专利名称：一种双链rna及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种双链RNA及其抗肿瘤用途。具体涉及一种21-nt双链RNA及其在抑制非小细胞肺癌细胞株表皮生长因子受体表达的用途。
目前，抗肿瘤药物的研制主要针对治疗靶标的高通量药物筛选和针对治疗靶标的理性化药物设计。近年来受到广泛重视的反义核酸技术是后者的一个重要代表，通过设计和靶标蛋白基因的反义核酸，导入到细胞中，对靶标蛋白的表达进行抑制，达到杀死和治疗肿瘤的目的。反义核酸由于其作用靶点序列清楚、易设计制备，被认为是极具潜力的肿瘤治疗药物，但在实际应用中，存在抑制效率低，专一性差，较大的毒性以及用药量较大和成本高等缺陷。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引发的序列依赖性的转录后基因沉默机制(posttranscriptional genesilencing，PTGS)。在哺乳动物细胞中，21-23nt dsRNA进入细胞后，能以其为模板，降解与之序列相应的mRNA，从而达到专一性抑制特定基因的蛋白生成。RNAi是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。在药物开发方面，RNAi除了具有和反义核酸相同的优点外，还具有针对靶点抑制的专一性高，用量少，药物毒性小的特点。目前将RNAi技术用于抗病毒(如HIV病毒)和细胞信号传递系统的研究方兴未艾，但用于肿瘤治疗未见报道。
本发明的进一步目的是提供新的抗肿瘤生物制剂和抗肿瘤药物。
本发明选定哺乳动物肿瘤细胞表皮生长因子受体(EGFR)作为肿瘤治疗靶点，采用RNA干扰(RNAi)技术，体外合成与EGFR cDNA序列互补的21nt双链RNA，与非病毒载体和/或病毒载体结合导入哺乳动物肿瘤细胞，抑制表皮生长因子受体的表达，从而改变NSCLC细胞生物学特性，增加放化疗敏感性。
本发明所述哺乳动物肿瘤细胞表皮生长因子受体(epidermal growthfactor receptor，EGFR)是一分子量为170KD的跨膜糖蛋白，可调控细胞周期，调节细胞增生、存活、粘附、迁移和分化，促进损伤修复。EGFR在包括非小细胞肺癌(non-small-cell-lung cancer，NSCLC)在内的多种上皮源性肿瘤中过度表达，与肿瘤增生、转移、放化疗敏感性下降关系密切。
本发明按下述方法和步骤进行，1、测定EGFR受体(1)选用EGFR阳性的细胞株A549、SPC-A-1，通过免疫组化法和免疫荧光法对EGFR定性、定位。
免疫组化设低倍镜、高倍镜阴性对照和阳性对照。免疫组化结果阳性对照在细胞膜，细胞浆和细胞核显示棕色颗粒，阴性对照未见特异性着色。
上述方法所用一抗为鼠抗人EGFR单克隆抗体，由中科院细胞生物所提供，二抗为SABC标记的兔抗鼠IgG。
所述细胞株由中科院上海细胞生物学研究所细胞库提供。
免疫荧光法设阴性和阳性对照荧光照片。试验结果同免疫组化染色。所述二抗采用FITC标记的兔抗鼠IgG。
(2).测定受体数量采用流式细胞仪测定受体数量，结果为A549％gated78.58％；mean54.51，SPC-A-1％gated98.89％mean103.79，H69％gated0.67％mean67.54。
2、筛选EGFR高表达细胞株取细胞株A549，SPC-A-1，ECV，HFL，H7402，BEL7402、SKOV3和H69进行筛选，结果表明A549，SPC-A-1为EGFR高表达细胞株，ECV、HFL、H7402、BEL7402、SKOV3细胞株EGFR表达较低。H69细胞株无EGFR表达。设H69细胞株为阴性对照。
所述细胞株由中科院上海细胞生物学研究所细胞库提供。
3、按下述原则设计ssRNA，1)EGFR的cDNA启动子AUG下游75碱基处，2)找到第一个AA二聚体，3)记录AA下游19个核苷酸(siRNA-EGFR)，其核苷酸序列为5’AAGGAGCUGCCCAUGAGAAAU……mRNA4)计算嘌呤和嘧啶的百分比(G/C)，G/C比值为30％至70％，50％最佳。
4、按已知的体外化学合成方法合成siRNA-EGFR，其核苷酸序列为GGAGCUGCCCAUGAGAAAUdTdT……siRNAAUUUCUCAUGGGCAGCUCCdTdT……siRNA complement5、拟和(annealing)siRNA双链1)独立分装上述化学合成的RNA单链，用无RNase水稀释，2)正义、反义RNA混合，加入拟和缓冲液，
3)90℃孵育，离心，收集管底液体。
4)37℃孵育1小时。
5)拟和的双链RNA的终浓度为20uM。形成的双链具有如下序列。GGAGCUGCCCAUGAGAAAUdTdT……siRNAAUUUCUCAUGGGCAGCUCCdTdT……siRNA complement6、sRNA-unrelated的设计、合成以及拟和同dsRNA-EGFR。序列为5’-GAACUUCAGGGUCAGCUUGCCUU-3’——dsRNA-unrelated5’-GGCAAGCUGACCCUGAAGUUCUU-3’——unrelated completement7、15％PAGE-SDS电泳鉴定拟和的双链，拟和完全，双链片段大小正确。
