降解甾体化合物phomopsic acid及其用途
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，具体涉及hiv病毒潜伏期逆转剂。
背景技术：
2.艾滋病由艾滋病毒(hiv)感染引起，是人类面临的最难以捉摸的大流行病之一。艾滋病无法完全治愈的原因之一是hiv潜伏病毒库的存在，即hiv病毒可与被感染细胞的基因组整合，其中包括最具特征的宿主休眠记忆t细胞，形成潜伏状态并保持沉默，以逃避宿主免疫系统。目前广泛应用的高活性抗逆转录病毒疗法(haart)可以抑制病毒复制，但它不能完全消除潜伏的病毒。当haart停止时，hiv的潜伏病毒能够恢复主动复制形成大量新的病毒，从而导致hiv病毒无法彻底清除。因此，与haart相结合的“shock and kill”策略被认为是一种有效的治疗hiv的方法。它是基于潜伏期逆转剂(lras)激活潜伏的病毒(shock)，随后用haart和免疫反应来阻止激活病毒的传播(kill)，以达到完全清除病毒的目的。
3.lras通过不同的方式重新激活潜伏的病毒库，包括信号转导、转录调控、表观遗传修饰等，如组蛋白去乙酰化酶抑制剂(hdaci)诱导hiv-ltr染色质乙酰化和重塑，bet抑制剂(beti)拮抗brd4抑制tat反式激活。最近有两组研究表明，不同lras诱导的“shock”治疗可以在动物模型中重新激活hiv-1潜伏期，这为药物逆转病毒潜伏提供了可能。但截至目前，lras联合haart治疗的策略均未能在临床上得以实现，其显示的临床疗效较差，有效性和特异性仍需提升。究其原因，除了缺乏有效的化合物作为“kill”，还需要寻找有效的“shock”方法，将“shock”与“kill”策略结合起来。因此，寻找新型有效的lras是关键所在。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了降解甾体化合物phomopsic acid及其用途。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
6.降解甾体化合物，其结构式如式ⅰ所示：
[0007][0008]
其中，r1选自h、c1～c12的烷基或芳基；优选地，r1选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、环戊基、环己基、烯丙基、苄基、苯基、萘基等；
[0009]
其中，r2选自h、c1～c12的烷基或芳基；优选地，r2选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、环戊基、环己基、烯丙基、苄基、苯基、萘基等；
[0010]
其中，r2还可以选自酰基，该酰基的通式为r3c＝o或r3oc＝o，其中r3选自c1～c12的烷基或芳基，优选地，r3选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、环戊基、环己基、烯丙基、苄基、苯基、萘基等。
[0011]
甾体是一类含有环戊烷骈多氢菲的具有特殊结构的天然产物，是自然界中存在最广泛的化合物之一，甾核骨架上含有4个环，a、b、c环为多氢菲的三个六元环，d环为五元碳环。降解甾体化合物指的是甾体骨架上4个环中的至少一个发生开环的甾体化合物。降解甾体化合物并不常见，降解a环和b环的甾体化合物则非常罕见，其结构和生物活性的报道很少。本发明的式ⅰ所示的降解甾体化合物即为a、b两个六元环都降解的降解甾体化合物。
[0012][0013]
优选地，所述r1为h，所述r2为h，即所述降解甾体化合物为化合物phomopsic acid，其结构式如式ⅱ所示：
[0014][0015]
所述化合物phomopsic acid来源于金线莲anoectochilus roxburghii(wall.)lindl.叶片内生真菌phomopsis sp.。化合物phomopsic acid从结构上看也属于a、b两个六元环都降解的降解甾体类化合物。
[0016]
