1.本发明涉及动物免疫，基因工程，抗体工程及自动化设备技术领域，尤其涉及全羊源单克隆抗体的高通量制备方法。


背景技术：

2.绵羊和山羊是目前最广泛用于产生多克隆抗体的宿主物种，属于山羊亚科，这两个物种有很多共同之处。一个共同的特点是它们都拥有大量的抗血清，通常每个羊的血清产量约为200-300毫升，很多公司优先选择绵羊和山羊作为大规模生产多克隆抗体物种。研究人员能够从一只羊中获得大量抗体，从而消除个体和批次之间的差异。除此之外，羊表现出更高的免疫敏感性，比其他宿主物种的候选者能够识别更广泛的表位。免疫羊的抗体通常比标准小鼠，大鼠和兔抗体具有更高的特异性和亲和力，这表明在生物医学、兽医和农业方面具有巨大的潜力。
3.羊单克隆抗体是新一代单克隆抗体应用于科研、诊断和治疗。羊单克隆抗体主要以lambda型抗体为主，在igg抗体中占比约90％。与来自其他动物宿主的单克隆抗体相比，羊单克隆抗体的主要优势包括但不限于：超高亲和力
–
与目标的结合时间更长。这种亲和力通常比啮齿动物抗体大10至100倍；更广泛的表位识别-能够识别其他抗体技术失败的“困难”目标；更高的灵敏度
–
能够在目标物浓度非常低(例如激素)的情况下快速结合目标物；更高的特异性
–
能够精确区分密切相关的分子，例如药物衍生物；消除了交叉反应。羊单克隆抗体目前被用于各种生物医学应用。例如，具有高特异性和亲和力的单克隆绵羊抗体已被证明是适用于诊断、预防和治疗多种危及生命的细菌感染的理想临床先导物。
4.目前羊单克隆抗体发现的主要技术方案包括：羊杂交瘤技术，噬菌体展示技术。国外的两家公司creative diagnostics和bioventix同时拥有独特的羊b细胞融合技术，即羊杂交瘤技术，尤其bioventix公司通过该技术拿到了很多针对激素和毒品等小分子的高亲和力和高特异性的羊单克隆抗体，在诊断领域被广泛应用。但由于筛选羊融合细胞比较困难，使其没有在市场中得到广泛的应用。很多公司都在运用效率比较低的噬菌体展示技术来获得羊单克隆抗体。噬菌体展示技术获得的抗体效率低，且是随机配对的，未经过免疫监视/耐受选择的羊重组抗体，不是真正意义上的全羊源抗体，往往亲和力差。
5.为了实现高通量、高品质的制备真正意义的全羊源单克隆抗体，打破外国技术垄断，在全兔源单克隆抗体技术(专利号：202110545707.0)的基础上我们发明了世界上第一个羊单个b细胞抗体发现技术。这项研究成果的发现，标志着在生物科技领域方面，我们又有了新的突破和发展，在世界上也处于领先地位。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供提供高通量、高品质的全羊源单克隆抗体的制备方法。
7.本发明提供的高通量全羊源单克隆抗体的制备方法，包括：
8.步骤1：抗原免疫羊后取外周血分离单个核细胞；
9.步骤2：流式细胞术分选抗原特异性b淋巴细胞；
10.步骤3：扩增所述抗原特异性b淋巴细胞的可变区和恒定区；
11.步骤4：所述可变区和恒定区经重组、表达获得羊源单克隆抗体。
12.本发明所述制备方法的步骤1中：所述免疫的抗原为蛋白、多肽、小分子化合物或核酸。本发明实施例中，所述抗原为pct(降钙素原，procalcitonin)。
13.本发明中，所述羊为绵羊。一些实施例中，所述羊为6～12月龄的雌性绵羊。
14.所述免疫的部位为颈部，四肢和/或背部。免疫的频率为每间隔两周免疫一次，共免疫6～9次。每次免疫的剂量为100～500μg。一些实施例中，每次免疫的剂量为150μg。
15.制备所述pbmc的细胞悬液后，进行流式分选。
16.所述流式细胞术分选的标志物选自如下i～iv中任一种组合：
17.i)、7aad、cd4、cd8、cd14、igm、cd21、抗原；
18.ii)、7aad、cd4、cd8、cd14、cd45r、igm、cd21、抗原；
19.iii)、7aad、cd4、cd8、cd14、igm、igg、抗原；
20.iv)、7aad、cd4、cd8、cd14、cd45r、igm、igg、抗原；
21.一些实施例中，步骤2中，以标志物组合i)或ii)，分选pbmc中的抗原特异性b淋巴细胞。
22.一些实施例中，步骤3中所述扩增包括反转录、第一轮巢式pcr扩增和第二轮巢式pcr扩增；
