一种环状非编码rna circstk39及其在预防和治疗动脉粥样硬化中的应用
技术领域
1.本发明涉及一种环状非编码rna-circstk39及其在预防和治疗动脉粥样硬化中的应用。本发明属于分子生物学领域，


背景技术：

2.随着社会经济的发展，心血管疾病的发病率和死亡率在全球范围内不断上升，中国心血管健康与疾病报告指出，2018年心血管病死亡占我国城乡居民总死亡原因的首位，农村为46.66％，城市为43.81％，心血管疾病已成为威胁公众健康的重要疾病之一。动脉粥样硬化(atherosclerosis，as)被认为是由多种因素相互作用导致的一种慢性炎症反应，是多种心脑血管疾病的主要病理基础。as早期常表现为缓慢隐匿型增长，而晚期阶段容易出现跳跃式快速进展，导致急性临床事件的发生。
3.血管平滑肌细胞(vsmc)是as斑块的重要组成部分，在as进展过程中起到关键的作用，内皮功能受损，炎症反应刺激，vsmc发生表型转换，迁移到损伤血管内膜，发生异常增殖并分泌大量细胞外基质，参与as早期阶段纤维帽的形成和发展，而as晚期阶段，vsmc凋亡占主要地位，是不稳定性斑块破裂，继而发生出血和形成血栓的主要原因之一。因此vsmc的异常增殖和迁移与as的发生发展密不可分。
4.环状rna(circular rna，circrna)，是一类新兴的非编码rna，在真核生物中普遍存在，表达稳定且在物种间高度保守。近年来的研究表明circrna与包括心脏病在内的多种疾病密切相关，对人类健康有很大影响，但是绝大部分的circrna的功能仍不清楚。本发明借助高通量测序筛选出在晚期as动脉组织中表达且在物种间高度保守的circstk39，通过设计干扰rna检测其对平滑肌细胞功能的影响，并进一步通过体内转染干扰rna的腺相关病毒载体，发现了circstk39与动脉粥样硬化疾病的关系，有助于我们更好的理解其发病机制，从rna水平为as提供新的诊疗靶点。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种在晚期动脉粥样硬化动脉组织中表达且在物种间高度保守的环状非编码rna及其在预防和治疗动脉粥样硬化中的应用。
6.circstk39
7.为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
8.本发明通过对小鼠as模型中的动脉组织进行全转录组高通量测序，筛选到在晚期as组有表达，且保守性高的circstk39。其中，人类中的circstk39是由核苷酸序列如seq id no.1所示的dna序列经转录后得到。小鼠中的circstk39是由核苷酸序列如seq id no.2所示的dna序列经转录后得到。通过荧光定量pcr实验发现circstk39在人as斑块组织中显著高表达。构建sirna沉默小鼠主动脉平滑肌细胞(masmc)以及人类主动脉平滑肌细胞(hasmc)的circstk39，研究circstk39在平滑肌细胞的增殖、迁移等功能中的作用，从而探
究circstk39在动脉粥样硬化中的作用机制。通过探究circstk39对血管平滑肌细胞增殖迁移的调控功能，我们发现circstk39在动脉粥样硬化整个发生发展过程中发挥着重要的作用，circstk39具有抑制动脉粥样硬化进展的作用，可成为治疗as的新靶点。
9.在上述研究的基础上，本发明首先提出了一种环状非编码rna，命名为circstk39，所述的环状非编码rna circstk39是由核苷酸序列如seq id no.1所示的dna序列经转录后得到。
10.进一步的，本发明还提出了一种腺相关病毒载体，所述的腺相关病毒载体中含有编码所述的环状非编码rna的dna序列。以及所述的腺相关病毒载体在制备预防和治疗动脉粥样硬化药物中的应用。
11.再进一步的，本发明还提出了环状非编码rnacircstk39在制备预防和治疗动脉粥样硬化药物中的应用。
12.其中，优选的，所述的环状非编码rnacircstk39是由核苷酸序列如seq id no.1所示的dna序列经转录后得到。
13.其中，优选的，所述的环状非编码rnacircstk39以及腺相关病毒载体通过促进主动脉平滑肌细胞增殖及迁移的作用来达到预防和治疗动脉粥样硬化的目的。
14.相较于现有技术，本发明的有益效果是：
15.本发明通过探究circstk39对血管平滑肌细胞增殖迁移的调控功能，发现了circstk39在动脉粥样硬化整个发生发展过程中发挥着重要的作用。本发明的提出使得可以在临床中通过对该靶点的筛查，对早期动脉粥样硬化及时进行药物干预，延缓甚至逆转疾病。在晚期的动脉粥样硬化筛查中，可了解患者病变发展情况，及时干预避免临床事件发生。因此，可作为诊疗动脉粥样硬化新的分子标记和干预靶点。
附图说明
16.图1为人和小鼠中状非编码rna-circstk39的序列比对结果；
