水稻捕光色素叶绿素a/b结合蛋白基因lhcb3及其在水稻光保护中的应用
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种水稻捕光色素叶绿素a/b结合蛋白基因lhcb3及其在水稻光保护中的应用。


背景技术：

2.水稻作为世界上三大粮食作物之一，也是我国重要的粮食作物，由于世界人口数量的大幅度增长，水稻的需求量也愈来愈大。光是植物光合作用所必需的，植物光合机制中的叶绿体色素吸收光能并使之转化成稳定的化学能。但是，在光能过剩的情况下，植物接受的能量要超过其所能转化的能量，如果过量的光能不能及时耗散掉，过剩的光会导致光抑制现象，从而降低光合效率。光合作用及其复杂，其协调主要表现为光能的吸收和利用的平衡。经过长期的演化，水稻已经形成了多种协调光能吸收和利用的保护机制。其中非光化学猝灭(npq)就是一种重要的保护机，它能使植株以无害的热能形式耗散吸收的过剩光能，可减少活性氧的产生，能够有效避免光抑制的发生。
3.植物有两个光系统(光系统i和光系统ii)参与光的捕获和转换。两者都是由发生光化学反应的核心复合物和参与光捕获的天线系统组成，光系统是多蛋白超级复合物。植物的光系统ii的天线包括较小的捕光获复合物ii(lhcb4、lhcb5和lhcb6)和较大的天线复合物三聚体(lhcb1、lhcb2和lhcb3)，这是地球上最丰富的膜蛋白。lhcb除了参与光能的捕获外，还参与过剩光能的能量耗散，转化光系统i和光系统ii的能量分配，起到光保护的作用。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种水稻捕光色素叶绿素a/b结合蛋白基因lhcb3及其在水稻光保护中的应用，从水稻中分离了一个控制叶绿素含量、光合速率和npq值基因lhcb3，对该基因进行了rna干扰表达，发现该基因能够降低叶绿素含量，影响光合效率和npq值，该基因在水稻高光效育种和光保护中具有重要的价值。
5.本发明通过下述技术方案实现：
6.本发明提供了一种水稻捕光色素叶绿素a/b结合蛋白基因lhcb3，核苷酸序列如序列表seq id no:1所示，它是从典型的水稻粳稻品种中华11品种中克隆了一种捕光色素叶绿素a/b结合蛋白基因，再运用rnai干扰技术对lhcb3基因进行干扰，获得了lhcb3基因功能被抑制的转基因植株。
7.序列表seq id no:1是本发明克隆自水稻品种中花11的lhcb3基因的dna序列，该基因全长，编码区长，编码
‑‑
氨基酸。
8.对lhcb3基因抑制表达的t0代转基因植株的叶绿素含量和光合功能期进行了系统考察，发现lhcb3基因抑制表达的材料和野生型相比其spad值、叶绿素a、叶绿素b、总的叶绿素含量及npq均极显著下降；叶绿素a/叶绿素b的比值出现上升。
9.对lhcb3基因抑制表达的t0代转基因植株进行了共分离检测，发现lhcb3基因表达量低的植株其叶绿素含量和npq值含量也低，叶绿素含量和npq值这两类表型和表达量呈现很好的共分离。
10.对lhcb3基因抑制表达的t1代转基因植株苗期进行了透射电镜的观察，发现阳性植株和野生型植株相比，其类囊体的片层结构的致密性不如野生型。
11.对lhcb3基因抑制表达的t1代转基因植株苗期进行了系统的叶绿素含量和光合功能期进行了系统考察，发现spad值、叶绿素a、叶绿素b、总的叶绿素含量均极显著下降，叶绿素a/叶绿素b的比值出现上升。
12.对lhcb3基因抑制表达的t1代转基因植株抽穗期进行了系统的叶绿素含量和光合功能期进行了系统考察，发现spad值、叶绿素a、叶绿素b、总的叶绿素含量和npq值均极显著下降，叶绿素a/叶绿素b的比值出现上升，净光合速率出现了下降。
13.对lhcb3基因抑制表达的t1代转基因植株苗期和抽穗期的表达量进行检测分析发现在无论是苗期还是抽穗期，lhcb3基因表达量下降后，其光系统ii相关基因lhcb1、lhcb2的表达量出现了急剧下降；其光系统i相关基因lhcb4、lhcb5、lhcb6的表达量出现了轻微的下降；和光保护相关的基因psbs1在抽穗期出现了表达量的下降，说明lhcb3在调控光保护左右中发挥重要的作用。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
