根优先和胁迫诱导型启动子及其用途
1.本技术是申请日为2016年7月19日的、发明名称为“根优先和胁迫诱导型启动子及其用途”的中国专利申请201680045905.8(pct/ep2016/067152) 的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及农业生物技术领域，更具体地涉及转基因在胁迫条件下提高植物产量的用途。具体地，提供了在干旱胁迫条件下在植物中表达编码来自芥菜(brassica juncea)的膜联蛋白的基因以提高产量的方法。提供了胁迫诱导的根优先启动子以及用于调节膜联蛋白在胁迫条件下优先在根中表达的表达盒。


背景技术：

3.近年来，全球变暖的现象和其对作物植物生产的影响已经成为关键的问题。在植物水平上解决这个问题几乎完全是一个处理植物胁迫的问题。现在，国际农业和环境研究机构以及公司再次发现植物胁迫是全球变暖对地区和全球粮食生产的影响的一个主要组成部分。应对这些挑战的研究涉及广泛不同的学科，例如大气科学、土壤科学、植物生理学、生物化学、遗传学、植物育种、分子生物学以及农业工程。
4.非生物植物环境胁迫构成了对作物生产的主要限制。在世界范围内具有当代经济重要性的主要植物环境胁迫是水分胁迫(包括干旱和洪水)、冷 (低温和冷冻)、热、盐度、渍水、土壤矿物质缺乏、土壤矿物质毒性以及氧化胁迫。这些因素不是孤立的，而是互相联系的和彼此影响的。
5.因此，当今农业实践和研究中的一项主要挑战是如何以经济和环境可持续的方法处理植物环境胁迫。鉴于世界上已经存在的暴露于非生物胁迫条件的地区和不间断的气候变化，提供赋予对至少一种非生物胁迫有抗性的转基因植物仍是一个主要目标，以便在世界上暴露于此类非生物胁迫的地区中也实现令人满意的营养状况。
6.棉花(棉属物种(gossypium spp.))是世界上最重要的天然纺织纤维并且也是一种重要的油籽作物。棉花生产为大约25亿户家庭提供收入，并且大约150个国家涉及棉花进口和出口。其经济影响估计为全球每年大约5000亿美元。世界棉花纤维的消耗每年大约11.5亿包或大约2.7亿公吨(国家棉花委员会(national cotton council)，www.cotton.org，2006)。棉属是相对复杂的并且包括大约45个二倍体(2n＝2x＝26)和5个四倍体(2n＝4x＝52) 的物种，全部都呈现二倍体遗传形式。二倍体物种(2n＝26)落入8个基因组群(a-g、和k)。非洲进化枝，包括a、b、e和f基因组，天然地发生在非洲和亚洲，而d基因组进化枝是美洲本土的。第三个二倍体进化枝(包括c、g和k)发现于澳洲。全部52个染色体的物种(包括陆地棉 (gossypium hirsutum)和海岛棉(gossypium barbadense))，是在新世界出现的经典的天然异源四倍体，其来自a基因组样祖传非洲物种和d基因组样美洲物种之间的种间杂交。原始四倍体祖先最接近的现存亲属是a基因组物种草棉(gossypium herbaceum)(a1)和亚洲棉(gossypium arboreum) (a2)和d基因组物种雷蒙德氏棉(gossypium raimondii)(d5)
ꢀ‘
ulbrich’。多倍体化被估计发生在100至200万年前，产生了
biol.[植物生物学年鉴]65: 715-41)。
[0013]
尽管有许多赋予植物非生物胁迫耐受性的基因的报道，但是很少有实际报道在田间条件下的产量提高。综述于例如cominelli等人，2012，newbiotechnol[新生物技术]，dx.doi.org/10.1016/j.nbt.2012.11.001，lawlor 2013， j exp bot[实验植物学杂志]，第64卷(1):83-108，以及tardieu 2012，j expbot[实验植物学杂志]，第63卷(1):25-31的这种有限的成功主要归因于农业上不现实的胁迫条件和胁迫应用的时机。此外，在实验室或温室实验中生长条件得到很好的控制，而田间种植的植物经历不同的条件且很少是单一的胁迫。在田间条件下在胁迫下赋予实际产量提高的基因因此有限，并且在实验室或温室实验中鉴定的对田间条件的胁迫耐受性的可转移性不是直接的。
[0014]
迄今为止，已知在棉花中赋予干旱、盐或渗透胁迫耐受性的基因是拟南芥液泡h
+
焦磷酸酶基因avp1(pasapula等人，2011，plant biotechnologyjournal[植物生物技术杂志]9:88-99)、涉及aba信号传导的拟南芥 edt1/hdg11基因(yu等人，2016，plant biotechnology j[植物生物技术杂志]，14(1):72-84)、涉及aba生物合成的拟南芥los5基因(yue等人， 2012，j.exp bot[实验植物学杂志]，63(10):3741-3748)、涉及细胞分裂素生物合成的ipt基因(kuppu等人，2013，plos one[公共科学图书馆]8(5): e64190)、水稻snac1基因(liu等人，2014，plos one[公共科学图书馆] 9(1):e86895)、来自芥菜annbj1或陆地棉ghann1的膜联蛋白1基因(分别地，divya等人，2010，plant mol.biol[植物分子生物学]73:293-308，和 zhang等人，2015，plant mol.biol.[植物分子生物学]，87:47-67)和来自亚洲棉的热休克蛋白基因ghsp26(maqbool等人，2009，biotechnol.prog.[生物技术进展]26(1):21-25)。其中，只有avp1被证明在田间在胁迫下赋予产量增加。
[0015]
膜联蛋白(ann)形成了多基因家族，并且迄今在植物界和动物界都已被鉴定。它们编码涉及钙依赖性细胞(根毛、花粉和棉花纤维)极性生长的钙依赖性膜结合蛋白。膜联蛋白由其高度保守的折叠定义，该折叠由四个或更多个所谓的膜联蛋白重复结构域特征序列的重复组成(barton等人， 1991，eur.j.biochem.[欧洲生物化学杂志]198:749-760)。
[0016]
膜联蛋白普遍表达并且其表达水平受环境刺激(像光照、重力、非生物胁迫和创伤)调节，表明在调节胁迫反应中的作用。此类作用被以下发现支持：来自拟南芥(arabidopsis thaliana)和芥菜的ann1被发现具有过氧化物酶活性(gorecka等人，2005，biochem biophys res commun[生物化学和生物物理学研究通讯]，336(3):868-875，divya等人，2010，plant mol.biol.[植物分子生物学]73:293-308)，因此能够用作细胞抗氧化剂。
[0017]
在拟南芥、烟草和棉花中研究了在胁迫反应中ann1的参与。atann1和 atann4突变体的功能缺失分析表明对盐和渗透胁迫的敏感性增加以及脱落酸处理后萌发率和生长减少(美国申请2005/089872)。cantero等人(2006， plant physiology and biochemistry[植物生理学和生物技术]，44:13-24)显示 atann1被冷、热、干旱和盐胁迫上调。拟南芥atann1敲除突变体积累更多的活性氧种类，并且比野生型对严重的干旱胁迫更敏感。发现过表达 atann1的拟南芥植物更耐旱，因为它们可以从重度干旱中复活(konopka
‑ꢀ
postupolska等人，2009，plant physiology[植物生理学]，150:1394-1410)。此外，在绿色组织中组成型或优先地表达atann1的水稻植物在最适和干旱胁迫条件下都具有增加的产量(美国申请2010/0170011)。
[0018]
发现工程化以过表达莲花膜联蛋白1(nnann1)的拟南芥株系在热胁迫下具有提高的萌发率(专利申请cn 102229662)。
[0019]
芥菜(annbj1)的膜联蛋白1基因被aba、盐和过氧化物处理诱导， (jami等人，2009，plant physiology and biochemistry[植物生理学和生物化学]47:977-990)。组成型表达annbj1的烟草植物在幼苗期的存活测定中显示更耐受干旱(甘露醇)、盐和氧化胁迫(jami等人，2008，plantphysiology and biochemistry[植物生理学和生物化学]，46:1019-1030)。相似地，组成型表达annbj1的棉花植物在幼苗期对盐、渗透和氧化胁迫具有增加的耐受性(divya等人，2010，plant mol.biol.[植物分子生物学]73:293
‑ꢀ
308)。此外，这些转基因植物当在盐胁迫下生长时显示维持正常的种子发育和纤维品质(divya等人，2010，plant mol.biol.[植物分子生物学]73:293
‑ꢀ
308)。
[0020]
在棉花中，当用aba、过氧化物、盐和peg处理时诱导ghann1表达 (zhang等人，2015，plant mol.biol.[植物分子生物学]87:47-67)。在各种胁迫下研究了过表达ghann1的棉花植物的萌发和幼苗生长。当经受盐胁迫或干旱(peg)胁迫时，过表达株系比野生型萌发更快并显示更好的幼苗生长，表明更好的胁迫耐受性(zhang等人，2015，plant mol.biol.[植物分子生物学]87:47-67)。
[0021]
尽管现有技术描述了在各种非生物胁迫下提高的棉花萌发和早期生长以及水稻中产量增加，但是现有技术并未揭示棉花纤维产量的增加。因此仍然需要在田间条件下在干旱胁迫下增加棉花产量(棉绒产量和种子产量)。为了那个目的，还需要适当的表达(空间、时间)。还需要获得植物产量更一致的增加，特别是在干旱条件下，特别是在田间条件下。
[0022]
改变和/或改善表型性状(例如生产力或质量)的植物的遗传修饰依赖于根据需要驱动和控制基因表达的手段的可用性。的确，遗传修饰依赖于合适的启动子的可用性和使用，这些启动子在植物中有效且调节转录从而在转基因植物中产生所希望的一种或多种影响。
[0023]
对于植物生物技术中的许多应用，需要以组织优先和/或可诱导的方式表达转基因以避免转基因表达可能在其他组织中或在不需要的时候引起的不希望的影响。
[0024]
根优先启动子可用于在根中优先地表达或下调基因以获得所希望的功能或效果，例如提高对土传病原体或根病原体的抗性、提高对非生物胁迫(例如温度、水分或盐胁迫)的耐受性、扩大植物可能生长的土壤范围、改变根构型(例如根密度或根强度)、改变或提高营养物摄取和/或营养物利用、修改根和地上生物质之间的相互作用、或修改根中的代谢途径。
[0025]
根优先启动子的实例包括来自烟草(nicotiana tabacum)的rb7启动子 (美国专利号5,459,252和5,750,386)；来自拟南芥的arsk1启动子 (hwang和goodman(1995)plant j[植物杂志]8:37-43)、来自玉蜀黍 (zea mays)的mr7启动子(美国专利号5,837,848)、玉蜀黍的zrp2启动子(美国专利号5,633,363)、和来自玉蜀黍的mtl启动子(美国专利号 5,466,785和6,018,099)、来自高粱(sorghum bicolor)的pltp和tip2-3启动子(分别地，wo 2014/164399 a1和wo 2014/159113 a1)、h型马铃薯糖蛋白启动子(等人，mol.gen.genet.[分子和普通遗传学]219 (1989)，390-396)、agropinsynthase-启动子(ags)(inoguchi等人，plantphys.[植物生理学]149(1996)，73-78)、akt1启动子(lagarde
等人， plant j.[植物杂志]9(1996)，195-203)、和tobrb7启动子(yamamoto等人，plant cell[植物细胞]3(1991)，371-382)。
[0026]
胁迫诱导型启动子可用于在胁迫条件下特异性表达或下调基因以获得所希望的功能或效果，例如提高对非生物胁迫(例如温度、水分或盐胁迫)的耐受性。
[0027]
非生物胁迫诱导型启动子的实例包括来自拟南芥的干旱诱导的rd29a启动子(yamaguchi-shinozaki等人，1993，mol.gen.genet.[分子和普通遗传学]，236:331-340)、来自拟南芥的热诱导的hsp81.1(takahashi等人， 1992，plant physiol.[植物生理学]，99:383-390)、和来自玉蜀黍的干旱诱导的rab17启动子(morran等人，2011，plant biotechnology journal[植物生物技术杂志]，9:230-249)。
[0028]
已经分离了组合组织特异性和胁迫诱导性两者的几个启动子。此类启动子的实例包括拟南芥的芽特异性和干旱胁迫诱导的hpr1启动子(wang等人，2009，molecular plant[分子植物]，2(1):191-200)、来自獐茅 (aeluropus littoralis)的芽特异性以及盐和干旱胁迫诱导的alsap启动子 (saad等人，2011，transgenic res[转基因研究]，20:1003-1018)、巨桉 (eucalyptus grandis)的芽特异性和渗透胁迫相应的egtip2启动子 (rodrigues等人，2013，plant science[植物科学]，213:106-113)以及来自欧洲油菜(brassica napus)的盐诱导的和根表皮特异性btg-26启动子(wo2001/055433、us 2005044585 a1)，还证明在大麦中起作用(good等人， 2007，can j.bot.[加拿大植物学期刊]85:252-262)，以及来自水稻osant1 的其直系同源基因的启动子(us 7,982,093)。
[0029]
需要另外的赋予组织特异性、胁迫诱导性或两者的启动子，特别地在植物(例如棉属植物、大豆属植物和小麦属植物)中控制胁迫诱导的和/或根优先表达的启动子。
[0030]
本发明的目的是增加植物产量，例如在田间条件下在干旱胁迫下增加棉花产量(包括棉绒产量或种子产量)。另一个目标是在植物中获得更一致的产量增加，例如棉花棉绒产量或棉花种子产量。如下文所述，特别是在不同的实施例、实例和权利要求中解决了这些和其他问题。还提供了用于在植物中胁迫诱导和/或根优先表达感兴趣的基因的棉属启动子。


技术实现要素：

[0031]
在一方面，本发明提供了包含根优先启动子活性和胁迫诱导型启动子活性的分离的核酸，该分离的核酸选自下组，该组由以下各项组成：(a)包含 seq id no:7的核苷酸序列或其功能片段的核酸；(b)包含与seq id no:7 或其功能片段具有至少约95％序列一致性的核苷酸序列的核酸；以及(c)在严格条件下与seq id no:7的核苷酸序列或其功能片段杂交的功能性启动子的核酸；其中所述功能片段包含seq id no:7的转录起点上游的至少400bp序列。
[0032]
另外的实施例提供重组基因，所述重组基因包含可操作地连接至异源核酸序列的根据本发明的核酸，并且任选地包含转录终止子和聚腺苷酸化序列，优选地包含在植物细胞中有功能的转录终止子和聚腺苷酸化区域，所述异源核酸序列编码感兴趣的表达产物。在另外的实施例中，所述感兴趣的表达产物是能够调节基因的表达的rna或是蛋白质。
[0033]
又另一个实施例提供诸如大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、或植物细胞等宿主细胞，这些宿主细胞包含根据本发明的分离的核酸、或根据本发明的重组基因。
[0034]
在另外的实施例中，提供包含根据本发明的重组基因的植物。另外的实施例提供可从根据本发明的植物中获得的植物部分和种子。这些植物部分和种子包含上文描述的重组基因。在另一个实施例中，根据本发明的这些植物、植物部分或种子是棉花、大豆或小麦植物、植物部分或种子。也可以预期，这种启动子在其他双子叶和单子叶植物中是有功能的。
[0035]
又另一个实施例提供生产转基因植物的方法，该方法包括以下步骤：(a) 向植物细胞中引入或提供根据本发明的重组基因以产生转基因细胞；并且(b) 从所述转基因细胞中再生转基因植物。
[0036]