23.所述第一轮巢式pcr的正向引物在igg先导肽区域，反向引物位于igg ch1区域；
24.所述第二轮巢式pcr获得重链可变区扩增产物、轻链l可变区扩增产物和轻链κ可变区扩增产物。
25.所述第一轮巢式pcr扩增的引物包括：
[0026][0027]
所述第二轮巢式pcr扩增的引物包括：
[0028]
重链可变区引物：
[0029][0030]
轻链κ可变区引物：
[0031][0032]
轻链λ可变区引物：
[0033][0034][0035]
步骤4中所述的重组包括：
[0036]
①
纯化步骤3扩增所得片段经纯化后，分别构建线性表达载体；
[0037]
②
构建所得线性化载体转化入宿主细胞，经培养、表达获得含有羊源单克隆抗体的培养液；
[0038]
所述线性表达载体由骨架载体和外源片段组成，所述骨架载体为哺乳动物细胞表达载体，其包括cmv启动子和β-globin poly(a)signal信号肽，所述外源片段包括kozak序列，先导肽序列、可变区片段和恒定区片段。
[0039]
所述可变区序列为所述重链可变区引物、所述轻链l可变区引物或所述轻链κ可变区引物扩增所得片段；所述恒定区序列可为扩增获得也可为市售或实验室保存，本发明对此不做限定。具体的，所述恒定区片段为羊源igg的fc区。
[0040]
本发明构建的表达载体中，所述启动子为cmv，所述先导肽的编码序列为atggagtttgggctgagctggattttccttgctgctattttaaaaggtgtccagtgt；所述宿主细胞为293f细胞或cho细胞。
[0041]
本发明步骤4中获得羊源单克隆抗体后，还包括高通量制备的步骤，具体包括：批量制备所述的线性表达载体，然后转化入宿主细胞批量表达；所述批量制备和/或批量表达在purifier
tm ht的24孔纯化仪器中进行。
[0042]
本发明还提供所述制备方法制备获得的羊源单克隆抗体。
[0043]
提供的方案包括免疫、分选、扩增、重组、表达几个步骤，完全摒弃了利用传统杂交瘤技术和噬菌体展示来获取羊单克隆抗体，无需进行细胞培养，通过直接克隆抗体vh&vl，并构建至表达载体上实现羊单克隆抗体发现的技术，将羊单克隆抗体开发时间从8-12周才能确定的完成整抗体序列，缩短至3周(自末次免疫后计算)。并完全解决了杂交瘤技术，b细胞培养技术和噬菌体展示技术过程中，细胞凋亡，不稳定性和随机配对等问题。实现了世界第一个天然配对的羊单个b细胞抗体发现技术。
[0044]
实验表明，本发明采用的技术方案，羊单克隆抗体筛选阳性率可以达到50％，相对于杂交瘤5％的阳性率，本发明可以在短时间内可以拿到数以千计的阳性羊单克隆抗体，为抗体发现项目提供有力的技术支撑。
附图说明
[0045]
图1羊单克隆抗体发现的流程图；
[0046]
图2流式分选抗原特异性b淋巴细胞图；
[0047]
图3是扩增重链和轻链的凝胶电泳图；
[0048]
图4示初次筛选elisa阳性率；
[0049]
图5示功能实验elisa值；
[0050]
图6示所得序列的进化树；
[0051]
图7示重链表达载体图谱；
[0052]
图8示轻链表达载体图谱。
具体实施方式
[0053]
本发明提供了全羊源单克隆抗体的高通量制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0054]
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0055]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0056]
本发明所述的高通量全羊源单克隆抗体的制备方法，包括免疫、分选、扩增、重组和表达几个步骤。该方法从1个b淋巴细胞中分离出天然配对的重链和轻链基因，实现了高通量制备羊单克隆抗体方法。该方法保留了轻链重链可变区的天然配对，具有基因多样性好、效价高、抗体亲和力好、特异性强等优势，为羊单克隆抗体发现提供了一个新的技术方
案。
[0057]
