1.本发明属于生物技术领域，涉及一种组织特异启动子及其应用。


背景技术：

2.基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的，但临床中往往发生非特异性表达，即外源基因在人体内广泛表达，能够引起人体免疫排斥反应，是临床上较难克服的问题之一。
3.例如a型血友病(hemophiliaa，ha)又名遗传性抗血友病球蛋白缺乏症或f
ⅷ
(f8)缺乏症，是一种是由凝血因子viii的基因(f
ⅷ
基因或f8基因)的遗传缺陷引起的凝血障碍，目前对ha的治疗主要有基于血浆源性凝血因子或外源培养的重组蛋白的蛋白置换疗法和基因治治疗等方法。有研究对人类f8基因的分析显示其表达蛋白具有明显的结构域，表示为a1-a2-b-a3-c1-c2，b结构域由非常大的外显子编码，含有由连接寡糖的天门冬酰胺(n)组成的高度保守区。miao等人指出，b结构域的部分缺失，保留n端226-氨基酸延伸，其中包含六个完整的天门冬酰胺连接的糖基化位点，能够使f8的体外分泌增加10倍(参见miao,h.z.,sirachainan,n.,palmer,l.,kucab,p.,cunningham,m.a.et al.bioengineering of coagulation factor viii for improved secretion.blood,2004,103(9),3412-3419.)。但目前利用b结构域缺失的f8基因(f8-bdd)进行基因治疗的方法存在蛋白分泌和功能较低、f8病毒载体转染效率低以及产生抗体和抑制物反应(免疫排斥)等问题。
4.综上所述，如何实现治疗基因在体内特异性表达，以避免产生免疫排斥，是基因治疗领域亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种组织特异启动子及其应用，所述组织特异启动子能够在内皮细胞或巨核细胞-血小板细胞中启动编码基因特异性表达，降低异位表达，能够应用于需要在内皮细胞或巨核细胞-血小板细胞中特异性表达基因的基因治疗中，有效降低抗体与抑制物反应。
6.为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.第一方面，本发明提供一种组织特异启动子，所述组织特异启动子的核酸序列包括80％以上的seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4所示的序列。
8.seq id no:1：
9.gcggccgctccaaaaatatccttccatcacactccccatcttgtgctctgatttactaaacggccctgggccctctctttctcagggtctctgcttgcccagctatataataaaacaagtttgggacttcccaaccattcacccatggaaaaacagaagcaactcttcaaaggacagattcccaggatctgccctgggagattccaaatcagttgatctggggtgagcccagtcctctgtagtttttagaagctcctcctatgtctctcctggtcagcagaatcttggcccctcccttccccccagcctcttggttcttctgggctctgatccagcctcagcgtcactgtcttccacgcccctctttgattctcgtttatgtcaaaagccttgtgaggatgaggctgtgattatccccattttacagatgaggaaactgtggctccag
gatgacacaactggccagaggtcacatcagaagcagagctgggtcacttgactccacccaatatccctaaatgcaaacatcccctacagaccgaggctggcaccttagagctggagtccatgcccgctctgaccaggagaagccaacctggtcctccagagccaagagcttctgtccctttcccatctcctgaagcctccctgtcacctttaaagtccattcccacaaagacatcatgggatcaccacagaaaatcaagctctggggctaggctgaccccagctagatttttggctcttttataccccagctgggtggacaagcaccttaaacccgctgagcctcagcttcccgggctataaaatgggggtgatgacacctgcctgtagcattccaaggagggttaaatgtgatgctgcagccaagggtccccacagccaggctctttgcaggtgctgggttcagagtcccagagctgaggccgggagtaggggttcaagtggggtgccccaggcagggtccagtgccagccctctgtggagacagccatccggggccgaggcagccgcccaccgcagggcctgcctatctgcagccagcccagccctcacaaaggaacaataacaggaaaccatcccagggggaagtgggccagggccagctggaaaacctgaaggggaggcagccaggcctccctcgccagcggggtgtggctcccctccaaagacggtcggctgacaggctccacagagctccactcccggggatcc。