进一步提供的是实现核酸的根优先表达、胁迫诱导型表达、以及组合的根优先和胁迫诱导型表达的方法，这些方法包括将根据本发明的重组基因引入植物的基因组中，或提供根据本发明的植物。还提供的是用于改变生物或非生物胁迫耐受性、根构型、营养物利用效率、或植物产量的方法，所述方法包括向植物的基因组中引入根据本发明的重组基因、或提供根据本发明的植物。在另一个实施例中，所述植物是棉花、大豆或小麦植物。
[0037]
还提供的是根据本发明的分离的核酸调节植物中可操作地连接的核酸的表达的用途，以及根据本发明的分离的核酸、或根据本发明的重组基因改变生物或非生物胁迫耐受性、根构型、营养物利用效率、或植物产量的用途。在另外的实施例中，所述植物是棉花、大豆或小麦植物。
[0038]
又另一个实施例提供生产食品、饲料、或工业产品的方法，该方法包括(a)获得根据本发明的植物或其部分；并且(b)从植物或其部分制备该食品、饲料或工业产品。在另一个实施例中，所述食品或饲料是油、膳食、磨碎的或压碎的种子、大豆片、谷物、淀粉、面粉或蛋白质，或者所述工业产品是生物燃料、纤维、化工原料、药物或营养食品。此类食品、饲料或工业产品含有在此描述的根优先启动子、胁迫诱导型启动子以及胁迫诱导型根优先启动子。
[0039]
在另一方面，本发明提供重组基因，该重组基因包含(a)选自下组的植物可表达启动子，该组由以下各项组成：i)根优先启动子、ii)胁迫诱导型启动子和iii)胁迫诱导型根优先启动子，(b)编码膜联蛋白蛋白质的核酸序列以及(c)任选地，转录终止子和聚腺苷酸化序列，优选地在植物中有功能的转录终止子和聚腺苷酸化区域。
[0040]
在另外的实施例中，该根优先启动子是pbtg-26ghd10启动子。
[0041]
在另一个实施例中，编码膜联蛋白蛋白质的核酸序列包含(a)seq idno:12或seq id no:14的核苷酸序列；(b)与seq id no:12或seq id no: 14具有至少80％一致性的核苷酸序列；(c)在严格条件下能够与seq id no: 12或seq id no:14的核苷酸序列杂交的核酸的核苷酸序列；(d)编码seqid no:13或seq id no:15的氨基酸序列的核苷酸序列；(e)编码与seq idno:13或seq id no:15具有至少80％一致性的氨基酸序列的核苷酸序列；(f) 编码包含四个或更多个膜联蛋白重复结构域的蛋白质的核苷酸序列。
[0042]
在又另一方面，本发明提供在胁迫条件下，与对照植物相比增加植物 (例如棉花、大豆或小麦植物)的产量(例如纤维产量和种子产量)的方法，该方法包括(a)向所述植物的细胞提供重组基因，该重组基因包含(i)异源植物可表达启动子、(ii)编码膜联蛋白蛋白质的核酸序列、以及(iii)任选地，转录终止子和聚腺苷酸化序列，优选地在植物中有功能的转录终止子和聚腺苷酸化区域，并且(b)再生所述植物。
[0043]
在另外的实施例中，该异源植物可表达启动子选自下组，该组由以下各项组成：a)根优先启动子、b)胁迫诱导型启动子和c)胁迫诱导型根优先启动子。在另一个实施例中，所述启动子是pbtg26-ghd10启动子。
[0044]
在另外的实施例中，该异源植物可表达启动子是组成型启动子。在另一个实施例中，所述启动子是花椰菜花叶病毒camv35s启动子。
[0045]
在另一个实施例中，编码膜联蛋白蛋白质的核酸序列包含(a)seq idno:12或seq id no:14的核苷酸序列；(b)与seq id no:12或seq id no: 14具有至少80％一致性的核苷酸序列；(c)在严格条件下能够与seq id no: 12或seq id no:14的核苷酸序列杂交的核酸的核苷酸序列；(d)编码seqid no:13或seq id no:15的氨基酸序列的核苷酸序列；(e)编码与seq idno:13或seq id no:15具有至少80％一致性的氨基酸序列的核苷酸序列；(f) 编码包含四个或更多个膜联蛋白重复结构域的蛋白质的核苷酸序列。
[0046]
另外的实施例披露在田间生长的植物上在植物生殖期期间发生的胁迫，如干旱胁迫。
[0047]
另一个实施例提供增加植物产量的方法。在另外的实施例中，所述植物是棉花、大豆或小麦植物。
[0048]
本发明提供增加棉绒产量的方法和增加种子产量的方法。在另外的实施例中，与对照植物相比增加的产量是至少5％。
[0049]
根据本发明，与当使用的启动子是组成型植物可表达启动子(优先地 camv35s启动子)时比较，当使用的启动子选自下组：根优先启动子、胁迫诱导型启动子或胁迫诱导型根优先启动子(优先地pbtg-26ghd10启动子) 时，该方法提供更一致地增加的产量。
[0050]
本发明进一步提供包含所提供的重组基因的植物、植物部分或植物细胞。在具体的实施例中，该植物、植物部分或植物细胞是棉花、大豆或小麦。
附图说明
[0051]
图1：来自陆地棉的亚基因组a和来自陆地棉的亚基因组d的btg-26基因的启动子区域的比对。亚基因组a的启动子的核苷酸序列(上面的序列) 对应于seq id no:4从位置472至位置1486的核苷酸序列。亚基因组d的启动子的核苷酸序列(下面的序列)对应于seq id no:5从位置2067至位置3089的核苷酸序列。核苷酸序列中的差异由灰色框表示。在其他启动子区域中没有对应的核苷酸的核苷酸在缺失这些核苷酸的核苷酸序列中由虚线表示。对大约0.6kb的每个启动子片段的第一个核苷酸加下划线。对预测的 tata框加双下划线，而对转录起始起点加波浪下划线。对预测的aba应答元件样结合位点基序(abre-样基序)加框。由于克隆启动子所需的ncoi限制性位点的产生，在t-dna中，括号内的核苷酸被序列acc置换。翻译起始密码子以粗体表示。在两个启动子区域之间的整体一致性是约78％序列一致性。在两个启动子的翻译起点上游约600bp之间的序列一致性是约94％。
[0052]
图2：不同膜联蛋白蛋白质的氨基酸序列的比对。全部蛋白质中保守的氨基酸残基用星号表示。保守的氨基酸取代用冒号表示。对膜联蛋白重复结构域加下划线。对具有其特征性kghgtdexxlipilapr基序的17个氨基酸内联蛋白折叠区域加框。对于过氧化物酶活性保守的组氨酸残基在灰色背景上以粗体表示。保守的磷脂结合位点(色氨酸残基)在黄色背景上以粗体表示。ii型钙结合序列(gxgtd基序)以绿色突出。annbj1：来自芥菜的膜联蛋白1
蛋白质(seq id no:13)；atann1：来自拟南芥的膜联蛋白1蛋白质 (seq id no:17)；ghann1：来自陆地棉的膜联蛋白1蛋白质(seq id no: 15)。在其他蛋白质序列中没有对应核苷酸的氨基酸在缺失这些氨基酸的氨基酸序列中由虚线表示。在annbj1和atann1之间的整体一致性是约91％、在annbj1和ghann1之间的整体一致性是约70％、并且在atann1和 ghann1之间的整体一致性是约72％。
[0053]
图3：不同膜联蛋白编码序列的核苷酸序列的比对。annbj1：来自芥菜的膜联蛋白1编码序列(seq id no:12)；atann1：来自拟南芥的膜联蛋白 1编码序列(seq id no:16)；ghann1：来自陆地棉的膜联蛋白1编码序列 (seq id no:14)。在全部三个序列中保守的核苷酸用星号表示。仅在 annbj1和atann1序列之间保守的核苷酸用冒号表示。仅在annbj1和ghann1 序列之间保守的核苷酸用分号表示。仅在atann1和ghann1序列之间保守的核苷酸用点表示。在其他核苷酸序列中没有对应核苷酸的核苷酸在缺失这些核苷酸的核苷酸序列中由虚线表示。在编码序列之间的整体一致性在atann1 和ghann1之间以及在annbj1和ghann1之间是约70％，并且在annbj1和 atann1之间是约89％。
具体实施方式
[0054]
本发明基于如下令人惊讶的发现：与它们各自的对照植物相比，植物中膜联蛋白的表达导致在田间在胁迫条件下产量增加。此外，发现来自陆地棉的d基因组的启动子序列pbtg-26ghd10在植物中展现出胁迫诱导型根优先启动子活性。此外发现，与膜联蛋白在组成型启动子的控制下的表达相比，当相同的膜联蛋白在胁迫诱导型根优先启动子的控制下表达时，在表达膜联蛋白时获得的产量增加是更一致地获得的。
[0055]
在第一方面，本发明提供包含根优先和胁迫诱导型启动子活性的分离的核酸，该分离的核酸选自下组，该组由以下各项组成：(a)包含seq id no:7 的核苷酸序列或其功能片段的核酸；(b)包含与seq id no:7具有至少约 95％序列一致性的核苷酸序列或其功能片段的核酸；以及(c)在严格条件下能够与seq id no:7的核苷酸序列或其功能片段杂交的功能性启动子的核酸；其中所述功能片段包含seq id no:7的转录起点上游的至少400bp序列。
[0056]
启动子
[0057]
seq id no:7代表陆地棉的转录起点上游的btg-26gh-d启动子的约1kb 长序列。seq id no:7是本发明中优选的启动子片段，然而可以使用可替代的功能片段。此类功能片段将优选地是转录起始位点(seq id no 7核苷酸位置755)的上游的超过600个长、超过700个长、超过800个长或甚至超过 900个长的连续核苷酸，或者是转录起始位点(图1核苷酸位置1022-1024) 的上游的超过700个长、超过800个长、超多900个长甚至超多1000个长的连续核苷酸，并且优先地在根中并且以胁迫诱导的方式促进可操作地连接的核酸的转录。因此，根据本发明的启动子片段可以包含seq id no:7的核苷酸序列(从位置351处的核苷酸至位置755处的核苷酸)。可替代地，因此，根据本发明的启动子片段可以包含seq id no:7的核苷酸序列(从位置 251处的核苷酸至位置755处的核苷酸)。因此，根据本发明的又另一个启动子片段可以包含seq id no:7的核苷酸序列(从位置151处的核苷酸至位置 755处的核苷酸)。因此，根据本发明的仍另一个启动子片段可以包含seqid no:7的核苷酸序列(从位置51处的核苷酸至位置755处的核苷酸)。因此，根据本发明的又另一个启动子片段可以
包含seq id no:7的核苷酸序列 (从位置1处的核苷酸至位置755处的核苷酸)。
[0058]
包含根据本发明的胁迫诱导型根优先启动子活性的核酸可以包含在较大的dna分子中。
[0059]
在本发明的上下文中“根优先启动子活性”意指启动子活性在根中比在其他组织中高至少2倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少20倍或甚至至少 100倍。换句话说，在根优先启动子活性中，可操作地连接至本发明的启动子的核酸在根中的转录比在其他组织中高至少2倍、或至少5倍、或至少10 倍、或至少20倍或甚至至少100倍。换句话说，该根优先启动子控制可操作地连接至根优先启动子的核酸的根优先表达。“根优先启动子活性”涵盖“胁迫诱导型根优先启动子活性”。
[0060]“胁迫诱导型启动子活性”意指启动子活性在植物或植物部分经受环境胁迫时比在对照条件中的高至少2倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少20 倍或甚至至少100倍。换句话说，在胁迫诱导型启动子活性中，可操作地连接至本发明的启动子的核酸在植物或植物部分经受胁迫时的转录比在对照条件中的高至少2倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少20倍或甚至至少100 倍。换句话说，该胁迫诱导型启动子控制可操作地连接至胁迫诱导型启动子的核酸的胁迫诱导型表达。“胁迫诱导型启动子活性”涵盖“胁迫诱导型根优先启动子活性”。
[0061]“胁迫诱导的根优先启动子活性”意指当植物或植物部分经受环境胁迫时，与其他植物组织相比，启动子活性在根中高至少2倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少20倍或甚至至少100倍。换句话说，在胁迫诱导型根优先启动子活性中，当该植物或植物部分经受胁迫时，可操作地连接至本发明的启动子的核酸在根组织中的转录比在其他植物组织中的高至少2倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少20倍或甚至至少100倍。换句话说，该胁迫诱导型根优先启动子控制可操作地连接至胁迫诱导型根优先启动子的核酸的胁迫诱导型根优先表达。
[0062]
如在此使用的，“启动子”意指对dna转录的起始必不可少的dna序列区域，导致了与转录的dna互补的rna分子的产生；这种区域也可以是指“5'调节区域”。启动子通常位于待转录的编码序列的上游，并且具有用作 rna聚合酶ii和其他蛋白质例如转录因子(调节转录的反式作用蛋白质因子)的结合位点以起始可操作地连接的基因的转录的区域。启动子自身可以含有调节可操作地连接的基因的转录的子元件(即启动子基序)，例如顺式作用元件或增强结构域。本发明的启动子可以被改变以包含“增强子dna”以协助提高基因表达。如本领域公知的，某些dna元件可以被用于增强dna 的转录。这些增强子经常发现于在真核细胞中行使功能的启动子中的转录起始的5'端，但是经常可以被插入编码序列的上游(5')或下游(3')。在一些情况下，这些5'增强子dna元件是内含子。在用作增强子dna的内含子中，有用的是来自水稻肌动蛋白1基因的5'内含子(参见us 5641876)、水稻肌动蛋白2基因、玉蜀黍乙醇脱氢酶基因、玉蜀黍热休克蛋白70基因(参见us 5593874)、玉蜀黍shrunken 1基因、马铃薯的光敏1基因、拟南芥组蛋白4内含子和矮牵牛(petunia hybrida)热休克蛋白70基因(参见us 5659122)。因此，如在此考虑的，启动子或启动子区包括通过插入或缺失调节区域、使启动子经受随机或定点诱变等而衍生的启动子的变化形式。相对于其转录活性在以前已经评估的启动子，启动子的活性或强度可以按照其产生的rna的量、或在细胞或组织中的蛋白质积累的量进行测量。
[0063]
因此，如在此使用的启动子可以包括在转录起始下游的序列，例如编码 rna的5'非翻译区(5'utr)的序列或位于转录起始下游的内含子。根据本发明的启动子片段可以包含其自身5'utr，该5'utr包含seq id no:7的从核苷酸756至核苷酸1022的核苷酸序列。如实验证明，来自在此描述的启动子的5'utr的最后三个核苷酸可被交换为其他核苷酸以产生方便的限制性内切酶识别位点。因此，根据本发明的启动子片段可以包含其自身5'utr，该 5'utr包含seq id no:7的从核苷酸756至核苷酸1019的核苷酸序列。结合上文描述的启动子片段，根据本发明的启动子片段因此可以包含seq id no: 7的从位置351处的核苷酸至位置1019处的核苷酸的核苷酸序列、或seq idno:7的从位置251处的核苷酸至位置1019处的核苷酸的核苷酸序列、或 seq id no:7的从位置151处的核苷酸至位置1019处的核苷酸的核苷酸序列、或seq id no:7的从位置51处的核苷酸至位置1019处的核苷酸的核苷酸序列、或seq id no:7的从位置1处的核苷酸至位置1019处的核苷酸的核苷酸序列，例如seq id no:7的从位置351处的核苷酸至位置1022处的核苷酸的核苷酸序列、或seq id no:7的从位置251处的核苷酸至位置1022处的核苷酸的核苷酸序列、或seq id no:7的从位置151处的核苷酸至位置1022 处的核苷酸的核苷酸序列、或seq id no:7的从位置51处的核苷酸至位置 1022处的核苷酸的核苷酸序列、或seq id no:7的从位置1处的核苷酸至位置1022处的核苷酸的核苷酸序列。可替代地，可以使用来自其他基因的 5'utr片段。
[0064]
本领域技术人员可以确定功能性启动子片段在根中的启动子活性和功能性启动子片段在胁迫下的启动子活性，例如使用对从可操作地连接至在此描述的启动子的核酸产生的rna积累的分析来确定，借此可操作地连接至该启动子的核酸可以是天然地连接至启动子的核酸，即其表达由该启动子控制的内源基因。
[0065]