本发明所述的制备方法步骤1中，所述免疫的抗原来自植物、动物或微生物。优选的，所述微生物为病原微生物、一些实施例中，所述微生物包括病毒、真菌、细菌。本发明所述抗原的种类为蛋白、多肽、小分子化合物或核酸。本发明中，所述核酸为dna、rna、cdna、pna。其可为单链、双链，可为线性或环状。在本发明的一个具体实施例中，以pct(降钙素原，procalcitonin)为实验对象验证全羊源单克隆抗体的制备效果。本技术提供方法的抗体制备效果不受抗原的种类的影响。
[0058]
全羊源单克隆抗体的制备效果受到羊品种及月龄的影响。前期试验表明，绵羊和山羊制备抗体的效果优于其他实验羊种类。雌性实验羊制备抗体的效果优于雄性实验羊。以6-12月龄的雌性绵羊和山羊为实验动物能够获得最佳的抗体制备效果。本发明对羊的免疫部位选择在颈部，四肢和/或背部。一些实施例中，在颈部，四肢和背部都进行免疫。免疫的频率为每间隔两周免疫一次，共免疫6～9次。每次免疫的剂量为100～500μg。一些实施例中，每次免疫的剂量为150μg。每两周在羊子的颈部，四肢和背部进行免疫，每个位点免疫的剂量为150μg。免疫的佐剂对免疫效果存在影响，为了进一步提高抗体制备效果，本技术实施例中，采用弗氏佐剂作为佐剂。
[0059]
本发明中，保证抗体制备的效果，血清效价达到243k以上，视为合格。在第3次免疫和第5次免疫后取血清，如果血清效价合格，第6次免疫后7天取血液并分离pbmc。如果血清效价不合格，再加免2次后，取血清验证，第9次免疫后7天取血液并分离pbmc。
[0060]
本发明实施例中，外周血单个核细胞(pbmc)分离方法为密度梯度离心法。具体包括：以1：1的体积比稀释血样小心加于分离液之液面上，常温离心，离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层。第二层为环状乳白色淋巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层，清洗后得到的单细胞悬浮液，外周血单个核细胞(pbmc)悬浮液可以直接用于细胞染色并流式分选抗原特异性b淋巴细胞，也可以进行液氮冻存，随时取用。
[0061]
采用流式细胞术对细胞中的抗原特异性b淋巴细胞进行分选。为了保证分选后细胞制备抗体的效果，本技术对分选所采用的标志物进行了多种尝试。申请所述分选的标志物选自：7aad、cd4、cd8、cd14、igm、cd21、抗原。
[0062]
一些实施例中，7aad、cd4、cd8、cd14、igm、cd21、抗原对单个核细胞进行分选。另一些实施例中以7aad、cd4、cd8、cd14、cd45r、igm、cd21、抗原对单个核细胞进行分选。另一些实施例中，以7aad、cd4、cd8、cd14、igm、igg、抗原对单个核细胞进行分选。另一些实施例中，以7aad、cd4、cd8、cd14、cd45r、igm、igg、抗原对单个核细胞进行分选。
[0063]
为了更好的对细胞进行分选，所述标志物上还连接有荧光基团：
[0064]
cd4/cd8/cd14以fitc标记，cd45r以percp-cy5.5标记，igm以apc-cy7标记，igg和cd21以apc标记，所述抗原即用于免疫羊子的抗原，以pe+进行标记。
[0065]
一些具体实施例中，分选标志物包括：
[0066]
i)、7aad、cd4、cd8、cd14、igm、cd21、抗原；
[0067]
ii)、7aad、cd4、cd8、cd14、cd45r、igm、cd21、抗原；
[0068]
iii)、7aad、cd4、cd8、cd14、igm、igg、抗原；
[0069]
iv)、7aad、cd4、cd8、cd14、cd45r、igm、igg、抗原；
[0070]
研究表明，本发明所述的标志物组合中，i)和ii)更适用于pbmc中的igg+,iga+,ige+b cells的分选，iii)和iv)更适用更适用于pbmc中的igg+b cells的分选。在本发明实验中研究发现i)和ii)方法用于pbmc来源的抗原特异性b淋巴细胞数量更多，获得阳性抗体数量也更多。
[0071]
分选获得的抗原特异性b淋巴细胞置于96孔pcr板中。每孔1个抗原特异性b淋巴细胞，孔中装有细胞裂解液，分选的96孔pcr板可以直接进行单个b细胞抗体基因的扩增，也可以把分选的96孔pcr板放置-80℃存放。存放的时间可长达3年。