15.1、本发明通过rnai干扰技术对水稻捕光色素叶绿素a/b结合蛋白基因oslhcb3进行了抑制，获得了转基因植株，系统考察和分析了转基因植株和野生型光合功能期的生理表型，实验证明了lhcb3基因控制叶绿素含量，光合速率，qe型的npq等表型，该基因在水稻光保护作用中发挥着重要的作用。
16.2、本发明在水稻中首次发现lhcb3能够调控npq值，影响水稻光合产量，利用转基因材料充分证实了这一点。该基因在水稻光保护中发挥了重要的作用，在水稻高光效育种中具有重要的作用。本发明也丰富了lhcb3基因的功能认识，也为该基因调控其它植物npq值提供了借鉴。
附图说明
17.图1：lhcb3基因rnait0代转基因植株叶绿素含量、npq值及表达量；
18.图2：lhcb3基因rnait1代转基因植株两个家系苗期和抽穗期的spad值；
19.图3：lhcb3基因rnait1代转基因植株两个家系苗期和抽穗期的叶绿素含量；
20.图4：lhcb3基因rnait1代转基因植株fv/fm值；
21.图5：lhcb3基因rnait1代转基因植株npq值；
22.图6：lhcb3基因rnait1代转基因植株净光合速率；
23.图7：lhcb3基因rnai转基因植株的叶色图；
24.图8：lhcb3基因rnai转基因植株的叶片透射电镜图；
25.图9：lhcb1.1基因在lhcb3 rnai转基因植株中的相对表达量图；
26.图10：lhcb1.2基因在lhcb3 rnai转基因植株中的相对表达量图；
27.图11：lhcb1.3基因在lhcb3 rnai转基因植株中的相对表达量图；
28.图12：lhcb2基因在lhcb3 rnai转基因植株中的相对表达量图；
29.图13：lhcb3基因在lhcb3 rnai转基因植株中的相对表达量图；
30.图14：lhcb4基因在lhcb3 rnai转基因植株中的相对表达量图；
31.图15：lhcb5基因在lhcb3 rnai转基因植株中的相对表达量图；
32.图16：lhcb6基因在lhcb3 rnai转基因植株中的相对表达量图；
33.图17：lhca1基因在lhcb3 rnai转基因植株中的相对表达量图；
34.图18：lhca3基因在lhcb3 rnai转基因植株中的相对表达量图；
35.图19：lhca4基因在lhcb3 rnai转基因植株中的相对表达量图；
36.图20：lhca6基因在lhcb3 rnai转基因植株中的相对表达量图；
37.图21：psbs1基因在lhcb3 rnai转基因植株中的相对表达量图。
具体实施方式
38.实施例1
39.lhcb3基因rnai载体的构建
40.1.1.dna的抽提
41.取典型的粳稻品种中花11的幼叶，抽提dna；具体的，水稻植株上取2cm长的幼嫩叶片放入2ml离心管，加800μl 1.5x ctab研磨后，65℃水浴30min，每隔10min上下颠倒混匀一次。在通风橱中，每管样品加入600μl三氯甲烷，在摇床上摇匀30min，接着8000rpm/min离心10min，吸取400μl上清于一新离心管中，加1000μl冰乙醇混匀于-20℃放置过夜；第二天，12000rpm/min离心15min。倒掉液体，倒扣在吸水纸上吸干表面液体。加入1ml 75％乙醇混匀，静置2min，倒掉液体，倒扣在吸水纸上吸干表面液体，超净台上吹干液体，加入200μl灭菌ddh2o溶解dna。
42.1.2.pcr扩增
43.以上述抽提的dna作为模板(扩增引物设计在lhcb3基因第二个外显子内部)pcr：20μl体系(3μl ddh2o+2μl模板+15μl mixture)+20μl矿物油15μl mixture如下：
[0044][0045]
按照94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，循环32；72℃延伸7min的pcr程序程序扩增
[0046]
1.3.rnai载体的构建
[0047]
