1.本发明属于蛋白提取方法，特别属于体外下拉实验(pull-down)、凝胶阻滞实验(emsa)、等温滴定(itc)实验的蛋白提取方法。


背景技术：

2.蛋白质是生物功能最直接的执行者，虽然一些蛋白质可以独立的完成他的使命，但是大部分的蛋白都是需要一些伴侣分子的协助一起完成任务或者形成复合物之后才能充分发挥他的功能。了解蛋白质与蛋白质之间的相互作用，能够帮助我们更好的了解细胞的生命活性，揭示隐藏在表象下的调控机理。经典的蛋白相互作分析研究实验包括pull-down，emsa、itc，这些试验通过蛋白相互作用来研究细胞通路。但这些实验在蛋白提取过程中存在着杂蛋白过多、提取的蛋白浓度低，只有1-2mg/ml。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是提供一种用于体外实验的提取蛋白浓度高，不小于30mg/ml的方法。
4.本发明解决技术问题的技术方案是：一种用于体外实验的蛋白提取方法，依次包括以下步骤：a)融合8his-mbp标签的蛋白表达载体的构建步骤；b)rossta菌株热激转化步骤；c)rosseta表达菌株培养、表达蛋白步骤；d)提取蛋白步骤；
5.所述的a)融合8his-mbp标签的蛋白表达载体的构建步骤：
6.在snapgene软件上构建目的蛋白表达载体的质粒图谱，设计并合成引物，pcr扩增目的蛋白的蛋白编码序列，酚氯仿抽提纯化pcr产物，酶切、连接到含有8his-mbp标签的载体上，大肠杆菌热激转化，菌落pcr，质粒抽取、酶切、鉴定、测序；得到融合8his-mbp标签的蛋白表达载体；
7.所述的；b)rossta菌株热激转化步骤为：
8.转化方法同cn202110243351.5(一种定点突变的水稻隐色素及其构建方法)
9.所述的c)rosseta表达菌株培养、表达蛋白步骤：
10.取步骤b涂平板获得的目的蛋白表达菌株中的单克隆接入含有卡那霉素抗生素的lb液体培养基的试管中，37℃220rpm培养4h-6h；再摇菌液转接到含有卡那霉素抗生素的lb培养基的容器中，37℃220rpm培养6h-8h；测量培养菌液od值，od值＝0.9-1时即可按2000：1的比例加入1m的iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)，16℃220rpm培养16-20h；
11.所述的d)提取蛋白步骤：
12.d1)收菌步骤：诱导表达结束后，4℃，4000rpm，离心15min，收集菌体；
13.d2)破碎步骤：加入适量的100mmnaci，50mm tris(ph＝7.4)的混合溶剂1于菌体中，形成菌液，将菌液置于超声破碎仪中，工作1s，间歇2s，破碎30min，得到破碎液；
14.所述的混合溶剂1中100mmnaci、50mm tris(ph＝7.4)是按照5m nacl、1m tris(ph＝7.4)体积比为2：5配制的；
15.d3)离心步骤：将破碎液于4℃，10000rpm，15min高速离心，得到离心上清；
16.d4)结合步骤：将离心上清加入镍珠(his珠)，混匀；4℃于旋转仪器中孵育2-24小时，使上清与镍珠充分结合，800rpm离心2min，弃上清保留镍珠，离心上清、镍珠的体积比为10：2-2.5；
17.d5)洗脱步骤：结合结束，先用少量混合溶剂1清洗镍珠，然后加入适量混合溶剂2进行洗脱，分2次收集洗脱液，第1个洗脱半程得到蛋白洗脱液1，第2次洗脱半程得到蛋白洗脱液2，所述的混合溶剂2中1m tris(ph＝8.0)、5m nacl、咪唑的摩尔比为1：3：5，咪唑现用现加；
18.d6)层析步骤：将收集的蛋白洗脱液1、蛋白洗脱液2分别转移到层析过滤管，收集层析后的蛋白，得到层析蛋白1、层析蛋白2；
19.d7)第1次浓缩步骤：将层析蛋白1、层析蛋白2；加入超滤离心管中，4℃，5000rpm，浓缩至原体积的3.3-7.1％，浓缩管浓缩过程可将小于30kd的蛋白去除，得到浓缩蛋白1、浓缩蛋白2；