10.seq id no:2：
11.gcggccgcctccttcccctgggcctaaggatatcttggctggaagctctgctctgaaaaggggcatggccaaactttcactagggctcttcgttggggagcacgatggacaaaagccttcttggggctaggcaggtcacttcaaacttggagccgccaaatattttgggaaatagcgggaatgctggcgaactgggcaagtgcgttttctgattaagagcaaccagattcagctttttaaactacaattatactggccaaacaaaatacccttatacaaaaaccaaaactactggcaggagtcgctgccagcttgcgacccggcatacttggctgagtatccgcttctcccttgtggctccaaactgctgcagattctcggccacttcagacgcgcgcgatggcgaagagggtcctgcactttgacgcgcctggtgagggagcggtgctcttcgcagcgctcctggtgatgctccccaaatttcggggaccggcaagcgattaaatcttggagttgctcagcgcccgttaccgagtactttttatttacaccagaaacaaagttgttgctctgggatgttctctcctgggcgacttggggcccagcgcagtccagttgtgtggggaaatggggagatgtaaatgggcttggggagctggagatccccgccgggtacccgggtgaggggcggggctggccgcacgggagagcccctcctccgccccggccccgccccgcatggccccgcctccgcgctctagagtttcggctccagctcccaccctgcactgagtcccgggaccccgggagagcggtcagtgtgtggtcgctgcgtttcctctgcctgcgccgggcatcacttgcgcgccgcagaaagtccgtctggcagcctggatatcctctcctaccggcacccgcagacgcccctgcagccgccggtcggcgcccgggctccctagccctgtgcgctcaactgtcctgcgctgcggggtgccgcgagttccacctccgcgcctccttctctagacaggcgctgggagaaagaaccggctcccgagttctgggcatttcgcccggctcgaggtgccccggggatcc。
12.seq id no:3：
13.gcggccgctgtgaacggaccaagagtaaacagtgtgctcaatgctgtgcctacgtgtgttagcccacgcggccagcctgaggagtcagggaaggctcccctaggcaaagcccccaaccagaatcaagtcttaatggttaaagagctccatcacccaaaaaggattgagggcctaccttcaactgaacagctaatgcataatctcagaaactgtgagtcaaaattccctggaataactccactttatccccaatctccttgccacctagaccaaggtccattcaccaccctgtccccagcactgactgcactgctgtggccacactaaagcttggctcaagacggaggaggagtgaggaagctgctgcaccaatatggctggttgaggccgcccaaggtcctagaaggaggaagtgggtaaatgccatatccaaaaagatacagaagcctcaggttttatcgggggcagcagcttccttctccttccccgacctgtggccaagtcacaaagcaccacagctgtacagccagatgggggaagggaggagattagaactgtaggctagagtagacaagtatggaccagttcacaatcacgctatcccaagcagaaagtgatggtggcttggactagcacggtggtagtagagatggggtaaagattcaagagacatcattgataggcagaaccaataggacatggtaataaactattctcaggaaaggggaggagtcatggctttcagccatgagcatccaccctctgggtggcctcacccacttcctggcaattctagccaccatgagtccaggggctatagccctttgc
tctgcccgttgctcagcaagttacttggggttccagtttgataagaaaagacttcctgtggaggaatctgaagggaaggaggaggagctggcccattcctgcctgggaggttgtggaagaaggacccggggatcc。
14.seq id no:4：
