1.本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种鸭坦布苏病毒质粒载体、弱毒株及其制备方法和应用。
背景技术：
2.鸭坦布苏病毒(dtmuv)是能引起蛋鸭产蛋下降综合征，甚至致死性脑炎的一种新型黄病毒。自2010年在中国东南沿海地区首次爆发以来，迅速扩散大到全国多个省市，给我国的养鸭产业造成了巨大的经济损失。经病原的分离与鉴定确定引起该病的病原为鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus，dtmuv)。
3.当前对该病的防控措施主要还是通过疫苗免疫来进行，虽然已有商品化的减毒活疫苗和灭活疫苗，但已有的商品化灭活疫苗免疫效果不够理想，需要多次增强免疫，加大了鸭群的应激反应。而现有的减毒活疫苗都是通过传统连续传代方式获得，安全风险较高。所以，当前的dtmuv的疫苗仍有很大的提高空间，尤其尤其需要研制一种安全性高、免疫效果好的dtmuv减毒活疫苗。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于解决现有技术中存在的鸭坦布苏病毒减毒活疫苗安全性低、免疫效果差的问题，提供一种鸭坦布苏病毒质粒载体、弱毒株及其制备方法和应用。
5.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种质粒载体，所述质粒载体的核苷酸序列如seq id no.1所示。
6.优选地，所述质粒载体命名为pacyc-cqw1-ires-mc，所述质粒载体包含ires元件，所述ires元件的核苷酸序列如seq id no.16所示。
7.优选地，将质粒载体pacyc-cqw1-ires-mc中的ires元件的5’端序列进行截短，截短后的ires元件命名为mini-ires元件，所述mini ires元件的核苷酸序列如seq id no.22所示；获得的截短后的质粒载体命名为pacyc-cqw1-mini-mc。
8.进一步优选，所述pacyc-cqw1-ires-mc的制备方法包括以下步骤：
9.s1、以pacyc-fl-tmuv质粒为模板，以序列seq id no.3和seq id no.4为引物，pcr扩增得到片段p1a；以ires-rluc-pa质粒为模板，以序列seq id no.5和seq id no.6为引物，pcr扩增得到片段p1b，所述p1b为ires元件；以puc57-mc质粒为模板，以序列seq id no.7和seq id no.8为引物，pcr扩增得到片段p1c，mc基因进行了同义密码子突变，但不改变mc的氨基酸残基的序列,防止潜在的rna重组的影响；以pacyc-fl-tmuv质粒为模板，以序列seq id no.9和seq id no.10为引物，pcr扩增得到片段p1d；通过融合pcr将片段p1a、p1b、p1c和p1d依次进行融合，获得片段p1-ires-mc；将片段p1-ires-mc与线性化后的pacyc-cqw1-p2-6质粒进行连接，筛选获得pacyc-cqw1-p2-6-ires-mc质粒；
10.s2、以pacyc-fl-tmuv质粒为模板，以序列seq id no.11和seq id no.12为引物，pcr扩增得到片段δc-a；再以序列seq id no.13和seq id no.14为引物，pcr扩增得到片段
δc-b；通过融合pcr将片段δc-a和片段δc-b连接起来，获得δc片段；
11.s3、将δc片段与线性化后的pacyc-cqw1-p2-6-ires-mc质粒进行连接，筛选获得质粒载体pacyc-cqw1-ires-mc。
12.本发明提供上述质粒载体在黄病毒减毒活疫苗制备中的应用。
13.本发明还提供一种鸭坦布苏病毒弱毒株的制备方法，将上述质粒载体进行体外rna转录，然后将体外转录的rna转染bhk-21细胞，获得鸭坦布苏病毒弱毒株。
14.本发明同时提供由上述制备方法获得的鸭坦布苏病毒弱毒株及该鸭坦布苏病毒弱毒株在鸭坦布苏减毒活疫苗制备中的应用。
15.本发明所具有的有益效果：