可以在单个时间点或在多个时间点测量rna积累或rna(例如 mrna)的水平，因此倍数增加可以是平均倍数增加或从实验测量值衍生的推测值。由于它是水平的比较，因此可以使用测量mrna水平的任何方法。在优选的方面，所比较的组织或器官是根组织与生物体的其他组织。在另一个优选的方面，多个组织或器官被比较。优选的多重比较是在胁迫下根组织与选自下组的1个或2个组织或器官比较，该组由以下各项组成：叶片和茎或叶组织。另一个优选的多重比较是在胁迫条件下的组织或器官与在对照条件下的组织或器官进行比较。在此使用的，植物器官的实例是纤维、叶片、根等，并且组织的实例是叶原基、芽尖端、维管组织等。
[0066]
鉴定或产生的启动子片段的根优先表达能力、胁迫诱导型表达能力或胁迫诱导型根优先表达能力可以通过如下方便地进行测试：将此类dna分子可操作地连接至编码容易得分的标记(例如β-葡萄糖醛酸酶基因)的核苷酸序列，将这样的重组基因引入植物中，并且分析标记在根中的表达模式(如与标记在植物的其他部分中的表达模式相比较)。标记(报告基因)的其他候选者是氯霉素乙酰转移酶(cat)以及具有荧光特性的蛋白，例如来自维多利亚多管发光水母(aequora victoria)的绿色荧光蛋白(gfp)。为了定义最小的启动子区域，代表启动子区域的dna区段从感兴趣的基因的5'端去除并且通过本领域所熟知的重组dna技术可操作地连接至标记(报告基因)的编码区域。该报告基因连接至启动子的下游，这样使得在该启动子处起始的转录通过该报告基因进行。通常报告基因编码被容易地测量的蛋白质，包括但不限于，氯霉素乙酰转移酶(cat)、β-葡萄糖醛酸酶(gus)、绿色荧光蛋白(gfp)、β-半乳糖苷酶(β-gal)和荧光素酶。包含在启动子的控制下的报告基因的表达
盒可以通过本领域所熟知的转染技术引入适当的细胞类型中。为了测定报告蛋白，制备细胞裂解液并且针对该报告蛋白进行本领域所熟知的适当测定。酶活性的水平对应于产生的酶的量，该产生的酶的量反过来揭示了从感兴趣的启动子或启动子片段的表达水平和根特异性功能性。这种表达水平也可以与其他启动子比较以确定研究中的启动子的相对强度。一旦确认了活性和功能性，则可以使用另外的突变和/或缺失分析来确定起始转录所需的最小区域和/或序列。因此，序列可以在启动子区域的5'末端和/或启动子区域的3'末端缺失，并且核苷酸取代可以被引入。然后，将这些构建体再次引入细胞中并且确定它们的活性和/或功能性。
[0067]
启动子的活性或强度按照相对于mrna或蛋白质的总量，该启动子具体生产的mrna或蛋白质积累的量来测量。启动子优选地以大于总mrna水平的约0.1％、约0.2％、约0.5％、更优选地大于总mrna水平的约1％的水平表达可操作地连接的核酸序列。可替代地，启动子的活性或强度可以相对于充分表征的启动子(先前对其转录活性进行了评估)来表示。
[0068]
在此将进一步清楚的是，可以从携带d基因组的其他棉属植物(像例如雷蒙德氏棉(gossypium raimondii)、海岛棉(gossypium barbadense)和达尔文氏棉(gossypium darwinii))中分离等价的根优先启动子、胁迫诱导型启动子和胁迫诱导型根优先启动子。为此，直系同源启动子片段可以从其他植物分离，使用seq id no:7或具有其至少600个连续核苷酸的功能片段作为探针并且鉴定来自这些其他植物的在本文描述的杂交条件下杂交的核苷酸序列。通过举例的方式，本发明的启动子可以用于根据本领域所熟知的技术来筛选感兴趣的作物或植物的基因组文库以分离相应的启动子序列。因此，可以将本发明的启动子序列用作探针用于在中严格至高严格条件下与基因组文库杂交。作为可替代的等价方案，可以使用由seq id no:7的启动子控制的基因的编码序列来筛选感兴趣的作物的基因组文库(例如通过杂交或计算机模拟)来分离启动子。当获得足够的在编码序列之间的一致性(例如，高于95％的一致性)时，可以分离在直系同源基因上游的启动子区域。
[0069]
适用于本发明的是包含根优先启动子活性、胁迫诱导型启动子活性或胁迫诱导型根优先启动子活性的核酸，这些核酸包含与在此描述的启动子和启动子区域或其功能片段具有至少95％、或至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列并且被称为变体。关于本发明的转录调控核苷酸序列seq id no: 7，术语“变体”旨在意指实质性地相似的序列。天然存在的等位基因变体(例如这些)可以通过使用熟知的分子生物学技术来鉴定，如，例如，通过在此之前概述的聚合酶链式反应(pcr)和杂交技术来鉴定。变体核苷酸序列还包括合成地衍生的核苷酸序列，例如通过使用seq id no:7的定点诱变产生的那些。通常，本发明的核苷酸序列变体将通常与天然(野生型或内源的) 核苷酸序列或其功能片段具有至少80％，例如81％、82％、83％、84％、至少 85％，例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、至98％和99％的核苷酸序列一致性。在此披露的dna分子的衍生物可以包括但不限于，序列缺失、单个或多个点突变、在特定的限制性内切酶位点处的改变、功能元件的添加、或可以增强或另外改变启动子表达的其他分子修饰手段。用于获得此类衍生物的技术是本领域所熟知的(参见，例如，j.f.sambrook、d.w.russell、和n.irwin(2000)molecular cloning: a laboratory manual[分子克隆：实验室手册]，第3版，第1、2和3卷，冷泉港实验室出版)。例如，本领域的普通技术人员可以界定在此所披露的启动子内的功能元件和使任何非必需的元件缺失。功能元件可以被修改或组合以针对任何
特定应用来增加本发明的序列的实用性或表达。本领域的技术人员通晓标准资源材料，这些标准资源材料描述用于构建、操纵和分离大分子 (例如，dna分子、质粒等)以及产生重组生物体和筛选并分离dna分子的具体条件和程序。
[0070]
如在此使用的，术语“序列一致性百分比”是指最优比对的dna的窗口的两个区段之间的相同核苷酸的百分比。用于比对比较窗口的最优比对对本领域的普通技术人员而言是熟知的，并且可以通过多种工具例如smith和 waterman的局部同源算法(waterman,m.s.，introduction to computationalbiology:maps,sequences and genomes[计算生物学入门：图谱、序列和基因组] chapman&hall出版社，伦敦(1995)，needleman和wunsch的同源比对算法(j.moi.biol.[分子生物学杂志]，48:443-453(1970)，pearson和lipman 相似性搜索方法(proc.natl.acad.sci.[美国科学院院刊]，85:2444 (1988)，以及优选地通过这些算法的计算机化实施例如作为gcg(注册商标)、威斯康星软件包(wisconsin package)(来自加利福尼亚州圣地亚哥阿赛乐公司(accelrys inc.)的注册商标)的部分可获得的gap、bestfit、 fasta和tfasta来进行。用于测试序列和参考序列的比对区段的“一致性分数”是两个比对序列所共有的相同组分的数目除以参考序列区段(即完整的参考序列或该参考序列的较小的限定部分)中组分的总数目。序列一致性百分比表示为一致性分数乘以100。一个或多个dna序列的比较可以是与全长 dna序列或其部分或与更长的dna序列比较。
[0071]
因此，包含与seq id no:7具有至少约95％序列一致性的核苷酸序列的核酸可以是包含与seq id no:7具有至少约95％、或至少约98％、99％或 100％序列一致性的核苷酸序列的核酸。
[0072]
包含根优先启动子和胁迫诱导型启动子的核酸的“功能片段”表示如下核酸，该核酸包含一段seq id no:7的核酸序列、或一段与seq id no:7具有至少95％序列一致性的核酸，其是至少400bp并且仍然发挥所希望的功能，即，其具有根优先启动子活性和胁迫诱导型启动子活性。在此提供了用于确定根优先启动子活性的测定。优选地，根优先启动子和胁迫诱导型启动子的功能片段含有保守的启动子基序，例如像，如在doop(doop.abc.hu，直系同源启动子数据库(databases of orthologous promoters)，barta e.等人， (2005)nucleic acids research[核酸研究]第33卷，d86-d90)中描述的保守启动子基序。功能片段可以是从转录起始位点至少约400pb、至少约500 pb、至少约600bp、至少约700bp、至少约800bp、至少约900bp或从转录起始位点至少约600bp、至少约700bp、至少约800bp、至少约900bp、至少约1000bp的片段。
[0073]
包含seq id no:7的核苷酸序列的核酸，其进一步包含至少1个核苷酸多达20个核苷酸、至少1个核苷酸多达15个核苷酸、至少1个核苷酸多达 10个核苷酸、至少1个核苷酸多达5个核苷酸、至少1个核苷酸多达4个核苷酸、至少1个核苷酸多达3个核苷酸、或甚至至少1个核苷酸多达2个核苷酸的插入、缺失、取代，可以覆盖从转录起始位点的至少约600bp、至少约700bp、至少约800bp、至少约900bp、或者从转录起始位点的至少约800 bp、至少约900bp、至少约1000bp。
[0074]
在本文所披露的启动子序列上鉴定了许多推定的反应元件。搜索限于胁迫反应元件。在seq id no:7中位置186至193、192至199、223至230和 235至242处鉴定了四个aba-反应元件样(abre-样)基序。
[0075]
在此描述的启动子的变体包括包含鉴定的abre样基序的那些，但是已经被另外修饰以缺失在该序列内的核苷酸段，这些核苷酸段对于启动子以根优先和胁迫诱导的方式发挥功能是不需要的。例如，位于基序之间和/或转录起始和第一基序之间的任何核苷酸段可以至少部分缺失以产生比seq id no: 7的约1kb序列更短的核苷酸序列。
[0076]
包含根优先启动子活性、胁迫诱导型启动子活性或胁迫诱导型根优先启动子活性的其他核酸可以使用本领域已知的方法鉴定。此类核苷酸序列可以通过在严格条件下使用包含seq id no:7的核苷酸序列或其部分的核酸作为探针杂交来进行鉴定和分离。包含根优先启动子活性、胁迫诱导型启动子活性或胁迫诱导型根优先启动子活性的其他核酸也可以通过dna扩增来获得，该dna扩增使用对根据本发明的序列具有特异性的寡核苷酸作为引物，例如但不限于如下寡核苷酸，这些寡核苷酸包含来自seq id no:7的核苷酸序列中的任一个或其互补序列的约20个至约50个连续的核苷酸、或由其组成。可以使用基本局部比对搜索工具(blast)同源搜索和其他核苷酸或氨基酸序列，以计算机模拟的方式鉴定包含根优先启动子活性、胁迫诱导型启动子活性或胁迫诱导型根优先启动子活性的其他核酸。可以使用在此描述的方法验证包含根优先启动子活性、胁迫诱导型启动子活性或胁迫诱导型根优先启动子活性的所鉴定的核酸的功能性。还可以通过识别与由本发明的启动子控制的基因的内源编码序列的基因序列直系同源的基因序列并且分离和测试这些直系同源的同源编码序列上游的启动子序列来鉴定包含根优先启动子活性、胁迫诱导型启动子活性或胁迫诱导型根优先启动子活性的其他核酸。
[0077]
根据本发明的启动子可以进一步用于产生杂合启动子，即含有(部分地)一种或多种本发明的启动子以及含有(部分地)可以是本领域中新鉴定的或已知的其他启动子。此类杂合启动子可能具有优化的组织特异性或表达水平。
[0078]
如在此使用的，“植物可表达启动子”意指对在植物细胞中的转录起始是必需的dna序列的区域。这包括任何植物来源的启动子，但还包括任何非植物来源的能够在植物细胞中指导转录的启动子，即病毒或细菌来源的某些启动子，例如camv35s、地三叶草病毒启动子4号或7号(wo 9606932)或 t-dna基因启动子等。
[0079]
在另外的实施例中，该植物可表达启动子是组成型启动子。在另一个实施例中，该启动子是花椰菜花叶病毒camv35s启动子。
[0080]
组成型启动子的其他实例包括来自肌动蛋白基因的启动子(mcelroy等人，(1990)plant cell[植物细胞]2:163-171)、camv19s启动子(nilsson 等人，(1997)physiol.plant.[植物生理学]100:456-462)、gos2启动子 (de pater等人，(1992)plant.j.[植物杂志]2(6):837-44)、来自泛素基因的启动子(christensen等人，(1992)plant mol.biol.[植物分子生物学]18: 675-689)、来自水稻亲环蛋白基因的启动子(buchholz等人，(1994)plant. mol.biol.[植物分子生物学]25(5):837-43)、来自玉蜀黍h3组蛋白基因的启动子(lepetit等人，(1992)mol.gen.genet.[分子和普通遗传学]231:276
‑ꢀ
285)或来自肌动蛋白2基因的启动子(an等人，(1996)plant j.[植物杂志] 10(1):107-121)。
[0081]
重组基因
[0082]
另外的实施例提供重组基因，所述重组基因包含具有上文描述的胁迫诱导型根优先启动子活性的核酸，并且任选地包含转录终止子和聚腺苷酸化序列，优选地包含棉属植
物细胞中有功能的转录终止子和聚腺苷酸化区域，所述核酸可操作地连接至编码感兴趣的表达产物的异源核酸序列。在另外的实施例中，所述感兴趣的表达产物是能够调节基因的表达的rna或是蛋白质。
[0083]
短语“可操作地连接的”是指两个或更多个核酸区域或核酸序列的功能性空间排列。例如，启动子区域可以相对于核酸序列被定位，这样使得核酸序列的转录由启动子区域指导。因此，启动子区域被“可操作地连接”至该核酸区域。“功能性地连接”是等价的术语。
[0084]
术语“表达产物”是指转录的产物。所述表达产物可以是转录的rna。应理解的是所产生的rna是生物活性的rna。当所述生物活性的rna是 mrna并且所述蛋白质是通过所述mrna的翻译产生的时，所述表达产物也可以是肽、多肽、或蛋白质。
[0085]
可替代地，可操作地连接至本发明的启动子的异源核酸也可以编码能够调节基因的表达的rna。所述能够调节基因的表达的rna也可以是减少基因的表达的rna。所述rna可以例如通过rna介导的基因沉默的机制减少基因的表达。
[0086]
所述能够调节基因的表达的rna可以是下调靶基因的表达的沉默 rna。如在此使用的，“沉默rna”或“沉默rna分子”是指在引入植物细胞中时减少靶基因的表达的任何rna分子。这样的沉默rna可以是例如所谓的“反义rna”，由此该rna分子包含与靶核酸的序列(优选地，靶基因的编码序列)的互补序列具有95％序列一致性的至少20个连续核苷酸的序列。然而，反义rna也可以针对靶基因的调节序列，包括启动子序列以及转录终止和聚腺苷酸化信号。沉默rna进一步包括例如所谓的“正义rna”，由此该rna分子包含与靶核酸的序列具有95％序列一致性的至少20个连续核苷酸的序列。其他沉默rna可以是与靶核酸的序列的互补序列具有95％序列一致性的、包含至少20个连续核苷酸的“未经聚腺苷酸化的rna”，如在wo01/12824或us 6423885中所述(两个文件均通过引用结合在此)。沉默 rna的又另一种类型是如描述于wo 03/076619(通过引用结合在此)中的 rna分子，该rna分子包含至少20个连续核苷酸、与靶核酸的序列或其互补序列具有至少95％序列一致性，并且进一步包含如描述于wo 03/076619中的主要为双链的区域(包括主要为双链的区域，其包含来自马铃薯纺锤块茎类病毒类型的类病毒的核定位信号或包含cug三核苷酸重复序列)。沉默 rna还可以是包含如在此所定义的正义链和反义链的双链rna，其中该正义链和反义链能够彼此碱基配对以形成双链rna区域(优选地，正义和反义 rna的所述至少20个连续核苷酸彼此互补)。正义和反义区域还可以存在于一个rna分子内，这样使得当正义和反义区域形成双链rna区域时可以形成发夹rna(hprna)。hprna在本领域内是熟知的(参见，例如wo99/53050，通过引用结合在此)。hprna可以被归类为长hprna，具有可以大部分互补、但不必完全互补的长的正义和反义区域(典型地大于约200 bp，范围在200-1000bp之间)。hprna也可以相当小，其大小在从约30bp 至约42bp的范围内，但不会比94bp长很多(参见wo 04/073390，通过引用结合在此)。沉默rna也可以是例如描述于wo 2005/052170、wo2005/047505或us 2005/0144667中的人工微rna分子、或者如描述于wo2006/074400中的ta-sirna(所有文件通过引用结合在此)。所述能够调节基因的表达的rna也可以是rna核酶。