[0072]
对单个b细胞进行抗体基因的扩增，首先需进行反转录合成cdna；然后通过巢式pcr扩增抗体重链和轻链基因，扩增出配对的重链和轻链片段通过dna纯化磁珠对克隆免疫球蛋白重链和轻链的可变区进行高通量纯化。
[0073]
通过巢式pcr扩增抗体重链和轻链基因，第一轮巢式pcr扩增重链、轻链λ和轻链κ部分基因，第二轮巢式pcr分别扩增重链可变区片段、轻链λ可变区片段和轻链κ可变区片段。前期验证表明，相对于采用其他引物组合，表1～4中采用的引物能够取得更优秀的扩增效果。具体表现为，扩增获得片段的阳性率较高，且所得抗体的效价更高。
[0074]
第一轮巢式pcr的正向引物在抗体基因的先导肽区域，反向引物位于igg和igm ch1区域与轻链igκ和igλ的cl区域，所用引物如实施例中表1；第二轮巢式pcr所用引物如实施例中表2，3和4所示。
[0075]
扩增所得到的重链可变区片段：一端序列与表达载体的部分引导区序列重合，另一端序列与部分重链的恒定区序列重合；所得轻链λ可变区片段的一端序列与部分引导区序列重合，另一端序列与部分轻链λ的恒定区序列重合；所得轻链κ可变区片段的一端序列与部分引导区序列重合，另一端序列与部分轻链λ的恒定区序列重合。
[0076]
一些实施例中，与线性载体部分引导区序列重合的序列为acagcaggagtgcacagc；与线性载体部分重链恒定区重合的序列为tggagccttaggttgccc；与线性载体部分轻链λ恒定区重合的序列为aggagccactggatctcc；与线性载体部分轻链λ恒定区重合的序列为aggagccactggatctcc。
[0077]
经过第二轮pcr扩增后，获得的三个片段，然后分别挑选配对的vh&vl基因片段至96孔深孔板中进行纯化。所述配对是指：将重链可变区片段、轻链κ可变区来自于同一个b细胞，分别置于相邻的96孔深孔板中。将重链可变区片段、轻链l可变区置于相邻的96孔深孔板中。为了进一步提高纯化效率，降低工作量，所述纯化采用高通量纯化。具体的，通过purifier
tm ht的96孔装置和dna纯化磁珠，高通量的纯化dna片段。
[0078]
传统质粒载体构建耗时长、效率低，因此本发明构建表达载体。一些实施例中，通过同源重组方法将分离得到的抗体重链和轻链可变区分别连入相应的载体实现重组，即是重组反应产物。一些实施例中，所述载体包括两类，其一包括启动子，kozak序列，先导肽序列及抗体可变区基因；其二包括重链片段或轻链片段的恒定区和β-globinpolya信号肽片段。
[0079]
所述线性表达载体由骨架载体和外源片段组成，所述骨架载体为哺乳动物细胞表达载体，其包括cmv启动子和β-globinpolya信号肽，所述外源片段包括kozak序列，先导肽序列、可变区片段和恒定区片段。
[0080]
所述可变区序列为所述重链可变区引物、所述轻链λ可变区引物或所述轻链κ可变
区引物扩增所得片段；所述恒定区序列可为扩增获得也可为市售或实验室保存，本发明对此不做限定。具体的，所述恒定区片段为羊源igg的fc区。
[0081]
本发明所述线性载体中，启动子选自cmv中任一种。所述先导肽的编码序列为atggagtttgggctgagctggattttccttgctgctattttaaaaggtgtccagtgt。
[0082]
本发明构建获得的线性载体在大肠杆菌中实现扩增。扩增获得的质粒经提取后转化入宿主细胞经培养后获得含有抗体的培养液。所述宿主细胞为动物细胞。一些实施例中，所述宿主细胞为293或cho细胞。本发明研究表明，采用293f或cho进行批量表达，表达的效率更高。
[0083]
本发明实施例中，记载的抗体的制备步骤包括：
[0084]
高通量全羊源单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
[0085]
(1)动物免疫：使用蛋白，多肽，小分子或者dna对于羊进行免疫，获取合格的免疫后的pbmc；
[0086]
(2)单细胞悬浮液制备：所述分离外周血单核细胞(pbmc)可以被立即使用，也可以被液氮冻存备用；
[0087]
(3)分选单个b细胞：所述单个b细胞为抗原特异性浆细胞和/或抗原特异性记忆b淋巴细胞；
[0088]
