专利名称：借助于膜色谱进行的维生素k依赖性蛋白的纯化的制作方法
技术领域：
本发明的主题是从含有这些组分的原料源制备既含有经病毒灭活的维生素K依赖性血浆组分又含有蛋白C和蛋白S的药剂的方法。
维生素K依赖性血浆组分，例如蛋白C、蛋白S、因子II、VII、IX和X是血浆中包含的组分，在凝血级联系统中起着重要的病理生理作用。这些因子在治疗表现出由分别缺损这些因子引起的症状的病人中用作药物。
现在，作为这些因子的商业性回收原料源，血浆不能以任意需要的量被获得。因此，由于伦理的和经济的原因任何分级分离和分离这些维生素K依赖性血浆组分，以及蛋白C和蛋白S的目的必然是一方面保证尽可能多地单独地产生各因子自身且另一方面同时也使各种其它因子得以分离。本发明的目的是提供一种能够达到所述目的的方法。
所得出的目的由按照本发明的包含权利要求1中提出的技术特征的方法达到。
在按照本发明的方法中，膜色谱法的使用起到了重要的作用。Josic等在Joural of Chromatography(632(1993)1-10)中描述了肝素亲和色谱在从凝血级联系统分离血浆蛋白质上的适用性。描述了阴离子色谱预分离后的抗凝血酶III的分离以及因子IX和因子X的分离。用于预分离因子IX和因子X的阴离子交换色谱用制备型HPLC进行。按照H.G.J.Brummelhuis的方法(J.M.Curling(Editor)，″Methods of Plasma Protein Fractionation”，AcademicPress，London，Orlando，1980，p.117)完成含有因子IX和因子X的样品的富集。
Josic等(Joural of Chromatography 590(1992)59-76)已使血清和血浆膜蛋白的高效膜色谱公知。其中已描述了血清和血浆膜蛋白的分离。例如，分离了来源于肝肾组织的血浆膜蛋白。
令人惊奇地是，业已表明通过以下所述的方法可以以高的纯度和产率获得有价值的维生素K依赖性血浆组分例如蛋白C、蛋白S、因子II、VII、IX和X。
第一步，将既含有各维生素K依赖性血浆组分又含有蛋白C和蛋白S的原料源(该源优选采用新鲜或解冻状态下的血浆)进行阴离子交换剂材料上的固相抽提。所述阴离子交换剂材料可以以排列在膜上的疏松块状颗粒材料或以紧密片状形式使用。在交联的或非交联的和已用碱性基团修饰过的多糖上的固相抽提是优选的。更具体地说，可以使用如用二乙氨乙基(DEAE)或季胺修饰的多糖之类的材料。因此，例如可以使用像SephadexP50一类的材料。特别是将DEAE修饰的分相材料用于因子IX的分离。在固相抽提中，将待抽提的原料源与以固定状态存在的材料混合。
所说的固相抽提最好在低离子强度条件下进行。在可进行可不进行的洗涤步骤之后，收集洗脱物，然后又将其进行其它的处理步骤。
这样，为了分离因子IX，样品最好经合适的修饰膜过滤。然后可进一步任选利用例如产生白蛋白或不利用滤液。
结合到膜上或各固相材料上的蛋白质即因子II，特别是因子IX和因子X在较高的离子强度的条件下从固相连续流出。当使用DEAE-或季胺-修饰膜时，借助于以上提到的固相抽提材料，特别是颗粒材料，其多种可适用性与固相抽提相比是优越的。
然后，通过具有高离子强度的溶液的作用将吸附在固相上的物质从载体材料上解吸。接着将组分的离子强度采用合适的方法调节至完成后续分离步骤所需的状态，例如稀释或超滤或渗滤或添加增加离子强度的试剂。
此后可以接着进行阴离子交换剂膜色谱或亲和膜色谱后者采用具有高或低分子量，对待分离的维生素K依赖性血浆组分以及蛋白C和蛋白S具有高亲和力的固定化物质。
这一色谱纯化步骤也可以在用于进行疏水作用色谱的物质上进行。