[0087]
所述能够调节基因的表达的rna可以调节(优选地下调)包含在根内的其他基因(即靶基因)的表达、或甚至存在于以转基因植物的根为食的病原体或有害生物(例如病毒、真菌、昆虫、线虫、细菌)内的基因的表达。使用基因沉默的有害生物控制的实例描述在例如wo 2007/080127中。
[0088]
与根据本发明的启动子异源的核酸序列通常可以是实现增加的、改变的 (例如，在不同器官中)或减少的基因转录水平的任何核酸序列，对于该基因这样的表达调节是所希望的。例如该核酸序列可以编码感兴趣的蛋白质。在根中增加或减少的转录水平可能是所希望的示例性基因是例如可以在根中提供农业或工业上重要的特征的核酸。合适的感兴趣的异源核酸序列包括调节以下基因的表达的核酸：赋予对根有害生物(像线虫)和病害的抗性的基因、胁迫耐受性基因、编码涉及细胞扩增的蛋白质的基因、和涉及蛋白质摄取的细胞分化基因、涉及新陈代谢或营养物吸收的基因、编码转运蛋白蛋白质(例如硝酸盐转运蛋白(包括nrt转运蛋白蛋白质)、铵转运蛋白(包括 amt蛋白质)等等)的基因。
[0089]
在胁迫下增加的或降低的转录水平可能是希望的示例性基因是例如编码大分子保护因子(lea蛋白质、分子伴侣)、渗透物生物合成的关键酶(脯氨酸、糖类)、解毒酶(例如超氧化物歧化酶)、水通道或转运蛋白、转录因子(例如dreb2、areb、myc、bzip、nac)的基因、或涉及激素信号传导或生物合成(相关的激素的实例是aba、油菜素类固醇、细胞分裂素、乙烯)的基因。线虫抗性的基因也是相关的，例如wo 1995/020669、wo2001/051627、wo 2008/139334、wo 2008/095972、wo 2006/085966、wo2003/033651、wo 1999/060141、wo 1998/012335、wo 1996/030517、wo1993/018170、wo 2008/095886、wo 2008/095887、wo 2008/095888、wo2008/095889、wo 2008/095910、wo 2008/095911、wo 2008/095916、wo2008/095919、wo 2008/095969、wo 2008/095970、wo 2008/095972、wo2008/110522、wo 2008/139334、wo 2008/152008、wo 2010/077858、wo2010/091230、wo 2010/102172、wo 2010/106163、wo 2011/082217、wo2011/003783、wo 2011/014749、wo 2007/147029、wo 2014/003769、wo2010/077858。
[0090]
如在此使用的“转录终止子和聚腺苷酸化区域”是控制初生态rna的切割的序列，随后将poly(a)尾巴添加至所得rna 3'端，在植物细胞中发挥功能。在植物细胞中发挥功能的转录终止子和聚腺苷酸化信号包括但不限于3'nos、 3'35s、3'his和3'g7。
[0091]
术语“蛋白质”可与术语“多肽”互换使用，在此使用的，术语“多肽”描述了一组由超过30个氨基酸组成的分子，然而术语“肽”描述了由最多30个氨基酸组成的分子。蛋白质和肽可以进一步形成二聚体、三聚体和更高级的寡聚体，即由多于一个(多)肽分子组成。形成此类二聚体、三聚体等的蛋白质或肽分子可以是相同或不相同的。因此，相应的更高级的结构被称为同二聚体或异二聚体、同三聚体或异三聚体等。术语“蛋白质”和“肽”也指天然修饰的蛋白质或肽，其中该修饰是例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化等实现的。此类修饰在本领域中是熟知的。
[0092]
术语“异源”是指源自不同来源的两个或更多个核酸序列或蛋白质序列之间的关系。例如，启动子关于可操作地连接的dna区域(例如编码序列)是异源的，假如这种组合一般在自然界中不存在。此外，特定序列关于插入其的细胞或生物体可以是异源的(即不天然存在于该特定细胞或生物体中)。例如，在此披露的重组基因是异源核酸。
[0093]
术语“重组基因”是指含有以下各项的任何人工基因：a)dna序列，包括在自然界中不一起存在的调节和编码序列、或b)编码不是天然毗邻的蛋白质的部分的序列、或c)不是天然毗邻的启动子的部分。相应地，重组基因可以包含调节序列和源自不同来源的编码序列，或包含调节序列和源自相同来源的编码序列，但是以与自然界发现的不同的方式排列。
[0094]
在另一方面，本发明提供包含以下各项的重组基因：(a)选自下组的植物可表达启
动子，该组由以下各项组成：i.根优先启动子、ii.胁迫诱导型启动子、和iii.胁迫诱导型根优先启动子，(b)编码膜联蛋白蛋白质的核酸序列，以及(c)任选地，转录终止子和聚腺苷酸化序列，优选地在植物中有功能的转录终止子和聚腺苷酸化区域。
[0095]
可以在重组载体中提供上文描述的任何启动子和异源核酸序列。典型地重组载体包含，以5'至3'取向：指导核酸序列转录的启动子和核酸序列。该重组载体可以进一步包含3'端转录终止子、3'端聚聚腺苷酸化信号、其他非翻译核酸序列、运输和靶向核酸序列、选择性标记、增强子和操纵子，如所希望的。词语“5'utr”是指dna上游的非翻译区域、或基因编码区域的5'端，并且“3'utr”是指dna下游的非翻译区域、或基因编码区域的3'端。用于制备重组载体的手段是本领域熟知的。用于制备特别适合于植物转化的重组载体的方法描述于us 4971908、us 4940835、us 4769061和us 4757011中。可用于在高等植物中表达核酸的典型载体是本领域熟知的，并且包括源自根癌农杆菌的肿瘤诱导的(ti)质粒的载体。在重组质粒中也可以提供一种或更多种另外的启动子。这些启动子可以被可操作地连接至，例如但不限于，上文描述的任何核酸序列。可替代地，这些启动子可以被可操作地连接至其他核酸序列，例如编码转运肽、选择性标记蛋白质或反义序列的那些核酸序列。这些另外的启动子可以基于载体将被插入其中的细胞类型来进行选择。而且，在细菌、酵母和植物中发挥功能的启动子在本领域中也被很好地传授。这些另外的启动子也可以基于它们的调节特征来进行选择。此类特征的实例包括转录活性、可诱导性、组织特异性和发育阶段特异性的增强。
[0096]
该重组载体也可以包含一种或更多种另外的核酸序列。这些另外的核酸序列通常可以是适合于在重组载体中使用的任何序列。此类核酸序列包括但不限于上文描述的任何核酸序列及其修饰形式。另外的结构核酸序列还可以被可操作地连接至上文描述的任何启动子。一个或多个结构核酸序列各自可以被可操作地连接至分离启动子。可替代地，结构核酸序列可以被可操作地连接至单一启动子(即，单一操纵子)。
[0097]
膜联蛋白
[0098]
适合于本发明的是编码膜联蛋白蛋白质的核酸，这些核酸包含与在此描述的基因具有至少40％、至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少 80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％序列一致性的核苷酸序列并且也被称为变体。关于本发明的seq id no:12和seq id no:14 的核苷酸序列，术语“变体”旨在意指实质上相似的序列。天然存在的等位基因变体(例如这些)可以通过使用熟知的分子生物学技术来鉴定，如，例如，通过在此之前概述的聚合酶链式反应(pcr)和杂交技术来鉴定。变体核苷酸序列还包括合成地衍生的核苷酸序列，例如通过使用seq id no:12 或14的任一者的定点诱变产生的那些。总体上，本发明的核苷酸序列变体将与天然的(野生型或内源的)核苷酸序列具有至少40％、50％、60％至 70％，例如，优选地71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％至 79％，总体上至少80％，例如，81％至84％，至少85％，例如，86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、至98％和 99％的核苷酸序列一致性。在此披露的dna分子的衍生物可以包括但不限于，序列缺失、单个或多个点突变、在具体的限制性内切酶位点处的改变、功能元件的添加、或其他分子修饰手段。用于获得此类衍生物的技术是本领域所熟知的(参见，例如，j.f.sambrook、d.w.russell、和n.irwin (2000)molecular cloning:a laboratory manual[分子克隆：实验室手册]，第 3版，第1、2和3卷，冷泉港实验
室出版)。本领域的技术人员通晓标准资源材料，这些标准资源材料描述用于构建、操纵和分离大分子(例如，dna分子、质粒等)以及产生重组生物体和筛选并分离dna分子的具体条件和程序。
[0099]
如上文所定义的，在这部分种使用术语“序列一致性百分比”。
[0100]
因此，包含与seq id no:12或seq id no:14具有至少80％序列一致性的核苷酸序列的核酸可以是包含分别与seq id no:12或seq id no:14具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％、或 100％序列一致性的核苷酸序列的核酸。
[0101]
在优选的实施例中，编码膜联蛋白蛋白质的核酸序列包含(a)seq idno:12或seq id no:14的核苷酸序列；(b)与seq id no:12或seq id no: 14具有至少80％一致性的核苷酸序列；(c)在严格条件下能够与seq id no: 12或seq id no:14的核苷酸序列杂交的核酸的核苷酸序列；(d)编码seqid no:13或seq id no:15的氨基酸序列的核苷酸序列；(e)编码与seq idno:13或seq id no:15具有80％一致性的氨基酸序列的核苷酸序列；(f)编码包含四个或更多个膜联蛋白重复结构域的蛋白质的核苷酸序列。
[0102]
seq id no:12代表annbj1基因的核苷酸序列，seq id no:14代表 ghann1基因的核苷酸序列，seq id no:13代表annbj1蛋白质的氨基酸序列，并且seq id no:15代表ghann1蛋白质的氨基酸序列。
[0103]
膜联蛋白由其高度保守的折叠定义，这些折叠由四个或更多个所谓的膜联蛋白重复结构域特征序列的重复序列组成。膜联蛋白重复结构域在pfam数据库中被称为pf00191，在interpro数据库中被称为ipr001464，并且在智能数据库中被称为sm00335。每个重复序列由五个螺旋束组成。可以在每个重复序列的起始处鉴定内联蛋白折叠。钙结合发生在第一和第四重复序列的内联蛋白折叠区域中建立的ii型结合位点中。另外的特定的氨基酸对于膜联蛋白功能是必需的：第一内联蛋白折叠中的色氨酸和组氨酸、第一膜联蛋白重复结构域的色氨酸以及第三内联蛋白折叠中的异亮氨酸-精氨酸-异亮氨酸(图 2)。
[0104]
虽然本发明优选使用编码来自芥菜(brassica juncea)的annbj1的核酸，但是可以使用编码其他膜联蛋白的核酸。此类蛋白质的实例是： q67ex8、e0zqa2、d2jya7、a0a078hjr9、x2jgy9、a0a078ceh0、 d9j167、m4f009、d7klx8、q9syt0、d2jya6、r0gqt5、 a0a078hys1、m4f6q4、a0a087g1v1、a0a078dr00、v4lgl7、 a0a061fnb4、a0a067gqh6、v4t729、m4n630、o82090、s5gfp3、 p93157、a9pa39、g3e7m9、m4mz02、m5xrz4、a9ph68、 a0a059bs83、a0a067kyu4、m4feq6、k9jgf9、i3szs2、a0a067lqj4、 b9rjj1、o22341、s5g971、a0a059b7w7、a0a061djj7、a5btz8、 g7kb73、a0a059b7m2、a0a059b7c5、q9xen8、a0a068txq7、 k4bsr4、a0a059b8a3、a0a059b8z0、q42657、m5w098、q9sb88、 q9zru7、p93158、a0a059brt1、o24131、b9hfg8、m0znv9、 b9h529、c6tft8、i3rzy7、m4mx74、q69dc2、l0au94、l0asq7、v7b5v0、q9m3h3、o81536、o24132、m4mx50、a0a068tyu6、 r0g7s3、o81535、a0a022r8d3、a0a067ers2、a0a078fje4、m4e6e2、 i3y171、q2xte7、v7crx1、a5b479、q9xee2、q42922、a9x4r2、 d7mt72、a0a072tf84、v4mj15、a0a078h8v3、w9qyy2、m4esw0、 a0a087ge86、x2jpm6、q9lx07、v4vzp8、b3tly9、q4abp7、 a0a078bzl8、a9x4r1、v4ksn9、b7u9r9。
[0105]
此外，将清楚的是，其中一个或多个氨基酸残基已被缺失、取代或插入的膜联蛋白蛋白质的变体也可以用于根据本发明的方法中的相同效应，其条件是膜联蛋白重复结构域不受氨基酸的缺失、取代或插入的影响。这些变体膜联蛋白蛋白质可以与在此提及的任一
种膜联蛋白蛋白质具有约95％序列一致性。
[0106]
取代的实例是保守取代，即一个氨基酸被另一个具有相似生理化学性质的氨基酸取代。已知这些取代不会影响蛋白质的结构。此类取代通过用属于如下的相同组的另一个氨基酸置换一个氨基酸实现：
[0107]
第1组：半胱氨酸(c)；
[0108]
第2组：苯丙氨酸(f)、色氨酸(w)和酪氨酸(y)；
[0109]
第3组：组氨酸(h)、赖氨酸(k)和精氨酸(r)；
[0110]
第4组：天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)、天冬酰胺(n)和谷氨酰胺(q)；
[0111]
第5组：异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、蛋氨酸(m)和缬氨酸(v)；
[0112]
第6组：丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、脯氨酸(p)、丝氨酸(s)和苏氨酸 (t)。
[0113]
宿主细胞和植物
[0114]
又其他实施例提供包含根据本发明的分离的核酸或根据本发明的重组基因的宿主细胞，例如大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、或植物细胞。
[0115]
其他核酸序列连同启动子和结构核酸序列(例如也与本发明的载体连接)也可以被引入宿主细胞。这些其他序列可以包括3'转录终止子、3'聚腺苷酸化信号、其他非翻译核酸序列、转运或靶向序列、选择性标记、增强子和操纵子。上文描述了本发明的优选的核酸序列，包括重组载体、结构核酸序列、启动子和其他调节元件。
[0116]
在另外的实施例中，提供了包含根据本发明的任一个重组基因的植物。另外的实施例提供可从根据本发明的植物中获得的植物部分和种子。这些植物部分和种子包含上文描述的重组基因。在另一个实施例中，根据本发明的这些植物、植物部分或种子是棉花、大豆或小麦植物、植物部分或种子。
[0117]
