1.本发明涉及一种玉米锈菌致病型寄主的鉴定方法，具体讲涉及一种中国玉米多堆柄锈菌致病型寄主体系构建和鉴定方法。


背景技术：

2.玉米南方锈病是由多堆柄锈菌puccinia polysora underw.引起的一种气传病害。玉米多堆柄锈菌主要危害部位是玉米的叶片和叶鞘，严重时也会侵染玉米茎和苞叶部位。发病严重时，叶片上会散生大量的孢子，杀死寄主组织，致叶片提早干枯死亡，尤其是在晚播玉米上，发病初期，侵染点附近首先会出现褪绿斑点，褪绿斑点此后会出现呈疱疹状隆起孢子堆，叶片正反面均可产生夏孢子堆，通常以叶表居多，夏孢子堆黄色，颜色比玉米普通锈菌的颜色浅，多为圆形或卵圆形，初期埋生于寄主表皮组织下，后期夏孢子堆破裂后散生许多淡黄色的夏孢子。发病后期，冬孢子堆会在叶片的背面形成，圆形或椭圆形，颜色较夏孢子较深，棕褐色或近乎黑色，埋生玉米表皮组织下。
3.如今的玉米多堆柄锈菌变异情况暂不清楚。通常情况下，新致病性的优势集群的不断出现，以及种植环境选择，使得抗病品种的抗锈性随着小种集群改变不断丧失。但我国的研究处于初级阶段，无论是生理小种和致病型的种类或者分布尚不清楚，我国大多数研究未考虑存在多个生理小种或致病性差异，无法立足生理小种或优势致病型的层面，缺少利用水平抗病性、垂直抗病性、成株期抗病性、慢锈性等提高玉米品种的整体抗锈性水平的基础，品种推广和抗病育种都无法与生理小种或优势致病型的现状结合。


技术实现要素：

4.本发明的目的是明确中国玉米南方锈菌在我国的种类和分布，为将来抗病基因的合理布局以及药剂防治辅助等多重手段实现玉米南方锈病的综合治理和防控提供技术支持，进一步对我国的致病型种类和分布以及主要优势致病型进行更好的防控，并结合玉米品种的抗性评价，更好的推广玉米品种，合理布局品种、研究生理小种、选育抗玉米南方锈病品种。
5.实现本发明目的的技术方案如下：
6.一种玉米多堆柄锈菌致病型鉴别寄主体系构建和鉴定方法，其改进之处在于，将玉米多堆柄锈菌的单孢子堆接种到健康玉米苗上，发病后再次将已发病的玉米多堆柄锈菌的单孢子堆接种到健康玉米苗上经转接二次纯化，获得足量单孢系；
7.从28个玉米品种田间病情指数中挑出抗病品种，抗病品种接种多个二次纯化的单孢系，筛选同时表现抗病和感病的玉米品种；
8.采用全国182个单孢系进行鉴定并找出频率高的致病型；
9.所述方法包括如下步骤：
10.(一)收集种子并种苗；
11.(二)菌种收集：供试玉米南方锈菌菌种采自海南三亚、广东河源、广西桂林、广西
河池、云南玉溪和湖南邵阳的玉米南方锈病样品，其中，除海南菌株经温室人工扩繁并收集夏孢子备用外其他地区菌株均为直接从田间病株样品上刮取夏孢子备用；
12.(三)田间接菌：在玉米大喇叭口期将步骤(二)所收集的菌种进行田间接菌；
13.(四)抗病品种筛选：根据田间发病后的病情指数挑选的接种不同地区菌株后，同时出现感病和抗病的并综合多地区菌源呈现抗病的玉米品种；
14.(五)单孢系扩繁：经过二次纯化，培养全国各地多个单孢系；
15.(六)抗病品种复筛选：将步骤(三)筛选出的抗病品种接种多个二次纯化后的单孢系，选出同时可以抗病和感病的玉米品种；
16.(七)致病型划分：采用二进制方法累加法对致病型分类；
17.(八)致病型鉴定：使用2020年的182个单孢系鉴定，找出我国频率最高的玉米多堆柄锈菌致病型。
18.优选的，步骤(二)供试多堆柄锈菌采自海南三亚、广东河源、广西桂林、广西河池、云南玉溪和湖南邵阳六个地区；
19.步骤(三)，用海绵摩擦待接菌的玉米叶片，去除蜡质层后，分别将所述6 个地区各收集的2mg夏孢子，用5
‰
浓度的tween-20水溶液配制成1l孢子悬浮液，于傍晚喷雾接种于小区接种中心的天贵糯937叶片；用保鲜膜覆盖接种后的叶片保湿12h后去掉保鲜膜，并于第二天晨间全田喷灌，提高田间湿度；发病后各接种区在每个玉米品种上的病情指数按下式计算：
20.病情指数(di)＝100
×
∑(各级病叶数
×
各级代表值)/(调查总叶数
×
最高级代表值)；
21.步骤(五)，将玉米多堆柄锈菌的单孢子堆接种到健康玉米苗上，将已发病的玉米多堆柄锈菌的单孢子堆再次接种到健康玉米苗上，获得足量二次纯化单孢系；