这里也将分别考虑到作为阴离子交换剂的材料，更具体地说是用二乙氨乙基或季胺修饰的膜。对维生素K依赖性血浆组分以及蛋白C和蛋白S具有高亲和力的物质可以是免疫亲和配体。所考虑的免疫亲和配体是直接针对待分离的因子的抗体。因此，例如就因子IX的分离来说，可以使用具有针对因子IX的各固定化抗体的膜。洗掉未被阴离子交换剂膜或免疫亲和膜吸留的物质，可进行可不进行收集和进一步处理。
用于疏水色谱的典型配体在疏水性上表现出某些渐变。它们包括例如无环或脂环脂肪族化合物具有例如C1到C18烷基链或芳香族化合物，也可以是已用极性质子或极性非质子配体，例如氰基，修饰。就适于疏水作用色谱的疏水配体而言，特别要考虑丙基、丁基、苯基基团(载体材料已经它们修饰)和疏水性上表现出某些渐变的类似配体。疏水性上的渐变也可以被极性基团影响。因此，更具体地说，2-羟氨烷基基团，例如2-羟氨丙基基团，作为分离因子IX的疏水配体是合适的。
接下来的步骤包括吸附的血浆组分的进一步的分级分离，该步骤是基于在离子强度和/或pH值的变化下组分的逐步流出，用具有不同极性的高离子强度溶剂系统的溶剂系统或消除免疫亲和配体和基质之间的亲和性的溶剂系统进行的。然后也可以采用以上提到的方法将从膜流出的组分的离子强度调节至进一步的分离步骤的条件下。
权利要求1的任选的步骤f)包括亲和膜色谱。在按照本发明的方法范围内的亲和膜色谱被理解为包括疏水色谱。以上已指出了合适配体的特征。
在按照本发明的方法范围内的亲和膜色谱也涉及其中使用由免疫亲和配体修饰的膜的色谱方法。这里，更具体地说，使用针对维生素K依赖性血浆组分以及蛋白C和蛋白S的单克隆抗体，所述单克隆抗体已在膜上固定化。
一方面可以用由离子交换剂基团特别是阴离子交换剂修饰的基质材料或另一方面可以用由免疫亲和配体修饰的材料进行样品中的维生素依赖性血浆组分以及蛋白C和蛋白S的色谱分离操作。
在一种非常有利的模式中，所说的色谱材料排列在膜上。膜由基质材料例如经修饰的纤维素或合成纤维构成较好。更具体地说，由多孔聚甲基丙烯酸缩水甘油酯和/或其它具有类似结构的多孔亲水聚合物(例如亲水化的聚苯乙烯)制成的膜及紧密片状物是合适的。
在第一种情况下，适于分离的膜由纤维素或合成纤维制成的堆积薄多孔膜组成，而在第二种情况下，它由硅胶或聚合物载体制成的紧密片状物组成。所述片状物膜的基质材料已备有合适的阴离子交换剂基团或免疫亲和配体。更具体地说，离子交换剂基团可以是阴离子交换剂基团，例如季胺化合物或二乙氨乙基(DEAE)基团。阳离子交换剂基本上可以是弱的或强的酸性阳离子交换剂，例如由磺酸或磷酸基团修饰的物质。
离子交换剂基团可以是或者可以不是已经所谓的间隔基键合到基质材料纤维上的。备有间隔基的材料也称为触角材料。DE 4204694中已限定了合适的间隔基和配体。例如葡糖胺部分(glucosaminemioety)也可以用作间隔基。阴离子交换剂基团(例如DEAE或季胺化合物)也可以是已键合到由多孔聚甲基丙烯酸缩水甘油酯或其它提及的物质制成的膜上的。阴离子交换剂基团直接或者经间隔基例如葡糖胺部分键合到形成膜的材料上。
在按照本发明的另一个实施方案中，使用了亲和膜色谱，其中采用固定化的低或高分子量的对维生素K依赖性血浆组分以及蛋白C和蛋白S优选是人或鼠 的有高亲和力的物质。
借助化学活性基团使对维生素K依赖性血浆组分、因子II、VII、IX或X以及蛋白C和蛋白S有高亲和力的物质在载体上固定化。优选活性基团不直接与载体材料而是与间隔基未端起化学反应。通过将对所述因子具有亲合力的物质键合到活性基团例如甲苯磺酰基、tresyl、酰肼等上来进行所述物质的固定化。合适的方法已是公知的(T.M.Phillips，“Affinity Chromatography”，in“Chromatography”(E，Heftmann，Ed.)，5th edition，Elsevier，Amsterdam 1992)。
