专利名称：Aire基因第七号外显子多态性的制作方法
技术领域：
本发明涉及AIRE基因第七号外显子的单核苷酸多态性。本发明还涉及分析AIRE基因第七号外显子的等位基因突变的方法。
背景技术：
AIRE(autoimmune regulator)基因是一种自体免疫调节因子，具体功能虽然还不是非常清晰，但它所包含的锌指结构(zinc fmger motifs)表明它是一个转录因子。其编码的蛋白在细胞质和细胞核内都有发现。缺失该基因会导致常染色体隐性自体免疫性疾病APECED(autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermaldystrophy)。(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/LocRpt.cgi？l＝326)在本申请之前，还没有AIRE基因第七号外显子多态性的相关报道。

发明内容
本发明的目的就是提供AIRE基因第七号外显子的多态性及其检测方法。
在本发明的第一方面，提供了一种检测人AIRE基因第七号外显子的单核苷酸多态性的方法，它包括步骤(a)确定在人AIRE基因第七号外显子的SEQ ID NO1所示序列的第168位的核苷酸；(b)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性。
在一优选例中，所述的单核苷酸多态性是在第168位存在C。
在本发明的第二方面，提供了一种分离核酸，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第168位为C。
在本发明的第三方面，提供了一种等位基因特异性的核酸引物，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出含人AIRE基因第七号外显子的SEQ ID NO1所示序列中第168位单核苷酸多态性的扩增产物。
在本发明的第四方面，提供了一种等位基因特异性的寡核苷酸探针，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并检测含人AIRE基因第七号外显子的SEQ ID NO1所示序列中第168位单核苷酸多态性。
一种试剂盒包括(1)特异性扩增人AIRE基因第七号外显子的引物对，(2)检测扩增产物与正常的AIRE基因第七号外显子相比是否存在变化所需的试剂，所述的SEQ ID NO1所示序列中第168位单核苷酸多态性。
另一种诊断试剂盒包括本发明上述的引物和/或本发明上述的寡核苷酸探针。
具体实施例方式
本发明人通过广泛而深入的研究，已经发现了AIRE基因第七号外显子所编码的蛋白序列中第12位Arg(R)->Ser(S)多态(即mRNA上168位G->C多态性)，在此基础上完成了本发明。
根据对正常人AIRE基因测序结果，发现了该SNP。经分析发现，该SNP导致12位氨基酸由Arg(R)->Ser(S)。由于这是不同性质氨基酸的置换，因此，会导致AIRE基因第七号外显子所编码的蛋白的活性发生改变。
AIRE基因第七号外显子的eDNA序列列于SEQ ID NO1，其中开放阅读框为第134-214位，其所编码的氨基酸序列列于SEQ ID NO2。AIRE基因第七号外显子的基因组序列可以从GenBank中获得。
本领域的技术人员知道，有大量的分析技术可用于检测AIRE基因第七号外显子中所述位点是否存在单核苷酸多态性。这些技术包括(但并不限于)DNA测序、杂交测序；酶促错配切割、异源双链分析、点杂交、寡核苷酸阵列(DNA芯片)、Mini-sequencing、Taqman技术、分子信标等，变性高效液相色谱法(DHPLC)。
另一方面，本发明的检测方法被用于评估个体患AIRE基因第七号外显子相关疾病的易感性。
用于本发明的测试样品没有特别限制，对于检测SNP而言，可以是从血液、组织等样品中抽提出的DNA或mRNA。对于检测AIRE基因第七号外显子活性而言，可以任何含有AIRE基因第七号外显子的样品，如血液等。
用于本发明方法或检测试剂盒的引物和探针，根据AIRE基因第七号外显子的cDNA序列(SEQ ID NO1的序列)或基因组序列进行设计，并可用常规的合成技术进行合成即可。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1基因的抽提和测序用常规酚氯仿法从人的血液中提取DNA，浓度校正至20ng/ul后，用于常规PCR扩增。引物是有义引物5’-ggaacagcgt tgcctctgg-3’(SEQ ID NO3)反义引物5′-gagctgtaccctgtgggtagg-3′(SEQ ID NO4)扩增出的426bp的产物，纯化后进行DNA测序。
实施例2SNP的获得对AIRE基因进行直接测序。将测定的各样本序列进行比较，从而得出序列的差异，获得SNP。
实施例3检测试剂盒制备一检测AIRE基因相关疾病易感性的检测试剂盒，其中，含有下列可扩增出168位SNP的引物对有义引物5’-ggaacagcgt tgcctctgg-3’(SEQ ID NO3)
