1.本发明涉及微生物培养技术领域，具体涉及一种既适用于细菌培养，也适用于真菌培养的牡蛎壳培养基及其制备方法。


背景技术：

2.牡蛎，俗称海蛎子、蚝等，隶属软体动物门、双壳纲、珍珠贝目，是世界上第一大养殖贝类，是人类可利用的重要海洋生物资源之一，为全球性分布种类。牡蛎不仅肉鲜味美、营养丰富, 而且具有独特的保健功能和药用价值，是一种营养价值很高的海产珍品。牡蛎的含锌量居人类食物之首。然而牡蛎的大规模养殖与食用的导致了废弃牡蛎壳的大量产生。废弃牡蛎壳的不当处理容易引起水体、空气污染，同时废弃牡蛎壳的大量堆积会侵占土地资源和海洋资源，对生态环境造成破坏。因此，针对废弃牡蛎壳的利用与处理，迫在眉睫。
3.牡蛎壳结构可分为三层，表层为硬化角质层，经单独酸解分离处理，可获得甲壳素和糖蛋白；中间层为牡蛎自身分泌的有机物，与碳酸钙结合形成了多孔的棱柱层；内层是珍珠层，其含有丰富的氨基酸、微量元素以及稀土元素。玉米须，为禾本科植物玉蜀黍的花柱和柱头，富含黄酮、苷类、矿质元素（钾、钠、钙、铁、铬等）、糖类（单糖、低聚糖和多糖）及有机酸。麦饭石是一种对生物无毒、无害并具有一定生物活性的复合矿物或药用岩石，其主要化学成分是硅铝酸盐（sio2、al2o3、fe2o3、feo、mgo、cao、k2o、na2o、tio2、p2o5等），含有生物生长所需要的多种元素，达58种之多，如k、na、ca、mg、cu、mo等微量元素和稀土元素。
4.本发明，收集刚取完肉质的废弃新鲜牡蛎壳，既能控制固废污染，又能利用其残余汁液和牡蛎壳上所含有的各种有益元素及营养物质，配合玉米须熬制液体汤汁，再将熬煮后的牡蛎壳收集磨粉，提供其他实验需要。因此本发明为废弃牡蛎壳的处理提供了新的思路。玉米须与新鲜牡蛎壳配合熬制，获得的液体培养基富含微量元素及各种糖类，利于细菌真菌生长。
5.而目前，实验室常用培养基有lb培养基、pda培养基、ypd培养基、牛肉膏蛋白胨培养基等等，这些培养基多使用胰蛋白胨、酵母提取粉、氯化钠、葡萄糖等化学药品，且这些培养基只能单一的培养细菌真菌，适用范围相对本发明中的培养基较窄。同时在培育细菌真菌时，相对于本发明废弃牡蛎壳及麦饭石、玉米须制得的微生物培养基而言，价格较贵，成本高昂。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种既适用于细菌培养，又适用于真菌培养的牡蛎壳培养基及其配置方法。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种适用于细菌真菌培养的牡蛎壳培养基的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：1）收集废弃牡蛎壳，牡蛎壳占培养基总重量的14%-18%；
2）取直径小于5cm的麦饭石，麦饭石占培养基总重量的5%-9%，用蒸馏水浸泡2h后沥干备用；3）取新鲜玉米须，玉米须占培养基总重量的5%-9%，将其破碎至长度小于0.5cm的丝状，并收集破碎时流溢的汁液；4）将步骤3）得到的破碎玉米须及其汁液同步骤1）得到的废弃牡蛎壳及步骤2）得到的麦饭石混合均匀，向混合物中加入蒸馏水，蒸馏水占培养基总重量的64%-76%，得到固液混合物；5）将步骤4）得到的固液混合物于120℃下高压灭菌30min；6）将步骤5）灭菌后的固液混合物用3层无菌纱布过滤2次后，滤液于120℃下高压灭菌20min，即得到牡蛎壳液体培养基；7）将步骤5）灭菌后的固液混合物用3层无菌纱布过滤2次后，向滤液中按每升培养基添加1.5wt%的琼脂粉，随后于120℃下高压灭菌20min后倒板，即得到牡蛎壳固体培养基。
8.进一步的，上述制备方法中，步骤1）中，所述牡蛎壳占培养基总重量的14.7%；步骤2）中，所述麦饭石占培养基总重量的5.88%；步骤3）中，所述玉米须占培养基总重量的5.88%；步骤4）中，所述蒸馏水占培养基总重量的73.54%。