包含根据本发明的任一个重组基因的植物细胞或植物可以是如下植物细胞或植物，该植物细胞或植物包含其启动子或或可操作地连接至所述启动子的异源核酸序列对于植物细胞是异源的重组基因。此类植物细胞或植物可以是转基因植物，其中重组基因经由转化引入。可替代地，植物的植物细胞可以包含根据本发明的衍生自相同物种的启动子，该启动子可操作地连接至衍生自该相同的物种的核酸，即启动子和可操作地连接的核酸对于植物细胞都不是异源的，但是该启动子可操作地连接至不是其天然连接的核酸。可以经由转化将重组基因引入植物或植物细胞中，这样使得启动子和可操作地连接的核苷酸两者都在它们都不是天然存在的基因组中的位置。可替代地，根据本发明的启动子能够以靶向方式整合到编码感兴趣的表达产物的内源核酸上游的、植物或植物细胞的基因组中，即以便调节内源基因的表达模式。以靶向方式整合到内源核酸上游的启动子可以整合到其最初来源的植物物种的细胞中，或整合到异源植物物种的细胞中。可替代地，异源核酸能够以靶向方式整合到根据本发明的启动子下游的、植物或植物细胞的基因组中，这样使得所述异源核酸是根优先地表达的并且是胁迫诱导的。所述异源核酸是对于启动子是异源的核酸，即启动子与所述异源核酸的组合在自然界中通常不存在。所述异源核酸可以是对其所插入的所述植物物种而言是异源的核酸，但是其也可以在植物基因组的不同位置处天然存在于所述植物物种中。所述启动子或所述异源核酸可以使用例如在wo 2005/049842中描述的方法经由靶向序列插入以靶向方式整合到植物基因组中。
[0118]“植物”涵盖“单子叶植物”和“双子叶植物”。
[0119]“单子叶植物”(“monocotyledonous plants”)也称为“单子叶植物
”ꢀ
(“monocot plants”或“monocots”)，是本领域熟知的并且其种子通常具有一个子叶的植物。单子叶植物的实例是草，例如草甸草(蓝草，早熟禾属 (poa))；饲草，例如羊茅属(festuca)、黑麦草属(lolium)；温带草，例如翦股颖属(agrostis)；以及谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。
[0120]“双子叶植物”(“dicotyledonous plants”)也称为“双子叶植物”(“dicotplants”或“dicots”)，是本领域熟知的并且是其种子通常具有两个子叶的植物。双子叶植物家族的实例是十字花科(brassicaceae)、茄科 (solanaceae)、豆科(fabaceae)、锦葵科(malvaceae)。
[0121]
如在此使用的“锦葵科”是指属于锦葵科植物(malvaceae plants)家族的植物，也称为锦葵科(mallows family)。锦葵科的实例包括但不限于棉属物种，例如陆地棉、海岛棉、亚洲棉和草棉或来自此类物种与其他物种杂交的后代或这些物种之间杂交的后代。
[0122]
如在此使用的“棉花”或“棉花植物”可以是可用于种植棉花的任何品种。最常用的棉花品种是海岛棉、陆地棉、亚洲棉和草棉。另外的品种包括阿非利加棉(g.africanum)和雷蒙德氏棉(g.raimondii)。还包括的是来自前述任一物种与其他物种杂交或这类物种之间杂交的后代。
[0123]
以下是可以用于转化的棉花基因型的非限制性列表：coker 312、coker310、coker 5acala sj-5、gsc25110、siokra 1-3、t25、gsa75、acala sj2、 acala sj4、acala sj5、acala sj-c1、acala b1644、acala b1654-26、acalab1654-43、acala b3991、acala gc356、acala gc510、acala gam1、acalac1、acala royale、acala maxxa、acala prema、acala b638、acala b1810、 acala b2724、acala b4894、acala b5002、acala 1517-88、acala 1517-91、 acala 1517-95、non acala“picker”siokra、“stripper”品种fc2017、coker 315、 stoneville 506、stoneville 825、stoneville 324、stoneville453、stoneville 474、stoneville kc 311、stoneville la 887、 stoneville 4145、stoneville 4288、stoneville 4498、 stoneville 4554、stoneville 4747、stoneville 4946、 stoneville 5032、stoneville 5115、stoneville 5289、 stoneville 5445、stoneville 5458、stoneville 6182、 stoneville 6448、daytona、cobalt、dp20、dp20b、dp nucotn 33b、 dp nucotn 35b、dp41、dp50、dp51、dp61、dp90、dp77、dp161、 dp340、dp357、dp358、dp360、dp744、dp0912、dp0920、dp0924、 dp0935、dp0949、dp0920、dp1028、dp1034、dp1044、dp1050、 dp1133、dp1137、dp1212、dp1219、dp1252、dp1311、dp1321、 dp1359、dp1410、dp1441、dp1454、dp5409、dp5415、dp5461、 dp5690、dp5816、mon/dp 09r303、mon/dp 09r549、mon/dp 09r550、 mon/dp 09r555、mon/dp 09r573、mon/dp 09r605、mon/dp 09r615、mon/dp 09r619、mon/dp 09r621、mon/dp 09r623、mon/dp 09r627、 mon/dp 09r643、mon/dp 09r796、mon/dp 09r999、mon/dp 10r013、 mon/dp 10r020、mon/dp 10r030、mon/dp 10r051、mon/dp 10r052、 mon/dp 11r112、mon/dp 11r124、mon/dp 11r130、mon/dp 11r136、 mon/dp 11r154、mon/dp 11r158、mon/dp 11r159、mon/dp 12r224、 mon/dp 12r242、mon/dp 12r244、mon/dp 12r249、mon/dp 12r251、 12r254、mon/dp 13r310、mon/dp 13r348、mon/dp 13r352、mon/dp14r1455、mon/dp 14r1456、dp suregrow、suregrow 125、suregrow 248、 suregrow 404、suregrow 501、suregrow 1001、
des119、mcn235、hbx87、 hbx191、hbx107、fc 3027、chembred a1、chembred a2、 chembred a3、chembred a4、chembred b1、chembred b2、 chembred b3、chembred c1、chembred c2、chembred c3、 chembred c4、chembred cb407、paymaster 145、hs26、hs46、 hyperformer 44、hyperformer hs46、sicala、pima s6 oro blancopima、pima s7、ha01、ha02、ha03、ha04、ha05、ha195、ha211、 ha195、ha222、白色(white)pima、phy72、phy222、phy333、 phy339、phy367、phy375、phy417、phy427、phy495、phy499、 phy565、phy575、phy725、phy755、phy800、phy802、phy804、 phy805、phy811、phy830、fm5013、fm5015、fm5017、fm989、 fm832、fm966、fm958、fm989、fm958、fm832、fm991、fm819、 fm800、fm960、fm966、fm981、fm1320、fm1740、fm1773、fm1830、 fm1845、fm1880、fm1900、fm1944、fm2007、fm2011、fm2322、 fm2324、fm2334、fm2484、fm2989、fm5035、fm5044、fm5045、 fm5013、fm5015、fm5017、fm5024、fm8270、fm9058、fm9160、 fm9170、fm9180、fm9250以及具有衍生自其的基因型的植物。
[0124]
如在此使用的“豆科”是指通常称为豆类、豌豆或菜豆植物家族的植物。豆科的实例是但不限于大豆(glycine max、soybean)、菜豆属(phaseolus) (豆子(beans))、豌豆(pisum sativum、pea)、鹰嘴豆(cicerarietinum、chickpeas)、苜蓿(medicago sativa、alfalfa)、花生(arachishypogaea、peanut)、香豌豆(lathyrus odoratus、sweet pea)、长角豆 (ceratonia siliqua、carob)、和光果甘草(glycyrrhiza glabra)(甘草(liquorice))。
[0125]
如在此使用的“植物部分”是植物的部分，其可以是细胞、组织或器官，例如种子，切断的部分(例如根、叶、花、花粉、纤维等)。
[0126]
根据本发明的植物可以另外含有赋予除草剂耐受性的内源或转基因，例如赋予抗草铵膦(或)的bar或pat基因[ep 0 242236和ep 0 242 246，通过引用结合]；或任何修饰的epsps基因，例如来自玉蜀黍的2mepsps基因[ep0 508 909和ep 0 507 698，通过引用结合]、或赋予对草甘膦的耐受性的草甘膦乙酰转移酶、或草甘膦氧化还原酶，或赋予溴苯腈耐受性的溴苯腈腈水解酶，或赋予对磺酰脲类、咪唑啉酮类、磺酰基氨基羰基三唑啉酮、三唑并嘧啶或嘧啶基(氧基/硫基)苯甲酸盐的耐受性的任何修饰的ahas基因，例如油菜咪唑啉酮耐性突变体pm1 和pm2，目前以卡诺拉(canola)作为商品销售。此外，根据本发明的植物可以另外含有赋予增加的油含量或改进的油组成的内源或转基因，例如12:0acp硫酯酶增加以获得高月桂酸酯，赋予授粉控制的内源或转基因，例如芽孢杆菌rna酶在花药特异性启动子控制下以获得雄性不育、或者芽胞杆菌rna酶抑制剂在花药特异性启动子的控制下以赋予雄性不育的恢复、或者例如ogura细胞质雄性不育和可育性核恢复系。
[0127]
根据本发明的植物的植物或种子可以进一步用化学化合物处理，例如选自以下列表的化学化合物：除草剂：敌草隆、伏草隆、msma、乙氧氟草醚、扑草净、氟乐灵、唑草酮、烯草酮、吡氟禾草灵-丁基、草甘膦、达草灭、二甲戊乐灵、嘧草硫醚-钠、三氟啶磺隆、吡喃草酮、草铵膦、丙炔氟草胺、苯基噻二唑脲；棉花杀昆虫剂，例如乙酰甲胺磷、涕灭威、毒死稗、氯氰菊酯、溴氰菊酯、阿维菌素、啶虫脒、埃玛菌素苯钾酸酯、吡虫啉、茚虫威、λ-氯氟氰菊酯、多杀菌素、硫双威、γ-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、啶虫丙醚、氟啶虫酰胺、氟虫酰胺、杀铃脲、氯虫
酰胺、β-氟氯氰菊酯、螺虫乙酯、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、呋虫胺、氟虫酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、乙基多杀菌素(spinotoram)、γ-氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2
‑ꢀ
二氟乙基)氨基]呋喃-2(5h)-酮、硫双威、阿维菌素、氟啶虫酰胺、啶虫丙醚、螺甲螨酯、砜虫啶；以及棉花杀真菌剂，例如嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌灵、百菌清、铜、环唑醇、苯醚甲环唑、醚菌胺、氟环唑、咪唑菌酮、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺、异菌脲、吡唑萘菌胺、异噻菌胺、代森锰锌、代森锰、苯氧菌胺、吡噻菌胺、啶氧菌酯、丙森锌、丙硫菌唑、唑菌胺酯、五氯硝基苯、戊唑醇、氟醚唑、甲基硫菌灵、肟菌酯、二氯吡啶酸、禾草灵、胺苯磺隆、吡氟禾草灵、吡草胺、氯甲喹啉酸、喹禾灵。杀真菌剂/pgr：嘧菌酯、n-[9-(二氯甲烷)-1,2,3,4-四氢-1,4-甲烷萘-5
‑ꢀ
基]-3-(二氟甲基)-1-甲基-1h-吡唑-4-甲酰胺(苯并烯氟菌唑 (benzovindiflupyr)、benzodiflupyr)、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌灵、萎锈灵、矮壮素、coniothryrium minitans、环丙唑醇、嘧菌环胺、苯醚甲环唑、烯酰吗啉、醚菌胺、氟环唑、恶唑菌酮、氟啶胺、咯菌腈、氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟喹唑、氟硅唑、fluthianil、粉唑醇、氟唑菌酰胺、异菌脲、吡唑萘菌胺、精甲霜灵、甲哌鎓、甲霜灵、叶菌唑、苯氧菌胺、多效唑、戊苯吡菌胺、吡噻菌胺、啶氧菌酯、咪鲜胺、丙硫菌唑、唑菌胺酯、氟唑环菌胺、戊唑醇、氟醚唑、甲基硫菌灵、福美双、唑菌醇、肟菌酯、坚硬芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌菌株i-1582、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株gb03、枯草芽孢杆菌菌株qst 713、短小芽孢杆菌、短小芽孢杆菌菌株gb34。杀昆虫剂：啶虫脒、涕灭威、印楝素、卡巴呋喃、氯虫苯甲酰胺 (氯虫酰胺)、噻虫胺、溴氰虫酰胺(氰虫酰胺)、β-氟氯氰菊酯、γ-氯氟氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、乐果、呋虫胺、乙虫腈、氟啶虫酰胺、氟虫双酰胺、联氟砜(fluensulfone)、氟吡菌酰胺、氟吡呋喃酮 (flupyradifurone)、τ-氟胺氰菊酯、新烟磷(imicyafos)、吡虫啉、氰氟虫腙、灭虫威、吡蚜酮、氟虫吡喹(pyrifluquinazon)、乙基多杀菌素、多杀菌素、螺虫乙酯、砜虫啶、噻虫啉、噻虫嗪、1-(3-氯吡啶-2-基)-n-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2h-四唑-2-基]甲基}-1h-吡唑-5-甲酰胺、1-(3-氯吡啶-2-基)-n-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-1h-四唑-1-基]甲基}-1h-吡唑-5-甲酰胺、1-{2-氟-4-甲基-5-[(2,2,2-三氟乙基)亚磺酰基]苯基}-3-(三氟甲基)-1h-1,2,4-三唑-5-胺、(1e)-n-[(6-氯吡啶-3-基) 甲基]-n'-氰基-n-(2,2-二氟乙基)乙脒、坚硬芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌菌株i
‑ꢀ
1582、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株gb03、枯草芽孢杆菌菌株qst 713、绿僵菌(metarhizium anisopliae)f52。
[0128]
无论何时提及制造了根据本发明的“植物”或“多个植物”时，应理解的是除非另外指明，在此还包括植物部分(细胞、组织或器官、种子荚、种子、切断的部分例如根、叶片、花、花粉等)、保留了亲本的区别特征的植物的后代，例如通过自交或杂交获得的种子，例如杂交种子(通过将两个近交亲本品系杂交而获得)，从其衍生的杂交植物和植物部分。
[0129]
在一些实施例中，本发明的植物细胞以及根据本发明的方法产生的植物细胞可以是非繁殖细胞。