15.gcggccgctctgggattacaggcatgagccacgcgcccggccctggagaggtttttaaaagatggcagaaggctgtttggaggagtccacccccatctcccctgtgtaaaaggaaagcggaagagagaaccacaaagagggcctgggggaaagccgtggagtgaggcgataagggcttgtgtccaggggattcccggtcactggaatccctatcaggcctgcatttcctcctcacccccatccccttccttgccactggcttagtcctccatggggctagaagagagaaggacggagtcgagtggcaccctagaagacgctctgtgccttcggaggatcc。
16.本发明创造性设计组织特异启动子，包括能够在内皮细胞中启动基因特异性表达的启动子vec(seq id no:1或与seq id no:1具有至少80％同源性)和kdr(seq id no:2或与seq id no:2具有至少80％同源性)，能够在巨核细胞-血小板细胞中启动基因特异性表达的启动子itga(seq id no:3或与seq id no:3具有至少80％同源性)和gp(seq id no:4或与seq id no:4具有至少80％同源性)，利用本发明的组织特异启动子能够在内皮细胞或巨核细胞-血小板细胞中特异性表达编码基因，因此，本发明的组织特异启动子能够有效应用于需要将目标编码基因在内皮细胞或巨核细胞-血小板细胞中特异性表达的基因治疗中，能够降低免疫排斥风险，节约治疗成本，如a型血友病基因治疗。
17.优选地，所述组织特异启动子的核酸序列为seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4所示的序列。
18.第二方面，本发明提供一种基因表达框，所述基因表达框包括第一方面所述的组织特异启动子和编码基因。
19.优选地，所述编码基因包括重组凝血因子viii的编码基因。
20.优选地，所述重组凝血因子viii的编码基因的核酸序列包括seq id no:5所示的序列。
21.seq id no:5：
22.atgcagatcgaactgagcacctgcttcttcctgtgtctcctgagattctgctttagtgctaccagacggtattacctgggagccgtcgagctgagttgggattacatgcagtccgacctcggagaactgcctgtggatgcacgctttccaccaagagtgcctaagtcattcccattcaacacctcagtcgtgtataagaagactctgttcgtcgagtttactgatcacctgttcaatatcgctaaacctagaccaccctggatgggactgctgggtcctacaatccaggcagaggtctatgacactgtggtgattacacttaagaacatggcttcccatcctgtcagtcttcatgctgttggtgtatcctactggaaagcttctgagggagctgaatatgatgatcagaccagtcaaagggagaaagaagatgataaagtcttccctggtggaagccatacatatgtctggcaggtcctgaaagagaatggtccaatggcctctgacccactgtgccttacctactcatatctttctcatgtggacctggtaaaagacttgaattcaggcctcattggagccctactagtatgtagagaagggagtctggccaaggaaaagacacagaccttgcacaaatttatactactttttgctgtatttgatgaagggaaaagttggcactcagaaacaaagaactccttgatgcaggatagggatgctgcatctgctcgggcctggcctaaaatgcacacagtcaatggttatgtaaacaggtctctgccaggtctgattggatgccacaggaaatcagtctattggcatgtgattggaatgggcaccactcctgaagtgcactcaatattcctcgaaggtcacacatttcttgtgaggaaccatcgccaggcgtccttggaaatctcgccaataactttccttactgctcaaacactcttgatggaccttggacagtttctactgttttgtcatatctcttcccaccaacatgatggcatggaagcttatgtcaaagtagacagctgtccagaggaaccccaactacgaatgaaaaataatgaagaagcggaagactatgatgatgatcttactgattctgaaatggatgtggtca