9.一种利用上述制备方法制得的牡蛎壳培养基。
10.上述一种牡蛎壳培养基在培养细菌上的应用。
11.上述一种牡蛎壳培养基在培养真菌上的应用。
12.上述一种适用于细菌真菌培养的牡蛎壳培养基及其制备方法中所涉及的各组分的重量百分比比例为多次实验后选定，其中，提升牡蛎壳比例或麦饭石比例、降低其余两种配方比例会导致糖类等营养物质不足，微生物生长状况不良；提升玉米须比例，降低其余两种配方比例，会导致液体培养基浓稠度过高，从而影响使用。
13.本发明的有益效果在于：（1）本发明采用废弃的牡蛎壳作为原材料，有效缓解了废弃牡蛎壳在自然环境中随意丢弃导致的环境问题。
14.（2）本发明的牡蛎壳培养基因为同时适用于细菌真菌培养，相对于lb培养基、pda培养基，其适用范围更广。
15.（3）本发明以废弃的新鲜牡蛎壳、玉米须和麦饭石作为培养基基质，相比现有的多种培养基，配方简单，成本低廉，适于大规模推广应用。
附图说明
16.图1为lb固体培养基及本发明实施例1制备的牡蛎壳固体培养基培养枯草芽孢杆菌12h后的效果对照图。图1a：lb固体培养基；图1b：牡蛎壳固体培养基。
17.图2为lb固体培养基及本发明实施例1制备的牡蛎壳固体培养基培养阴沟肠杆菌12h后的效果对照图。图2a：lb固体培养基；图2b：牡蛎壳固体培养基。
18.图3为pda固体培养基及本发明实施例1制备的牡蛎壳固体培养基培养尖孢镰刀菌48h后的效果对照图。图3a：pda固体培养基；图3b：牡蛎壳固体培养基。
19.图4为lb固体培养基及本发明实施例2制备的牡蛎壳固体培养基培养金橙黄微小杆菌36h后的效果对照图。图4a：lb固体培养基；图4b：牡蛎壳固体培养基。
20.图5为lb固体培养基及本发明实施例2制备的牡蛎壳固体培养基培养地衣芽孢杆
菌12h后后的效果对照图。图5a：lb固体培养基；图5b：牡蛎壳固体培养基。
21.图6为pda固体培养基及本发明实施例2制备的牡蛎壳固体培养基培养新弯月孢霉48h后的效果对照图。图6a：pda固体培养基；图6b：牡蛎壳固体培养基。
22.图7为pda固体培养基及本发明实施例2制备的牡蛎壳固体培养基培养灰黄青霉48h后的效果对照图。图7a：pda固体培养基；图7b：牡蛎壳固体培养基。
23.图8为pda固体培养基及本发明实施例2制备的牡蛎壳固体培养基培养丝衣毛霉48h后的效果对照图。图8a：pda固体培养基；图8b：牡蛎壳固体培养基。
具体实施方式
24.下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.实施例1本发明提供了一种适用于细菌真菌培养的牡蛎壳培养基的制备方法，所述方法包括以下步骤：（1）收集500g废弃牡蛎壳。
26.（2）取178.57g直径小于5cm的麦饭石，用蒸馏水浸泡2h后沥干备用。
27.（3）将178.57g新鲜的玉米须破碎至长度小于0.5cm的丝状，并收集破碎时流溢的汁液。
28.（4）将步骤（3）得到的破碎玉米须及其汁液同步骤（1）得到的废弃牡蛎壳和步骤（2）得到的麦饭石均匀混合，并向混合物加入2714ml蒸馏水，得到固液混合物。
29.（5）将步骤（4）得到的固液混合物于高压灭菌锅中120℃下高压灭菌30min。
30.（6）将步骤（5）灭菌后的固液混合物用3层无菌纱布过滤2次后，滤液于120℃下高压灭菌30min，待冷却至常温，即得牡蛎壳液体培养基；将步骤（5）灭菌后的固液混合物用3层无菌纱布过滤2次后，向滤液中按每升培养基添加1.5wt%的琼脂粉，随后于120℃下高压灭菌20min后倒板，倒板即得牡蛎壳固体培养基。
31.分别采用本实施例获得的牡蛎壳液体培养基以及lb液体培养基培养革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌以及革兰氏阴性菌阴沟肠杆菌两种菌种。取菌悬液（od
600
