1.本发明属于有机化合物合成与医药应用技术领域，具体涉及一种5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶类化合物及其制备方法与应用。


背景技术：

[0002]
艾滋病是由人体免疫缺陷病毒(hiv-1)感染并导致人体防御机能缺陷而易于引发机会性感染和肿瘤的临床综合征。目前全球约有3800万艾滋病毒感染者，每年约有170万的新发感染者；而在我国，艾滋病流行已经进入快速增长期，目前感染人数已超过100万，但我国在临床上用于免费治疗的抗艾滋病药物大多为专利过期的仿制药物，品种少，毒副作用大，且在长期的临床应用中易产生了严重的耐药性，无法满足患者的临床需求。因此，立足自主创新，研发具有自主知识产权的治疗艾滋病的原创性新药，为国民提供安全、有效和价廉的抗艾滋病药物，是面向国家发展战略和人民生命健康的重大需求。
[0003]
依曲韦林(etravirine,etr)和利匹韦林(rilpivirne,rpv)是经美国fda批准的第二代抗艾滋病上市药物，二者均属于hiv-1非核苷类逆转录酶抑制剂(nnrtis)。它们对hiv-1野生株和临床上常见的单突变株均具有高效的抑制活性，但是随着它们在临床上的广泛应用，目前在临床上出现了多种针对它们的突变株。例如，依曲韦林对双突变株k103n/y181c的活性(ec
50
＝45.4nm)以及利匹韦林对双突变株f227l/v106a的活性(ec
50
＝81.6nm)均大幅降低。在我们的前期工作中(j.med.chem.2019,62,1484-1501)，经基于靶标的合理药物设计得到抗hiv-1候选药物13c2，其对hiv-1野生株、常见单突变株和双突变株f227l/v106a具有高效的抗病毒活性，但是对双突变株k103n/y181c，其活性与野生株相比降低了约26倍。因此，急需对其进行结构修饰，以发现新一代具有高效抗耐药性的抗艾滋病候选药物。
[0004]


技术实现要素：

[0005]
本发明针对现有技术的不足，提供了一种5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶类化合物及其制备方法；本发明还提供了5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶类化合物在制备抗艾滋病毒药物中的应用。
[0006]
本发明的技术方案如下：
[0007]
一、5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶类化合物
[0008]
本发明的5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐，是具有如下通式i或ii所示的结构：
[0009][0010]
其中，r为：so2nh2，so2ch3，conh2，nhso2nh2，nhso2ch3，no2，nh2，cf3，oh，cooh，ch2oh，co2me，f，cl，br，ch3，och3；取代基为邻、间、对位单取代或多取代。
[0011]
根据本发明优选的，本发明的5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶类化合物为如下之一：
[0012]
[0013][0014]
二、5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶类化合物的制备方法
[0015]
(1)5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶类化合物i的制备方法，步骤包括：以2,4-二氯-5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶a为起始原料，首先在n,n-二甲基甲酰胺溶液中与(e)-3,5-二甲基-4-羟基苯丙烯腈生成中间体b；然后中间体b与n-boc-4-氨基哌啶发生亲核取代反应生成中间体c，中间体c经三氟乙酸中脱boc保护得中间体d，最后d与各种取代氯苄或溴苄反应生成目标产物i。
[0016]
合成路线一如下：
[0017][0018]
试剂及条件：(i)(e)-3,5-二甲基-4-羟基苯丙烯腈，n,n-二甲基甲酰胺，碳酸钾，20℃；(ii)n-boc-4-氨基哌啶，n,n-二甲基甲酰胺，碳酸钾，100-120℃；(iii)三氟乙酸，二氯甲烷，20℃；(iv)取代氯苄或溴苄，n,n-二甲基甲酰胺，碳酸钾，20-40℃。
[0019]
(2)5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶类化合物ii的制备方法，步骤包括：以对位取代的氟苯a1为初始原料，在二甲基亚砜中与4-boc-氨基哌啶反应得中间体b1，b1经三氟乙酸脱boc得中间体c1，最后中间体c1和b经亲核取代反应得到目标产物ii。
[0020]
合成路线二如下：
[0021][0022]
试剂及条件：(i)4-boc-氨基哌啶，二甲基亚砜，120℃；(ii)三氟乙酸，二氯甲烷，20℃；(iii)化合物b，n,n-二甲基甲酰胺，碳酸钾，100-120℃；
[0023]
r同上述通式i或ii所示。
[0024]
三、5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶类化合物的应用
[0025]