20.d8)过分子筛步骤：先用超纯水将泵头、分子筛柱、上样环冲洗干净，再用蛋白质缓冲液清洗分子筛柱，用注射器将浓缩蛋白1、2通过上样孔注射上样，过分子筛时分子量大的蛋白先从出样孔中流出，分子量小的蛋白后流出，根据电脑工作站中蛋白吸收峰的出峰时间，用离心管分别收集各个峰对应的蛋白并做标记，将已经标记的蛋白取样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色、考马斯亮蓝洗脱液脱色，根据蛋白质的mark值，确定目的蛋白对应收集管，将蛋白对应收集管中的蛋白液倒入超滤离心管中，4℃，5000rpm，浓缩至原体积的1-4％，得到浓缩蛋白21、浓缩蛋白22。
21.所述的蛋白质缓冲液中，每500ml溶液中含有1m tris(ph＝8)25ml、5m nacl 15ml，其余为超纯水。
22.本发明的步骤a融合8his-mbp标签的蛋白表达载体的构建的过程中：在构建蛋白表达载体过程中融合8his-mbp标签，方便后续实验被检测，并且当his抗体效价不高的时候还可以使用mbp抗体检测。
23.一般适用于体外下拉实验(pull-dwon)的蛋白的浓度只有1-2mg/ml，但在研究蛋白作用时还要进行其他相关实验，例如等温滴定(itc)、凝胶阻滞(emsa)实验对蛋白浓度要求高，本发明删除洗涤缓冲液洗五次的步骤，减少洗涤过程中的蛋白损耗，并在粗蛋白提取完成后，将蛋白过一次层析柱，滤过蛋白洗脱液中存在的少量镍珠(his珠)，层析过滤是为了减少分子筛过柱堵塞，层析过滤后，使用浓缩管将洗脱的蛋白浓缩处理，以达到一个浓度相对较高的状态，再将浓缩后的蛋白液过分子筛，去除破碎过程中的杂蛋白和断裂的蛋白，将过完分子筛收集的蛋白再次过浓缩管进行浓缩，达到高纯度高浓度的目的，最终实现提一次蛋白可以进行多种实验的目的。
24.本发明与现有技术相比，所得蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、考马斯亮蓝染色、再脱色后观察，杂蛋白和断裂的蛋白明显的减少，蛋白的浓度达到32-68mg/ml。
附图说明
25.图1实施例1所制的浓缩蛋白；
26.如图1所示：1为实施例1所制的浓缩蛋白21、2为实施例1所制的浓缩蛋白22；
27.图2为实施例3所制的洗脱蛋白；
28.如图2所示：3为实施例3所制的洗脱蛋白31、4为实施例3所制的洗脱蛋白32；
具体实施方式
29.下面通过实例对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
30.实施例1
31.一种用于体外实验的蛋白提取方法，依次包括以下步骤：a)融合8his-mbp标签的蛋白表达载体的构建步骤；b)rossta菌株热激转化步骤；c)rosseta表达菌株培养、表达蛋白步骤；d)提取蛋白步骤；
32.所述的a)融合8his-mbp标签的蛋白表达载体的构建步骤：
33.在snapgene软件上构建目的蛋白表达载体的质粒图谱，设计并合成引物，pcr扩增目的蛋白的蛋白编码序列,酚氯仿抽提纯化pcr产物,酶切、连接到含有8his-mbp标签的载体上，大肠杆菌热激转化，菌落pcr，质粒抽取、酶切、鉴定、测序；得到融合8his-mbp标签的蛋白表达载体；
34.所述的；b)rossta菌株热激转化步骤为：
35.转化方法同cn202110243351.5(一种定点突变的水稻隐色素及其构建方法)
36.所述的c)rosseta表达菌株培养、表达蛋白步骤：
37.取步骤b涂平板获得的目的蛋白表达菌株中的单克隆接入含有卡那霉素抗生素的lb液体培养基的试管中，37℃220rpm培养4h-6h；再将菌液转接到含有卡那霉素抗生素的lb液体培养基的容器中，37℃220rpm培养6h；测量培养菌液od值，od值＝0.9时即可按1:2000的比例加入1m的iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)，16℃220rpm培养20h；
38.所述的d)提取蛋白步骤:
39.d1)收菌步骤：诱导表达结束后，4℃，4000rpm，离心15min，收集菌体，得到菌体12g；
40.d2)破碎步骤：加入15ml的100mmnaci，50mm tris(ph＝7.4)的混合溶剂1于菌体中，形成菌液，将菌液置于超声破碎仪中，135w35％功率，工作1s，间歇2s，破碎30min，得到破碎液；所述的混合溶剂1中100mmnaci、50mm tris(ph＝7.4)是按照5m nacl、1m tris(ph＝7.4)体积比为2：5配制的；