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
[0017]
上述式ⅰ所示的降解甾体化合物或其药学上可接受的衍生物在制备hiv病毒的潜伏期逆转剂(lras)中的用途。优选地，所述式ⅰ所示的降解甾体化合物为式ⅱ所示的phomopsic acid。
[0018]
所述式ⅰ所示的降解甾体化合物的药学上可接受的衍生物在体内可转化为所述式ⅰ所示的降解甾体化合物，因而具有与所述式ⅰ所示的降解甾体化合物相同或相近的活性，例如所述phomopsic acid的药学上可接受的衍生物在体内可转化为phomopsic acid，因而具有与所述phomopsic acid相同或相近的活性。具体地，所述式ⅰ所示的降解甾体化合物的药学上可接受的衍生物例如包括式ⅰ所示的降解甾体化合物的药学上可接受的盐、式ⅰ所示的降解甾体化合物的药学上可接受的酯等；所述式ⅰ所示的降解甾体化合物的药学上可接受的盐如钠盐、钾盐、钙盐等，所述式ⅰ所示的降解甾体化合物的药学上可接受的酯如乙酯
等。
[0019]
进一步地，所述式ⅰ所示的降解甾体化合物或其药学上可接受的衍生物通过激活潜伏的hiv转录实现潜伏期逆转，而且是激活tat依赖的hiv转录。优选地，所述式ⅰ所示的降解甾体化合物为式ⅱ所示的phomopsic acid。
[0020]
具体地，所述式ⅰ所示的降解甾体化合物或其药学上可接受的衍生物通过诱导brd4降解、诱导brd4-p-tefb复合物解离等方式以激活tat依赖的hiv转录。优选地，所述式ⅰ所示的降解甾体化合物为式ⅱ所示的phomopsic acid。
[0021]
优选地，所述hiv病毒为hiv-1型。
[0022]
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：
[0023]
上述式ⅰ所示的降解甾体化合物或其药学上可接受的衍生物在制备艾滋病治疗药物中的用途。所述艾滋病为hiv病毒感染引起。由于所述式ⅰ所示的降解甾体化合物具有作为潜伏期逆转剂(lras)的性质，因此其可以制备艾滋病治疗药物，通过激活潜伏的hiv转录实现潜伏期逆转，配合或不配合haart疗法以实现hiv病毒的彻底清除，进而实现艾滋病的治疗。优选地，所述式ⅰ所示的降解甾体化合物为式ⅱ所示的phomopsic acid。
[0024]
优选地，所述艾滋病由hiv-1型病毒感染引起。
[0025]
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：
[0026]
上述式ⅰ所示的降解甾体化合物或其药学上可接受的衍生物在制备hiv转录激活剂中的用途；优选地，是在制备tat依赖的hiv转录激活剂中的用途。由于所述式ⅰ所示的降解甾体化合物可以激活hiv转录，因此，所述式ⅰ所示的降解甾体化合物或其药学上可接受的衍生物不仅可用于制备lras，还可单独用于制备hiv转录激活剂，可用于科研、临床等。优选地，所述式ⅰ所示的降解甾体化合物为式ⅱ所示的phomopsic acid。
[0027]
优选地，所述hiv病毒为hiv-1型。
[0028]
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之五是：
[0029]
上述式ⅰ所示的降解甾体化合物或其药学上可接受的衍生物在制备brd4抑制剂中的用途；由于所述式ⅰ所示的降解甾体化合物可诱导brd4降解，因此所述式ⅰ所示的降解甾体化合物或其药学上可接受的衍生物可用于制备brd4的抑制剂，可用于科研、临床等。优选地，所述式ⅰ所示的降解甾体化合物为式ⅱ所示的phomopsic acid。
[0030]
本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。
[0031]
本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。
[0032]
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
[0033]