(4)单个b细胞基因扩增：对单个b细胞进行反转录合成cdna，扩增抗体重链和轻链可变区基因；
[0089]
(5)抗体vh&vl片段的高通量纯化：挑取配对的vh&vl基因片段至96孔pcr板中，通过purifier
tm ht的96孔装置和dna纯化磁珠，高通量的纯化dna片段。
[0090]
(6)构建含抗体重链、轻链基因的线性表达系统：通过同源重组的方法将步骤(5)分离得到的抗体重链、轻链可变区基因分别连入线性载体表达系统中；
[0091]
(7)高通量转化和培养大肠杆菌：转移步骤(6)得到的同源重组反应液至预制的96孔pcr板的感受态中，进行热激转化，转化完成后，转移转化后的大肠杆菌至含有1ml 48孔深孔板中培养；
[0092]
(8)高通量小量质粒抽提：步骤(6)培养的大肠杆菌，通过purifier
tm ht的96孔装置和质粒抽提磁珠，高通量的抽提质粒；
[0093]
(9)高通量小量抗体表达验证：将步骤(7)获得质粒在48孔细胞培养板中导入293或cho宿主细胞进行高通量表达，收集表达的上清直接用于抗体的结合及功能试验；
[0094]
(10)测序分析：将步骤(9)具有活性的抗体质粒，转化大肠杆菌，涂布lb培养板，挑取单菌落送测，获得的测序序列在imgt和igblst上分析；
[0095]
(11)高通量质粒制备：将(10)分析得到的单克隆抗体的菌液接菌至含lb液体培养基的24孔板中，培养过夜，并通过purifier
tm ht的24孔装置和质粒抽提磁珠，批量抽提质粒；
[0096]
(12)抗体制备：将(11)得到的单克隆抗体质粒在24孔深孔细胞培养板中导入293或cho宿主细胞进行高通量的批量表达，收集表达上清，通过purifier
tm ht的24孔装置和proteina磁珠，纯化抗体并用于抗体结合和功能试验。
[0097]
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0098]
实施例1动物免疫
[0099]
每个靶点项目使用1只6-12月龄健康的雌性绵羊，以pct(降钙素原，procalcitonin)免疫部位颈部，四肢和背部，免疫间隔两周免疫次数6-9次，免疫剂量150μg。
[0100]
在第3次免疫和第5次免疫后取血清，如果血清效价不低于243k合格，第6次免疫后7天取血液并分离pbmc。如果血清不合格，再加免2次后，取血清验证，第9次免疫后7天取血液并分离pbmc。
[0101]
实施例2单细胞悬浮液的制备
[0102]
1.外周血单个核细胞(pbmc)细胞悬浮液的制备：
[0103]
pbmc分离方法为：获得的新鲜血样，使用稀释液1：1稀释血样，取一支50ml离心管，先加入20ml分离液，再加入20ml经稀释后的血液样本小心加于分离液之液面上，800g，常温离心25min。离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层。第二层为环状乳白色淋巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中，往所得离心管中加入10ml清洗液，混匀细胞，350g 4℃离心10min，共清洗3次。尽弃上清，可以使用facs缓冲液重新悬浮细胞直接用于细胞染色并流式分选，也可以加入细胞冻存液重新悬浮细胞，液氮冻存，随时取用。
[0104]
实施例3流式分选抗原特异性b细胞
[0105]
取出新鲜的细胞悬浮液或者冷冻保存的细胞，冷冻保存的细胞在37℃水浴锅溶解，转移细胞至15ml离心管，加入3倍体积的红细胞裂解液，冰上孵育3min，加入pbs+2％fbs至终体积15ml，混匀，4℃，450g离心5min。弃上清，重复1次，重新溶解细胞至浓度1
×
107细胞/ml，分别吸取50μl至10个ep管，再加入pbs+2％fbs至200μl/管，作为空白对照，单染管，阴性对照，阳性对照，剩余的细胞为样品管。避光加入相应的抗体(bd，biolegend)，4℃放置30min；加入pbs+2％fbs，轻混匀，4℃，450g离心5min，重复洗3次；用500-3000μl pbs+2％fbs重悬，0.22μm滤膜过滤后上机分选。使单个b细胞分选入96孔板(eppendorf)。分选完成的96孔板分选完成后迅速封膜(axygen)，放入干冰，待分选完成后转移至-80℃冰箱保存，分选的96孔pcr板放置-80℃存放3年。
