1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向真菌的抗菌肽及制备方法和应用。


背景技术：

2.白色念珠菌是存在于人类消化道、皮肤和粘膜中的常驻微生物区系的一种成分。作为常驻微生物群的一员，由于其正常的环境生态位，可有效地隐藏在免疫系统之外。白色念珠菌感染可能发生在侵入性药物治疗后，如注射和手术后，并且全身感染的死亡率接近40％。白色念珠菌造成死亡率的另一个因素是安全有效的治疗选择有限。传统抗念珠菌药物诸如多烯类(两性霉素b)、三唑类(氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑)和棘白菌素(米卡芬净和安尼霉素)均具有较高的系统性毒性，无法作为全身性念珠菌感染患者的最佳治疗选择，与此同时，由于抗念珠菌药物的不合理使用，念珠菌耐药性问题也日益严重，人们正陷入无药可用的可怖境地。因此，新型生物类抗念珠菌药剂的研发备受关注。
3.抗真菌肽(afps)是一类广泛存在于自然界，由生物体合成的具有抗真菌活性的小肽类物质，具有低毒、高效、无残留等特点。与传统抗真菌药物相比，抗真菌肽不仅可以物理性破坏真菌细胞膜，其还会诱导真菌细胞产生过量的ros，进而诱导真菌细胞凋亡，达到多重机制杀菌的功效。因此，抗真菌肽(afps)被认为是极具应用潜力的新一代抗念珠菌制剂。
4.然而，大部分天然存在的afps具有与传统抗生素相似的广谱抗菌特征，对真菌、革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有抗菌活性。这些药剂不加区分地杀死或抑制良性和致病性微生物体，从而破坏机体微生物群和免疫系统之间的平衡，甚至诱发严重的二次感染。因此，迫切需要能够靶向杀灭特定病原菌而不损害正常菌群的新型抗真菌肽。


技术实现要素：

5.基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种靶向真菌的抗菌肽，对真菌属菌株具有靶向杀灭作用，尤其是念珠菌属。
6.本发明的目的通过如下技术实现：一种靶向真菌的抗菌肽c
8-i6的序列为c
8-rririiirirr-nh2，c8为辛酸，对氨基酸的n端进行辛酸脂酰化修饰，氨基酸的c端酰胺化修饰。
7.本发明的另一目的是提供一种靶向一种靶向真菌的抗菌肽c
8-i6的制备方法，如下：
8.(1)以肽i6为活性中心，在其n端连接脂肪酸链c8，c端酰胺化修饰，设计出多肽c
8-i6，其序列为：c
8-rririiirirr-nh2；
9.(2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过tfa切割后，得到多肽；
10.(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成抗菌肽的制备。
11.本发明的另一目的是提供一种靶向真菌的抗菌肽c
8-i6在制备治疗真菌属感染性疾病中的应用。
12.进一步的，如上所述的真菌为念珠菌。
13.本发明的优点及有益效果：抗菌肽c
8-i6对真菌属菌株具有明显的靶向杀灭作用，平均抗白色念珠菌活性高达7.61μm。生物相容性试验结果表明，抗菌肽c
8-i6具有较低的细胞毒性，其选择性指数为8.40。综上，抗菌肽c
8-i6是一种具有较高应用价值靶向抗真菌属的抗菌肽。
附图说明
14.图1为抗菌肽c
8-i6的质谱图。
15.图2为抗菌肽c
8-i6的溶血活性的测定图。
16.图3为抗菌肽c
8-i6对ipec、raw 264.7和hek 293t的细胞毒性图。
17.图4为抗菌肽c
8-i6在pbs缓冲液中的杀菌动力曲线图。
18.图5为抗菌肽c
8-i6对念珠菌细胞壁通透性作用的测定图。
19.图6为抗菌肽c
8-i6对念珠菌质膜去极化电势变化的测定图。
具体实施方式
20.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
21.实施例1
22.靶向抗真菌肽的设计：
23.抗念珠菌肽c
8-i6的氨基酸序列为：
24.c
8-arg arg ile arg ile ile ile arg ile arg arg-nh225.以i6这条中心对称结构的非完美两亲性α-螺旋短肽为中心，在其n端的精氨酸arg上通过酰胺键链接脂肪酸链c8，c端酰胺化以提高正电荷数，将该抗念珠菌肽命名为c
8-i6。抗念珠菌肽序列如表1所示。
26.表1 c
8-i6的氨基酸序列
[0027][0028]
实施例2
[0029]
将上述抗念珠菌肽使用多肽合成仪进行合成，方法为固相化学合成法，具体步骤为：
[0030]
1、多肽主链的制备从c端到n端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将fmoc-x(x是每个抗菌肽的c端第一个氨基酸)接入到wang树脂，然后脱去fmoc基团后得到x-wang树脂；再将fmoc-y-trt-oh(9-芴甲氧羧基-三甲基-y，y为每个抗菌肽c端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从c端合成到n端，直至合成完毕，得到脱去fmoc基团的侧链保护的树脂；
[0031]
2、重复步骤1，在n端的精氨酸上进行脂肪酸链链接，c端酰胺化。