本发明公开了5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶类化合物抗hiv-1活性筛选结果及其作为抗艾滋病毒抑制剂的首次应用。实验结果证明本发明的5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶类化合物可用于制备抗艾滋病毒药物。
[0026]
目标化合物的抗hiv-1的活性实验及成药性评价
[0027]
对按照上述方法合成的5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶类化合物进行了细胞水平的抗hiv-1野生株iiib，突变株k103n、y181c、e138k、f227l/v106a以及k103n/y181c的活性筛选，以依曲韦林(etr)和利匹韦林(rpv)为阳性对照。它们的抗hiv-1活性如表1所示，化合物e3和f2的药代动力学参数如表2所示。
[0028]
由表1可以看出，本发明的5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶类化合物表现出了极强的抗hiv-1野生株和突变株活性。化合物e3和f2的活性尤为突出，尤其对双突变株f227l/v106a以及k103n/y181c，抗耐药性显著提高，均具有优于上市药物etr的活性，
[0029]
由表2可以看出，e3在大鼠中的半衰期为1.05h，生物利用度为32.1％；f2在大鼠中的半衰期为1.47h，生物利用度为16.6％。结果说明化合物e3和f2均具有良好的药代动力学性质，可作为制备抗hiv的候选药物加以利用开发。
[0030]
因此，本发明的5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶类化合物可作为非核苷类hiv-1抑制剂应用。具体地说，作为hiv-1抑制剂用于制备抗艾滋病药物。
[0031]
一种抗hiv-1药物组合物，包括本发明的5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶类化合物和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。
[0032]
本发明提供了结构全新的5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶类化合物、其制备方法、其抗hiv-1活性筛选结果及其在抗病毒领域中的首次应用。经过试验证明，本发明的5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶类化合物可作为hiv-1非核苷类逆转录酶抑制剂应用并具有很高的应用价值。具体地说，作为hiv-1抑制剂用于制备抗艾滋病药物。
具体实施方式
[0033]
通过下述实例有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容，在下列实例中，所有目标化合物的编号与表1相同。
[0034]
合成路线1：
[0035][0036]
试剂及条件：(i)(e)-3,5-二甲基-4-羟基苯丙烯腈，n,n-二甲基甲酰胺，碳酸钾，20℃；(ii)n-boc-4-氨基哌啶，n,n-二甲基甲酰胺，碳酸钾，120℃；(iii)三氟乙酸，二氯甲烷，20℃；(iv)取代氯苄或溴苄，n,n-二甲基甲酰胺，碳酸钾，20-40℃。
[0037]
合成路线2：
[0038][0039]
试剂及条件：(i)(e)-3,5-二甲基-4-羟基苯丙烯腈，n,n-二甲基甲酰胺，碳酸钾，20℃；(ii)c1，n,n-二甲基甲酰胺，碳酸钾，120℃。
[0040]
实施例1.2-(哌啶-4-胺)-4-(2,6-二甲基-4-氰基乙烯基苯氧基)5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶(d)的合成
[0041]
2,4-二氯5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶(a,1.72g,10mmol)、4-羟基-3,5-二甲基苯丙烯腈(1.73g,10mmol)和碳酸钾(1.70g,12mmol)加入到30ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，室温搅拌5h。然后慢慢地向反应液中加入25ml冰水，过滤，干燥，得到白色固体即为化合物b。esi-ms:m/z 328.3[m+1]
+
,350.4[m+na]
+
.c
17h14
cln3o2(327.08).
[0042]
将化合物b(3.2g,10mmol)，n-boc-4-氨基哌啶(2.4g,12mmol)与碳酸钾(2.8g,20mmol)于50ml的dmf中，120℃下反应6h。反应冷却后，慢慢地将反应液倒入200ml水中，生成大量的白色固体。过滤，干燥得粗品c，化合物c不经纯化直接投入下一步。
[0043]
称取c(0.49g,1.0mmol)溶于4ml二氯甲烷中，然后向反应液中加入三氟乙酸(0.74ml,10mmol)，室温条件下反应5h。向反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，调节ph为9。然后用二氯甲烷萃取，加入饱和氯化钠溶液水洗，无水硫酸钠干燥有机层。最后经柱层析分离得到中间体d，收率66％。esi-ms:m/z 392.4[m+1]
+
,c
22h25
n5o2(391.20).