[0130]
根据本发明获得的植物可以用于常规育种方案以产生更多具有相同特征的植物或者以将该相同特征引入相同或相关植物物种的其他品种中或杂交植物中。获得的植物可以进一步用于产生繁殖材料。根据本发明的植物可以进一步用于产生配子、种子(包括压碎的种子和种子饼)、种子油、纤维、纱线、胚胎、合子或躯体、后代、或通过本发明的方法获得的植物的杂种。从根据本发明的植物获得的种子也被本发明涵盖。
[0131]
如在此使用的，“产生繁殖材料”涉及本领域已知的任何用于生产另外的植物、植物部分或种子的手段，并且尤其包括营养繁殖方法(例如空中或地面压条、分裂、(芽)嫁接、微繁殖、匍匐枝或匍匐茎、贮藏器官(例如鳞茎、球茎、块茎和根茎)、插条或切条、双鳞片)，有性生殖(与另一植物杂交)和无性繁殖(例如单性生殖、体细胞杂交)。
[0132]
方法和用途
[0133]
又其他实施例提供生产转基因植物的方法，该方法包括以下步骤(a)向植物细胞引入或提供任何根据本发明的重组基因以产生转基因细胞；并且(b) 从所述转基因细胞中再生转基因植物。
[0134]
与本技术有关的“引入”涉及通过人工手段将遗传信息置于植物细胞或植物中。这可以通过本领域已知的将rna或dna引入植物细胞、原生质体、愈伤组织、根、块茎、种子、茎、叶片、幼苗、胚胎、花粉和小孢子、其他植物组织或完整植株中的任何方法来实现。“引入”还包括稳定整合至植物的基因组中。可以通过转化或通过与经由转化获得的植物或其后代杂交来引入重组基因(也称为“基因渗入”)。
[0135]
术语“提供”可以是指通过转化将外源dna分子引入植物细胞中，任选地随后从转化的植物细胞再生植物。该术语还可以是指通过以下方式引入重组dna分子：使包含重组dna分子的转基因植物与另一植物进行杂交，并且选择已经遗传了重组dna分子或转基因的后代植物。提供的又另一种可替代的含义是指通过例如原生质体融合等技术引入重组dna分子，任选地随后从融合的原生质体再生植物。
[0136]
可以通过本领域中熟知的方法将重组基因引入植物细胞中。
[0137]
术语“转化”在此是指将核酸引入(或转移)至受体宿主中，该受体宿主例如是包括植物或任何植物部分，包括植物细胞、原生质体、愈伤组织、根、块茎、种子、茎、叶片、纤维、幼苗、胚胎和花粉。含有转化的核酸序列的植物被称为“转基因植物”。转化的、转基因的和重组的是指已经向其中引入异源核酸分子(例如表达盒或重组载体)的宿主生物体例如植物。该核酸可以被稳定地整合至植物的基因组中。
[0138]
在此使用的，短语“转基因植物”是指具有稳定地整合至植物基因组(例如，细胞核基因组或质粒基因组)中的核酸的植物。换句话说，含有转化的核酸序列的植物被称为“转基因植物”，并且包括从转化及其后代(tx世代) 直接获得的植物。转基因的和重组的是指已经向其中引入异源核酸分子(例如，如在此所述的启动子、重组基因或载体)的宿主生物体，例如植物。该核酸可以被稳定地整合至植物的基因组中。
[0139]
应清楚的是，使用的转化方法与本发明具有较小相关性。现在，植物的转化是常规技术。有利地，若干种转化方法中的任一种都可以用于将感兴趣的核酸/基因引入适合的祖先细胞中。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、增加游离dna摄取的化学品、直接将dna注射到植物中、粒子枪轰击、使用病毒或花粉进行转化、以及显微喷射。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(krens等人(1982)nature[自然]296:72-74；negrutiu等人 (1987)plant.mol.biol.[植物分子生物学]8:363-373)；原生质体的电穿孔 (shillito等人(1985)bio/technol.[生物/技术]3:1099-1102)；显微注射至植物材料中(crossway等人(1986)mol.gen.genet.[分子和普通遗传学]202: 179-185)；dna或rna-包被的粒子轰击(klein等人(1987)nature[自然] 327:70)；用(非整合的)病毒感染；等等。
[0140]
用于转化棉花植物的方法也是本领域中熟知的。例如在美国专利 5.004.863或美
国专利6.483.013中已经描述了棉花的农杆菌介导的转化，并且例如在wo 92/15675中报道了通过粒子轰击的棉花转化。其他合适的棉花转化方法披露于例如wo 00071733和us 5.159.135中，这些披露通过引用结合在此，如同完全阐述一样。转化大豆的方法例如描述在wo 2014/150449中。
[0141]
可以为各种谷类建立不同的转化系统：组织的电穿孔、原生质体的转化以及在可再生组织和细胞中通过粒子轰击的dna转移(关于综述，参见jane，euphytica[荷兰植物育种杂志]85(1995)，35-44)。小麦的转化已经在文献中多次描述(关于综述，参见maheshwari，critical reviews in plantscience[植物科学关键评论]14(2)(1995)，149-178，nehra等人，plant j. [植物杂志]5(1994)，285-297)。yuji ishida等人，2015，methods inmolecular biology[分子生物学中的方法]，1223:189-198描述了获得转基因小麦植物的最新方法。
[0142]
根据本发明的重组dna分子可以使用本领域中熟知的方法以稳定的方式或以瞬时的方式引入植物中。重组基因可以被引入植物中，或可以在植物细胞内部产生，如例如在ep 1339859中所述的。
[0143]
进一步提供的是实现核酸的根优先表达、胁迫诱导型表达和胁迫诱导型根优先表达的方法，该方法包括将根据本发明的包含具有根优先启动子活性、胁迫诱导型启动子活性或胁迫诱导型根优先启动子活性的启动子的重组基因引入植物基因组中，或提供根据本发明的植物。还提供的是用于改变生物或非生物胁迫耐受性、根构型、营养物利用效率、线虫抗性或植物产量的方法，该方法包括向植物基因组中引入根据本发明的重组基因、或提供根据本发明的植物。在另一个实施例中，所述植物是棉花、大豆或小麦植物。
[0144]
还提供的是根据本发明的分离的核酸调节在植物中可操作地连接的核酸的表达的用途，以及根据本发明的分离的核酸、或包含具有根优先启动子活性、胁迫诱导型启动子活性和胁迫诱导型根优先启动子活性的核酸的重组基因改变在植物中的生物或非生物胁迫耐受性、根构型、营养物利用效率、或产量的用途。在另外的实施例中，所述植物是棉花、大豆或小麦植物。还提供的是根据本发明的分离的核酸鉴定包含根优先启动子活性、胁迫诱导型启动子活性或胁迫诱导型根优先启动子活性的其他核酸的用途。
[0145]
又另一个实施例提供生产食品、饲料、或工业产品的方法，该方法包括 (a)获得根据本发明的植物或其部分；并且(b)从植物或其部分制备该食品、饲料或工业产品。在另一个实施例中，所述食品或饲料是油、膳食、磨碎的或压碎的种子、大豆片、谷物、淀粉、面粉或蛋白质，或者所述工业产品是生物燃料、纤维、化工原料、药物或营养食品。此类食品、饲料或工业产品含有在此描述的根优先启动子、胁迫诱导型启动子以及胁迫诱导型根优先启动子。
[0146]
在另一个实施例中，本发明提供在胁迫条件下，与对照植物相比增加植物(例如棉花、大豆植物和小麦植物)的产量(例如纤维产量和种子产量) 的方法，该方法包括(a)向所述植物的细胞提供重组基因，该重组基因包含(i) 异源植物可表达启动子、(ii)编码膜联蛋白蛋白质的核酸序列、以及(iii)任选地，转录终止子和聚腺苷酸化序列，优选地在植物中有功能的转录终止子和聚腺苷酸化区域，并且(b)再生所述植物。
[0147]
在另外的实施例中，该胁迫是在田间生长的植物中在植物生殖期期间发生的干旱胁迫。
[0148]
本发明提供增加棉绒产量的方法和增加种子产量的方法。在另外的实施例中，与对照植物相比的产量增加是至少5％。
[0149]
如在此使用的，“对照植物”是指与受试植物遗传相似但不携带重组基因的植物，例如野生型植物或无效隔离植物。
[0150]
此外，披露的方法预期会在其他植物物种中产生类似的结果。特别地，预期在田间条件下在干旱胁迫下玉米的产量会增加。其也可以导致在田间在胁迫条件下欧洲油菜的产量增加。
[0151]
根据本发明，与当所述植物可表达启动子是组成型启动子(优先地 camv35s启动子)时相比，当所述植物可表达启动子是根优先启动子、胁迫诱导型启动子或胁迫诱导型根优先启动子(优先地pbtg-26ghd10启动子) 时，该方法提供更一致地增加的产量。
[0152]
如在此申请中使用的，短语“更一致地增加产量”意指与当使用组成型启动子时展示增加的产量的植物的比例比较，当使用根优先启动子、胁迫诱导型启动子或胁迫诱导型根优先启动子时更大比例的获得的植物展示增加的产量。例如，该比例可能增加了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或甚至100％。
[0153]
此外，披露的方法预期会在其他植物物种中产生类似的结果。特别地，预期在田间条件下在干旱胁迫下玉米的产量会更一致地增加。其也可以导致在田间在胁迫条件下欧洲油菜中更一致的产量增加。
[0154]
通过在此描述的方法获得的转化的植物细胞和植物可以进一步用于本领域熟知的育种程序(例如杂交、自交、和回交)。育种计划可能涉及产生f1 (子一代)世代的杂交，随后进行若干代的自交(产生f2、f3等)。育种计划还可能涉及回交(bc)步骤，由此子代与被称为轮回亲本的亲本系之一回交。
[0155]
因此，在此还披露了用于产生包含在此披露的重组基因的植物的方法，所述方法包括使在此披露的植物与另一植物或与自身杂交并且选择包含所述重组基因的子代的步骤。
[0156]
通过在此披露的方法获得的转化的植物细胞和植物还可以进一步用于后续转化程序，例如，用于引入另外的重组基因。
[0157]
胁迫和产量定义
[0158]
如在此使用的产量可以包含收获的植物或植物部分(例如棉绒、生物质、或种子)的产量，包括种子油含量、种子重量、种子数量。增加的产量可以是增加的产量/株植物、增加的产量/耕地面积单位，例如产量/公顷。可以通过调节例如根中的水分摄取来增加产量，或者通过增加对生物和非生物胁迫条件的耐受性来间接增加产量。
[0159]“胁迫”是指非最佳的环境条件，例如生物胁迫和非生物胁迫。
[0160]
如在此使用的非生物胁迫耐受性可以包含对环境胁迫因子(例如干旱、洪水、极端(高或低)温度、土壤盐度或重金属、低氧、缺氧、渗透胁迫、氧化胁迫、低营养水平(例如氮或磷))的抗性。
[0161]
如在此使用的生物胁迫耐受性可以包含有害生物抗性，例如对真菌、细菌、细菌或病毒病原体、或线虫、或昆虫的抗性。
[0162]
如本技术中所使用的干旱涉及持续特定时间的缺少或不存在可供植物使用的水。
这样的水的缺少或不存在可能持续仅几天，例如至少或多达2天、至少或多达3天、至少或多达4天、至少或多达5天、至少或多达6天、至少或多达7天、至少或多达8天、至少或多达9天、至少或多达10天、至少或多达15天或至少或多达20天。其也可能持续更长的时期，例如至少或多达3周、至少或多达4周、至少或多达5周、至少或多达6周、至少或多达2 个月、至少或多达3个月、至少或多达4个月、至少或多达5个月或至少或多达6个月。在世界上的一些地区中，干旱可能甚至持续比6个月更长，例如7、8、9、10、11、12、15、18或24个月。
[0163]
干旱胁迫可以简单地通过剥夺或减少植物的供水(通过将植物置放在天然干旱暴露区域中或通过减少田间的供水)而施加到植物上。举例来说，供水可以减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少 60％、至少70％、至少80％、至少90％或甚至100％，持续所希望的时间，该时间落入上文关于干旱胁迫所描述的那些时间中。
[0164]
一般定义
[0165]“分离的核酸”，与如在此使用的“分离的dna”可互换使用，是指不存在于其天然基因组环境中的核酸，不考虑其长度和序列。例如，分离的dna可以是指从基因组环境中物理分离的dna，例如基因组dna的片段。分离的 dna也可以是人工产生的dna，例如化学合成的dna，或例如经由扩增反应(例如本领域熟知的聚合酶链式反应(pcr))产生的dna。分离的dna 可以进一步是指存在于其不天然存在的dna环境中的dna。例如，分离的 dna可以是指存在于质粒中的一段dna。此外，分离的dna可以是指存在于除其天然存在的环境以外的另一个染色体环境中的一段dna，如例如基因组中除了天然位置以外的另一个位置、除了其天然存在的物种以外的另一种物种的基因组、或在人工染色体中。
[0166]
杂交发生在两个核酸分子在适宜条件下彼此退火的时候。核酸杂交是 dna操作领域中的技术人员所熟知的技术。一对给定核酸的杂交特性是其相似性或一致性的指示。两个核酸序列实质上相同的另一个指示是在严格条件下这两个分子彼此杂交。短语“特异性杂交”是指一个分子在严格条件下仅仅结合、双链化或杂交至一个特定的核苷酸序列，当该序列存在于复杂的混合物(例如全细胞的)dna或rna中时。“实质性结合”是指在探针核酸和靶核酸之间的互补性杂交并且包含较小的不匹配，这些不匹配可以通过减小杂交介质的严格性来调整以实现靶核酸序列所希望的检测。在核酸杂交实验例如dna印迹杂交和rna印迹杂交的背景下，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下不同。高严格洗涤条件的实例是在72℃在0.15m nacl中持续大约15分钟。严格洗涤条件的实例是在 65℃在0.2x ssc洗涤液中持续15分钟。也可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来实现严格条件。通常，在特定杂交测定法中是(或高于)对不相关探针所观察的信噪比的2x表示检测到特异性杂交。在严格条件下不彼此杂交的核酸，假如它们编码的蛋白质是实质上相同的，它们仍然是实质上相同的。这发生在，例如，使用被基因编码允许的最大密码子简并性产生一个拷贝的核酸的时候。
[0167]
短语“dna”、“dna序列”、“核酸序列”、“核酸分子”、“核苷酸序列”和“核酸”是指包含有序排列的核苷酸的物理结构。该dna序列或核苷酸序列可以包括在更大的核苷酸分子、载体或类似物中。此外，在这些序列中核酸的有序排列可以被描述在序列表、附图、表格、电子媒介物或类似物的形式中。
[0168]
如在此使用的，“包含”应解释为指定所陈述的特征、整体、步骤或组分的存在，但不排除存在或增加一个或多个特征、整体、步骤、组分或其组。因此，例如包含核苷酸或氨基
酸的序列的核酸或蛋白质可以包含多于实际引用的序列的核苷酸或氨基酸，即被嵌入更大的核酸或蛋白质中。包含功能上或结构上定义的核酸的重组基因可以包含另外的dna区域等。然而，在本披露的上下文中，术语“包含”也包括“由
……
组成”。
[0169]
序列表包含在名称为“bcs15-2008wo_st25.txt”的文件中，其为118千字节大小(如microsoft 中所测量)，含有seq id no:1至seqid no:31的31个序列，通过电子提交方式同此提交并且通过引用结合在此。
[0170]
在说明书和实例中，参考以下序列：
[0171]
序列表
[0172]
seq id no:1 t-dna pbtg-26bn::gus的核苷酸序列。
[0173]
seq id no:2 kva07-32引物的核苷酸序列。
[0174]
seq id no:3 kva07-34引物的核苷酸序列。
[0175]
seq id no:4 btg-26gh的a-基因组变体的核苷酸序列。
[0176]
seq id no:5 btg-26gh的d-基因组变体的核苷酸序列。
[0177]
seq id no:6 pbtg-26gh的a-基因组变体的约1kb长启动子的核苷酸序列。
[0178]
seq id no:7 pbtg-26gh的d-基因组变体的约1kb长启动子的核苷酸序列。
[0179]
seq id no:8 t-dna pbtg-26gha0.6::gus的核苷酸序列。
[0180]