16.一)本发明将鸭坦布苏cqw1株病毒的结构蛋白c(capsid)蛋白在病毒基因组内进行了异位表达，即把原本的c蛋白删除后，利用内部核糖体进入位点(ires元件或mini-ires元件)在病毒的3’utr区域表达同义密码子更换的c蛋白，由于独立于病毒多聚蛋白表达的c蛋白无法被ns2a有效募集到病毒的组装位点，导致其病毒粒子的组装过程受损，显著降低病毒组装/释放过程的效率，因此获得了两株重组致弱病毒(cqw1-ires-mc病毒株和cqw1-mini-mc病毒株)。
17.二)本发明制备的重组致弱病毒(cqw1-ires-mc病毒株和cqw1-mini-mc病毒株)在bhk-21细胞上的复制显著降低，对鸭胚和雏鸭的毒力显著减弱，不引起任何临床症状，并且引入的突变设计都具有良好的遗传稳定性，10代以内未恢复到野生型基因组和毒力水平。同时单剂量cqw1-ires-mc病毒或cqw1-mini-mc病毒就能为雏鸭提供完全的攻毒保护，是制备鸭坦布苏减毒活疫苗的非常优秀的候选病毒株。
附图说明
18.图1为实施例2中质粒载体pacyc-cqw1-ires-mc和pacyc-cqw1-mini-mc的构建示意图；
19.图2为实施例3中鸭坦布苏病毒弱毒株cqw1-ires-mc、cqw1-mini-mc转染bhk21细胞后f0代和f1代的荧光信号图；
20.图3为实施例4中鸭坦布苏病毒弱毒株cqw1-ires-mc和cqw1-mini-mc的传代稳定性验证结果图(3a为弱毒株在bhk21细胞上的生长曲线图；3b为弱毒株的f1代和f10代的噬斑试验结果图)；
21.图4为实施例5中鸭坦布苏病毒弱毒株cqw1-ires-mc和cqw1-mini-mc对鸭胚的毒力试验结果图；
22.图5为实施例6中鸭坦布苏病毒弱毒株cqw1-ires-mc和cqw1-mini-mc在25日龄雏鸭体内诱导的免疫反应结果图(5a为免疫后，脾组织的ifn-α，ifn-β，il-1β和tnf-α的mrna表达情况图；5b为鸭外周血的t淋巴细胞特异性增殖数据图；5c为鸭血清中的th1型细胞因子ifnγ和th2型细胞因子il-4的表达水平数据图)；
23.图6为实施例7中鸭坦布苏病毒弱毒株cqw1-ires-mc和cqw1-mini-mc对5日龄spf雏鸭的致病性及其免疫保护力试验结果图(6a为试验流程图；6b为雏鸭免疫后及免疫攻毒后的体重变化图；6c为雏鸭免疫后临床症状统计图；6d为雏鸭免疫后死亡统计图；6e为雏鸭免疫攻毒后病毒血症滴度统计图；6f为雏鸭免疫攻毒后临床症状统计图；6g为雏鸭免疫攻
毒后死亡统计图)。
具体实施方式
24.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
25.质粒、细胞及实验动物：payc-fl-tmuv，ires-rluc-pa质粒，payc-cqw1-p2-6质粒、bhk21细胞、野生型鸭坦布苏病毒株dtmuv-cqw1、anti-tmuv的多抗均由四川农业大学动物医学院禽病防治中心提供；spf雏鸭和spf鸭胚购自哈尔滨兽医研究所；鸭坦布苏病毒株dtmuv-chn-yc由华中农业大学动物医学院赠与；puc57-mc质粒由擎科生物进行全基因合成。
26.主要试剂盒：clonexpress ii one step cloning kit购自南京诺唯赞生物；phanta evo hs super-fidelity dna polymerase购自南京诺唯赞生物；转染试剂lipofectamine messengermax reagent购自invitrogen。
27.实施例1
28.构建质粒载体pacyc-cqw1-ires-mc
29.以pacyc-fl-tmuv质粒为模板，以序列seq id no.3和seq id no.4为引物，pcr扩增得到片段p1a；以ires-rluc-pa质粒为模板，以序列seq id no.5和seq id no.6为引物，pcr扩增得到片段p1b，所述p1b为ires元件；以puc57-mc质粒为模板，以序列seq id no.7和seq id no.8为引物，pcr扩增得到片段p1c，puc57-mc质粒为全基因合成，puc57-mc质粒中对mc基因(表达鸭坦布苏病毒的结构蛋白c)进行了同义密码子突变，但不改变mc的氨基酸残基的序列,防止潜在的rna重组的影响；以pacyc-fl-tmuv质粒为模板，以序列seq id no.9和seq id no.10为引物，pcr扩增得到片段p1d；通过融合pcr将片段p1a、p1b、p1c和p1d依次进行融合，获得片段p1-ires-mc；将片段p1-ires-mc与线性化后的pacyc-cqw1-p2-6质粒进行连接，筛选获得pacyc-cqw1-p2-6-ires-mc质粒；