[0106]
分选羊的抗原特异性b淋巴细胞采用的细胞标记物和荧光组合选自以下组合，荧光可以根据流式分选仪器配置相应改变：
[0107]
i)、7aad、cd4、cd8、cd14、igm、cd21、抗原；
[0108]
ii)、7aad、cd4、cd8、cd14、cd45r、igm、cd21、抗原；
[0109]
iii)、7aad、cd4、cd8、cd14、igm、igg、抗原；
[0110]
iv)、7aad、cd4、cd8、cd14、cd45r、igm、igg、抗原；
[0111]
流式细胞分选的抗原特异性b淋巴细胞分析，见图2。
[0112]
实施例4单个b细胞抗体基因的扩增
[0113]
1.反转录合成cdna，
[0114]
在96-孔pcr板中以20μl反应体系合成cdna，0.5μl的random hexamer primers(50μm)，1μldntps(25mm)，及50u superscript vi反转录酶，先在pcr仪上运行65℃反应5min，4℃反应5min。然后25℃10min，42℃30min，50℃10min，90℃5min，16℃保存；
[0115]
第一轮巢式pcr扩增重链、轻链λ和轻链κ部分基因，正向引物在抗体基因的先导肽
区域，反向引物位于igg,igm,ige和iga ch1区域与轻链igκ和igλ的cl区域，所用引物如表1；第二轮巢式pcr分别扩增重链、轻链λ和轻链κ可变区基因，所用引物表2，3和4所示。重链可变区扩增产物一端序列与表达载体的部分引导区序列重合，另一端序列与部分重链的恒定区序列重合；轻链λ可变区扩增产物一端序列与部分引导区序列重合，另一端序列与部分轻链λ的恒定区序列重合；轻链κ可变区扩增产物一端序列与部分引导区序列重合，另一端序列与部分轻链λ的恒定区序列重合。
[0116]
与线性载体部分引导区序列重合的序列为acagcaggagtgcacagc
[0117]
与线性载体部分重链恒定区重合的序列为tgggggctgttgtgcttgc
[0118]
与线性载体部分轻链λ恒定区重合的序列为ggcgctcttgggctggcc
[0119]
与线性载体部分轻链κ恒定区重合的序列为ggcgctcttgggctggcc
[0120]
第一轮巢式pcr扩增所用引物如表所示；第二轮巢式pcr扩增所用引物如下表所示。
[0121]
表1第一轮巢式pcr引物
[0122][0123][0124]
表2第二轮巢式pcr重链引物
[0125]
directionprimer id5
’‑3’
sequenceforword2
nd-svh-f1caggtgcggctgcaggrgtc
forword2
nd-svh-f2caggtgcagctgsaggagtcforword2
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nd-svh-f5caggtgcgactgcaggrgtcforword2
nd-svh-f6caggttcagcttcaggggtcreverse2
nd-svh-r1tgargagacggtgaccaggreverse2
nd-svh-r2tgaggaaacggtgaccaggreverse2
nd-svh-r3tgaggagacggtgagcagg
[0126]
表3第二轮巢式pcr轻链k引物
[0127][0128][0129]
表4第二轮巢式pcr轻链λ引物
[0130]
directionprimer id5
’‑3’
sequenceforword2
nd-svλ-f1cagsctktgcygactcarccforword2
nd-svλ-f2caggctgtgctgacmcagccforword2
nd-svλ-f3cagtctgscctractcagccforword2
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[0131]