也可以将抗体预先吸附在携带有蛋白A或蛋白G配体的膜上。抗体的流出(柱流出)可以用随后的柱共价交联阻止。为了将抗体交联到蛋白A或蛋白G膜上，可以采用类似于使用疏松载体的方法。在蛋白A和蛋白G上固定化的优点包括抗体全部地固定在分子(Fc)的恒定区段上，因此，抗原结合部分(Fab)保持游离，并且在其与各因子的相互作用中不被抑制。
对色谱纯化后获得级分用去垢剂例如离子或非离子表面活性剂处理来灭活病毒，该处理是按照EP 0 131 740A1中所述的方法在例如二或三烷基化的磷酸盐化合物例如三正丁基磷酸盐的存在下进行的。灭活病毒基本上也可以在第一色谱步骤之前进行。将TritonX-100Tween/TNBP(三正丁基磷酸盐)用于灭活病毒是优选的。用氯酸钠/TNBP也获得好的结果。最好使用重量比达15％的去垢剂。
然而，也可以经加热处理来进行病毒灭活。在这一方法中，在第一膜色谱后，对维生素K依赖性血浆组分以及蛋白C和蛋白S进行巴氏杀菌步骤。德国专利申请P43 18 435.9提出了一种合适的方法。其中使富含因子VIII的级分在稳定剂例如糖、氨基酸、二价阳离子和/或肝素存在下与三或三烷基磷酸盐任选的润湿剂接触，并且同时或者相继在从55℃到70℃范围内的某一提高的温度下处理5小时到30小时。如果需要，也可以进行过滤除去病毒。
将两种灭活病毒的方法，即用去垢剂和加热及过滤处理结合会是有利的。
在因子IX的分离中，巴氏灭菌步骤最好接着权利要求1的步骤f)进行。此后可进行另一膜色谱，除去在所述步骤中使用的化学品。最好借助膜除去添加的稳定剂，所说的膜是由通过一个间隔基处于色谱载体材料表面的DEAE或季胺化合物修饰的。不采用间隔基使相应的配体处于色谱载体材料的表面也是可能的。
在选择的条件下，稳定剂不被这一阴离子交换剂材料滞留，而各因子被吸附在色谱材料上。
也可以经超滤或渗滤除去通常由低分子量物质组成的稳定剂。然后，如果需要将形成的积累了维生素K依赖性血浆组分如蛋白C和蛋白S级分浓缩。呈现的浓缩方法涉及在温和条件下除去溶剂(通常是水)的方法。更具体地说，它们包括其中在减压下除去溶剂的方法，例如冻干(冷冻干燥)或喷雾干燥。
更具体地说，在按照本发明的方法中使用膜色谱意味着具有色谱分离进行的速度被大大加快这一优点。而且，所使用的膜可以重复使用多次。与此相反，如果使用按照现有技术的固相材料，这种材料不能重复使用，而使用一次后就需要进行处理。
用分离因子IX的过程比较详细地说明了按照本发明的方法。
实施例1用SephadexP50对解冻的血浆进行固相抽提。在吸附在固相上的物质流出后，将所形成的级分在pH7.4下调节至具有相当于10到20mM柠檬酸钠的离子强度，并且在DEAE QuickDisk(直径25mm；厚度3mm)中进行膜色谱。压力约3巴。然后，在5ml/min的流速下进行色谱。合并液含有因子II和因子VII的混合物，可进行进一步的分离。后来从柱中流出的峰含有因子IX和因子X的混合物。用梯度洗脱(从所说的起始缓冲溶液向作为缓冲溶液B的含有1M NaCl及10-20mM柠檬酸钠(pH7.4)的缓冲溶液变化)进行膜色谱。如果使用具有配体高表面占有的强阴离子交换剂，则可获得更大的载量。某些限制性因素由材料的选择性构成。洗脱梯度的进程取决于载体上配体表面占有的程度。
将包含因子IX和因子X的混合物进行进一步的色谱。使用的膜色谱材料的载量等于或大于颗粒形式的材料的载量，两种载量均依据材料的量。
实施例2按Journal of Chromatography，632(1993)，1-10中所述的方法处理按照实施例1的方法回收的并含有因子IX/X的级分。将按照实施例1的方法获得的包含因子IX/X的级分进行紧密片状物上的肝素亲和层析。在具有相对低的离子强度的缓冲液中加样后，用具有约500mOsm离子强度的缓冲液冲洗材料。然后用梯度溶液(从约500mOsm开始增加至约1,000mOsm)洗脱因子IX。由此洗脱的因子IX具有高的纯度。从第一分离步骤开始，因子IX的回收率为约87％。