本发明从叶片内生真菌phomopsis sp.中分离出一类降解甾体化合物，作为一种低毒激活剂，在100μmol/l时，该类降解甾体化合物中的phomopsic acid对潜伏的hiv-1具有较高的激活活性，且无毒性。这是首次发现这类化合物可以激活hiv-1潜伏期。此外，本发明还发现phomopsic acid可能诱导brd4的降解。尽管尚不清楚phomopsic acid诱导brd4降解的方式，但作为一种罕见的降解类固醇，phomopsic acid通过拮抗brd4的抑制作用，使brd4-p-tefb复合物解离并激活hiv-1转录。此外，本发明的降解甾体化合物，尤其是phomopsic acid在细胞模型中具有高效率和低毒性，可作为lras的候选或与其他lras联合使用。
附图说明
[0034]
图1用于说明化合物phomopsic acid的1h-1
h cosy(粗体)和hmbc(箭头)相关性。
[0035]
图2用于说明化合物phomopsic acid相关的关键noesy。
[0036]
图3用于说明化合物phomopsic acid激活j-lat a2和2d10中潜伏的hiv-1。其中，a为j-lat a2细胞，b为2d10细胞，图中横坐标的1-25μmol/l、1-50μmol/l、1-100μmol/l分别代表phomopsic acid的浓度为25μmol/l、50μmol/l、100μmol/l，纵坐标为在不同浓度化合物phomopsic acid和阳性对照2.5μmol/l prostratin作用下egfp阳性细胞在总细胞群中的百分比。
[0037]
图4用于说明phomopsic acid激活tat依赖的hiv-1转录。其中，a为nh1细胞中转染空载体，b为nh1细胞中转染tat蛋白，图中横坐标的1代表化合物phomopsic acid，纵坐标以dmso处理下的活性设为1以体现化合物phomopsic acid处理后改变的活性倍数。误差代表三个独立测量的平均值+/-sd。
[0038]
图5用于说明phomopsic acid通过诱导brd4蛋白降解来激活hiv潜伏期。其中，a为制备f1c2细胞的核提取物，进行抗flag免疫沉淀，用western blotting分析左侧显示的蛋白；b为采用rt-qpcr分析brd4的mrna水平，并将其与gapdh的mrna水平归一化；图中的1代表化合物phomopsic acid。误差代表三个独立测量的平均值+/-sd。
具体实施方式
[0039]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0040]
实施例1
[0041]
本实施例将金线莲anoectochilus roxburghii(wall.)lindl.叶片内生真菌phomopsis sp.的发酵产物用乙酸乙酯-甲醇混合溶剂(4:1，v/v)浸泡提取，再依次用十八烷基硅烷(ods)柱层析、sephadex hl-20和反相高效液相色谱(hplc)分离，最终得到一种活性化合物，记为phomopsic acid。随后通过波谱数据(1d和2d nmr)、hr-ms数据、电子圆二色谱(ecd)计算，阐明其化学结构。
[0042]
phomopsic acid为白色无定形粉末。根据其(+)-hr-esi-ms(m/z 349.2366[m+h]+(calcd.；for c
21h33o4 349.2379)和371.2184[m+na]+(calcd.对于c
21h32
o4na，371.2198)，表明有6度不饱和。
[0043]
phomopsic acid的1h nmr数据(表1)显示五甲基的存在(δh 1.02(3h d j＝6.9hz),1.10(3h d j＝6.7hz),1.11(3h,s),1.15(3h,s)和1.16(3h,s)]和两个烯质子(δh 5.35(1h,dd,j＝15.2,8.7hz)5.43(1h,dd,j＝15.2,8.3hz)]。
[0044]
表1.phomopsic acid的1h-nmr(600mhz)和
13
c-nmr(150mhz)数据(in meod).