ggtttgatgatgacaactctccttcctttatccaaattcgctcagttgccaagaagcatcctaaaacttgggtacattacattgctgctgaagaggaggactgggactatgctcccttagtcctcgcccccgatgacagaagttataaaagtcaatatttgaacaatggccctcagcggattggtaggaagtacaaaaaagtccgatttatggcatacacagatgaaacctttaagactcgtgaagctattcagcatgaatcaggaatcttgggacctttactttatggggaagttggagacacactgttgattatatttaagaatcaagcaagcagaccatataacatctaccctcacggaatcactgatgtccgtcctttgtattcaaggagattaccaaaaggtgtaaaacatttgaaggattttccaattctgccaggagaaatattcaaatataaatggacagtgactgtagaagatgggccaactaaatcagatcctcggtgcctgacccgctattactctagtttcgttaatatggagagagatctagcttcaggactcattggccctctcctcatctgctacaaagaatctgtagatcaaagaggaaaccagataatgtcagacaagaggaatgtcatcctgttttctgtatttgatgagaaccgaagctggtacctcacagagaatatacaacgctttctccccaatccagctggagtgcagcttgaggatccagagttccaagcctccaacatcatgcacagcatcaatggctatgtttttgatagtttgcagttgtcagtttgtttgcatgaggtggcatactggtacattctaagcattggagcacagactgacttcctttctgtcttcttctctggatataccttcaaacacaaaatggtctatgaagacacactcaccctattcccattctcaggagaaactgtcttcatgtcgatggaaaacccaggtctatggattctggggtgccacaactcagactttcggaacagaggcatgaccgccttactgaaggtttctagttgtgacaagaacactggtgattattacgaggacagttatgaagatatttcagcatacttgctgagtaaaaacaatgccattgaaccaagaagcttttctcagaatcctcctgtcctcaaacgccatcaacgggagattacacggaccacactccaaagcgatcaggaggagatcgactatgacgataccatatctgtggaaatgaagaaagaggacttcgacatctacgacgaagatgagaaccaaagtccaagatccttccagaagaagactaggcactacttcatcgctgccgtggaacgcctctgggattacggaatgtccagttctccacatgtcctcaggaatagggcacagtctggctctgttccacagtttaagaaagttgtctttcaggagttcacagatggctcattcactcaaccactgtatagaggcgaactgaatgagcacctgggactgctgggtccctacatcagagccgaagtggaggataacattatggtcacctttcggaaccaagcctccaggccatacagtttctacagttctctgatctcatacgaggaagatcagaggcaaggagcagaaccaaggaagaacttcgtgaaaccaaacgagacaaagacctatttctggaaagttcagcatcatatggcacccactaaagatgagtttgactgcaaagcctgggcttatttctctgatgttgacctggaaaaagatgtgcactcaggcctgattggaccccttctggtctgccacactaacacactgaaccctgctcatgggagacaagtgacagtacaggaatttgctctgtttttcaccatctttgatgagaccaaaagctggtacttcactgaaaatatggaaagaaactgcagggctccctgcaatatccagatggaagatcccacttttaaagagaattatcgcttccatgcaatcaatggctacataatggatacactacctggcttagtaatggctcaggatcaaaggattcgatggtatctgctcagcatgggcagcaatgaaaacatccattctattcatttcagtggacatgtgttcactgtacgaaaaaaagaggagtataaaatggcactgtacaatctctatccaggtgtttttgagacagtggaaatgttaccatccaaagctggaatttggcgggtggaatgccttattggcgagcatctacatgctgggatgagcacactttttctggtgtacagcaataagtgtcagactcccctgggaatggcttctggacacattagagattttcagattacagcttcaggacaatatggacagtgggccccaaagctggccagacttcattattccggatcaatcaatgcctggagcaccaaggagcccttttcttggatcaaggtggatctgttggcaccaatgattattcacggcatcaagacccagggtgcccgtcagaagttctccagcctctacatctctcagtttatcatcatgtatagtcttgatgggaagaagtggcagacttatcgaggaaattccactggaaccttaatggtcttctttggcaatgtggattcatctgggataaaacacaatatttttaaccctccaattattgctcgatacatccgtttgcacccaactcattatagcattcgcagcactcttcgcatggagttgatgggctgtgatttaaatagttgcagcatgccattgggaatggagagtaaagcaatatcagatgcacagattactgcttcatcctactttaccaatatgtttgccacctggtctccttcaaaagctcgacttcacctccaagggaggagtaatgcctggagacctcaggtgaataatccaaaagagtggctgcaagtggacttccagaagacaatgaaagtca
caggagtaactactcagggagtaaaatctctgcttaccagcatgtatgtgaaggagttcctcatctccagcagtcaagatggccatcagtggactctcttttttcagaatggcaaagtaaaggtttttcagggaaatcaagactccttcacacctgtggtgaactctctagacccaccgttactgactcgctaccttcgaattcacccccagagttgggtgcaccagattgccctgaggatggaggttctgggctgcgaggcacaggacctctactga。
23.本发明一具体实施例中，首次采用本发明的组织特异启动子启动重组凝血因子viii的编码基因的表达，将fviii基因在内皮细胞(如肝窦内皮细胞)或巨核细胞中表达，以减少fviii蛋白在体内异位表达，降低抗体与抑制物的反应，有效进行a型血友病基因治疗。
24.第三方面，本发明提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包括第一方面所述的组织特异启动子。
25.优选地，所述重组表达载体包括含有第一方面所述的组织特异启动子的病毒载体或质粒载体。
26.优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体pegwi。
27.优选地，所述重组表达载体还包括编码基因。
28.优选地，所述编码基因包括重组凝血因子viii的编码基因。
29.优选地，所述慢病毒载体pegwi的5’剪接供体位点突变。
30.优选地，所述慢病毒载体pegwi的u3区中的增强子缺失。
31.优选地，所述慢病毒载体pegwi的u3区中含有静默子。
32.本发明中，对慢病毒载体pegwi进行改造，将野生型5’剪接供体位点突变，将u3区中的增强子删除，并在u3区中加入静默子(ch4 silencer)，不仅能够有效提高pegwi的转染效率和表达效率，从而降低载体使用成本，还能提高安全性。
33.本发明一具体实施例中，将所述组织特异启动子和重组凝血因子viii的编码基因共同插入慢病毒载体pegwi，同时采用静脉直接注射的方式，将慢病毒载体导入体内，高效递送凝血因子viii基因及特异性表达，能够有效保障治疗效果，降低免疫排斥风险，节约治疗成本，实现了高效ha基因治疗。
34.第四方面，本发明提供一种重组慢病毒，所述重组慢病毒含有第三方面所述的重组表达载体。
35.第五方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞含有第一方面所述的组织特异启动子。
36.优选地，所述重组细胞的基因组中整合有第二方面所述的基因表达框。
37.优选地，所述重组细胞含有第三方面所述的重组表达载体。
38.第六方面，本发明提供一种如第五方面所述的重组细胞的制备方法，所述方法包括：
39.将第一方面所述的组织特异启动子、第二方面所述的基因表达框、第三方面所述的重组表达载体或第四方面所述的重组慢病毒导入宿主细胞中，获得所述重组细胞。
40.优选地，所述导入的方法包括电转导、病毒载体系统、非病毒载体系统或直接基因注射中的任意一种。
41.优选地，所述宿主细胞包括造血干细胞。
42.第七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的组织特异启动子、第二方面所述的基因表达框、第三方面所述的重组表达载体、第四方面所述
的重组慢病毒或第五方面所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合。
43.优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
44.第八方面，本发明提供第一方面所述的组织特异启动子、第二方面所述的基因表达框、第三方面所述的重组表达载体、第四方面所述的重组慢病毒、第五方面所述的重组细胞或第七方面所述的药物组合物在制备组织特异基因治疗药物中的应用。