[0032]
3、在上述得到的多肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；沉淀tfa(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚
洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由tfa、水和tis(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；
[0033]
4、使用0.2mol/l硫酸钠(磷酸调节至ph＝7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，c18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1ml/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相c18柱进一步纯化，洗脱液a为0.1％tfa/水溶液；洗脱液b为0.1％tfa/乙腈溶液，洗脱浓度为25％b～40％b，洗脱时间为12min，流速为1ml/min，再同上收集主峰，冻干；
[0034]
5、抗念珠菌肽的鉴定：将上述得到的抗念珠菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(见附图1)，质谱图中显示的分子量与表1中的理论分子量基本一致，抗念珠菌肽的纯度大于95％。
[0035]
实施例3
[0036]
1、靶向抗念珠菌肽生物学活性测定
[0037]
1.1抗细菌活性测定
[0038]
本试验参考美国临床试验室标准委员会(national committee for clinical laboratory standards，nccls)推荐的方法，测定多肽的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，mic)和最小杀细菌浓度(minimum bactericidal concentration，mbc)，并根据抗菌肽阳离子特征进行适当改进，具体步骤如下：
[0039]
(1)菌体准备：取冻存于-20℃的菌种划线接种于mha固体培养基，37℃过夜培养。随后挑单菌落接种于mhb中，220rpm，37℃培养至对数生长期，用mhb调整其浓度至od
600nm
＝0.1，最后用mhb进一步稀释1000倍至0.5-1
×
105cfu/ml。
[0040]
(2)多肽的稀释：在96孔板中a行内加入95μl 0.2％bsa稀释液，其余孔加入50μl0.2％bsa稀释液。将5μl 2.56mm浓度的多肽加入a行孔中，充分混匀，然后吸取50μl加入b行，以此类推，倍比稀释至g行，混匀后吸取50μl弃去。每个测定多肽设置三个平行。
[0041]
(3)菌液接种：将50μl菌液加入96孔板a-g行孔中，h行1-6号孔同样加入50μl菌液作为阳性对照，7-12号孔加入50μl新鲜的mhb培养基作为阴性对照，混匀后置于37℃下培养24h。
[0042]
(4)最小抑制浓度确定：阳性孔浑浊，表明细菌正常生长，阴性孔清亮，表明试验过程无污染。若测试孔无肉眼可见菌生长，则其对映的最低药物浓度即为测定多肽的最小抑菌浓度。
[0043]
(5)最小杀菌浓度确定：测定mic后，从无肉眼可见菌生长孔中取50μl样品，用pbs连续倍比稀释后涂布于mha固体培养基上，37℃孵育培养16h后计算菌落数，以杀死99.99％细菌的最低药物浓度为测定多肽的最小杀细菌浓度。本试验独立重复三遍。
[0044]
1.2抗念珠菌活性测定
[0045]
本试验参考美国临床试验室标准委员会(national committee for clinical laboratory standards，nccls)推荐的方法，测定多肽的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,mic)和最小杀真菌浓度(minimum fungicidal concentration，mfc)，并根据抗菌肽阳离子特征进行适当改进，具体步骤如下：
[0046]
(1)菌体准备：取冻存于-20℃的菌种划线接种于ym固体培养基，28℃培养48h。随后挑单菌落，于去离子水中调节菌体浓度至0.5麦氏比浊度，并用prmi-1640培养基进一步
稀释1000倍至0.5-1
×
103cfu/ml。
[0047]
(2)多肽的稀释：步骤同1.1(2)
[0048]
(3)真菌接种：同1.1(3)，将念珠菌菌液50μl接种于96孔板中，28℃培养48h。
[0049]
(4)最小抑菌浓度确定：同1.1(4)
[0050]
(5)最小杀真菌浓度确定：同1.1(5)，测定mic后，从无肉眼可见菌生长孔中取50μl样品，用pbs连续倍比稀释后涂布于ym固体培养基上，28℃孵育培养48h后计算菌落数，以杀死99.99％细菌的最低药物浓度为测定多肽的最小杀真菌浓度。本试验独立重复三遍。
[0051]
通过表2可以看出，c
8-i6对于念珠菌属的总体杀菌活性较强并且很稳定，对细菌无论是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌都无杀菌活性，表明c