28.2)相关，这些构成了a部分。此外，1h-1
h cosy谱中h-5/6 1的相关性，hmbc中h-5α(δ
h 2.32-2.36)和c-7(δ
c 46.6)/c-4(δ
c 199.9),h-5β(δ
h 2.62-2.69)和c-3(δ
c 126.6),h-6β(δ
h 2.27-2.29)to c-12(δc16.9)/c-8(δ
c 179.3)/c-4(δ
c 199.9),还有h-2(δ
h 3.16)和c-1(δ
c 175.1)/c-8(δ
c 179.3)/c-4(δc199.9)的相关性，表征了b部分。以上结果结合hmbc谱中h-9β(δ
h 2.54-2.59)和c-7(δc46.6)/c-3(δ
c 126.6)，h-10α(δ
h 1.88-1.93)和c-7(δ
c 46.6)/c-8(δ
c 179.3),还有h-12(δ
h 1.16)和c-11(δ
c 57.3)共同构成了phomopsic acid的平面结构(如图1)。
[0048]
在noesy谱中，h-13与h-12、h-10β相关，而h-11与h-10α、h-14相关，说明h-13与h-12平面相同，与h-11平面相反(如图2)。c-17的构型可以通过noesy实验确定。然后对所有四种不同的绝对配置进行了理论ecd计算。如图s12所示，计算得到的(7r,11r,13r,17s)-1的ecd谱与实验得到的ecd谱吻合较好。根据以上结果，phomopsic acid的绝对构型应被认定为7r、11r、13r和17s。
[0049]
根据上述检测和分析，可以确定phomopsic acid的结构如下式ⅰ所示，命名为2-((7r,11r)-11-((13r,17s,e)-18-hydroxy-17,18-dimethylhept-15-en-13-yl)-7-methyl-4-oxo-4,5,6,7,9,10-hexahydro-11h-inden-3-yl)acetic acid(根据chemdraw里面的给的名字改了c的编号得出的系统命名)，它是一种新型降解甾类化合物。
[0050][0051]
实施例2 phomopsic acid浓度依赖性激活hiv-1转录
[0052]
j-lat a2是基于jurkat t细胞构建的一种被广泛应用的hiv-1潜伏期细胞模型，本实施例将j-lat a2细胞用于检测phomopsic acid对hiv-1的活性。j-lat a2细胞包含能够完整表达5
’‑
ltr-tat-flag-ires-egfp-3
’‑
ltr的序列，其中egfp由5
’‑
hiv-ltr调控。prostratin是hiv潜伏激活剂，作为阳性对照。本实施例分别用2.5μmol/l prostratin或25μmol/l、50μmol/l、100μmol/l的化合物phomopsic acid分别处理j-lat a2和2d10细胞24h，然后用流式细胞仪(facs)分析。结果显示以浓度梯度的化合物phomopsic acid处理j-lat a2细胞后，phomopsic acid以浓度依赖的方式激活hiv-ltr驱动的egfp表达(图3a)。除了j-lat a2细胞外，在另一种常用的基于jurkat t细胞系的细胞模型2d10中，也显示了phomopsic acid的激活作用，该细胞系几乎包含了完整的hiv基因组，只有nef基因被egfp所取代(图3b)。结果说明phomopsic acid能够激活hiv-1转录，且呈浓度依赖性。
[0053]
实施例3 phomopsic acid激活tat依赖性的hiv-1转录
[0054]
为了验证phomopsic acid诱导的hiv潜伏期激活是否取决于重要的5'-ltr或整合基因序列中的其他重要序列，本实施例使用了另一种基于hela构建的细胞系nh1，该细胞系仅包含由hiv 5'-ltr驱动的荧光素酶报告基因。本实施例在nh1细胞中转染空载体或tat蛋白，然后用dmso或100μmol/l化合物phomopsic acid处理，全细胞裂解液进行荧光素酶活性
分析。然而，phomopsic acid并没有激活nh1细胞中ltr驱动的荧光素酶的表达(图4a)。但当在nh1细胞中瞬时转染表达tat时，phomopsic acid可激活荧光素酶的表达(图4b)。这表明phomopsic acid通过5'-ltr激活hiv潜伏期，仅激活tat依赖的hiv转录，而不激活基础转录。
[0055]
实施例4 phomopsic acid诱导brd4降解并使brd4-p-tefb复合物解离。
[0056]
以往研究表明，p-tefb(正转录延伸因子b)在hiv的转录中起着关键作用，特别是brd4拮抗tat-p-tefb复合物而导致的tat依赖转录。本实施例用dmso或100μmol/l化合物phomopsic acid处理f1c2细胞24小时后，制备核提取物，进行抗flag免疫沉淀，用western blotting分析蛋白，采用rt-qpcr分析brd4的mrna水平，并将其与gapdh的mrna水平归一化。结果显示化合物phomopsic acid降低了brd4的水平，并进一步诱导了brd4-p-tefb复合物的解离(图5a)。brd4的mrna水平在phomopsic acid处理后略有升高(图5b)。因此，phomopsic acid可能诱导brd4的降解，并通过拮抗brd4的抑制来促进hiv tat依赖的转录。
[0057]
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。