17.图2为sirna沉默效果；
18.a：小鼠circstk39特异sirna干扰序列沉默效果；b：人类circstk39特异sirna干扰序列沉默效果；
19.图3为原代小鼠主动脉平滑肌中沉默circstk39，抑制平滑肌的增殖活性；
20.a：cck8增殖实验；b：edu实验
21.图4为原代小鼠主动脉平滑肌细胞中沉默circstk39，抑制平滑肌的迁移能力；
22.a：transwell实验；b：细胞划痕实验
23.图5为人主动脉平滑肌细胞沉默circstk39，抑制平滑肌的增殖活性；
24.a：cck8增殖实验；b：edu实验
25.图6为人主动脉平滑肌细胞中沉默circstk39，抑制平滑肌的迁移能力；
26.a、b：transwell实验；c、d：细胞划痕实验
27.图7为体内转染过表达/敲减circstk39对小鼠动脉粥样硬化的进展的影响。
具体实施方式
28.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随具体实施
例的描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
29.实施例1：构建平滑肌细胞circstk39的沉默模型
30.1.材料
31.1.1细胞与sirna
32.本发明所用的小鼠主动脉平滑肌细胞(mvsmc)来源于c57bl/6小鼠主动脉，通过组织贴壁法进行提取及培养，细胞培养应用含有10％灭活胎牛血清(美国science cell公司)、青霉素(100u/ml)、链霉素(100μg/ml)的dmem培养基中，培养条件为37℃，5％co2。人主动脉平滑肌细胞(hasmc)购买自美国atcc细胞库，细胞培养应用vascular smooth muscle cell growth kit。
33.设计小鼠circstk39沉默(sirna)序列：
34.rnai-1正义链(sence):uccgcugccuucuuggcuctt，
35.rnai-1反义链(antisense):gagccaagaaggcagcggatt，
36.rnai-2正义链(sence):ugcuccgcugccuucuuggtt，
37.rnai-2反义链(antisense):ccaagaaggcagcggagcatt。
38.小干扰rna的设计和合成由苏州吉玛基因股份有限公司完成。
39.1.2试剂
40.小干扰rna(sirna)转染所用neon transfection system和细胞转染仪购自美国invitrogen公司；dmem培养基购自hyclone公司，青霉素、链霉素购自上海碧云天生物技术有限公司。
41.2.方法
42.2.1circstk39在小鼠主动脉平滑肌细胞中的表达
43.待细胞培养密度达到80％～90％时，吸弃培养基，用pbs冲洗后，加入2ml胰蛋白酶消化约2分钟后，再加入2ml完全培养基终止消化，将4ml细胞悬液加入离心管，25℃，1000rpm离心5分钟。弃掉上清，加入1ml pbs重悬细胞并计数。25℃，1000rpm再次离心5分钟，弃掉上清，加入缓冲液r重悬细胞。将sirna加入1.5ml离心管中，再加入细胞悬液抽吸混匀。将装有3ml电解缓冲液e的neontm管插入电转仪中，吸取细胞混合液(枪头中必须无气泡)，将带有样品的neontm移液器垂直插入neontm管中，设置脉冲电压、脉冲宽度、脉冲数及脉冲时间。电脉冲释放后，电转完成，将转染完毕的细胞接种到6孔板，加入新鲜的完全培养基。48小时后，通过real-time pcr检测circrna在细胞中的表达情况。
44.3.结果
45.提取的平滑肌细胞总rna，通过real-time pcr分析circstk39的表达情况。si-rna转染组相对于si-nc转染组，circstk39的表达量显著降低，说明circstk39的细胞沉默模型造模成功(图2)，从而为进一步研究circstk39在平滑肌细胞的功能中发挥的作用奠定了基础。
46.实施例2：circrna对小鼠主动脉平滑肌细胞增殖及迁移的调控作用
47.1.材料
48.1.1细胞
字进行划痕，镜下记录划痕区相对距离。pbs液清洗细胞3次，加入无血清培养基。37℃，5％co2，培养箱中培养。0h、24h、48h取样，拍照。
66.3.结果
67.3.1 circstk39对小鼠主动脉平滑肌细胞增殖能力的影响
68.为了验证circstk39是否影响小鼠原代平滑肌细胞增殖能力，本发明通过cck8增殖实验和edu实验检测了si-rna转染细胞后的增殖情况，发现circstk39沉默组细胞增殖受到明显抑制(图3)，提示circstk39具有促进小鼠主动脉平滑肌细胞增殖的能力。
69.3.2 circstk39对小鼠主动脉平滑肌细胞迁移能力的影响