30.为了构建获得全长cdna感染性克隆，以pacyc-fl-tmuv质粒为模板，以序列seq id no.11和seq id no.12为引物，pcr扩增得到片段δc-a；再以序列seq id no.13和seq id no.14为引物，pcr扩增得到片段δc-b；通过融合pcr将片段δc-a和片段δc-b连接起来，获得δc片段；
31.将δc片段与线性化后的pacyc-cqw1-p2-6-ires-mc质粒进行连接，筛选获得质粒载体pacyc-cqw1-ires-mc。质粒载体pacyc-cqw1-ires-mc的核苷酸序列如seq id no.1所示。
32.质粒载体pacyc-cqw1-ires-mc的构建示意图详见图1，如图1所示，本实施例将鸭坦布苏病毒基因组中原本的c蛋白序列删除后，利用内部核糖体进入位点(ires元件)在病毒的3’utr区域表达同义密码子更换的c蛋白。
33.片段p1a、p1b(ires)、p1c、p1d、δc-a、δc-b、质粒puc57-mc的核苷酸序列依次如seq id no.15-21所示。本实施例中pcr扩增所用引物详见表1：
34.表1 pcr扩增引物
[0035][0036]
实施例2
[0037]
构建质粒载体pacyc-cqw1-mini-mc
[0038]
在实施例1的基础上，按照相同的方法进行pcr扩增得到片段p1a、p1c、p1d、δc-a、δc-b，以ires-rluc-pa质粒为模板，以序列seq id no.2和seq id no.6为引物，pcr扩增得到片段mini-ires，mini-ires的核苷酸序列如seq id no.22所示。按照实施例1中质粒载体的构建方法，通过融合pcr将片段p1a、mini-ires、p1c和p1d依次进行融合，获得片段p1-mini-mc；将片段p1-mini-mc与线性化后的pacyc-cqw1-p2-6质粒进行连接，筛选获得pacyc-cqw1-p2-6-mini-mc质粒；通过融合pcr将片段δc-a和片段δc-b连接起来，获得δc片段；将δc片段与线性化后的pacyc-cqw1-p2-6-mini-mc质粒进行连接，筛选获得质粒载体pacyc-cqw1-mini-mc。如图1所示，重组质粒pacyc-cqw1-mini-mc仅仅是将实施例1获得的重组质粒pacyc-cqw1-ires-mc核苷酸序列中的ires元件替换成了mini-ires元件，除此之外的其余核苷酸序列与pacyc-cqw1-ires-mc的核苷酸序列完全一致。
[0039]
质粒载体pacyc-cqw1-mini-mc的构建示意图详见图1，如图1中所示，本实施例将鸭坦布苏病毒基因组中原本的c蛋白序列删除后，利用内部核糖体进入位点(mini-ires元件)在病毒的3’utr区域表达同义密码子更换的c蛋白。本实施例将实施例1中的ires元件的5’端序列进行截短，获得mini-ires元件。与ires元件相比，mini-ires元件只保留了保证其起始翻译的基本序列，相比原本的ires元件的序列更短，但是其起始翻译的效率更低。
[0040]
本实施例中用于扩增mini-ires序列的引物详见表2。
[0041]
表2用于扩增mini-ires序列的引物
[0042][0043]
实施例3
[0044]
转染及拯救鸭坦布苏重组致弱病毒cqw1-ires-mc和cqw1-mini-mc
[0045]