[0044]
实施例2.目标化合物e的合成
[0045]
将化合物d(0.39g,1.0mmol)、碳酸钾(0.28g,2.0mmol)与取代苄基(1.2mmol)加入到10ml dmf中，室温条件下搅拌3-8h(tlc检测)。向反应溶液中加入40ml水，然后用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥有机相，最后经快速柱层析分离得目标化合物e。
[0046]
以不同的取代苄基和中间体d用上述方法分别制得目标化合物e1-6，结果如下：
[0047][0048]
操作同上，所不同的是使用d和4-溴甲基苯磺酰胺，产物为e1，白色固体，收率：84％。
[0049]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.78(d,j＝7.8hz,2h),7.60(d,j＝16.4hz,1h,arch＝),7.48-7.45(m,4h),7.37-7.24(m,2h),7.08(s,1h,nh),6.41(d,j＝16.7hz,1h,＝chcn),4.92(s,2h,o-ch2),4.76(s,2h,o-ch2),3.78-3.37(m,3h),2.92-2.56(m,2h),2.08(s,6h),1.88-1.13(m,6h).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ163.0,162.9,150.5,148.5,143.1,131.7,131.6,129.4,128.9,128.3,126.9,126.0,119.3,96.6,69.4,61.9,52.6,31.6,16.5.esi-ms:m/z 561.3[m+1]
+
,583.4[m+na]
+
[0050][0051]
操作同上，所不同的是使用d和4-(甲磺酰基)苄溴，产物为e2，白色固体，收率：82％。
[0052]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.90-7.86(m,2h),7.60-7.58(m,1h,arch＝),7.54(d,j＝7.8hz,2h),7.44(s,2h,c3,c
5-ph-h),7.31-6.99(m,1h),6.40(d,j＝16.6hz,1h,＝chcn),5.00-4.87(m,2h,o-ch2),4.76(s,2h,o-ch2),3.63-3.39(m,3h),3.20(s,3h,so2ch3),2.85-2.56(m,2h),2.08(s,6h),1.83-1.07(m,6h).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ163.0,162.9,150.5,149.2,148.5,145.4,139.8,139.5,131.7,131.6,129.7,128.5,127.3,119.4,96.6,72.4,69.5,62.6,61.8,52.6,44.1,31.6,16.5.esi-ms:m/z 560.2[m+1]
+
,582.8[m+na]
+
.c
30h33
n5o4s(559.23).
[0053][0054]
操作同上，所不同的是使用d和4-氯甲基苯甲酰胺，产物为e3，白色固体，收率：74％。
[0055]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.79(d,j＝8.0hz,2h),7.60(d,j＝16.3hz,1h,arch＝),7.54-7.45(m,2h),7.44(m,2h,c3,c
5-ph-h),7.37-7.24(m,2h),7.07(s,1h,nh),6.40(d,j＝16.4hz,1h,＝chcn),4.94-4.92(m,2h,o-ch2),4.76(s,2h,o-ch2),3.65-3.37(m,3h),2.90-2.61(m,2h),2.08(s,6h),1.88-1.09(m,6h).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ163.0,162.8,150.5,148.5,143.1,139.5,131.8,129.4,128.9,128.5,127.0,126.3,119.3,96.6,72.5,69.4,61.7,52.6,31.6,16.5.esi-ms:m/z 525.3[m+1]
+
,547.5[m+na]
+
.c
30h32
n6o3(524.25).
[0056][0057]
操作同上，所不同的是使用d和对硝基溴化苄，产物e4，白色固体，收率：88％。
[0058]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.19(d,j＝8.3hz,2h,c3,c
5-ph
’‑
h),7.61-7.54(m,3h),7.44(s,2h,c3,c
5-ph-h),7.36-7.00(m,1h),6.40(d,j＝16.6hz,1h,＝chcn),4.90(s,2h,o-ch2),4.76(s,2h,o-ch2),3.64-3.44(m,3h),2.87-2.58(m,2h),2.07(s,6h),1.87-1.16(m,6h).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ163.1,162.9,150.5,148.5,147.5,146.9,131.7,131.6,130.0,128.5,123.8,119.3,96.6,72.3,69.5,61.6,52.6,31.6,29.0,26.8,16.5.esi-ms:m/z 527.5[m+1]
+
.c
29h30
n6o4(526.23).
[0059][0060]
操作同上，所不同的是使用d和对氨基溴苄,产物为e5，白色固体，收率：51％。
[0061]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.66-7.55(m,2h),7.45(s,2h,c3,c
5-ph-h),7.08-7.05(m,1h),6.54(d,j＝7.0hz,2h),6.42(d,j＝16.7hz,1h,＝chcn),5.89(s,1h,nh),5.28(s,2h,nh2),4.92(s,2h,o-ch2),4.77(s,2h,o-ch2),4.09-3.60(m,3h),2.87-2.70(m,2h),2.08(s,6h),1.90-1.04(m,6h).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ163.0,162.7,150.4,148.5,131.7,128.5,123.7,119.3,118.3,113.9,96.7,95.6,72.4,69.5,29.5,16.6.esi-ms:m/z 497.5[m+1]
+
,519.7[m+na]
+
.c
29h32
n6o2(496.26).