8-i6为靶向抗念珠菌肽，其具有成为新一代抗念珠菌药物的潜力。
[0052]
表2抗念珠菌属肽c
8-i6的抑菌活性
[0053][0054]
gm*是是短肽对念珠菌mic值的几何平均数
[0055]
2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1ml，肝素抗凝后溶解到2mlpbs溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用pbs洗涤3遍，再用10ml pbs重悬；取50μl红细胞悬液与50μl用pbs溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；l h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μl红细胞加50μlpbs作为阴性对照；50μl红细胞加50μl 0.1％tritonx-100作为
阳性对照。多肽溶血活性检测结果见表3。溶血率越低，表明多肽越安全。通过附图2可以看出，抗念珠菌肽c
8-i6在64μm以下的浓度检测范围内没有明显的溶血活性。溶血活性远高于抑菌活性，表明抗念珠菌肽c
8-i6具有极高的实际应用潜力。通过表3结果显示，综合分析抗菌肽的抑菌和溶血活性，可以通过细胞选择性指数(溶血浓度与抑菌浓度的比值)来更全面的评价各个抗菌肽的生物学活性。
[0056]
表3靶向念珠菌属肽c
8-i6溶血活性的测定
[0057][0058]
3、真核细胞毒性：抗菌肽对真核细胞的毒性采用mtt比色法测定。具体步骤如下：
[0059]
(1)细胞悬液准备：将冻存于液氮中的细胞复苏后接种于含有10％胎牛血清和1％双抗的培养基中，在37℃、5％co2条件下传代培养。将培养好的细胞用0.25％胰酶消化，用培养基将其调整至2-4
×
105cells/ml。
[0060]
(2)多肽处理：将50μl细胞悬液与50μl不同浓度的多肽混合于96孔板中，在37℃、5％co2条件下孵育4h，随后每孔加入25μl mtt(5mg/ml)，继续孵育12h。
[0061]
(3)结果测定：孵育结束后，低温高速离心机离心1000g，10min。弃去上清，用100μldmso溶解孔底结晶，用酶标仪在570nm处测定每孔吸光度值。培养基孔作为空白对照。计算每个处理孔的细胞存活率。结果如附图3所示，经过c
8-i6得处理，在肽浓度小于128μm时细胞存活率均在70％-80％之间。与溶血活性一样，c
8-i6在高浓度128μm时有一定的细胞毒性。
[0062]
4、杀菌动力学试验：
[0063]
将菌液与1
×
mbc(mfc)浓度抗菌肽混合，于不同时间点(0、15s、30s、45s、60s、3min、5min、10min、15min、30min、60min、120min)取样50μl倍比稀释，涂布于相应的固体培养基进行培养，随后计算每个时间点细菌存活率，绘制曲线。以不加多肽作为对照。检测结果如附图4所示，c
8-i6在1
×
mbc浓度下，1min内就杀灭了超过99.99％的菌体细胞，展现出极快的杀菌速率。
[0064]
实施例4
[0065]
抑菌机理
[0066]
1、细胞壁通透性试验：本试验采用1-n-phenylnaphthylamine(npn)摄入试验来检测多肽对待测菌株细胞壁的穿透性。具体步骤如下：
[0067]
(1)菌液准备：将处于对数生长期的菌离心(5000
×
g，5min)收集，用5mm hepes缓冲液(ph＝7.2，含5mm葡萄糖)冲洗三遍后，重悬至od
600nm
＝0.4，加入终浓度为10μm npn，室温条件下避光孵育30min。
[0068]
(2)样品测定：将等体积菌液与不同浓度的多肽混合于黑色96孔板中，使用荧光分光光度计在激发波长350nm、发射波长420nm条件下检测样品荧光强度。
[0069]
检测结果如附图5所示，c
8-i6对念珠菌的细胞壁的破坏作用呈剂量依赖效应，肽
浓度越高，荧光强度越高，说明其对细胞壁破坏程度越高。c
8-i6在4μm时对念珠菌细胞壁的破坏作用已超过同一浓度下的蜂毒素。传统抗菌剂氟康唑几乎无细胞壁穿透活性。
[0070]
2、细胞质去极化性试验：本试验采用膜电势敏感染料disc
3-5来检测抗菌肽对细胞质膜电势的影响。具体步骤如下：
[0071]
(1)菌体准备：将处于对数生长期的菌离心(5000
×
g，5min)收集，用5mm hepes缓冲液(ph＝7.2，含20mm葡萄糖)冲洗三遍后，重悬至od
600nm
＝0.05，加入终浓度为0.4μmdisc
3-5，室温条件下避光孵育1.5h。再加入终浓度为100mm k
+
，继续孵育30min。
[0072]
(2)向1cm石英比色皿中加入2ml准备好的菌液，在622nm激发光波长、670nm发射光波长条件下，使用f-4500荧光分光光度计检测菌液基础荧光值。再向菌液中加入不同浓度的待测抗菌肽，记录荧光强度变化。
[0073]
检测结果如附图6所示，c
8-i6对细胞质膜的去极化作用呈剂量和时间依赖效应。在1
×
mic时，c
8-i6和melittin均可快速的引起荧光强度的上升，说明c
8-i6可以通过破坏念珠菌的细胞质膜或膜离子通道达到杀灭细菌的效果。此外，氟康唑存在时，荧光强度并无增强趋势。