权利要求
1.一种制备既含有经病毒灭活的维生素K依赖性血浆组分又含有蛋白C和蛋白S、因子II、因子VII、因子IX和/或因子X以及其组合物的药剂例如PPSB制剂的方法，其中对含有这些组分的原料源按以下方法步骤进行处理a)在相对低的离子强度下，对阴离子交换剂材料上的含有待分离组分的原料源进行固相抽提，该阴离子交换剂处于疏松块状物中、膜上、紧密片状物上，除去形成的洗脱物，如果需要，对洗脱物进行进一步的处理以回收其它物质；b)洗脱吸附在固相上的物质；c)任选地调节包含洗脱物级分的离子强度和/或pH值至随后的纯化步骤所需的条件下d)阴离子交换剂膜色谱、亲和膜色谱、以及疏水作用色谱，其中亲和膜色谱采用固定化的，高或低分子量的物质进行，所述物质对维生素K依赖性血浆组分以及蛋白C和蛋白S具有高亲和力；e)经改变离子强度、极性和/或pH值的逐步洗脱进行单个组分的分级分离；f)任选地进行膜亲和色谱；g)任选地收集含有还未被除去的产物的洗脱物，任选地经重复步骤f)进行所述洗脱物的进一步分级分离，其中使用合适的亲和材料；h)在消除亲和键合的条件下洗脱结合到亲和材料上的物质，接着浓缩洗脱物，任选地减低用于从亲和材料洗脱的试剂的量；并且在每一色谱纯化步骤前借助离子和/或非离子去垢剂灭活病毒和/或经加热处理和/或过滤灭活病毒，以便在合适的阶段除去病毒。
2.按照权利要求1的方法，其中含有维生素K依赖性血浆组分例如蛋白C和蛋白S的原料源是新鲜或解冻状态的血浆。
3.按照权利要求1和/或2的方法，其中的固相抽提是借助由碱性基团修饰的交联多糖，例如Sephadex，或借助经适当修饰的阴离子交换剂膜进行的。
4.按照权利要求1到3至少之一的方法，其中所说的膜色谱通过用已由DEAE或季胺修饰的膜，或者通过用已由低或高分子量的能与所需血浆组分特异性结合的亲和配体修饰的膜(膜亲和色谱)进行。
5.按照权利要求1到4至少之一的方法，其中所说的亲和色谱是肝素膜亲和色谱，采用针对待分离物质的固定化抗体的膜免疫亲和色谱或使用具有疏水配体的膜的膜亲和色谱。
6.按照权利要求5的方法，其中用于修饰色谱载体的所说疏水配体是2-羟氨烷基基团，例如2-羟氨丙基，和/或疏水配体例如丙基、丁基、苯基基团和其它在疏水性上表现出某些渐变的类似配体。
7.按照权利要求1到6至少之一的方法，其中的色谱步骤后的离子强度的调节用稀释或脱盐过程例如渗滤或超滤，或用添加增加离子强度的试剂进行。
8.按照权利要求1到7至少之一的方法，其中的病毒灭活采用在二或三烷基磷酸盐化合物例如三-正丁基磷酸盐的存在下，用去垢剂例如离子的和/或非离子的去垢剂处理色谱纯化后获得的级分来进行。
9.按照权利要求1到8至少之一的方法，其中的病毒灭活是通过在稳定剂例如糖、氨基酸、二价阳离子和/或肝素存在下，在55℃到70℃将级分加热5到10小时进行的。
10.按照权利要求9的方法，其中的稳定剂经脱盐方法例如渗滤或超滤、肝素亲和色谱或阴离子交换剂色谱除去，或者在由DEAE或季胺化合物修饰的载体或由疏水配体修饰的载体上除去。
11.按照权利要求1到10至少之一的方法，其中的色谱材料是排列成疏松块状的颗粒材料，包埋在膜中的材料和/或由所述各种材料制成的紧密片状物。
12.按照权利要求1到11至少之一的方法，其中所获得的级分用冷干或喷雾干燥浓缩。
全文摘要
公开了一种制备含有既含有经病毒灭活的维生素K依赖性血浆组分又含有蛋白C和蛋白S、因子Ⅱ、因子Ⅶ、因子Ⅸ和/或因子Ⅹ以及其组合物的药剂例如PPSB制剂的方法，其中用合适的分离方法，特别是用膜色谱法处理含有这些组分的原料源。
文档编号C07K14/745GK1137292SQ94194445
公开日1996年12月4日 申请日期1994年12月7日 优先权日1993年12月10日
发明者D·佐西克, A·施特兰卡 申请人:奥克塔法马有限公司