[0062][0063]
操作同上，所不同的是使用d和对三氟甲基氯苄，产物为e6，白色固体，收率：77％。
[0064]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.67(d,j＝7.8hz,2h,c3,c
5-ph
’‑
h),7.64-7.55(m,1h),7.49(d,j＝7.9hz,2h,c2,c
6-ph
’‑
h),7.44(s,2h,c3,c
5-ph-h),7.24-7.08(m,1h),6.40(d,j＝16.7hz,1h,＝chcn),4.90(s,2h,o-ch2),4.76(s,2h,o-ch2),3.57-3.39(m,2h),2.82-2.56(m,3h),2.07(s,6h),1.93-1.13(m,6h).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ163.0,162.9,150.5,144.2,131.7,131.6,129.7,128.5,126.1,125.5,125.4,123.4,119.3,96.7,69.4,61.9,52.6,31.5,29.0,16.5.
[0065]
实施例3.化合物f的合成
[0066]
将化合物d(0.39g,1.0mmol)、碳酸钾(0.28g,2.0mmol)与化合物c1(1.2mmol)加入到10ml dmf中，120℃下反应6h。反应冷却后，慢慢地将反应液倒入50ml水中，然后用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥有机相，最后经快速柱层析分离得目标化合物f1-2。
[0067][0068]
操作同上，所不同的是使用d和n-(4-(4-氨基哌啶-1-基)苯基)氨基磺酰胺，产物为f1，白色固体，收率：29％。
[0069]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.67(s,1h,nh),7.68(d,j＝16.4hz,1h,arch＝),7.52(s,2h,c3,c
5-ph-h),7.48-7.45(m,2h),7.25(d,j＝8.1hz,2h,c3,c
5-ph
’‑
h),6.90(d,j＝8.1hz,2h,c2,c
6-ph
’‑
h),6.51(d,j＝16.7hz,1h,＝chcn),5.04(s,2h,o-ch2),4.90(s,2h,o-ch2),3.39(s,2h,ph-ch2),3.09(t,j＝4.8hz,4h,c3,c
5-piperazine-h),2.39(t,j＝4.8hz,4h,c2,c
6-piperazine-h),2.10(s,6h).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ173.9,162.8,160.6,152.2,150.5,139.5,131.9,131.8,130.8,129.1,128.6,119.4,118.6,104.5,96.8,72.2,69.5,61.5,52.1,45.9,16.5.esi-ms:m/z 562.2[m+1]
+
,584.5[m+na]
+
.c
28h31
n7o4s(561.22).
[0070][0071]
操作同上，所不同的是使用d和n-(4-(4-氨基哌啶-1-基)苯基)甲磺酰胺，产物为f2，白色固体，收率：79％。
[0072]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.69(s,1h,nh),7.69(d,j＝16.7hz,1h,arch＝),7.54(s,2h,c3,c
5-ph-h),7.25(d,j＝7.7hz,2h,c3,c
5-ph
’‑
h),6.91(d,j＝8.1hz,2h,c2,c
6-ph
’‑
h),6.50(d,j＝16.7hz,1h,＝chcn),5.06(s,2h,o-ch2),4.88(s,2h,o-ch2),3.37(s,2h,ph-ch2),3.09(t,j＝4.9hz,4h,c3,c
5-piperazine-h),2.88(s,3h,so2ch3),2.39(t,j＝4.8hz,4h,c2,c
6-piperazine-h),2.10(s,6h).
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ173.9,162.8,160.6,152.2,150.5,139.5,131.9,131.8,130.8,129.1,128.6,119.4,118.6,104.5,96.8,72.2,69.5,61.5,52.1,45.9,34.1,16.5.esi-ms:m/z 561.4[m+1]
+
,583.6[m+na]
+
.c
29h32
n6o4s(560.22).