将质粒载体pacyc-cqw1-ires-mc、pacyc-cqw1-mini-mc分别进行体外rna转录，然后将体外转录的rna转染bhk-21细胞，分别记为ires-mc组和mini-mc组；同时转染wt组和δc-replicon组，wt组为转染野生型鸭坦布苏病毒株dtmuv-cqw1的rna、δc-replicon为转染删除c蛋白的鸭坦布苏病毒突变株rna(δc-replicon突变株的构建详见图1中的cqw1-δc-replicon)。在转染后的第3、5天分别收样进行间接免疫荧光，检测病毒蛋白的表达情况。在转染后第5天(f0代)，收获细胞上清，接种下一代，获得f1代病毒，连续培养直至观察到细胞病变。
[0046]
如附图2所示，在f0代和f1代，相对于wt组，ires-mc和mini-mc组产生的荧光信号较弱；而在f1代感染后的第3天，wt组、ires-mc和mini-mc组仍然产生了明显的荧光信号，δc-replicon组不产生任何信号。同时在f1代感染后的第10天之后，ires-mc和mini-mc组都产生了明显的细胞病变。这些数据初步表明，弱毒株cqw1-ires-mc和cqw1-mini-mc的rna都产生了具有感染性的病毒粒子。将f1代细胞上清收获后进行了测序分析，进一步证明了这两株突变病毒被拯救成功，获得鸭坦布苏病毒弱毒株cqw1-ires-mc和cqw1-mini-mc。
[0047]
实施例4
[0048]
cqw1-ires-mc和cqw1-mini-mc突变体的传代稳定性验证
[0049]
在实施例3的基础上，设置ires组(ires-mc-f1和ires-mc-f10)、mini组(mini-mc-f1和mini-mc-f10)和wt组，ires组为实施例3中获得的cqw1-ires-mc病毒株，mini组为实施例3中获得的cqw1-mini-mc病毒株，wt组为野生型鸭坦布苏病毒株dtmuv-cqw1。将ires组、mini组和wt组分别在bhk-21细胞上连续传代10次。如附图3a所示，ires组和mini组的噬斑明显小于wt组形成的。进一步测定各组生长曲线(图3b)发现，相比于各自的f1代病毒，ires-mc-f10或mini-mc-f10的增殖都显著增强，且达到的滴度的峰值都分别提高了约10倍或100倍，但它们都显著低于wt组。测序发现，在f10代病毒的cqw1-ires-mc和cqw1-mini-mc的基因组仅分别出现了5个和3个适应性突变，突变位点如表3所示。
[0050]
表3 cqw1-ires-mc和cqw1-mini-mc基因组突变位点
[0051][0052]
实施例5
[0053]
cqw1-ires-mc和cqw1-mini-mc突变株对鸭胚的毒力验证
[0054]
在实施例4的基础上，设立ires-mc-f1组、ires-mc-f10组、mini-mc-f1组、mini-mc-f10组、mock组和wt组。其中，ires-mc-f1组为f1代的cqw1-ires-mc病毒株；ires-mc-f10组为f10代的cqw1-ires-mc病毒株；mini-mc-f1组为f1代的cqw1-mini-mc病毒株；mini-mc-f10组为f10代的cqw1-mini-mc病毒株；mock组为dmem；wt组为野生型鸭坦布苏病毒株dtmuv-cqw1。将上述各组病毒分别通过尿囊腔接种9日龄的鸭胚，每组接种3000tcid
50
的病毒，然后连续观察7天，记录死亡情况。如图4所示，wt感染组的鸭胚在5天之内全部死亡，表明wt病毒对鸭胚的毒力很强。相比之下，不论是f1还是f10代的cqw1-ires-mc和cqw1-mini-mc都没有造成任何的死亡。说明cqw1-ires-mc和cqw1-mini-mc弱毒株的鸭胚毒力显著降低，且连续传代10代后，毒力水平也没有出现明显的恢复，达到了非常好的减毒效果。
[0055]
实施例6
[0056]
cqw1-ires-mc和cqw1-mini-mc突变株在25日龄雏鸭体内诱导的免疫反应
[0057]
