t细胞、天然t细胞、记忆t细胞等等。
4.随着我国癌症发病率呈逐年升高的趋势，以及治疗手段的不断发展，越来越多的医疗单位开始用免疫细胞培养方法培养免疫细胞，但培养周期较长且细胞的死亡速度可能高于细胞的增殖速度，比如专利文件cn107686831a公开的一种针对胰腺癌的car-t细胞制备方法，培养周期约为15-20天，培养周期长且培养成本较高，又如专利文件cn102676453a提供的一种培养nk和/或nkt细胞的方法，培养方法复杂易出错，难以推广应用，因此本发明涉及一种特异性t细胞的体外培养方法，通过基因工程技术，增强t细胞对肿瘤细胞的识别杀伤能力，提高特异性t细胞的活性和纯度，且具有较快的培养周期。
技术实现要素：
5.针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种特异性t细胞的培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题，未细化的步骤为常规操作手段。
6.一种特异性t细胞的培养方法，包括以下步骤：
7.s1.将细胞培养器材用包被液进行包被，包被液包括质量比为3-5:1的重组人纤维连接蛋白和cd3单克隆抗体；重组人纤维连接蛋白可以提高细胞在体外的扩增能力并能增强t细胞对肿瘤的杀伤活性，cd3单克隆抗体则可通过t细胞表面的tcr结合重点刺激t细胞增殖，对人体外周血中其他细胞的刺激几乎没有，起到重点扩增t细胞的作用；二者分别作用时仅会对t细胞的扩增速度起到较小程度上的促进作用，当二者以3-5:1的重量比配比后，会通过协同作用成倍放大包被液对细胞的刺激效果，刺激细胞的增殖和分化，对缩短后续细胞培养时间以及提高细胞活性方面起到较重要的作用；
8.s2.抽取人体外周血并提取得到t细胞；
9.s3.将步骤s2得到的t细胞接种于步骤s1包被后的细胞培养器材中并用扩增培养液培养过夜；
10.s4.当步骤s3培养过夜后的t细胞的cd56表达在50-70％范围内时，用激活培养液进行诱导培养；
11.s5.将步骤s4诱导培养后的t细胞进行杀伤试验，收集杀伤率合格的t细胞进行细胞制备及质控，得到嵌合抗原受体t细胞。
12.优选的，所述细胞培养器材包括6孔板、12孔板、t25、t75中的一种或几种组合。
13.优选的，所述包被液包括pbs缓冲液、浓度在10-20μg/ml范围内的芦荟大黄素、浓度在5-20ng/ml范围内的细胞因子、浓度在2-5μg/ml范围内的多聚赖氨酸、浓度在2-5μg/ml范围内的纤维黏连蛋白、0.2-0.4％的明胶、浓度在20-50μg/ml范围内的重组人纤维连接蛋白、浓度在20-70μg/ml范围内的cd3单克隆抗体，重组人纤维连接蛋白和cd3单克隆抗体的质量比为3-5:1。pbs缓冲液作为基础溶剂，一方面能溶解添加物，另一方面相比于培养液可以减小对细胞的影响。芦荟大黄素在包被液中主要起到抑菌作用。细胞因子与t细胞上的特异性受体相结合，起到调节受体表达、促进t细胞的增殖等作用。多聚赖氨酸作为一种带正电荷的氨基酸，可以通过改变培育基质外表的电极来促进细胞贴壁成长、提高原代细胞的存活率、促进贴壁细胞的神经突长出。纤维粘连蛋白属于糖蛋白，存在于细胞外表蛋白和血浆中，于细胞膜外表受体和细胞外基质成分结合，是促进细胞贴壁和延伸成长的理想基质。明胶添加于pbs缓冲液内可进一步促进细胞贴壁，促进后续细胞分化胞。
14.优选的，所述细胞因子为okt3抗体、ifn-γ中的一种。
15.优选的，所述扩增培养液和激活培养液均由a液和b液构成，a液包括无血清淋巴细胞培养液、浓度在20-35mg/l范围内的l-丝氨酸、浓度在3-5ng/ml范围内的神经细胞生长因子、浓度在10-30mg/l范围内的无水氯化钙、浓度在0.5-0.9mg/l范围内的叶酸、浓度在2-5mg/l范围内的氯化胆碱、浓度在2-5ng/ml范围内的表皮细胞生长因子，b液为肿瘤病人的血浆。