[0073]
实施例4：目标化合物的体外抗hiv活性测试实验
[0074]
测试原理
[0075]
化合物体外抗hiv活性筛选采用mtt法。mtt全称为溴化-3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑氮(商品名：噻唑蓝)，可用于检测细胞的存活和生长。检测原理为：mtt可以与活的细胞内琥珀酸脱氢酶结合还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒沉积在细胞中，而死细胞并无此功能。二甲基亚砜可以溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪检测其在590nm下的吸光度(a)值可以间接的反映活细胞的数量。在一定的细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。
[0076]
由于hiv感染的mt-4细胞在一定时间内(5-7天)会发生病变，因此向hiv感染的mt-4细胞悬浊液中加入适当浓度的待检测化合物溶液，经过一段时间(5-7天)的培养后，用mtt分析法测定mt-4细胞活力，得到保护50％细胞免于细胞病变的药物浓度(ec
50
)即可得出目标化合物的抗hiv的活性。
[0077]
测试材料和方法
[0078]
(1)hiv-1(iiib)、各种hiv-1耐药株：由比利时鲁汶大学医学院rega研究所提供。
[0079]
(2)mt-4细胞：由比利时鲁汶大学医学院rega研究院提供。
[0080]
(3)mtt：购自美国sigma公司。
[0081]
(4)样品处理：样品溶于dmso配成适当浓度，并用双蒸水作5倍稀释，各5个稀释度。
[0082]
(5)阳性对照药：依曲韦林(etr)和利匹韦林(rpv)。
[0083]
(6)测试方法：样品稀释后加入到hiv感染mt-4细胞悬浊液中，经过一段时间后用mtt比色法测定细胞活力，用酶标仪中记录在590nm下的吸光度(a)值,计算出ec
50
。
[0084]
(7)mtt比色法：加入样品溶液培养一段时间后，向每孔加入mtt溶液(5mg/ml)20μl，继续培养若干小时后，弃染色液，并向每孔加入150μl dmso，充分混合，用酶标仪中测定
590nm下的吸光度(a)值。
[0085]
实验方法
[0086]
在96孔细胞培养板上，加入50μl含1
×
104mt-4细胞培养液，再分别加入20μl感染hiv-1的mt-4细胞混悬液(每毫升含100倍ccid
50
)，然后加入不同浓度的待测化合物溶液或者阳性对照药物，每个浓度设计3个复孔。接着细胞在5％co2氛围，37℃下培养5天，向每个孔中加入20μl(5mg/ml)mtt溶液，继续培养2小时，然后加入dmso，使用酶标仪测定反应溶液在540nm处的吸收度，计算化合物不同浓度下的细胞增值率p％。同时设空白和阳性药物对照组，由此计算化合物保护50％的细胞免于hiv诱导的细胞病变所需浓度(ec
50
)。
[0087]
按照上述实验方法对合成的部分5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶类化合物进行了细胞水平的抗hiv-1野生株iiib，单突变株k103n、y181c、e138k以及双突变株f227l/v106a、k103n/y181c的活性筛选，活性结果如表1所示。
[0088]
表1部分5,7-二氢呋喃并[3,4-d]嘧啶类化合物和阳性药物的抗hiv-1活性
[0089][0090]
注：aec
50
:保护50％感染hiv-1的mt-4细胞免于细胞病变的化合物浓度；
[0091]
实施例5：化合物e3和f2的药代动力学评价
[0092]
测试材料
[0093]
待测化合物、色谱甲醇、肝素购、纯净水、eppendorf 5415d型离心机、agilent 1200lc/msd液相色谱质谱联用仪、移液枪(ika)、大鼠灌胃针、健康雄性sd大鼠。
[0094]
实验方法
[0095]
12只雄性sd大鼠随机分成4组，每组3只。给药前禁食12h，自由饮水。e3和f2单次口服剂量为10mg/kg，在给药前以70％的peg400和30％的生理盐水配制成给药制剂。灌胃后分别在5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h和12h，经锁骨静脉窦采血约0.2ml，血样置于肝素化的离心管中，2200g离心15min后，取上清血浆样品保存于-20℃备用。尾静脉注射试验剂量2mg/kg，注射后分别在2min、5min、15min、30min、1h、2h、4h和8h，经锁骨静脉窦采血约0.2ml，血样处理同前。
[0096]
应用lc-ms分析方法进行血浆样品中e3和f2浓度的测定。使用das 2.0药代动力学
程序的非房室模型对测定的血浆药-时数据进行拟合分析，计算主要药代动力学参数c
max
、auc、t
max
、t
1/2
、cl等参数，并绘制出平均血药浓度-时间曲线。
[0097]
按照如下公式进行生物利用度的计算：
[0098]
f(％)＝[auc(po)
×
div]/[auc(iv)
×
dpo]
×
100％
[0099]
auc：曲线下面积；d：给药剂量
[0100]
表2.化合物e3和f2的药代动力学参数
[0101]