在实施例3的基础上，以25日龄雏鸭为模型，将25日龄雏鸭随机分为4组，包括wt组、ires-mc组、mini-mc组和mock组，每组11只。wt组通过肌肉注射200μl的wt病毒；ires-mc组通过肌肉注射200μl的cqw1-ires-mc病毒；mini-mc组通过肌肉注射200μl的cqw1-mini-mc病毒，mock组通过肌肉注射200μl的dmem。在免疫后的第5天，采取组织样品，用用rt-qpcr检测感染后第5天，脾组织的ifn-α，ifn-β，il-1β和tnf-α的mrna表达情况。第14天，分离鸭外周血的t淋巴细胞进行t细胞特异性增殖实验，测定其细胞免疫情况；用elisa测定鸭血清中的th1型细胞因子ifn-γ和th2型细胞因子il-4的表达水平。
[0058]
如附图5a所示，ires-mc组和mini-mc组都能明显激活ifn-α，ifn-β，il-1β和tnf-α的上调，且mini-mc组诱导的ifn-α，ifn-β和il-1β水平甚至比wt组更高。
[0059]
如附图5b所示，ires-mc和mini-mc组对t淋巴细胞的刺激系数分别约为5和2。如附图5c所示，相对dmem组，ires-mc和mini-mc组中th1型细胞因子ifn-γ和th2型细胞因子il-4的表达水平均显著的上调。以上数据表明cqw1-ires-mc和cqw1-mini-mc弱毒株的感染都能有效激活雏鸭的细胞免疫。
[0060]
实施例7
[0061]
cqw1-ires-mc和cqw1-mini-mc突变株对5日龄spf雏鸭的致病性及其免疫保护力
验证
[0062]
在实施例3的基础上，以5日龄的spf雏鸭为模型，随机分为4组，包括wt组、ires-mc组、mini-mc组和mock组。wt组通过肌肉注射200μl(105tcid
50
)的wt病毒；ires-mc组通过肌肉注射200μl(105tcid
50
)的cqw1-ires-mc病毒；mini-mc组通过肌肉注射200μl(105tcid
50
)的cqw1-mini-mc病毒，mock组通过肌肉注射200μl的dmem。在免疫后第1-14天，监测雏鸭的体重变化，临床症状以及死亡情况；在免疫14天后，所有组存活的雏鸭通过肌肉接种200μl(2
×
106tcid
50
)的chn-yc株dtmuv病毒，并在攻毒后14天内监测动物的体重变化、临床症状以及死亡情况。图6a为实验流程图。
[0063]
如图6b所示，在免疫后第4天开始，wt组的体重增长水平明显低于mock组，而ires-mc、mini-mc与mock组相比没有明显的差异。如图6c所示，在免疫后第3天开始，wt组的雏鸭出现精神沉郁、行动迟缓、站立不稳甚至后肢瘫痪等临床症状；如图6d所示，wt组从第5天开始出现死亡，到第7天，有70％的雏鸭死亡。而ires-mc、mini-mc和mock组未出现任何明显临床症状和死亡情况(图6c,6d)。
[0064]
如图6b所示，在攻毒后的第二天，mock组的体重显著低于ires-mc和mini-mc组，且开始出现出现精神沉郁、行动迟缓、站立不稳甚至后肢瘫痪等临床症状；而ires-mc、mini-mc组和wt组未出现任何临床症状(图6f)。检测攻毒后第3天的病毒血症情况发现，除了mock组产生了明显的病毒血症，ires-mc、mini-mc和wt组都未检测到任何临床症状(图6e)。在攻毒后的第6天，mock组的有2只雏鸭死亡。而ires-mc、mini-mc和wt组未出现任何死亡情况(图6g)。这些数据表明，单次免疫cqw1-ires-mc或cqw1-mini-mc突变病毒，即能为雏鸭提供非常显著的免疫保护效果。
[0065]
综上所述，本发明制备的重组致弱病毒(cqw1-ires-mc病毒株和cqw1-mini-mc病毒株)在bhk-21细胞上的复制显著降低，对鸭胚的毒力显著减弱，不引起任何临床症状，并且引入的突变设计都具有良好的遗传稳定性，10代以内未恢复到野生型基因组和毒力水平。同时单剂量cqw1-ires-mc病毒或cqw1-mini-mc病毒就能为雏鸭提供完全的攻毒保护，是制备鸭坦布苏减毒活疫苗的非常优秀的候选病毒株。
[0066]
本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的，在本发明基础上，本领域技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中一些技术特征做出一些替换和变形，均在本发明的保护范围内。