16.优选的，所述无血清淋巴细胞培养液为rpmi1640、kbm561培养液中的一种。
17.优选的，所述扩增培养液由98.5-100％的a液和0-1.5％的b液构成。
18.优选的，所述激活培养液由70-95％的a液和5-30％的b液构成。
19.本发明的有益效果：
20.(1)本发明涉及一种特异性t细胞的培养方法，该方案中的包被液中添加有芦荟大黄素、质量比为3-5:1的重组人纤维连接蛋白和cd3单克隆抗体，芦荟大黄素主要起到抑菌作用，防止细胞被细菌真菌污染，提高了细胞的存活率，还提高了细胞的保存时间，重组人纤维连接蛋白和cd3单克隆抗体按一定配比添加，其协同作用能够大幅提高t细胞的扩增效率和后续对肿瘤的杀伤活性，相比于不添加或单独添加二者的包被液对t细胞具有更佳的刺激效果。
21.(2)本发明涉及一种特异性t细胞的培养方法，其中，扩增培养液中添加有微量的肿瘤病人的自体血浆，会进一步提高t细胞的诱导效果，同时扩增培养液中添加的氨基酸、叶酸、生长因子等成分有助于提高t细胞的扩增效率，缩短细胞扩增周期。
22.(3)本发明涉及一种特异性t细胞的培养方法，其中，激活培养液由70-95％的a液和5-30％的b液构成，进一步提高细胞的特异性和活性。
23.(4)本发明涉及一种特异性t细胞的培养方法，该方案操作简便，细胞培养周期短，能够大幅提高t细胞的扩增速度和肿瘤杀伤效率，减少体外t细胞的培养周期，提高细胞的增殖分化效率。
具体实施方式
24.为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
25.实施例1
26.一种特异性t细胞的培养方法，包括以下步骤：
27.s1.用包被液对12孔板进行包被，包被液以pbs缓冲液为基液，其中添加有浓度为10μg/ml的芦荟大黄素、浓度为5ng/ml的细胞因子okt3抗体、浓度为2μg/ml的多聚赖氨酸、浓度为2μg/ml的纤维黏连蛋白、0.2％的明胶、浓度为20μg/ml的重组人纤维连接蛋白、浓度为20μg/ml的cd3单克隆抗体，其中重组人纤维连接蛋白和cd3单克隆抗体的质量比为3:1；
28.s2.采用肝素抗凝常规采血手段抽取采集人体外周血并提取得到外周淋巴细胞和外周血t细胞；
29.s3.将步骤s2得到的外周淋巴细胞和外周血t细胞接种于步骤s1包被后的12孔板中并用扩增培养液培养过夜，扩增温度维持在36-37℃范围内；扩增培养液由98.5％的a液和1.5％的b液构成，a液包括无血清淋巴细胞培养液rpmi1640、浓度为20mg/l的l-丝氨酸、浓度为3ng/ml的神经细胞生长因子、浓度为10mg/l的无水氯化钙、浓度为0.5mg/l的叶酸、浓度为2mg/l的氯化胆碱、浓度为2ng/ml的表皮细胞生长因子；b液为肿瘤病人的自体血浆；
30.s4.当步骤s3培养过夜后的t细胞的cd56表达达到70％以上时，用激活培养液进行诱导培养；激活培养液由70％的a液和30％的b液构成，a液包括无血清淋巴细胞培养液rpmi1640、浓度为20mg/l的l-丝氨酸、浓度为3ng/ml的神经细胞生长因子、浓度为10mg/l的无水氯化钙、浓度为0.5mg/l的叶酸、浓度为2mg/l的氯化胆碱、浓度为2ng/ml的表皮细胞生长因子；b液为肿瘤病人的自体血浆；
31.s5.将步骤s4诱导培养后的t细胞进行杀伤试验，收集杀伤率合格的t细胞进行细胞制备及质控，得到嵌合抗原受体t细胞。
32.实施例2
33.一种特异性t细胞的培养方法，包括以下步骤：