41.d3)离心步骤：将破碎液于4℃，10000rpm，15min高速离心，得到离心上清；
42.d4)结合步骤：将离心上清加入镍珠(his珠)，混匀；4℃于旋转仪器中孵育2小时，使上清与镍珠充分结合，800rpm离心2min，弃上清保留镍珠，离心上清、镍珠的体积比为10：2；
43.d5)洗脱步骤：结合结束，先用2ml混合溶剂1清洗镍珠，然后加入14ml混合溶剂2进行洗脱，分2次收集洗脱液，第1个洗脱半程得到蛋白洗脱液1，第2次洗脱半程得到蛋白洗脱液2，所述的混合溶剂2中1m tris(ph＝8.0)、5m nacl、咪唑的摩尔比为1：3：5，咪唑现用现加；
44.d6)层析步骤：将收集的蛋白洗脱液1、蛋白洗脱液2分别转移到层析过滤管，收集层析后的蛋白；得到层析蛋白1、层析蛋白2；
45.d7)第1次浓缩步骤：将层析蛋白1、层析蛋白2；加入超滤离心管中，4℃，5000rpm，
浓缩至原体积的3.3％，浓缩管浓缩过程可将小于30kd的蛋白去除，得到浓缩蛋白1、浓缩蛋白2；
46.d8)过分子筛步骤：先用超纯水将泵头、分子筛柱、上样环冲洗干净，再用蛋白质缓冲液清洗分子筛柱，用注射器将浓缩蛋白1、2通过上样孔注射上样，过分子筛时分子量大的蛋白先从出样孔中流出，分子量小的蛋白后流出，根据电脑工作站中蛋白吸收峰的出峰时间，用离心管分别收集各个峰对应的蛋白并做标记，将已经标记的蛋白取样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色、考马斯亮蓝洗脱液脱色，根据蛋白质的mark值，确定目的蛋白对应收集管，将蛋白对应收集管中的蛋白液倒入超滤离心管中，4℃，5000rpm，浓缩至原体积的1％，得到浓缩蛋白21、浓缩蛋白22。
47.所述的蛋白质缓冲液中，每500ml溶液中含有1m tris(ph＝8)25ml、5m nacl 15ml，其余为超纯水。
48.表1所示的是实施例1中的获得的浓缩蛋白21、浓缩蛋白22。使用分光光度计在280nm和260nm时所测得的吸光值和浓度
49.表1
50.样品260abs(nm)280abs(nm)浓度(mg/ml)浓缩蛋白2146.39846.06768.64浓缩蛋白2222.79421.86332.58
51.实施例2
52.一种用于体外实验的蛋白提取方法，依次包括以下步骤：a)融合8his-mbp标签的蛋白表达载体的构建步骤；b)rossta菌株热激转化步骤；c)rosseta表达菌株培养、表达蛋白步骤；d)提取蛋白步骤；
53.所述的a)融合8his-mbp标签的蛋白表达载体的构建步骤：
54.在snapgene软件上构建目的蛋白表达载体的质粒图谱，设计并合成引物，pcr扩增目的蛋白的蛋白编码序列，酚氯仿抽提纯化pcr产物，酶切、连接到含有8his-mbp标签的载体上，大肠杆菌热激转化，菌落pcr，质粒抽取、酶切、鉴定、测序；得到融合8his-mbp标签的蛋白表达载体；
55.所述的；b)rossta菌株热激转化步骤为：
56.转化方法同cn202110243351.5(一种定点突变的水稻隐色素及其构建方法)
57.所述的c)rosseta表达菌株培养、表达蛋白步骤：
58.取步骤b涂平板获得的目的蛋白表达菌株中的单克隆接入含有卡那霉素抗生素的lb液体培养基的试管中，37℃220rpm培养4h-6h；再摇菌液转接到含有卡那霉素抗生素的lb培养基的容器中，37℃220rpm培养8h；测量培养菌液od值，od值＝1时即可按1:2000的比例加入1m的iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)，16℃220rpm培养20h；
59.所述的d)提取蛋白步骤：
60.d1)收菌步骤：诱导表达结束后，4℃，4000rpm，离心15min，收集菌体，得到菌体12g；
61.d2)破碎步骤：加入15的100mmnaci，50mm tris(ph＝7.4)的混合溶剂1于菌体中，形成菌液，将菌液置于超声破碎仪中，135w 35％功率，工作1s，间歇2s，破碎30min，得到破碎液；所述的混合溶剂1中100mmnaci、50mm tris(ph＝7.4)是按照5m nacl、1m tris(ph＝