seq id no:9 t-dna pbtg-26gha10::gus的核苷酸序列。
[0181]
seq id no:10 t-dna pbtg-26ghd0.6::gus的核苷酸序列。
[0182]
seq id no:11 t-dna pbtg-26ghd10::gus的核苷酸序列。
[0183]
seq id no:12：annbj1的核苷酸序列。
[0184]
seq id no:13：annbj1的氨基酸序列。
[0185]
seq id no:14：ghann1的核苷酸序列。
[0186]
seq id no:15：ghann1的氨基酸序列。
[0187]
seq id no:16：atann1的核苷酸序列。
[0188]
seq id no:17：atann1的氨基酸序列。
[0189]
seq id no:18：t-dna p35s::annbj1的核苷酸序列。
[0190]
seq id no:19：t-dna pbtg-26ghd10::annbj1的核苷酸序列。
[0191]
seq id no:20：qrt-pcr正向引物annbj1。
[0192]
seq id no:21：qrt-pcr反向引物annbj1。
[0193]
seq id no:22：qrt-pcr正向引物pp2a。
[0194]
seq id no:23：qrt-pcr反向引物pp2a。
[0195]
seq id no:24：axmi196的核苷酸序列。
[0196]
seq id no:25：axmi196的氨基酸序列。
[0197]
seq id no:26：axmi031的核苷酸序列。
[0198]
seq id no:27：axmi031的氨基酸序列。
[0199]
seq id no:28：axmi277的核苷酸序列。
[0200]
seq id no:29：axmi277的氨基酸序列。
[0201]
seq id no:30：axn-2的核苷酸序列。
[0202]
seq id no:31：axn-2的氨基酸序列。
[0203]
实例
[0204]
实例1-具有可操作地连接至gus报告基因的欧洲油菜的pbtg-26bn启动子的表达构建体(pbtg-26bn::gus)的产生
[0205]
将欧洲油菜btg-26启动子的启动子序列(embl登录号s77096，seqid no:1的5'至3'位置4474至4148)、具有内含子的gus基因(β-葡萄糖醛酸酶)(seq id no:1的5'至3'位置4101至2101)和camv 35s基因的3' 非翻译区(utr)的片段(seq id no:1的5'至3'位置2031至1827)组装进含有条形选择性标记盒(seq id no:1的位置1720至56)的载体中以产生 t-dna pbtg-26bn::gus(seq id no:1)。
[0206]
实例2-包含pbtg-26bn::gus的转基因植物的产生
[0207]
在下一个步骤中，使用胚性愈伤组织转化方案，将包含实例1的表达盒的重组载体(即pbtg-26bn::gus)用于稳定地转化陆地棉coker 312。
[0208]
实例3-pbtg-26bn::gus在陆地棉中的表达模式
[0209]
在对应的活性测定期间，用发色底物x-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d
‑ꢀ
葡萄糖醛酸)原位监测用btg-26bn::gus转化的植物的β-葡萄糖醛酸酶活性 (jefferson ra等人(1987)embo j.[欧洲分子生物学学会杂志]20；6(13): 3901-7)。为了测定启动子活性，如所描述的(例如，pien s.等人(2001) pnas[美国科学院院刊]98(20):11812-7)对植物组织进行切割、包埋、染色以及分析。因此，在被转化的植物中β-葡萄糖醛酸酶的活性通过因底物x
‑ꢀ
gluc的酶促代谢所引起的蓝色的存在而得到证明。
[0210]
在最佳生长条件下使独立t0植物的后代生长之后，检查植物的gus表达。从这些植物采取来自第一对叶片的叶样品、根样品和茎并测试gus报告基因的表达(例如，pien s.等人(2001)pnas[美国科学院院刊]98(20): 11812-7)。
[0211]
令人惊讶地，欧洲油菜启动子在陆地棉中不能赋予根优先表达(关于结果，参见表1)，尽管在现有技术中证明该启动子甚至在更远的物种大麦中仍保持其根优先活性，并因此表明贯穿双子叶植物和单子叶植物存在高度保存。
[0212]
实例4-编码来自欧洲油菜的btg-26的直系同源基因的陆地棉a和d-亚基因组特异性等位基因的分离
[0213]
将来自欧洲油菜(embl登录号s77096)、水稻(embl登录号af32358)和拟南芥(at1g54100)的btg-26基因的编码序列用于对陆地棉基因组序列数据库进行blast比对。基于获得的结果，使用引物kva07-32 (seq id no:2)和kva07-34(seq id no:3)扩增656bp探针以筛选含有陆地棉fibermax)品种的基因组dna克隆的bac文库。鉴定了每种等位基因变体的基因组片段的核苷酸序列，并将其以seq id no:4(a基因组)和 seq id no:5(d基因组)表示。
[0214]
对于a基因组变体(seq id no:4)，可以在位置1986至1999处鉴定 tata盒；在位置1219处鉴定转录起始位点。5'非翻译前导序列从核苷酸 1219延伸至1483；翻译起始密码子位于位置1484至1486。
[0215]
对于d基因组变体(seq id no:5)，可以在位置2789至2803鉴定 tata盒；在位置2822处鉴定转录起始位点。5'非翻译前导序列从核苷酸 2822延伸至3089；翻译起始密码子位于位置3090至3092。
[0216]
图1显示a启动子和d启动子的第一个约1kb的核苷酸序列的比对。引人注目的是，
两个启动子片段共享约78％序列一致性，然而第一个600bp 几乎一致，共享约94％序列一致性。
[0217]
实例5-具有可操作地连接至gus报告基因的陆地棉的pbtg-26gh启动子的表达构建体(pbtg-26gha0.6::gus、pbtg-26gha10::gus、pbtg
‑ꢀ
26ghd0.6::gus、pbtg-26ghd10::gus)的产生
[0218]
将来自a亚基因组的陆地棉btg-26启动子的启动子短序列(约600bp) (pbtg-26gha0.6，seq id no:8的5'至3'位置4650至4086)、具有内含子的gus基因(seq id no:8的5'至3'位置4082至2082)和camv 35s基因 3'非翻译区(utr)的片段(seq id no:8的5'至3'位置2012至1808)组装进含有条形选择性标记盒(seq id no:8的位置1720至56)的载体中以产生t-dna pbtg-26gha0.6::gus(seq id no:8)。
[0219]
将来自a亚基因组的陆地棉btg-26启动子的启动子长序列(约1kb) (pbtg-26gha10，seq id no:9的5'至3'位置5094至4086)、具有内含子的 gus基因(seq id no:9的5'至3'位置4082至2082)和camv 35s基因的3' 非翻译区(utr)的片段(seq id no:9的5'至3'位置2012至1808)组装进含有条形选择性标记盒(seq id no:9的位置1720至56)的载体中以产生 t-dna pbtg-26gha10::gus(seq id no:9)。
[0220]
将来自d亚基因组的陆地棉btg-26启动子的启动子短序列(约600bp) (pbtg-26ghd0.6，seq id no:10的5'至3'位置4654至4083)、具有内含子的gus基因(seq id no:10的5'至3'位置4082至2082)和camv 35s基因的3'非翻译区(utr)的片段(seq id no:10的5'至3'位置2012至1808) 组装进含有条形选择性标记盒(seq id no:10的位置1720至56)的载体中以产生t-dna pbtg-26ghd0.6::gus(seq id no:10)。
[0221]
将来自d亚基因组的陆地棉btg-26启动子的启动子长序列(约1kb) (pbtg-26ghd10，seq id no:11的5'至3'位置5104至4083)、具有内含子的gus基因(seq id no:11的5'至3'位置4082至2082)和camv 35s基因的3'非翻译区(utr)的片段(seq id no:11的5'至3'位置2012至1808) 组装进含有条形选择性标记盒(seq id no:11的位置1720至56)的载体中以产生t-dna pbtg-26gha10::gus(seq id no:11)。
[0222]
实例6-包含不同pbtg-26gh::gus盒的转基因植物的产生
[0223]
在下一个步骤中，使用胚性愈伤组织转化方案，将包含实例5的表达盒 (即pbtg-26gha0.6::gus、pbtg-26gha10::gus、pbtg-26ghd0.6::gus和 pbtg-26ghd10::gus)的重组载体用于稳定地转化陆地棉coker 312。
[0224]
使用描述在yuji ishida等人，2015，methods in molecular biology[分子生物学中的方法]，1223:189-198中的方法，将包含表达盒pbtg
‑ꢀ
26ghd10::gus的重组载体用于稳定地转化小麦。
[0225]
使用描述在专利申请wo 2014/150449中的方法，将包含表达盒pbtg
‑ꢀ
26ghd10::gus的重组载体用于稳定地转化大豆。
[0226]
实例7-不同pbtg-26gh::gus在陆地棉中的表达模式
[0227]
如在实例3中描述的，监测用pbtg-26gha0.6::gus、pbtg
‑ꢀ
26gha10::gus、pbtg-26ghd0.6::gus和pbtg-26ghd10::gus转化的植物的β-葡萄糖醛酸酶活性。
[0228]
表1显示了每个构建体产生的所有事件在所选择的组织(根、叶和茎) 中的平均表达谱。将染色强度在从0至5的数值范围上定量，0对应于不存在染色。
[0229]
出乎意料地观察到，只有长版本的pbtg-26d启动子导致gus在根中优先表达。事实上，来自a亚基因组的短和长启动子片段以及来自d亚基因组的短启动子片段在所测试的所有组织中驱动相似的表达水平，短d启动子和长a启动子在根中驱动稍低的表达。
[0230]
表1：
[0231][0232]
从这些结果可以进一步总结，d的较短启动子片段不影响较长启动子片段(seqid no:7)的根优先活性，并且可能被例如在seq id no:7的核苷酸序列中的短a启动子的序列替换而不影响其活性。
[0233]
实例8-pbtg-26ghd10启动子的序列分析
[0234]
图1显示来自陆地棉的pbtg-26启动子的核苷酸序列，注释了与胁迫诱导型表达相关的预测的cis元件以及tata盒和转录起始位点的位置。
[0235]
可以从d亚基因组的btg-26启动子预测4个aba响应样基序(abre 样)，但是这些基序在来自a亚基因组的启动子序列中不是保守的。这些基序表明只有来自d亚基因组的启动子序列能够对胁迫响应。
[0236]
实例9-棉花内源btg-26d基因的胁迫诱导性
[0237]
来自cocker品种的陆地棉植物在生长室中生长并且对其浇水直至2个叶片发育阶段。然后在浇水的最后一天(对照样品)和不浇水7天后(d7样品)一式三份收集叶样品。
[0238]
使用西格玛(sigma)植物rna提取试剂盒提取rna，并通过测序进行分析。表2显示了不同样品中对于btg-26d内源基因获得的表达值。btg
‑ꢀ
26d被干旱胁迫显著诱导，并且其表达水平在干旱7天后比在对照条件中高约1.9倍。正如所预测的那样，btg26-d启动子因此具有胁迫诱导的活性，如施加干旱胁迫所证明的。因此确认了启动子中abre样元件的功能性。
[0239]
表2：
[0240] 重复1重复2重复3平均sd对照43.528.347.039.69.9d795.7725774.919.5
[0241]
实例10-对大豆和小麦中的pbtg-26ghd10启动子的启动子活性的评估
[0242]
如在实例3中描述的，监测用pbtg-26ghd10::gus转化的大豆和小麦植物的β-葡萄糖醛酸酶活性。
[0243]
结果表明，启动子pbtg-26ghd10在大豆中具有根优先启动子活性。它们还表明启动子在大豆中具有胁迫诱导型启动子活性。此外，启动子在大豆中具有胁迫诱导型根优先启动子活性。
[0244]
结果表明，启动子pbtg-26ghd10在小麦中具有根优先启动子活性。它们还表明启
动子在小麦中具有胁迫诱导型启动子活性。此外，启动子在小麦中具有胁迫诱导型根优先启动子活性。
[0245]
实例11-编码膜联蛋白的用于在棉花细胞中的根优先表达和用于组成型表达的重组基因的构建
[0246]
由恩特力传股份有限公司(entelechon gmbh)合成具有根据seq idno:12的核酸序列的dna分子。
[0247]
使用标准的重组dna技术，将根据seq id no:18的从核苷酸位置89 至506的序列的组成型启动子区域camv35s、根据seq id no:18的从核苷酸位置511至568的序列的包括矮牵牛花杂种的叶绿素a/b结合蛋白的前导序列的5'utr序列、编码根据seq id no:12的序列或根据seq id no:18的从核苷酸位置577至1530的序列的annbj1的dna片段、以及根据seq idno:18的从核苷酸位置1542至2202的序列的拟南芥组蛋白h4基因的3'非翻译序列组装进含有2mepsps选择性标记盒(seq id no:18的位置2252至 6080)的载体中以产生t-dna p35s::annbj1(seq id no:18)。
[0248]
使用标准的重组dna技术，将根据seq id no:19的从核苷酸位置89 至1107的序列的根优先启动子区域pbtg-26ghd10、编码根据序列seq idno:12或根据seq id no:19的从核苷酸位置1111至2064的序列的annbj1 的dna片段、以及根据seq id no:19的从核苷酸位置2076至2736的序列的拟南芥组蛋白h4基因的3'非翻译序列组装进含有2mepsps选择性标记盒 (seq id no:19的位置2786至6614)的载体中以产生t-dna pbtg
‑ꢀ
26ghd10::annbj1(seq id no:19)。
[0249]
实例12-表达annbj1的转基因棉花植物的产生
[0250]
将来自实例11的t-dna载体引入含有辅助ti质粒的根癌农杆菌菌株中，并且用于棉花转化中，基本上如在wo 00/71733中描述的。如在以下实例中描述的，进一步分析纯合子植物及其无效隔离子。
[0251]
实例13-在田间试验中表达annbj1的转基因棉花植物的种子和棉绒产量评估
[0252]
使用具有3个区块的裂区设计，在美国进行了12个来自用t-dna pbtg
‑ꢀ
26ghd10::annbj1转化的事件和15个来自用t-dna p35s::annbj1转化的事件的田间试验。将事件分配到区块内的整块地块，并且将合子(纯合子和无效)分配到整块地块内的子区块。
[0253]
从现蕾期开始施加不足的灌溉处理。应用用于该地区的常规种植的棉花的典型农艺输入，接着是当地最佳农艺措施。
[0254]
计分的参数是棉绒产量和籽棉产量。使用线性混合模型和asreml软件分析获得的数据(gilmour等人，1999)。模型的固定部分由事件的主要效应、合子的主要效应及其相互作用组成。模型的随机项是调节田间异质性处区块、整块地块和子区块因素。
[0255]
在对照条件下，对于所测试的事件没有观察到种子产量和棉绒产量。然而，在干旱胁迫下，annbj1的表达导致增加的种子和/或棉绒产量。表3显示了干旱条件的结果。
[0256]