70.为了验证circstk39是否影响小鼠主动脉平滑肌细胞迁移能力，本发明通过transwell和细胞划痕实验检测了si-rna转染细胞48小时后的细胞迁移能力的变化，发现circstk39沉默组细胞的迁移水平明显受到抑制(图4)，提示circst k39具有促进小鼠主动脉平滑肌细胞迁移的能力。
71.实施例3：circrna对人主动脉平滑肌细胞增殖及迁移的调控作用
72.1.材料
73.1.1细胞
74.实验所用的细胞及培养方法同实施例1。
75.1.2试剂
76.设计人类circstk39沉默序列：
77.si-circstk39正义链(sence):caaaaaggcaguggagcuatt，
78.si-circstk39反义链(antisense):uagcuccacugccuuuuugtt。
79.其余试剂同实施例2。
80.2.方法
81.2.1cck8增殖实验
82.同实施例2。
83.2.2edu实验
84.同实施例2。
85.2.3transwell实验
86.同实施例2。
87.2.4细胞划痕实验
88.同实施例2。
89.3.结果
90.3.1circstk39对人主动脉平滑肌细胞增殖能力的影响
91.为了验证circstk39是否影响人主动脉平滑肌细胞增殖能力，本发明通过cck8增值实验和edu实验检测了si-rna转染细胞后的增殖情况，发现circstk39沉默组细胞增殖受到明显抑制(图5)，提示circstk39具有促进人主动脉平滑肌细胞增殖的能力。
92.3.2 circstk39对人主动脉平滑肌细胞迁移能力的影响
93.为了验证circstk39是否影响人主动脉平滑肌细胞迁移能力，本发明通过tr answell和细胞划痕实验检测了si-rna转染细胞48小时后的细胞迁移能力的变化，发现circstk39沉默组细胞的迁移水平明显受到抑制(图6)，提示circst k39具有促进人主动脉
平滑肌细胞迁移的能力。
94.实施例4：circstk39对小鼠动脉粥样硬化进展的影响
95.1.材料
96.1.1动物
97.本发明的apoe-/-小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，在小鼠高脂12周时，小鼠分组：生理盐水组、空载体(aav-nc)或携带sh-circstk39的腺相关病毒2/9(aav-sh-circstk39)、过表达载体nc(aav9-oe-nc)及过表达circstk39(aav9-oe-circstk39)组。通过尾静脉注射到小鼠体内，小鼠22周龄时取材主动脉分析circstk39对动脉粥样硬化进展的影响。实验动物的使用得到了哈尔滨医科大学伦理委员会的批准。
98.aav-sh-circstk39中所含有的sh-circstk39序列为：
99.上游序列:
100.gatccgccaagaaggcagcggagcattcaagagatgctccgctgccttcttggtttttta
101.下游序列:
102.cgcgtaaaaaaccaagaaggcagcggagcatctcttgaatgctccgctgccttcttggcg
103.aav9-oe-circstk39中所含有的circstk39基因序列为seq id no.1所示。
104.1.2试剂
105.高脂饲料(猪油10％、奶粉4％、胆固醇2％、胆酸钠0.5％)购自于南京森堡生物制品公司，改良油红o染色液购自北京索莱宝有限公司。腺相关病毒由汉恒生物有限公司合成。
106.2.方法
107.2.1小鼠分组注射腺相关病毒
108.8周龄雄性apoe-/-小鼠被随机分为五组并给予高脂饮食，分别为：腺病毒空载体(aav-nc)组、circstk39沉默组(aav-sh-circstk39)、过表达载体nc(aav9-oe-nc)组及过表达circstk39(aav9-oe-circstk39)组、生理盐水组(saline组)，通过尾静脉注射到小鼠体内。从小鼠高脂12周开始尾静脉注射，每次注射100ul体量，为维持病毒浓度，4周后再次追加注射一次。小鼠高脂22周时给予麻醉，在体式显微镜下，分别取材小鼠心脏及小鼠主动脉。
109.2.2小鼠主动脉油红o染色
110.从甲醛溶液中取出标本，流水冲洗，剥去外膜，尽可能剔除多余脂肪组织。将处理好的血管置于预先配置好的油红o工作液中，室温染色10-20分钟(根据血管染色情况决定，着色明显后取出)，于75％酒精中脱去浮色，待透明血管部分无浮色时取出，体视显微镜下平铺整根血管，观察拍照。
111.3.结果
112.体内敲减circstk39与对照组相比可显著促进小鼠动脉粥样硬化的进展，而过表达circstk39可显著抑制as的进展，说明circstk39具有抑制动脉粥样硬化进展的作用，可成为治疗as的新靶点(图7)。