22.步骤(六)从最抗病的十个玉米品种中筛选出下述四个品种作为鉴别寄主：裕丰303、登海605、登海685和美玉11号；
23.步骤(七)所述选出的玉米品种按顺序排列，感抗反应用式二进制方法表示；
24.如品种1上的感病、品种2上的感病、品种3上的感病和品种四上的抗病，则根据1(s)
×23
+1(s)
×22
+1(s)
×
21+0(r)
×
20＝14，将毒力模式定为sssr-14；
25.步骤(八)利用挑选出来的所述四个品种对我国182个二次纯化的多堆柄锈菌单孢系进行鉴定分析。
26.优选的，所述步骤(二)或步骤(三)菌源来自不同地区。
27.优选的，所述步骤(四)的抗病玉米品种是综合多地区菌源呈现抗病的玉米品种。
28.优选的，所述步骤(四)的品种筛选包括，在相同条件下，针对不同地区同时抗病和感病的玉米品种。
29.优选的，所述步骤(八)和步骤(五)中，玉米多堆柄锈菌来自大范围取样，且均经二次纯化扩繁。
30.与最接近的现有技术比，本发明提供的技术方案具有以下优异效果：
31.本发明提供的技术方案克服了现有技术未考虑存在多个生理小种或致病性差异，无法立足生理小种或优势致病型的层面，缺少利用水平抗病性、垂直抗病性、成株期抗病性、慢锈性等的缺陷，提高了玉米品种的整体抗锈性水平，为品种推广和抗病育种以及与生
理小种或优势致病型的现状结合提供了技术支撑。
附图说明
32.图1玉米南方锈菌对玉米不同品种寄生适合度试验小区设计；
33.图2反应类型图；
34.图3我国主要致病型种类以及比例图；
35.其中：r1坏死斑；r2夏孢子堆极小，局部组织有褪绿坏死斑；r0完全免疫；s:夏孢子堆大。
具体实施例
36.下面通过实施例对本发明提供的技术方案作详细说明：
37.本发明提供的一种玉米多堆柄锈菌致病型寄主体系的鉴定方法，包括：将玉米多堆柄锈菌的单孢子堆接种到健康玉米苗上，发病后再次将已发病的玉米多堆柄锈菌的单孢子堆接种到健康玉米苗上经转接二次纯化，获得足量单孢系；
38.从28个玉米品种田间病情指数中挑出抗病品种，抗病品种接种多个二次纯化的单孢系，筛选同时表现抗病和感病的玉米品种；
39.采用全国182个单孢系进行鉴定并找出频率高的致病型。
40.所述方法包括如下步骤：
41.(一)收集种子并种苗；
42.(二)菌种收集：供试玉米南方锈菌菌种采自海南三亚、广东河源、广西桂林、广西河池、云南玉溪和湖南邵阳的玉米南方锈病样品，除海南菌株经温室人工扩繁并收集夏孢子备用外，其他地区菌株均为直接从田间病株样品上刮取夏孢子备用：
43.表1菌种和采样信息
[0044][0045]
(三)田间接菌：在玉米大喇叭口期对步骤(二)所收集的菌种进行田间接菌；
[0046]
用海绵摩擦待接菌的玉米叶片，去除蜡质层后，分别将表1所列的6个地区收集的2mg夏孢子，用5
‰
浓度的tween-20水溶液配制成1l孢子悬浮液，于傍晚喷雾接种于小区接种中心的天贵糯937叶片；用保鲜膜覆盖接种后的叶片保湿12h后去掉保鲜膜，并于第二天晨间全田喷灌，提高田间湿度。
[0047]
9月初，发病中心植株开始发病，15d后小区玉米品种轻度发病。调查发病初期每株玉米每个叶片的病情，以减少小区间交叉感染的影响。按袁红霞等评价玉米品种田间抗性的标准划分病情等级：0级，未发病；1级，叶片上有单孢子堆或少量孢子堆，面积少于6％；3级，发病轻，叶片孢子堆面积6％～25％；5 级，中度发病，叶片孢子堆面积26％～50％；7级，
中度发病，叶片孢子堆面积51％～75％； 9级，发病叶片孢子堆面积76％～100％甚至叶片枯死。
[0048]
于2019年7月-9月在河南省开封市中国农业大学开封实验站进行试验。 2019年7月初播种玉米，播种前施足量有机肥，苗期注意除草防虫。每个试验小区为半径1.8m和2.0m的同心圆形，将28个玉米品种每种两株分别种植成圆形(图1)，并做好品种标记。在每个小区的中心种植5株感病品种郑单958，作为接种中心。设置空白对照，每个处理重复3次，共21个试验小区，每个小区之间种植2m保护行(品种：登海605，行距0.3m)。
[0049]
试验区植株普遍发病后，按下述病情指数公式系统性逐叶调查病情等级：
[0050]