对pcr的扩增产物进行dna切胶回收，回收后的产物通过t4 dna连接酶连接到t-easy载体上，通过热激法将重组后的载体转入到dh5α大肠杆菌菌株，抽提重组质粒lhcb3-t-easy后。用bamh i和kpn i双酶切重组质粒lhcb3-t-easy和rnai载体pds1301，将酶切产物连接到酶切后的pds1301上，热激法转入到dh5α大肠杆菌菌株，37℃培养16小时，挑选无突变的单克隆进行扩增繁殖并抽提相应质粒，命名为lhcb3-pds1301-a。用sac i和spe i双
酶切重组质粒lhcb3-t-easy和rnai载体lhcb3-pds1301-a，热激法转入到dh5α大肠杆菌菌株，37℃培养16小时，挑选无突变的单克隆进行扩增繁殖并抽提相应质粒，命名为lhcb3-rnai-pds1301。至此，lhcb3基因rnai载体就构建成功了。构建好的载体送武汉天问生物科技有限公司基因遗传转化，通过农杆菌介导的遗传转化将rnai载体整合到水稻基因组中，并成功获得12株转基因苗。
[0048]
试验例1叶绿素含量测定
[0049]
叶绿素相对含量测定：叶绿素仪(spad仪)活体测定法
[0050]
本发明利用叶绿素仪对水稻的苗期和抽穗期进行活体测量，spad值代表植物叶片叶绿素含量的相对值，数值越大，表示叶绿素含量越高。
[0051]
叶绿素绝对含量测定-离体测定法
[0052]
离体叶绿素含量考察方法：选择突变体与野生型的叶片放入离心管后(每家系深浅各选5株进行取样)，立即放入装冰的泡沫盒中，用黑布裹好后立即带回实验室中。用分析天平精确称重，剪碎，加入丙酮：乙醇：水(4.5：4.5：1)的混合抽提液，4℃避光抽提，期间每隔一段时间摇匀样品，待样品完全脱色后于分光光度计上分别测定其在663nm、645nm处的吸光值，其后按照公式计算叶绿素含量。
[0053]
具体计算公式如下：
[0054]
chla=(12.71a663-2.59a645)
×
v/1000w
[0055]
chlb＝(22.88a645-4.67a663)
×
v/1000w
[0056]
total chl=(8.04a663+20.29a645)
×
v/1000w
[0057]
其中a663及a645分别为相应波长下的吸光值，v为抽提液的体积(ml)，w为重量g，转化后的叶绿素单位为mg/g。
[0058]
通过系统考察转基因植株苗期和抽穗期的叶绿素含量，发现阳性植株(mut)较野生型植株(wt)具有更加低的叶绿素含量，lhcb3基因能够下调叶绿素含量，在调控叶绿素含量中具发挥着重要的作用。
[0059]
试验例2叶绿素荧光的测定
[0060]
本发明利用便携式调制叶绿素荧光仪pam-2500对转基因家系进行叶绿素荧光测定，测定后对数据进行统计分析。在测定前，先对这些植物进行了30min的暗适应。用光测量法测定了开放psii中心的最小荧光(fo)，黑暗中适应30min后，在饱和光下应用0.8s脉冲后测定了闭合psii中心的最大荧光(fm)。psii(fv/fm)的最大量子效率定义为(f
m-fo)/fm。应用光化光(红光)测量稳态叶绿素荧光(fs)。在光适应状态下，f’m
是通过施加饱和脉冲来测量的，而f’o
则是通过在饱和脉冲后关闭光2s后施加远红光测量。npq定义为fm/f’m-1；psii(
φ
psii)的实际量子效率被定义为(f’m-fs)/f’m
；光化学猝灭(q
p
)被定义为1-(fs–
f’o
)/(f’m
–
f’o
)。
[0061]
通过系统考察转基因植株苗期和抽穗期的fv/fm和npq，发现阳性植株(mut)较野生型植株(wt)具有更加低的fv/fm和npq值，lhcb3基因能够下调fv/fm和npq值，在调控水稻非光化淬灭和光保护中发挥着重要的作用。
[0062]
试验例3净光合速率测量
[0063]
本发明，选择在晴天对转基因家系进行净光合速率测量，测量时设定光强的梯度。对所得数据进行统计分析。在水稻剑叶上安装一个红色/蓝色led光源(6400-02b；li-cor)，
利用北京力高泰科技有限公司的li-6400xt光合-荧光测定仪，测定净光合速率(pn)和光响应曲线。所有测量均在温度为30℃，co2浓度为400μll-1
，环境湿度为75
±
5％条件下进行。在pn测量期间，叶片表面的光合光子通量密度(ppfd)控制在1000μmol m-2
s-1
。
[0064]