34.s1.用包被液对12孔板进行包被，包被液以pbs缓冲液为基液，其中添加有浓度为16μg/ml的芦荟大黄素、浓度为15ng/ml的细胞因子ifn-γ、浓度为3μg/ml的多聚赖氨酸、浓度为4μg/ml的纤维黏连蛋白、0.3％的明胶、浓度为35μg/ml的重组人纤维连接蛋白、浓度为50μg/ml的cd3单克隆抗体，其中重组人纤维连接蛋白和cd3单克隆抗体的质量比为3:1；
35.s2.采用肝素抗凝常规采血手段抽取采集人体外周血并提取得到外周淋巴细胞和外周血t细胞；
36.s3.将步骤s2得到的外周淋巴细胞和外周血t细胞接种于步骤s1包被后的12孔板中并用扩增培养液培养过夜，扩增温度维持在36-37℃范围内；扩增培养液由98.5％的a液和1.5％的b液构成，a液包括无血清淋巴细胞培养液rpmi1640、浓度为25mg/l的l-丝氨酸、浓度为4ng/ml的神经细胞生长因子、浓度为26mg/l的无水氯化钙、浓度为0.8mg/l的叶酸、浓度为4mg/l的氯化胆碱、浓度为4ng/ml的表皮细胞生长因子；b液为肿瘤病人的自体血浆；
37.s4.当步骤s3培养过夜后的t细胞的cd56表达达到60％以上时，用激活培养液进行诱导培养；激活培养液由80％的a液和20％的b液构成，a液包括无血清淋巴细胞培养液rpmi1640、浓度为25mg/l的l-丝氨酸、浓度为4ng/ml的神经细胞生长因子、浓度为15mg/l的
无水氯化钙、浓度为0.8mg/l的叶酸、浓度为3mg/l的氯化胆碱、浓度为3ng/ml的表皮细胞生长因子；b液为肿瘤病人的自体血浆；
38.s5.将步骤s4诱导培养后的t细胞进行杀伤试验，收集杀伤率合格的t细胞进行细胞制备及质控，得到嵌合抗原受体t细胞。
39.实施例3
40.一种特异性t细胞的培养方法，包括以下步骤：
41.s1.用包被液对12孔板进行包被，包被液以pbs缓冲液为基液，其中添加有浓度为18μg/ml的芦荟大黄素、浓度为12ng/ml的细胞因子ifn-γ、浓度为4μg/ml的多聚赖氨酸、浓度为4μg/ml的纤维黏连蛋白、0.3％的明胶、浓度为35μg/ml的重组人纤维连接蛋白、浓度为45μg/ml的cd3单克隆抗体，其中重组人纤维连接蛋白和cd3单克隆抗体的质量比为4:1；
42.s2.采用肝素抗凝常规采血手段抽取采集人体外周血并提取得到外周淋巴细胞和外周血t细胞；
43.s3.将步骤s2得到的外周淋巴细胞和外周血t细胞接种于步骤s1包被后的12孔板中并用扩增培养液培养过夜，扩增温度维持在36-37℃范围内；扩增培养液由99.5％的a液和0.5％的b液构成，a液包括无血清淋巴细胞培养液rpmi1640、浓度为25mg/l的l-丝氨酸、浓度为4ng/ml的神经细胞生长因子、浓度为25mg/l的无水氯化钙、浓度为0.8mg/l的叶酸、浓度为4mg/l的氯化胆碱、浓度为4ng/ml的表皮细胞生长因子；b液为肿瘤病人的自体血浆；
44.s4.当步骤s3培养过夜后的t细胞的cd56表达达到65％以上时，用激活培养液进行诱导培养；激活培养液由85％的a液和15％的b液构成，a液包括无血清淋巴细胞培养液rpmi1640、浓度为25mg/l的l-丝氨酸、浓度为4ng/ml的神经细胞生长因子、浓度为15mg/l的无水氯化钙、浓度为0.8mg/l的叶酸、浓度为4mg/l的氯化胆碱、浓度为4ng/ml的表皮细胞生长因子；b液为肿瘤病人的自体血浆；
45.s5.将步骤s4诱导培养后的t细胞进行杀伤试验，收集杀伤率合格的t细胞进行细胞制备及质控，得到嵌合抗原受体t细胞。
46.实施例4
47.一种特异性t细胞的培养方法，包括以下步骤：