病情指数(di)＝100
×
∑(各级病叶数
×
各级代表值)/(调查总叶数
×
最高级代表值)；
[0051]
得到病情指数(di)后，再计算同一品种在6个接种区的病情指数平均值，以及同一接种区内28个品种的病情指数平均值。
[0052]
相对病指按：相对病指＝供试品种的病指/感病对照品种的病指计算，相对抗病性(irr)＝1-相对病指；
[0053]
抗病类型分为高抗hr(0.80≤irr≤1.00)、中抗mr(0.60≤irr《0.80)、中感ms(0.40≤irr《0.60)和高感hs(irr《0.40)四类。
[0054]
根据6个采集地区病菌菌株在28个不同玉米品种上的病情指数(表2)计算对应的相对寄生适合度。首先比较6个地区菌株在同一玉米品种上的平均病情指数，分析多个地区菌株的致病性分化。
[0055]
表2不同地区来源玉米南方锈菌在不同玉米品种上的病情指数
[0056]
[0057][0058]
其中：
[0059]
1)avg1：同一地区菌株在28个玉米品种上的平均病情指数；avg2：6个地区菌株在同一品种上的平均病情指数和抗性评价；一表示该品种作为感病对照。
[0060]
上表所列事实表明：同一玉米品种上存在同时抗病和感病的现象推测，玉米南方锈菌在我国出现了致病性分化。
[0061]
(四)抗病品种筛选：根据田间发病后的病情指数挑选的接种不同地区菌株后，同时出现感病和抗病的并综合多地区菌源呈现抗病的玉米品种。
[0062]
其中：抗病玉米品种是综合多地区菌源呈现抗病的玉米品种。
[0063]
品种筛选包括，在相同条件下，针对不同地区同时抗病和感病的玉米品种。
[0064]
(五)单孢系扩繁：经过二次纯化，培养全国各地多个单孢系；
[0065]
将玉米多堆柄锈菌的单孢子堆接种到健康玉米苗上，将已发病的玉米多堆柄锈菌的单孢子堆再次接种到健康玉米苗上，获得足量二次纯化单孢系；
[0066]
分别在海南省三亚市、广东省河源市、广西省河池市和湖南省邵东市进行了采样。在采集的新鲜玉米叶上刮取夏孢子，作为供试菌株，由于海南三亚的菌量不足，对该地区的玉米南方锈菌在温室进行了继代扩繁。
[0067]
(六)抗病品种复筛选：将步骤(三)筛选出的抗病品种接种多个二次纯化后的单孢系，选出同时可以抗病和感病的玉米品种；
[0068]
从最抗病的十个玉米品种中筛选出下述四个品种作为鉴别寄主：裕丰303、登海605、登海685和美玉11号。
[0069]
八月初，在玉米大喇叭口期进行田间接菌。待接菌的玉米叶片使用海绵摩擦，去除蜡质层后，分别将4个地区各收集到的2mg夏孢子，用5
‰
浓度的 tween-20水溶液配制成1l孢子悬浮液，于傍晚喷雾接种于小区接种中心的天贵糯937叶片。接种后立即用保鲜膜覆盖叶片保湿，12h后去掉保鲜膜，并于第二天晨间全田喷灌，提高田间湿度。
[0070]
八月中旬，接菌15d后，发病中心植株开始发病，小区供试玉米品种初次侵染发病。为减少小区间二次侵染增加交叉感染，在发病初期时即对每株玉米每个叶片进行病情调查。按袁红霞等评价玉米品种田间抗性的标准将病情等级划分为以下六级：0级，未发病；1级，叶片上有单孢子堆或少量孢子堆，面积少于6％；3级，发病轻，叶片孢子堆面积6％～25％；5级，中度发病，叶片孢子堆面积26％～50％；7级，中度发病，叶片孢子堆面积51％～75％；9级，发病叶片孢子堆面积76％～100％甚至叶片枯死。
[0071]
病情指数(di)＝100
×
∑(各级病叶数
×
各级代表值)/(调查总叶数
×
最高级代表值)，求得各接种区在每个玉米品种上的病情指数。根据公式：相对病指＝供试品种的病指/感病对照品种的病指，相对抗病性指数(irr)＝1-相对病指，对品种进行抗性评价，海南地区以禾新9号最感病，为感病对照；黄粘糯为广东、广西和湖南地区最感病的品种，作为广东、广西和湖南地区感病对照。抗病类型分为以下四类：高抗hr(0.80≤irr≤1.00)、中抗mr(0.60≤irr《0.80)、中感ms(0.40≤irr《0.60)和高感hs(irr《0.40)。最后以多个地区中抗病性最低水平作为最后玉米品种的抗性水平评价。
[0072]