巢式pcr扩增抗体igh、igλ及igκ可变区基因：第一轮pcr：50μl体系中含有5μl的rt反应产物，5个单位的hotstartaq酶，0.2mm dntps，及0.5μm的igh、igκor igλ第一轮扩增正
向引物，igm、iga、ige、igg或者igκ或igλ抗体恒定区第一轮反向引物。反应条件：预变性95℃5min，然后进行40个pcr循环，每个循环为：95℃
×
30sec，50℃
×
30sec，72℃
×
60sec，最后用72℃延伸7min。第二轮pcr：50μl体系中含有5μl的第一轮pcr反应产物作为模版，5个单位的hotstartaq plus酶，0.2mm dntps及0.5μm的可变区第二轮正向引物，igm、iga、ige、igg或者igκ或者igλ抗体可变区第二轮反向引物，反应条件：预变性95℃5min，然后进行40个pcr循环，每个循环为：95℃
×
30sec，55℃
×
30sec，72℃
×
45sec，最后用72℃延伸7min。
[0132]
实施例5抗体基因vh&vl片段纯化
[0133]
扩增的vh&vl片段用2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，分选30个igg/a/e
+
b细胞的孔作为阳性对照，分选0个细胞的作为阴性对照。
[0134]
单个b细胞rt-pcr克隆抗体vh&vl凝胶电泳检测，见图3。扩增的阳性率与在全兔源单克隆抗体技术(专利号：202110545707.0)的阳性率相当。
[0135]
挑取配对的vh&vl pcr产物至96孔深孔板中，加入40μl dna纯化磁珠，第2块和第3块96孔深孔板加入400μl的80％乙醇，第4块板加入50μl的超纯水，并做好标记。在样品板中放上磁力套，把96孔深孔板按照顺序放入purifier
tm ht自动化仪器上，运行程序。
[0136]
运行完成后，从96孔深孔板转移纯化的vh&vl片段至96孔pcr板，保存或者立即使用。
[0137]
实施例6构建含抗体重链、轻链基因的线性表达系统
[0138]
分别转移2μl(20-50μg)重链和轻链线性表达载体至96孔pcr板中，然后转移3μl纯化的vh&vl片段至相对应的载体孔中，并标记好配对抗体的位置，再加入5μl的同源重组酶，盖上封口膜，离心30s，放置pcr仪器上50℃反应25min，取出置于冰上，等待转化大肠杆菌。
[0139]
线性表达系统载体的骨架载体为哺乳动物细胞表达载体，其包括kozak序列、先导肽序列、cmv启动子和β-globin poly(a)signal信号肽。
[0140]
将重链可变区片段(表2引物扩增获得)，重链恒定区(羊源抗体igg的fc区)连入骨架载体，获得重链表达载体(图7)。
[0141]
将轻链可变区片段(表3引物扩增获得)，轻链恒定区(羊源抗体igg的fc区)连入骨架载体，获得轻链表达载体(图8)。
[0142]
将轻链可变区片段(表4引物扩增获得)，轻链恒定区(羊源抗体igg的fc区)连入骨架载体，获得轻链表达载体(图8)。
[0143]
实施例7高通量转化大肠杆菌和培养
[0144]
转移5μl重组反应产物转移至含50μl大肠感受态的96孔pcr板中，冰浴30mi，42℃热激60s,加入100μllb液体培养基，放置37℃培养箱，静置1h。
[0145]
分别转移复苏过后的转化大肠杆菌至含有lb培养基的48深孔培养板中，每孔含有1l的lb液体培养基，盖上透气膜，37℃，200rpm摇床培养过夜。
[0146]
实施例8高通量小量质粒抽提
[0147]
离心收集菌体，向48孔深孔板中加上100μlp1缓冲液，悬浮细菌，再加入100μl的p2缓冲液，轻柔晃动8次，直至透明，整个过程不超过5min，再加入100μlp3缓冲液，放置水平离心机4000rpm离心30min，转移240μl的上清至96孔深孔板中，再加入240μl的异丙醇，再加入100μl dna纯化磁珠。第2块和第3块96孔深孔板加入500μl的80％乙醇，第4块板加入100μl的超纯水，并做好标记。在样品板中放上磁力套，把96孔深孔板按照顺序放入purifier
tm ht
自动化仪器。
[0148]
实施例9高通量抗体表达与验证
[0149]