值为2~3）按3vol%的接种量接种于培养基中，37℃下培养，每隔12h观察结果。结果如表1所示。
32.表1 两种细菌在lb液体培养基及牡蛎壳液体培养基中培养所得od
600
值表分别采用本实施例获得的牡蛎壳固体培养基以及lb固体培养基培养革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌。取1ml菌悬液（od
600
值为2~3），将其稀释至10-4
后取0.1ml接种于培养基中，
37℃下培养，12h后观察结果。结果如图1所示。
33.分别采用本实施例获得的牡蛎壳固体培养基以及lb固体培养基培养革兰氏阴性菌阴沟肠杆菌。取1ml菌悬液（od
600
值为2~3），将其稀释至10-4
后取0.1ml接种于培养基中，37℃下培养，12h后观察结果。结果如图2所示。
34.分别采用本实施例获得的牡蛎壳固体培养基以及pda固体培养基培养尖孢镰刀菌。取1ml菌悬液（od
600
值为2~3），将其稀释至10-4
后取0.1ml接种于培养基中，37℃下培养，12h后观察结果。结果如图3所示。
35.实施例2本实施例提供了一种适用于细菌真菌培养的牡蛎壳培养基的制备方法，所述方法包括以下步骤：（1）收集500g废弃牡蛎壳。
36.（2）取250g直径小于5cm的麦饭石，用蒸馏水浸泡2h后沥干备用。
37.（3）将250g新鲜的玉米须破碎至长度小于0.5cm的丝状，并收集破碎时流溢的汁液。
38.（4）将步骤（3）得到的破碎玉米须及其汁液同步骤（1）得到的废弃牡蛎壳和步骤（2）得到的麦饭石均匀混合，并向混合物中加入1777ml蒸馏水，得到固液混合物。
39.（5）将步骤（4）得到的固液混合物于高压灭菌锅中120℃下高压灭菌30min。
40.（6）将步骤（5）灭菌后的固液混合物用3层无菌纱布过滤2次后,，滤液于120℃下高压灭菌30min，待冷却至常温，即得牡蛎壳液体培养基；将步骤（5）灭菌后的固液混合物用3层无菌纱布过滤2次后，向滤液中按每升培养基添加1.5wt%的琼脂粉，随后于120℃下高压灭菌20min后倒板，即得牡蛎壳固体培养基。
41.分别采用本实施例获得的牡蛎壳固体培养基以及lb固体培养基培养金橙黄微小杆菌。取1ml菌悬液（od
600
值为2~3），将其稀释至10-4
后取0.1ml接种于培养基中，37℃下培养，48h后观察结果。结果如图4所示。
42.分别采用本实施例获得的牡蛎壳固体培养基以及lb固体培养基培养地衣芽孢杆菌。取1ml菌悬液（od
600
值为2~3），将其稀释至10-4
后取0.1ml接种于培养基中，37℃下培养，48h后观察结果。结果如图5所示。
43.分别采用本实施例获得的牡蛎壳固体培养基以及pda固体培养基培养新弯月孢霉。取1ml菌悬液（od
600
值为2~3），将其稀释至10-4
后取0.1ml接种于培养基中，37℃下培养，48h后观察结果。结果如图6所示。
44.分别采用本实施例获得的牡蛎壳固体培养基以及pda固体培养基培养灰黄青霉。取1ml菌悬液（od
600
值为2~3），将其稀释至10-4
后取0.1ml接种于培养基中，37℃下培养，48h后观察结果。结果如图7所示。
45.分别采用本实施例获得的牡蛎壳固体培养基以及pda固体培养基培养丝衣毛霉。取1ml菌悬液（od
600
值为2~3），将其稀释至10-4
后取0.1ml接种于培养基中，37℃下培养，48h后观察结果。结果如图8所示。
46.从表1和图1-8可以看出，枯草芽孢杆菌、阴沟肠杆菌、尖孢镰刀菌、金橙黄微小杆菌、地衣芽孢杆菌、新弯月孢霉、灰黄青霉、丝衣毛霉均能在本发明所制得的牡蛎壳培养基中生长。因此，本发明所提供的的牡蛎壳培养基，将废弃的新鲜牡蛎壳资源利用，并以常见
作物玉米须配置培养基，辅以多功能性矿物麦饭石，其既适合真菌生长，又适合细菌生长。
47.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。