(七)致病型划分：采用二进制方法累加法对致病型分类；
[0073]
步骤(七)所述选出的玉米品种按顺序排列，感抗反应用式二进制方法表示；
[0074]
如品种1上的感病、品种2上的感病、品种3上的感病和品种四上的抗病，则根据1(s)
×23
+1(s)
×22
+1(s)
×
21+0(r)
×
20＝14，将毒力模式定为sssr-14；
[0075]
(八)致病型鉴定：使用2020年的182个单孢系鉴定，找出我国频率最高的玉米多堆柄锈菌致病型。
[0076]
步骤(八)利用挑选出来的所述四个品种对我国182个二次纯化的多堆柄锈菌单孢系进行鉴定分析。
[0077]
优选的，所述步骤(八)和步骤(五)中，玉米多堆柄锈菌来自大范围取样，且均经二次纯化扩繁。
[0078]
在本发明的一个实施例中，提出了对多堆柄锈菌致病型分化的方法。
[0079]
供试玉米品种：
[0080]
郑单958；裕丰303；登海605；登海685；美玉11号；登海3737；
[0081]
供试菌株：
[0082]
2019年实验菌株分别来自广东省河源、湖南省邵东、海南省乐东、河南省开封、云南省玉溪yn6：广西省河池、广东省惠州、广东省江门8个地区。
[0083]
2020年实验菌株来自我国玉米南方锈菌发病地区，南至海南，北达辽宁，共182个纯化单孢系(表3)。
[0084]
表3采样分布表
[0085][0086]
对多堆柄锈菌和柄锈菌纯化扩繁与鉴定
[0087]
在中国农业大学温室内种植感病品种玉米郑单958，每个小花盆种6-8粒种子，催芽种植15d左右，玉米长至两页一心进行玉米南方锈菌的纯化扩繁与鉴定，接菌前用手捋苗摩擦，破坏玉米叶片蜡质层，喷洒0.5％tween-20溶液，在接种玉米锈菌夏孢子粉末。接种后，花束袋保湿24h，然后取出放在温室内培养。
[0088]
用扩繁所得的玉米南方锈菌的夏孢子粉末和0.5％吐温-20溶液悬浮液喷接于脱蜡3叶一心的鉴别玉米品种裕丰(303、登海605、登海685和、美玉11号) 幼苗。根据(robert，1962)的反应型进行优化，接种后15天后，对抗病类型划分如图2所示。
[0089]
致病型鉴别品种筛选：
[0090]
根据2019年28个品种的田间抗病性评价，选取对不同地区来源菌株的抗病性水平呈现差异较大的品种与室内使用纯化菌株进行鉴定，选取同时可为高抗高感的玉米品种裕丰303、登海605、登海685、美玉11号、登海3737。
[0091]
致病型种类划分方法：
[0092]
根据二进制计数法，划分致病型按照habgood(1970)提出二进制方法，品种按固定顺序排列，感抗反应用公式2n表示，如在品种1上感病，品种2上感病，品种3上感病，品种四上抗病，则根据1(s)
×23
+1(s)
ꢀ×22
+1(s)
×
21+0(r)
×
20＝14，定为毒力模式sssr-14。
[0093]
表4二进制毒力类型计算方法计算：
[0094][0095]
致病型鉴别寄主体系
[0096]
源自我国广东省河源、湖南省邵东、海南省乐东、河南省开封、云南省玉溪：广西省河池、广东省惠州、广东省江门8个不同地区单孢系鉴定结果列于表4，其中：
[0097]
登海3737对p-gd抗病，而p-hun p-hai n p-he n p-yn p-gxp2-gd和p3-gd 对dh37缺具有很强的毒性。在8个分离株中，登海3737只对p-hun和p-hun 感病。登海605仅对p-yn感病。裕丰303对p-gdp-ynp-gxp2-gd和p3-gd均显示高抗，但对p-hun p-hain p-hen感病。结果清楚表明，我国玉米南方锈菌出现致病型分化，裕丰303、登海605、登海685、登海3737可作为鉴别寄主。
[0098]
表5 2019年致病性鉴定情况表
[0099][0100]
我国致病型种类
[0101]
2020年，通过全国多地区182个单孢系抗病性鉴定，通过分析发现，菌株可划分为
13个集群，其中3个致病型rrrr-0rrrs-1和ssss-15达20％以上。
[0102]
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求保护范围之内。