将配对的重链与轻链基因表达载体用pei转染试剂在48孔细胞培养板中共同导入0.5ml293f或cho宿主细胞，转染24小时后加入补料，并在37℃，200rpm，5％co2培养箱中培养72-96小时收集细胞上清。
[0150]
elisa检测：
[0151]
1、包被：准备elisa板(costar)，用包被缓冲液稀释抗原，每孔加入100μl抗原稀释液。4℃过夜。
[0152]
2、封闭：使用洗板机(pbst)洗4次，加入封闭液每孔250μl，37℃孵育2小时。
[0153]
3、加一抗：使用洗板机(pbst)洗4次，加入细胞培养上清，每孔100μl，37℃孵育1小时。
[0154]
4、加二抗：使用洗板机(pbst)洗4次，加入二抗(hrp标记的羊抗羊igg)每孔100μl，37℃孵育1小时。
[0155]
5、显色：使用洗板机(pbst)洗4次，加入tmb显色液每孔100μl。
[0156]
6、终止：室温放置10分钟，加入终止液，每孔50μl。
[0157]
7、酶标仪读数，双波长450-630nm。初步筛选如图4和阻断功能验证如图5。由次可见，我们提供的流式分选和提供的引物对，无论是是rt-pcr扩增的阳性率还是elisa验证的阳性率和全兔源单克隆抗体技术(专利号：202110545707.0)的阳性率相当。
[0158]
实施例10羊免疫球蛋白重链和轻链可变区基因序列分析
[0159]
挑取所有的阳性抗体的质粒对，分别转化大肠杆菌，并涂布lb固定培养基，37℃培养过夜，每个克隆挑取4个菌落于含有300μllb液体培养基的96孔深孔板中，封口膜封好，37℃培养2h，转移150μl菌液于新的96孔深孔板中，封膜，标记清楚，送测。
[0160]
测出的原始序列，用seqman进行序列分析，每个克隆分别输出fasta格式保存。抗体序列v区基因分析。用imgt数据库(http://www.imgt.org/)完成。用imgt/vquest下的“analyse your immunoglobulin(ig)orantibody nucleic acid sequences”功能来完成。可对抗体重链及轻链的v区亚型及identity，cdr1/cdr2/cdr3长度等进行分析，并能确认序列的读码框及序列翻译是否有功能。根据数据库分析的结果，挑取与数据库v区基因相似度最高的序列作为最终的序列。通过进化树分别对44个抗体的vh和vl基因进行分析，根据遗传距离可以看出这些序列都是unique，其中有3个轻链是kappa链，也证实羊的抗体以lambda轻链为主的抗体构型，如图6。
[0161]
实施例11高通量质粒制备：
[0162]
将分析得到的单克隆抗体的菌液接菌至含5mllb液体培养基的24孔板中，37℃培养过夜，离心收集菌体，向24孔深孔板中加上300μlp1缓冲液，悬浮细菌，再加入300μl的p2缓冲液，轻柔晃动8次，直至透明，整个过程不超过5min，再加入300μl p3缓冲液，放置水平离心机4000rpm离心30min，转移720μl的上清至24孔深孔板中，再加入720μl的异丙醇，再加入300μl dna纯化磁珠。第2块和第3块24孔深孔板加入2000μl的80％乙醇，第4块板加入300μl的超纯水，并做好标记。在样品板中放上磁力套，把24孔深孔板按照顺序放入purifier
tm ht自动化仪器。
[0163]
实施例12高通量抗体制备
[0164]
将配对的重链与轻链单克隆抗体质粒在24孔深孔细胞培养板中导入5ml293f或cho宿主细胞进行批量表达，转染24小时后加入补料和双抗，并在37℃，200rpm，5％co2培养箱中培养5d，收集细胞上清，离心弃去细胞碎片，转移上清至新的24孔深孔板中，加入100μl的protein a磁珠。在第2块和第3块24孔深孔板加入3ml的pbs缓冲液，第4和5块板中加入ph 2.5的柠檬酸缓冲液，运行purifier
tm ht的24孔纯化仪器，立即用1mol/l ph 8.5tris-hcl缓冲液中和。取样在紫外分光光度计上测od
260
、od
280
，计算蛋白质含量，然后置于4℃保存。
[0165]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。