45.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
46.(1)本发明的组织特异启动子能够在内皮细胞或巨核细胞-血小板细胞中启动编码基因特异性表达，能够应用于需要在内皮细胞或巨核细胞-血小板细胞中特异性表达基因的基因治疗中，保障治疗效果，降低免疫排斥风险，节约治疗成本；
47.(2)本发明中，利用所述组织特异性启动子、凝血因子viii的编码基因和慢病毒载体构建表达载体，并够成功在a型血友病小鼠体内表达，能一定程度地纠正a型血友病小鼠的出血表型，且抗体反应低，对于保障基因治疗的有效性具有重要的意义，为实现更快的a型血友病症状缓解以及更全面持久的基因治疗奠定了基础。
附图说明
48.图1为慢病毒载体pegwi的结构示意图；
49.图2为不同组织特异性启动子和f8-bdd基因在慢病毒载体中结构图；
50.图3为在内皮细胞和巨核细胞中，重组慢病毒载体拷贝数；
51.图4为分析重组慢病毒lv-wasabi转染细胞的荧光表达量结果图；
52.图5为重组慢病毒lv-f8-bdd转染细胞的蛋白质表达量结果图；
53.图6为体外血浆底物发光法检测结果图；
54.图7为a型血友病小鼠的治疗流程示意图；
55.图8为小鼠血细胞凝血因子viii阳性检测结果图；
56.图9为小鼠体内凝血因子viii活性图；
57.图10为小鼠血浆酶联免疫吸附检测结果图。
具体实施方式
58.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
59.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
60.本发明实施例中以a型血友病为例，证明本发明的组织特异启动子能够有效应用于基因治疗，并有效降低凝血因子抗体与抑制物反应。
61.实施例1
62.本实施例构建慢病毒载体，所述慢病毒载体中携带本发明特异启动子和f8基因，具体包括如下步骤：
63.(1)慢病毒载体pegwi的结构示意图如图1所示，将野生型5’剪接供体位点突变，将u3中的增强子删除，在u3中加入静默子(ch4 silencer)，具体的改造方法可参见“contributions of viral splice sites and cis-regulatory elements to lentivirus vector function,cui et al.journal ofvirology,july 1999,p.6171
–
6176”；
64.(2)不同组织特异性启动子以及f8-bdd基因的插入：
65.通过全基因合成wasabi基因序列(表达荧光蛋白)、b结构域缺失的f8基因(f8-bdd)序列(seq id no:5)以及组织特异启动子ef1α(seq id no:6)、vec(seq id no:1)、kdr(seq id no:2)、itga(seq id no:3)和gp(seq id no:4)启动子的核酸序列；分别将上述启动子与f8-bdd共同经限制性酶切位点连接入慢病毒载体pegwi中，通过测序及双酶切(最佳反应条件参照neb原厂建议)，5’端用bamhi克隆位点(ggatccacc)
–
aug，3’端用spei克隆位点(actagt)，对所获产物进行鉴定，获得正确连接的ef1α、vec、kdr、itga或gp启动f8-bdd基因的慢病毒载体pegwi-ef1α-f8-bdd，pegwi-vec-f8-bdd，pegwi-kdr-f8-bdd，pegwi-itga-f8-bdd或pegwi-gp-f8-bdd，具体的连接位置以及慢病毒载体构成如图2所示，以各启动子和wasabi基因共插入pegwi中得到的慢病毒载体(pegwi-ef1α-wasabi，pegwi-vec-wasabi，pegwi-kdr-wasabi，pegwi-itga-wasabi或pegwi-gp-wasabi)作为对照，用于后续试验。
66.seq id no:6：
67.ataatggccataatcacgaattggccgcagatctcgaccaattctcatgtttgacagcttatcatcgataagctttggagctaagccagcaatggtagagggaagattctgcacgtcccttccaggcggcctccccgtcaccaccccccccaacccgccccgaccggagctgagagtaattcatacaaaaggactcgcccctgccttggggaatcccagggaccgtcgttaaactcccactaacgtagaacccagagatcgctgcgttcccgccccctcacccgcccgctctcgtcatcactgaggtggagaagagcatgcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaagtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaaaactctagagcggccgcggaggccgaattccgtcga。
68.实施例2