48.s1.用包被液对12孔板进行包被，包被液以pbs缓冲液为基液，其中添加有浓度为15μg/ml的芦荟大黄素、浓度为10ng/ml的细胞因子ifn-γ、浓度为3μg/ml的多聚赖氨酸、浓度为3μg/ml的纤维黏连蛋白、0.3％的明胶、浓度为30μg/ml的重组人纤维连接蛋白、浓度为50μg/ml的cd3单克隆抗体，其中重组人纤维连接蛋白和cd3单克隆抗体的质量比为4:1；
49.s2.采用肝素抗凝常规采血手段抽取采集人体外周血并提取得到外周淋巴细胞和外周血t细胞；
50.s3.将步骤s2得到的外周淋巴细胞和外周血t细胞接种于步骤s1包被后的12孔板中并用扩增培养液培养过夜，扩增温度维持在36-37℃范围内；扩增培养液由99％的a液和1％的b液构成，a液包括无血清淋巴细胞培养液rpmi1640、浓度为25mg/l的l-丝氨酸、浓度为4ng/ml的神经细胞生长因子、浓度为20mg/l的无水氯化钙、浓度为0.6mg/l的叶酸、浓度为3mg/l的氯化胆碱、浓度为3ng/ml的表皮细胞生长因子；b液为肿瘤病人的自体血浆；
51.s4.当步骤s3培养过夜后的t细胞的cd56表达达到60％以上时，用激活培养液进行诱导培养；激活培养液由80％的a液和20％的b液构成，a液包括无血清淋巴细胞培养液
rpmi1640、浓度为25mg/l的l-丝氨酸、浓度为4ng/ml的神经细胞生长因子、浓度为15mg/l的无水氯化钙、浓度为0.7mg/l的叶酸、浓度为4mg/l的氯化胆碱、浓度为3ng/ml的表皮细胞生长因子；b液为肿瘤病人的自体血浆；
52.s5.将步骤s4诱导培养后的t细胞进行杀伤试验，收集杀伤率合格的t细胞进行细胞制备及质控，得到嵌合抗原受体t细胞。
53.实施例5
54.一种特异性t细胞的培养方法，包括以下步骤：
55.s1.用包被液对12孔板进行包被，包被液以pbs缓冲液为基液，其中添加有浓度为20μg/ml的芦荟大黄素、浓度为20ng/ml的细胞因子okt3抗体、浓度为5μg/ml的多聚赖氨酸、浓度为5μg/ml的纤维黏连蛋白、0.4％的明胶、浓度为50μg/ml的重组人纤维连接蛋白、浓度为70μg/ml的cd3单克隆抗体，其中重组人纤维连接蛋白和cd3单克隆抗体的质量比为5:1；
56.s2.采用肝素抗凝常规采血手段抽取采集人体外周血并提取得到外周淋巴细胞和外周血t细胞；
57.s3.将步骤s2得到的外周淋巴细胞和外周血t细胞接种于步骤s1包被后的12孔板中并用扩增培养液培养过夜，扩增温度维持在36-37℃范围内；扩增培养液由100％的a液构成，不含b液，a液包括无血清淋巴细胞培养液rpmi1640、浓度为35mg/l的l-丝氨酸、浓度为5ng/ml的神经细胞生长因子、浓度为30mg/l的无水氯化钙、浓度为0.9mg/l的叶酸、浓度为5mg/l的氯化胆碱、浓度为5ng/ml的表皮细胞生长因子；
58.s4.当步骤s3培养过夜后的t细胞的cd56表达达到50％以上时，用激活培养液进行诱导培养；激活培养液由70％的a液和30％的b液构成，a液包括无血清淋巴细胞培养液rpmi1640、浓度为35mg/l的l-丝氨酸、浓度为5ng/ml的神经细胞生长因子、浓度为30mg/l的无水氯化钙、浓度为0.9mg/l的叶酸、浓度为5mg/l的氯化胆碱、浓度为5ng/ml的表皮细胞生长因子；b液为肿瘤病人的自体血浆；
59.s5.将步骤s4诱导培养后的t细胞进行杀伤试验，收集杀伤率合格的t细胞进行细胞制备及质控，得到嵌合抗原受体t细胞。
60.结合实施例1至实施例5，包被液、扩增培养液和激活培养液的不同添加物的含量如表1所示；包被液中重组人纤维连接蛋白和cd3单克隆抗体的质量比如表2所示；扩增培养液以及激活培养液中a液与b液的比例如表3所示：
61.表1各实施例中包被液、扩增培养液和激活培养液中各添加物的添加量