8、筛选阳离子脂质体取阳离子脂质体TKO，Oligofectamine，LipofectamineTM2000进行筛选，采用高转导效率的LipofectamineTM2000用于dsRNA的转导。
9、RNA干扰技术用于肿瘤细胞1)制备贴壁细胞，2)制备dsRNA-Lipofectamine复合物，3)流式细胞仪检测EGFR受体数目。
实验结果证实，A549细胞株EGFR表达降低了73.23％，SPC-A-1细胞株受体表达降低了76.01％。本发明将体外合成的dsRNA借助阳离子脂质体导入哺乳动物肿瘤细胞，能抑制表皮生长因子受体的表达，从而改变NSCLC细胞生物学特性，增加哺乳动物肿瘤细胞对放化疗的敏感性，获得肯定的RNAi效果。
本发明双链RNA可与非病毒载体和/或病毒载体结合，制备新的抗肿瘤生物制剂和抗肿瘤药物，行瘤体内直接注射或静脉给药有效抑制肿瘤生长。
其中1分子量标准，2正义RNA-EGFR，3反义RNA-EGFR，
4双链RNA-EGFR，5非特异双链RNA图2是RNAi对SPC-A-1细胞EGFR的抑制作用。
按已知体外化学合成方法合成siRNA-EGFR，其序列为5’AAGGAGCUGCCCAUGAGAAAU……mRNA，GGAGCUGCCCAUGAGAAAUdTdT……siRNA，长度21，分子量6732.9(g/mole)，ODU26031.9(ug/ODU260)，数量50nmol/管×2管，AUUUCUCAUGGGCAGCUCCdTdT……siRNA complement长度21，分子量6583.7(g/mole)，ODU26033.4(ug/ODU260)，数量50nmol/管×2管，上述合成的每条RNA单链独立分装，RNase灭活的水稀释成50uM，正义RNA30ul与反义RNA30ul混合，加入15ul 5×拟和缓冲液，终体积为75ul，90℃孵育1分钟，离心15秒，收集管底液体，37℃孵育1小时，dsRNA双链终浓度为20uM。拟和缓冲液的组成为100mMKOAc，30mMHEPES-KOHpH7.4，2mM MgOAc。经15％PAGE-SDS电泳，结果表明拟和的双链拟和完全，双链片段大小正确。
实施例2 RNA干扰技术用于非小细胞肺癌细胞制备贴壁细胞转染前一天接种A549或SPC-A-1细胞于12孔培养板，使得次日转染的时候细胞密度达40-50％(0.5-2×105细胞/孔/12孔培养板)，更换培养液(DMEM+10％FBS)，体积1ml。
制备dsRNA-Lipofectamine复合物1)将dsRNA稀释于100ul无血清DMEM，混匀。
2)Lipofectamine使用前混匀，然后4ul Lipofectamine与100ul无血清DMEM混匀。室温孵育5min。
3)将dsRNA稀释液与Lipofectamine稀释液混匀，总体积200ul，室温孵育20min，室温保存。
4)加入12孔培养板，混匀，培养箱内孵育24-48小时。
流式细胞仪检测受体数目，结果为A549细胞株EGFR表达降低了73.23％(dsRNA-EGFR16ul/lipofectamine2000 4ul/12孔培养板)。SPC-A-1细胞株受体表达降低了76.01％(dsRNA-EGFR16 ul/lipofectamine 2000 4ul/12孔培养板)。
结果证实，本发明dsRNA能抑制表皮生长因子受体的表达，改变NSCLC细胞生物学特性，增加哺乳动物肿瘤细胞对放化疗的敏感性，获得肯定的RNAi效果。
权利要求
1.一种双链RNA，其特征是具有如下序列的21-nt双链RNA。GGAGCUGCCCAUGAGAAAUdTdT……siRNAAUUUCUCAUGGGCAGCUCCdTdT……siRNA complement
2.按权利要求1所述的双链RNA，其特征是所述的双链RNA是体外合成。
3.按权利要求1和2所述的双链RNA，其特征是所述双链RNA与非病毒载体和/或病毒载体结合导入肿瘤细胞，制备抗肿瘤生物制剂和抗肿瘤药物。
4.按权利要求3所述的双链RNA，其特征是所述非病毒载体是阳离子脂质体。
5.按权利要求4所述的双链RNA，其特征是所述阳离子脂质体是Lipofecta-mineTM2000。
6.按权利要求3所述的双链RNA，其特征是所述肿瘤细胞是哺乳动物肿瘤细胞。
7.按权利要求3所述的双链RNA，其特征是所述肿瘤细胞是非小细胞肺癌细胞。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及一种双链RNA及其抑制哺乳动物肿瘤细胞的用途。本发明采用RNA干扰技术，将体外合成的双链RNA通过非病毒载体和/或病毒载体结合导入哺乳动物肿瘤细胞，能抑制表皮生长因子受体的表达，从而改变NSCLC细胞生物学特性，增加哺乳动物肿瘤细胞对放化疗的敏感性。本发明双链RNA可制备新的抗肿瘤生物制剂和抗肿瘤药物，行瘤体内直接注射或静脉给药有效抑制肿瘤生长。
文档编号C07H21/02GK1434054SQ03115489
公开日2003年8月6日 申请日期2003年2月21日 优先权日2003年2月21日
发明者白春学, 张新, 张敏, 陈杰 申请人:复旦大学附属中山医院