69.本实施例将实施例1构建得到的慢病毒载体进一步包装、纯化和浓缩，得到重组慢病毒，实验方法参考([1]chang l j,urlacher v,iwakuma t,et al.efficacy and safety analyses of a recombinant human immunodeficiency virus type 1derived vector system[j].gene therapy,1999,6(5):715-728.[2]chang l j,zaiss a k.chang,lj and zaiss,ak.lentiviral vectors.preparation and use.methods mol med 69:303-318[j].methods in molecular medicine,2002,69:303-318.)
[0070]
具体步骤可以参考上列文献，并简单描述如下：
[0071]
(1)将实施例1中构建的慢病毒载体与包装辅助质粒pnhp和phef-vsv-g共转染哺乳细胞hek293t中培养48h，收取上清液病毒载体；
[0072]
(2)将培养收取得到的慢病毒进行纯化和浓缩，得到所述重组慢病毒，分别命名为lv-ef1α-f8-bdd，lv-vec-f8-bdd，lv-kdr-f8-bdd，lv-itga-f8-bdd，lv-gp-f8-bdd，lv-ef1α-wasabi，lv-vec-wasabi，lv-kdr-wasabi，lv-itga-wasabi和lv-gp-wasabi；
[0073]
(3)检测慢病毒载体拷贝数(vcn)，检测结果如图3所示，运用相同的感染复数，lv-ef1α-f8-bdd，lv-vec-f8-bdd，lv-kdr-f8-bdd，lv-itga-f8-bdd和lv-gp-f8-bdd慢病毒的拷贝数基本相同。
[0074]
实施例3
[0075]
本实施例利用实施例2制备的含有不同启动子和wasabi基因重组慢病毒进行体外测试，通过检测wasabi基因表达的荧光蛋白量，检测启动子在不同细胞中的特异性。
[0076]
将实施例2制备的携带正常wasabi基因的5种慢病毒(lv-ef1α-wasabi，lv-vec-wasabi，lv-kdr-wasabi，lv-itga-wasabi和lv-gp-wasabi)分别转染内皮细胞(ec)，巨核细胞(megakaryocyte)两个细胞系，慢病毒转染方法为：
[0077]
在六孔板(美国康宁)中加入含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素溶液的dmem培养基，分别在每孔中接种3
×
104个内皮细胞，或1
×
105个巨核细胞，于37℃、5％co2条件下培养18h，以moi＝200进行慢病毒转染，并补充聚凝胺(polybrene，8μg/ml，sigma-aldrich)至培养基终体积为600μl，转染24h，随后每天置换新鲜培养基，待细胞汇合度(confluence)达到90％，将细胞转至t75 cm2培养瓶(美国康宁)。
[0078]
进行荧光蛋白表达量检测，以明确wasabi基因在细胞中的表达情况，结果如图4所示，转染lv-ef1α-wasabi的内皮细胞、巨核细胞的荧光强度均较高，表明ef1α启动子在2种细胞中均能高效启动wasabi基因表达，说明其不具备组织特异性，转染lv-vec-wasabi和lv-kdr-wasabi的内皮细胞的荧光强度高于转染lv-itga-wasabi和lv-gp-wasabi的内皮细胞，转染lv-vec-wasabi和lv-kdr-wasabi的巨核细胞的荧光强度低于转染lv-itga-wasabi和lv-gp-wasabi的巨核细胞，综合上述，证实了vec和kdr启动子具有内皮细胞特异性，itga和gp启动子具有巨核细胞特异性。
[0079]
实施例4
[0080]
本实施例对实施例2制备的携带f8-bdd基因的重组慢病毒进行体外测试。
[0081]
将实施例2制备的携带f8-bdd基因的5种慢病毒(lv-ef1α-f8-bdd，lv-vec-f8-bdd，lv-kdr-f8-bdd，lv-itga-f8-bdd和lv-gp-f8-bdd)分别转染内皮细胞(ea-hy926)和巨核细胞(dami)两个细胞系，慢病毒转染方法同实施例3。
[0082]
收集转染后ea-hy926和dami分泌的上清液，进行浓缩，同时收集胞内萃取物，采用
elisa法检测蛋白质表达量，未经慢病毒转染的细胞作为阴性对照(nc)，结果如图5所示，通用型ef1α启动子在两种细胞中均能高效启动f8表达，在巨核细胞中，itga启动子能高效启动f8表达，在内皮细胞中，vec启动子具有比其他组织特异性启动子更高的启动f8表达能力，但与ef1α启动子相比，仅表达极低水平的f8(低10倍)。
[0083]
评估凝血功能的方法为底物发光测定法，该方法是一种使用人源f8 chromogenic assay试剂盒(法国hyphen biomed公司)进行活性测定的方法。底物发光测定方法为：首先将待测试血浆和空白对照组使用tris-bsa缓冲液(r4+)稀释40倍后取50μl加入微孔板，然后分别加入x因子(r1)，活化的ix因子混合物(r2)和sxa-11底物(r3)各50μl，37℃孵育5min，加入50μl 20％乙酸停止反应，在吸光度405nm处读取吸光值。