反义引物5′-gagctgtaccctgtgggtagg-3′(SEQ ID NO4)对扩增产物与正常对照用变性高效液相色谱仪(DHPLC)进行色谱分析，可轻易地检测出168位的G->C型SNP。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海人类基因组研究中心<120>AIRE基因第七号外显子多态性<130>030115<160>4<170>Patent In version 3.1<210>1<211>347<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(134)..(214)<223>
<400>1ggaacagcgt tgcctctggg ggaatggctc tgctgggggc tgggggctgc tgccgagaga 60cgcctggtgc cacagccatg tgcaccctcg ctgctgagac tgcccccatt gctgacgccc120ctcttccttg cag ggt gga ggt gag gct agg ctg ggc cag cag ggc agg 169Gly Gly Gly Glu Ala Arg Leu Gly Gln Gln Gly Arg1 5 10gtt ccc gcc cct ctg gcc ctc ccc agt gac ccc cag ctc cac cag 214Val Pro Ala Pro Leu Ala Leu Pro Ser Asp Pro Gln Leu His Gln15 20 25gtaatgccct agaccacagg agaggcccct gtctgccctt gctcccctcg ggtgggtcct274gctgcctctg cctttacctg ggcactcagg gatgagcacc ggggcctgag cccctaccca334cagggtacag ctc 347<210>2<211>27<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2
Gly Gly Gly Glu Ala Arg Leu Gly Gln Gln Gly Arg Val Pro Ala Pro1 5 10 15Leu Ala Leu Pro Ser Asp Pro Gln Leu His Gln20 25<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3ggaacagcgt tgcctctgg 19<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4gagctgtaccctgtgggtagg 2权利要求
1.一种检测人AIRE基因第七号外显子的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，它包括步骤(a)确定在人AIRE基因第七号外显子的SEQ ID NO1所示序列的第168位的核苷酸；(b)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单核苷酸多态性是在第168位存在C。
3.一种分离核酸，其特征在于，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第168位为C。
4.一种等位基因特异性的核酸引物，其特征在于，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出含人AIRE基因第七号外显子的SEQ ID NO1所示序列中第168位单核苷酸多态性的扩增产物。
5.一种等位基因特异性的寡核苷酸探针，其特征在于，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并检测含人AIRE基因第七号外显子的SEQ ID NO1所示序列中第168位单核苷酸多态性。
6.一种诊断试剂盒，其特征在于，它包括(1)特异性扩增人AIRE基因第七号外显子的引物对，(2)检测扩增产物与正常的AIRE基因第七号外显子相比是否存在变化所需的试剂，所述的SEQ ID NO1所示序列中第168位单核苷酸多态性。
7.一种诊断试剂盒，其特征在于，它包括权利要求4所述的引物和/或权利要求5所述的寡核苷酸探针。
全文摘要
本发明涉及AIRE基因第七号外显子的单核苷酸多态性(SNP)。本发明提供了分析AIRE基因第七号外显子的SNP或其活性的方法。本发明的SNP是SEQ ID NO1所示序列的人AIRE基因第七号外显子的第168位的G－＞C多态性。该SNP导致编码蛋白第12位发生R－＞S改变，从而改变了蛋白活性。
文档编号C07H21/00GK1519346SQ03115040
公开日2004年8月11日 申请日期2003年1月22日 优先权日2003年1月22日
发明者黄薇, 施锦绣, 奚慧峰, 金力, 黄 薇 申请人:上海人类基因组研究中心