7.4)体积比为2：5配制的；
62.d3)离心步骤：将破碎液于4℃，10000rpm，15min高速离心，得到离心上清；
63.d4)结合步骤：将离心上清加入镍珠(his珠)，混匀；4℃于旋转仪器中孵育24小时，使上清与镍珠充分结合，800rpm离心2min，弃上清保留镍珠，离心上清、镍珠的体积比为10：2.5；
64.d5)洗脱步骤：结合结束，先用2ml混合溶剂1清洗镍珠，然后加入15ml混合溶剂2进行洗脱，分2次收集洗脱液，第1个洗脱半程得到蛋白洗脱液1，第2次洗脱半程得到蛋白洗脱液2，所述的混合溶剂2中1m tris(ph＝8.0)、5m nacl、咪唑的摩尔比为1：3：5，咪唑现用现加；
65.d6)层析步骤：将收集的蛋白洗脱液1、蛋白洗脱液2分别转移到层析过滤管，收集层析后的蛋白；得到层析蛋白1、层析蛋白2；
66.d7)第1次浓缩步骤：将层析蛋白1、层析蛋白2；加入超滤离心管中，4℃，5000rpm，浓缩至原体积的7.1％，浓缩管浓缩过程可将小于30kd的蛋白去除，得到浓缩蛋白1、浓缩蛋白2；
67.d8)过分子筛步骤：先用超纯水将泵头、分子筛柱、上样环冲洗干净，再用蛋白质缓冲液清洗分子筛柱，用注射器将浓缩蛋白1、2通过上样孔注射上样，过分子筛时分子量大的蛋白先从出样孔中流出，分子量小的蛋白后流出，根据电脑工作站中蛋白吸收峰的出峰时间，用离心管分别收集各个峰对应的蛋白并做标记，将已经标记的蛋白取样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色、考马斯亮蓝洗脱液脱色，根据蛋白质的mark值，确定目的蛋白对应收集管，将蛋白对应收集管中的蛋白液倒入超滤离心管中，4℃，5000rpm，浓缩至原体积的4％，得到浓缩蛋白21、浓缩蛋白22。
68.所述的蛋白质缓冲液中，每500ml溶液中含有1m tris(ph＝8)25ml、5m nacl 15ml，其余为超纯水。
69.实施例3：(对比例)
70.除所述的d)提取蛋白步骤；外其余与实施例1相同。
71.所述的d)提取蛋白步骤为：
72.d1)收菌步骤：诱导表达结束后，4℃，4000rpm，离心15min，收集菌体，得到菌体12g；
73.d2)破碎步骤：加入15ml的100mmnaci，50mm tris(ph＝7.4)的混合溶剂1于菌体中，形成菌液，将菌液置于超声破碎仪中，135w35％功率，工作1s，间歇2s，破碎30min，得到破碎液；所述的混合溶剂1中100mmnaci、50mm tris(ph＝7.4)是按照5m nacl、1m tris(ph＝7.4)体积比为2：5配制的；
74.d3)离心步骤：将破碎液于4℃，10000rpm，15min高速离心，得到离心上清；
75.d4)结合步骤：将离心上清加入镍珠(his珠)，混匀；4℃于旋转仪器中孵育24h小时，使上清与镍珠充分结合，800rpm离心2min，弃上清保留镍珠，离心上清、镍珠的体积比为10：2；
76.d5)洗脱步骤：
77.d51)用2ml混合溶剂1清洗结合镍珠；
78.d52)加入2ml的混合溶剂3，在4℃下进行旋转孵育2min，800rpm离心1min，保留结
合镍珠，弃上清，重复此步骤5次；
79.d53)加入14ml混合溶剂2洗脱镍珠，分2次收集洗脱液，第1个洗脱半程得到蛋白洗脱液31，第2次洗脱半程得到蛋白洗脱液32，
80.所述的混合溶剂2中1m tris(ph＝8.0)、5m nacl、咪唑的摩尔比为1：3：5；
81.所述的混合溶剂3中1m tris(ph＝8.0)、5m nacl、咪唑的摩尔比为5：20：1。
82.表2所示的是实施例3中的获得的洗脱蛋白31、洗脱蛋白32使用分光光度计在280nm和260nm时所测得的吸光值和浓度。
83.表2
84.样品260abs(nm)280abs(nm)浓度(mg/ml)洗脱蛋白312.4112.1303.174洗脱蛋白322.5021.1891.772
85.如图2所示25-70kd的蛋白条带包含了目的蛋白和翻译过程中断裂的蛋白以及其他杂蛋白，图2与图1对应泳道比较，25-50kd之间的蛋白条带均为杂蛋白和断裂蛋白，杂蛋白条带明显较多。