[0084]
从-80℃取出上述收集好的病毒转染ea-hy926和dami的上清液，放于冰上融化，分别将各上清液与f8缺陷者血浆混合，以单独f8缺陷者血浆作为阴性对照(nc)，以健康志愿者血浆为阳性对照(pc)，采用底物发光法进行检测。
[0085]
图6为底物发光测定法的人源f8的检测结果，在由ef1α启动f8表达和vec启动f8表达的ea-hy926细胞的上清中，均检测到位于治疗范围内的人源f8活性，分别比正常水平高出约5倍和1.5倍，而含有其他启动子的细胞的上清未检测到人源f8活性。在由ef1α启动f8表达和itga启动f8表达的dami细胞的上清中，均检测到人源f8活性高于正常水平4倍。
[0086]
综上所述，本发明能够成功通过织特异性启动子启动f8基因表达的慢病毒载体，使细胞表达正常人源f8蛋白，且vec和itga启动子具有较好的特异性，启动表达具有高活性和凝血功能潜能的人源f8蛋白。
[0087]
实施例5
[0088]
将实施例2制备得到的携带f8-bdd慢病毒分别直接尾静脉注射a型血友病小鼠，进行治疗试验。
[0089]
治疗a型血友病小鼠的治疗流程示意图如图7所示，所使用a型血友病小鼠为敲除f8基因的c57bl/6雌性小鼠(6周龄，购买于北京百奥赛博生物科技有限公司)，所有小鼠均被安置在无病原体的环境中，使用x射线照射柜(faxitron,tucson，az，usa)对小鼠进行照射(600cgy/只)，并将慢病毒lv-ef1α-f8-bdd，lv-vec-f8-bdd，lv-itga-f8-bdd和lv-gp-f8-bdd分别以直接静脉注射的方式将慢病毒载体输入a型血友病小鼠体内进行疾病治疗，病毒注射剂量为1x10
7 tu，以注射pbs(每只200μl)为对照(mock)。
[0090]
在治疗后的第7、15、30、45、60和120天，采用流式细胞术检测外周血中人源f8基因的表达情况，结果如图8所示，lv-vec-f8-bdd治疗组小鼠血液中人源f8表达保持稳定(从正常血浆水平的10％到30％)，lv-gp-f8-bdd治疗组小鼠血液中也维持稳定的大约15％的人源f8表达，而lv-ef1α-f8-bdd和lv-itga-f8-bdd治疗组小鼠血液中人源f8表达均逐渐降低(从30％降到5％)。
[0091]
在治疗后第7、15、30、45、60和120天时，抽取小鼠的血液，从中分离出血浆，分别以未经处理的血友病小鼠(mock)和野生型小鼠(wt)为对照，用底物发光法测定f8活性，结果如图9所示，结果可以看出，与流式细胞术结果一致，lv-vec-f8-bdd和lv-gp-f8-bdd治疗小鼠血浆人源f8活性保持稳定增长，在60天达到25％的阳性，进一步在120天增加到80％(lv-vec-f8-bdd治疗组)和25％(lv-gp-f8-bdd治疗组)，lv-ef1α-f8-bdd和lv-itga-f8-bdd治疗组小鼠在30天后，血浆人源f8活性逐渐降低(小于3％)。
[0092]
综上，流式分析和底物发光法的检测结果均证明尾静脉注射lv-gp-f8-bdd或lv-vec-f8-bdd能够显著提高a型血友病小鼠血浆中f8水平并维持稳定，即能够有效治疗小鼠a型血友病。
[0093]
此外，针对抗体反应，采集上述经过治疗的小鼠眼眶外周血，3000rpm离心15min获得血浆，将血浆按1:200用tris-bsabuffer稀释，置于pvc微孔板中，加入过氧化物酶标记羊抗鼠igg(peroxidase-conjugated goat anti-mouse total igg)，随后加发光底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)，进行酶联免疫吸附试验(elisa)，以评估抗凝血因子viii(f8)的抗体反应，以注射抗凝血因子viii单克隆抗体的a型血友病小鼠作为阳性对照(ctrl+)，结果如图10所示，lv-vec-f8-bdd、lv-gp-f8-bdd和lv-itga-f8-bdd组小鼠的igg抗体反应都较小，lv-ef1α-f8-bdd组小鼠的抗体反应最大，表明将本发明组织特异启动子vec、gp和itga应用于基因治疗，均能有效降低免疫排斥反应。
[0094]
综上所述，本发明创造性设计组织特异启动子，能够在内皮细胞或巨核细胞-血小板细胞中启动编码基因特异性表达，有效降低异位表达，能够应用于需要在内皮细胞或巨核细胞-血小板细胞中特异性表达基因的基因治疗中，如a型血友病的基因治疗，本发明制备携带组织特异启动子和f8-bdd基因的慢病毒，通过直接静脉注射方式，对a型血友病小鼠进行治疗，有效地提高f8-bdd基因在小鼠体内的传递效率与表达量，可以一定程度地纠正a型血友病小鼠的出血表型，其中以vec启动子启动f8-bdd基因表达的治疗效果最好，且抗体反应低，对于保障基因治疗的有效性具有重要的意义，为实现更快的a型血友病症状缓解以及更全面持久的基因治疗奠定了基础。
[0095]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。