通过系统考察转基因植株苗期和抽穗期的净光合速率(pn)，发现阳性植株(mut)较野生型植株(wt)具有更加低的净光合速率，lhcb3基因下调表达后会除了影响叶绿素的含量和光保护能力，还会影响水稻的净光合速率。
[0065]
试验例4光合作用相关基因的表达量检测
[0066]
先进行rna抽提，组织用液氮研磨成粉约0.05-0.1g，使用1ml trans zol，加0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温静置5min。10,000rpm 4℃离心10min。此时样品分为三层。转移600μl上层溶液于新的离心管中，加入600μl异丙醇，混匀，室温静置10min。12,000rpm 4℃离心15min，可见在管侧和管底形成白色胶状沉淀。弃上清，加入1ml 75％乙醇(depc处理的水配制)，剧烈涡旋，10,000rpm 4℃离心5min(两次)。弃上清，10,000rpm离心1min，用枪头吸干没有倒干净的残留乙醇，样品超净台晾干沉淀(大约10min)。加入50μl rna溶解液，55
–
60℃水浴10min，保存于-70℃以备长期使用。rna抽提结束后进行反转录，采用上海新贝生物公司生产的hyperscript iii rt supermix反转录试剂按照说明书进行反转录。对反转录后的cdna进行表达量检测，采用罗氏的荧光定量试剂faststart universal sybr green master(rox)按照说明书进行扩增。按照2-δδct
进行基因相对表达量的计算。
[0067]
图1是lhcb3基因rnait0代转基因植株叶绿素含量、npq值及表达量，阳性植株(mut)和野生型(wt)的相比，其spad值、叶绿素a、叶绿素b、总的叶绿素含量、fv/fm、npq值其出现极显著下降；其叶绿素a/叶绿素b比值出现极显著上升；lhcb3基因表达量与spad值、叶绿素a、叶绿素b、总的叶绿素含量、fv/fm、npq值及叶绿素a/叶绿素b比值出现很好的共分离。
[0068]
图2是lhcb3基因rnait1代转基因植株两个家系苗期和抽穗期的spad值。阳性植株(mut)和野生型植株(wt)的相比，其spad值在两个时期都出现了极显著下降。
[0069]
图3是lhcb3基因rnait1代转基因植株两个家系苗期和抽穗期的叶绿素含量；阳性植株(mut)和野生型植株(wt)的相比，叶绿素a、叶绿素b、总的叶绿素含量出现了极显著下降；其叶绿素a/叶绿素b比值出现了极显著的上升。
[0070]
图4是lhcb3基因rnait1代转基因植株fv/fm值；阳性植株(mut)和野生型植株wt)的相比，其fv/fm值出现了下降。
[0071]
图5是lhcb3基因rnait1代转基因植株npq值；阳性植株(mut)和野生型植株wt)的相比，其npq值出现了下降。
[0072]
图6是lhcb3基因rnait1代转基因植株净光合速率；阳性植株(mut)和野生型植株(wt)的相比，其最大净值光合速率出现了下降。
[0073]
图7是lhcb3基因rnai转基因植株的叶色图；阳性植株(mut)颜色比野生型植株(wt)的颜色浅。
[0074]
图8是lhcb3基因rnai转基因植株的叶片透射电镜图；突变型叶绿体比野生型少且分布不均匀，突变型类囊体排布较稀疏。
[0075]
通过对转基因植株表达量进行检测发现：psii较大的天线捕光蛋白复合体基因(lhcb1.1、lhcb1.2、lhcb1.3、lhcb2、lhcb3)的表达量在苗期和抽穗期都出现了大幅度的下
降；psii较小的天线捕光蛋白复合体基因(lhcb4、lhcb5、lhcb6)的表达量在苗期和抽穗期都出现了轻微的下降；psi捕光蛋白复合体基因(lhca1、lhca3、lhca4、lhca6)突变型和野生型的表达量无显著差异；令人兴奋的是参与光保护的基因psbs1在抽穗期出现了下降，而该基因表达量的高低直接影响npq值的变化，水稻lhcb3基因通过下调psbs1的表达量进而影响光保护的能力。
[0076]
本发明所涉及到的引物如下表1
[0077]
表1所用的引物序列
[0078][0079]
[0080]
[0081]
[0082]