[0062][0063]
表2各实施例中重组人纤维连接蛋白和cd3单克隆抗体的质量比
[0064][0065]
[0066]
表3各实施例中扩增培养液以及激活培养液中a液与b液的比例
[0067] 扩增培养液中a液与b液的比例激活培养液中a液与b液的比例实施例198.5％：1.5％70％：30％实施例298.5％：1.5％80％：20％实施例399.5％：0.5％85％：15％实施例499％：1％80％：20％实施例5100％：0％70％：30％
[0068]
对比例1
[0069]
采用市售的ph＝9.6的碳酸盐包被缓冲液代替本发明所述的包被液，其余方法相同，与实施例1至实施例5一起进行同步培养。
[0070]
对比例2
[0071]
采用市售的无血清淋巴细胞培养液为rpmi1640代替本发明所述的扩增培养液，其余方法相同，与实施例1至实施例5一起进行同步培养。
[0072]
对比例3
[0073]
采用市售的无血清淋巴细胞培养液为rpmi1640同时添加肿瘤病人的10％的自体血浆代替本发明所述的激活培养液，其余方法相同，与实施例1至实施例5一起进行同步培养。
[0074]
试验例1
[0075]
为验证该培养方法对特异性t细胞的扩增和激活的影响，对实施例1-5和对比例1-3进行杀伤试验，计数未病毒感染的t细胞和已被病毒感染的t细胞，37℃下孵育24h，通过测定cd56的表达来确定24h下t细胞的杀伤效果，杀伤率达60％以上则为合格。
[0076]
试验例2
[0077]
为验证该培养方法对特异性t细胞的扩增和激活的影响，对实施例1-5和对比例1-3进行质控检测，连续培养细胞一周后对细胞形态、活性以及有无细菌真菌污染情况进行检测，分别通过显微镜对细胞形态进行检测、通过台盼蓝计数细胞数量并观察细胞活性、通过流式检测细胞的转染率，根据其结果进行综合评定，分为优良差三种结果：细胞形态完好数量充足且转染率高于50％为优，细胞形态完好数量充足但转染率在40-50％范围内为良，细胞形态较佳数量较充足但转染率在30-40％范围内为差。
[0078]
试验例1和试验例2中的杀伤率结果和细胞质控检测结果如表4所示。
[0079]
表4细胞杀伤率及细胞质控检测结果
[0080] 细胞杀伤率(％)细胞质控检测实施例174.6％优实施例281.8％优实施例376.1％优实施例479.7％优实施例575.9％优对比例157.3％差对比例265.2％良对比例368.9％良
[0081]
由上述表格可看出，包被液、扩增培养液和激活培养液均不同程度起到提高t细胞增殖能力以及杀伤能力的作用：由实施例1-5与对比例1进行对比发现，包被液在细胞培养过程中起到较大影响，一方面由于包被液中添加有芦荟大黄素，减少了细胞被细菌真菌污染的概率，提高了细胞的存活率，另一方面，包被液中按比例添加的重组人纤维连接蛋白和cd3单克隆抗体通过协同作用能够显著提高细胞的体外扩增能力和后续对肿瘤的杀伤活性，相比于不添加或单独添加二者的包被液对t细胞具有更佳的刺激效果；由实施例1-5与对比例2进行对比发现，扩增培养液中添加氨基酸、叶酸、生长因子等成分有助于提高t细胞的扩增效率，缩短细胞扩增周期，添加微量的肿瘤病人自体血浆有助于过滤并扩增出活力更强的t细胞，进一步提高扩增效果；由实施例1-5与对比例3进行对比发现，激活培养液中适量提高肿瘤病人自体血浆的添加量但控制在30％内会进一步提高t细胞的诱导效果。
[0082]
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0083]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。