在对pbtg-26ghd10::annbj1测试的12个事件中，9个事件与它们的无效隔离相比具有至少5％的增加的种子产量，意味着产生的事件中的四分之三表现出转基因的积极作用。相比之下，在15个p35s::annbj1事件中，仅有8个事件与它们的无效隔离相比具有至少5％的产量增加，意味着产生的事件中的一半表现出转基因的积极作用。因此，在pbtg-26ghd10启动子而不是组成型启动子的控制下表达annbj1基因导致获得50％以上的事件与
其无效相比具有至少5％的种子产量增加。
[0257]
关于棉绒产量，在用t-dna pbtg-26ghd10::annbj1转化产生的12个事件中的8个事件与其无效相比具有至少5％的增加的产量，即四分之三的事件表现出转基因的积极作用。相比之下，从用t-dna 35s::annbj1的转化测试的15个事件中仅有7个事件与其无效相比具有至少5％的增加的产量，即一半事件表现出转基因的积极作用。因此，在pbtg-26ghd10启动子而不是组成型启动子的控制下表达annbj1基因导致获得50％以上的事件与其无效相比具有至少5％的种子产量增加。
[0258]
总之，与各自的无效隔离子相比，annbj1在棉花中的组成型表达导致种子产量和棉绒产量两者增加至少5％。与各自的无效隔离子相比，annbj1在棉花中的胁迫诱导型根优先表达导致种子产量和棉绒产量两者增加至少5％。此外，与在田间在干旱胁迫条件下使用组成型启动子35s相比，当在棉花中使用根优先启动子pbtg-26ghd10时，annbj1过表达的效果更具渗透性，更多事件表现出提高的产量。
[0259]
表3：纯合子超过其各自的无效隔离子-干旱胁迫条件的％产量增加。
[0260][0261]
[0262]
实例14-在田间试验中来自实例13的选择的转基因棉花植物的种子和棉绒产量评估
[0263]
再次对来自用t-dna pbtg-26ghd10::annbj1的转化的6个事件和来自用t-dna p35s::annbj1的转化的4个事件进行了田间试验。基于其在先前的田间试验的表现来选择事件。如在实例13中描述的，设计、进行田间试验并分析结果。
[0264]
在对照条件下，对于所测试的事件没有观察到显著的产量损失。然而，在干旱胁迫下，与野生型coker植物相比，annbj1的表达导致增加的棉绒产量。表4显示了干旱条件的结果。
[0265]
表4：纯合子超过野生型coker-干旱胁迫条件的％棉绒产量增加。第一年田间试验的结果作为参考加入。
[0266][0267]
实例15-pbtg-26ghd10启动子在棉花中的胁迫诱导型根优先启动子活性
[0268]
为了进一步确认由pbtg-26ghd10启动子赋予的表达模式，将来自含有pbtg-26ghd10::annbj1转基因的8个事件的棉花种子和野生型棉花种子进行表面灭菌、播种并在对照培养基或含有250mm甘露醇的培养基(即胁迫培养基)中进行体外生长。在本领域熟知用甘露醇模拟干旱胁迫。在对照培养基和胁迫培养基上生长的植物播种后16天和27天分别收集根和叶组织。
[0269]
使用来自西格玛(sigma)的spectrum植物总rna试剂盒用方案a从采样的根和叶组织中提取rna。基因pp2a被用作参考基因。对于annbj1转录物用引物seq id no:20和seq id no:21，并且对于pp2a转录物用引物 seq id no:22和seq id no:23，使用应用生物系统公司(appliedbiosystems)的手册中描述的方法进行并分析q-rt pcr。表5显示所获得的结果。
[0270]
表5:
[0271][0272]
尽管在叶中的表达水平没有通过施加的胁迫处理增加，但是在根中的表达在胁迫条件下与在对照条件下相比增加了至少4倍。因此，pbtg-26ghd10 启动子在高胁迫下具有胁迫诱导型根优先启动子活性。
[0273]
在相同的事件中用较低浓度的甘露醇(200mm而不是250mm)进行类似的实验。携带两个拷贝的pbtg-26ghd10::annbj1转基因的事件也证实了 pbtg-26ghd10启动子在较温和的胁迫条件下的胁迫诱导型根优先启动子活性。
[0274]
实例16-构建编码线虫抗性基因的重组基因用于在大豆细胞中的胁迫诱导型根优先表达
[0275]
使用标准的重组dna技术，将如上文所述的胁迫诱导型根优先启动子区域pbtg-26ghd10、编码根据序列seq id no:24的axmi196的dna片段组装进含有选择性标记盒的载体中以产生t-dna pbtg-26ghd10::axmi196。
[0276]
将如上文所述的胁迫诱导型根优先启动子区域pbtg-26ghd10、编码根据序列seq id no:26的axmi031的dna片段组装进含有选择性标记盒的载体中以产生t-dna pbtg-26ghd10::axmi031。
[0277]
将如上文所述的胁迫诱导型根优先启动子区域pbtg-26ghd10、编码根据序列seq id no:28的axmi277的dna片段组装进含有选择性标记盒的载体中以产生t-dna pbtg-26ghd10::axmi277。
[0278]
将如上文所述的胁迫诱导型根优先启动子区域pbtg-26ghd10、编码根据序列seq id no:30的axn-2的dna片段组装进含有选择性标记盒的载体中以产生t-dna pbtg-26ghd10::axn-2。
[0279]
实例17-表达线虫抗性基因的转基因大豆植物的产生
[0280]
将来自实例16的t-dna载体引入含有辅助ti质粒的根癌农杆菌菌株中，并且用于大豆转化中，基本上如在wo 2014/150449中描述的。如在以下实例中描述的，进一步分析纯合子植物及其无效隔离子。
[0281]
实例18-对在pbtg-26ghd10启动子的控制下表达axmi196、axmi031、 axmi277或axn-2的转基因大豆植物的线虫抗性的评估
[0282]
根据在wo 2011/014749、wo 2007/147029、wo 2014/003769、wo2010/077858中描述的方法评估转基因植物的线虫抗性。
[0283]
总之，启动子pbtg-26ghd10可以用于大豆中以赋予生物胁迫耐受性，如线虫抗性。
[0284]
在以下段落中总结出优选的实施例：
[0285]
1.一种分离的核酸，该分离的核酸具有根优先启动子活性、胁迫诱导型启动子活性或胁迫诱导型根优先启动子活性，该分离的核酸选自下组，该组由以下各项组成：
[0286]
a.包含seq id no:7的核苷酸序列或其包含seq id no:7的从核苷酸位置351至核苷酸位置755的核苷酸序列的功能片段的核酸；
[0287]
b.包含与seq id no:7或其功能片段具有至少约95％序列一致性的核苷酸序列的核酸；以及
[0288]
c.在严格条件下能够与seq id no:7的核苷酸序列或其功能片段杂交的功能性启动子的核酸
[0289]
其中所述功能片段包含seq id no:7的转录起始上游的至少约400个连续核苷酸。
[0290]
2.一种重组基因，该重组基因包含可操作地连接至编码感兴趣的表达产物的异源核酸序列的根据段落1所述的核酸，并且任选地包含转录终止子和聚腺苷酸化序列、优选地包含在植物中有功能的转录终止子和聚腺苷酸化区域。
[0291]
3.根据段落2所述的重组基因，其中该感兴趣的表达产物是能够调节基因的表达的rna分子或是蛋白质。
[0292]
4.一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据段落1所述的分离的核酸、或根据段落2或3所述的重组基因。
[0293]
5.如段落4所述的宿主细胞，其是大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、或植物细胞。
[0294]
6.一种植物，该植物包含如段落2或3所述的重组基因，该重组基因优选稳定地整合至所述植物的基因组中。
[0295]
7.可获得自根据段落6所述的植物的植物部分和种子，所述植物部分和种子包含根据段落2或段落3所述的重组基因。
[0296]
8.根据段落5至7中任一段所述的植物或植物细胞或植物部分或种子，该植物或植物细胞或植物部分或种子是棉花植物、或棉花植物细胞或棉花植物部分或棉花种子。
[0297]
9.根据段落5至7中任一段所述的植物或植物细胞或植物部分或种子，该植物或植物细胞或植物部分或种子是大豆植物、或大豆植物细胞或大豆植物部分或大豆种子。
[0298]
10.根据段落5至7中任一段所述的植物或植物细胞或植物部分或种子，该植物或植物细胞或植物部分或种子是小麦植物、或小麦植物细胞或小麦植物部分或小麦种子。
[0299]
11.生产转基因植物的方法，该方法包括以下步骤：
[0300]
a.将根据段落2或3所述的重组基因引入或提供至植物细胞以产生转基因细胞；并且
[0301]
b.从所述转基因细胞中再生转基因植物。
[0302]
12.实现核酸的根优先表达的方法，该方法包括将根据段落2或3所述的重组基因
引入植物的基因组中，或提供根据段落6所述的植物。
[0303]
13.实现核酸的胁迫诱导型表达的方法，该方法包括将根据段落2或3所述的重组基因引入植物的基因组中，或提供根据段落6所述的植物。
[0304]
14.实现核酸优先地在根中的胁迫诱导型表达的方法，该方法包括将根据段落2或3所述的重组基因引入植物的基因组中，或提供根据段落6所述的植物。
[0305]
15.用于改变生物或非生物胁迫耐受性、根构型、营养物利用效率、或植物产量的方法，所述方法包括将根据段落2或3所述的重组基因引入植物的基因组中，或提供根据段落6所述的植物。
[0306]
16.根据段落1所述的分离的核酸调节在植物中可操作地连接的核酸的表达的用途。
[0307]
17.根据段落1所述的分离的核酸、或根据段落2或3所述的重组基因改变植物中生物或非生物胁迫耐受性、根构型、营养物利用效率、或产量的用途。
[0308]
18.根据段落1所述的分离的核酸鉴定包含根优先启动子活性的其他核酸的用途。
[0309]
19.根据段落1所述的分离的核酸鉴定包含胁迫诱导型启动子活性的其他核酸的用途。
[0310]
20.根据段落1所述的分离的核酸鉴定包含胁迫诱导型根优先启动子活性的其他核酸的用途。
[0311]
21.根据段落11至15中任一段所述的方法，或根据段落17至19所述的用途，其中所述植物是棉花植物。
[0312]
22.根据段落11至15中任一段所述的方法，或根据段落17至19所述的用途，其中所述植物是大豆植物。
[0313]
23.根据段落11至15中任一段所述的方法，或根据段落17至19所述的用途，其中所述植物是小麦植物。
[0314]
24.一种生产食品、饲料、或工业产品的方法，该方法包括
[0315]
a)获得如段落6至10中任一段所述的植物或其部分；并且
[0316]
b)从该植物或其部分制备该食品、饲料、或工业产品。
[0317]
25.如段落24所述的方法，其中
[0318]
a)该食品或饲料是油、粕、谷粒、淀粉、粉或蛋白质；或
[0319]
b)该工业产品是生物燃料、纤维、工业化学品、药物或营养制品。
[0320]
26.一种重组基因，该重组基因包含：
[0321]
(a)选自以下的植物可表达启动子
[0322]
i.根优先启动子；
[0323]
ii.胁迫诱导型启动子；或
[0324]
iii.胁迫诱导型根优先启动子；
[0325]
(b)编码膜联蛋白蛋白质的核酸序列；
[0326]
(c)以及任选地，转录终止子和聚腺苷酸化序列、优选地在植物中有功能的转录终止子和聚腺苷酸化区域。
[0327]
27.如段落26所述的重组基因，其中所述植物可表达启动子是pbtg
‑ꢀ
26ghd10启动子。
[0328]
28.如段落26或27所述的重组基因，其中所述编码膜联蛋白蛋白质的核酸包含：
[0329]
a.seq id no:12或seq id no:14的核苷酸序列；
[0330]
b.与seq id no:12或seq id no:14具有至少80％一致性的核苷酸序列；
[0331]
c.在严格条件下能够与seq id no:12或seq id no:14的核苷酸序列杂交的核酸的核苷酸序列；
[0332]
d.编码seq id no:13或seq id no:15的氨基酸序列的核苷酸序列；
[0333]
e.编码与seq id no:13或seq id no:15具有80％一致性的氨基酸序列的核苷酸序列；
[0334]
f.编码包含四个或更多个膜联蛋白重复结构域的蛋白质的核苷酸序列。
[0335]
29.一种增加植物在胁迫条件下的产量的方法，该方法包括：
[0336]
a.向所述植物的细胞提供重组基因，该重组基因包含：
[0337]
i.异源植物可表达启动子；
[0338]
ii.编码膜联蛋白蛋白质的核酸序列；
[0339]
iii.以及任选地，转录终止子和聚腺苷酸化序列、优选地在植物中有功能的转录终止子和聚腺苷酸化区域；
[0340]
b.再生所述植物；
[0341]
其中该产量的增加是与对照植物的产量相比。
[0342]
30.如段落29所述的方法，其中所述植物可表达启动子选自下组，该组由以下各项组成：
[0343]
a.根优先启动子；
[0344]
b.胁迫诱导型启动子；以及
[0345]
c.胁迫诱导型根优先启动子。
[0346]
31.如段落29或30所述的方法，其中所述植物可表达启动子是pbtg
‑ꢀ
26ghd10启动子。
[0347]
32.如段落29所述的方法，其中所述植物可表达启动子是组成型启动子。
[0348]
33.如段落29或32所述的方法，其中所述植物可表达启动子是camv35s 启动子。
[0349]
34.如段落29至33中任一段所述的方法，其中所述编码膜联蛋白蛋白质的核酸包含：
[0350]
a.seq id no:12或seq id no:14的核苷酸序列；
[0351]
b.与seq id no:12或seq id no:14具有至少80％一致性的核苷酸序列；
[0352]
c.在严格条件下能够与seq id no:12或seq id no 14的核苷酸序列杂交的核酸的核苷酸序列；
[0353]
d.编码seq id no:13或seq id no:15的氨基酸序列的核苷酸序列；
[0354]
e.编码与seq id no:13或seq id no:15具有80％一致性的氨基酸序列的核苷酸序列；
[0355]
f.编码包含四个或更多个膜联蛋白重复结构域的蛋白质的核苷酸序列。
[0356]
35.如段落29至34中任一段所述的方法，其中所述植物是棉花。
[0357]
36.如段落29至34中任一段所述的方法，其中所述植物是大豆。
[0358]
37.如段落29至34中任一段所述的方法，其中所述植物是小麦。
[0359]
38.如段落29至37中任一段所述的方法，其中所述胁迫条件是干旱胁迫。
[0360]
39.如段落29至37中任一段所述的方法，其中所述胁迫条件发生在植物生殖期期间。
[0361]
40.如段落29至37中任一段所述的方法，其中所述胁迫条件发生在田间生长的植物中发生。
[0362]
41.如段落29至35中任一段所述的方法，其中所述植物是棉花并且所述产量是棉绒产量。
[0363]
42.如段落29至37中任一段所述的方法，其中所述产量是种子产量。
[0364]
43.如段落29至42中任一段所述的方法，其中所述产量增加了至少5％。
[0365]
44.如段落43所述的方法，其中与段落32或33所述的方法相比，用段落 30或31所述的方法更一致地获得产量增加。
[0366]
45.一种植物细胞，该植物细胞包含段落26至28中任一段所定义的重组基因。
[0367]
46.一种植物，该植物基本上由段落45所述的植物细胞组成。
[0368]
47.获得自根据段落46所述的植物的植物部分或种子。
[0369]
48.根据段落45至47中任一段所述的植物、植物细胞、植物部分或种子，所述植物、植物细胞、植物部分或种子是棉花植物、棉花植物细胞、棉花植物部分或棉花种子。
[0370]
49.根据段落45至47中任一段所述的植物、植物细胞、植物部分或种子，所述植物、植物细胞、植物部分或种子是大豆植物、大豆植物细胞、大豆植物部分或大豆种子。
[0371]
50.根据段落45至47中任一段所述的植物、植物细胞、植物部分或种子，所述植物、植物细胞、植物部分或种子是小麦植物、小麦植物细胞、小麦植物部分或小麦种子。