1.本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一种普卡那肽的制备及纯化方法。


背景技术：

2.普卡那肽是一种鸟苷酸环化酶c（gc-c）受体激动剂，效应与利尿钠肽尿鸟苷素相似，可诱导液体分泌进入胃肠道，从而增加胃肠动力，从而治疗便秘，并获得美国食品和药物监督管理局（fda）的批准上市。普卡那肽为含有两对二硫键的十六肽，其肽序如下：h-asn
1-asp
2-glu
3-cys
4-glu
5-leu
6-cys
7-val
8-asn
9-val
10-ala
11-cys
12-thr
13-gly
14-cys
15-leu
16-oh，肽链中的二硫键连接方式为cys4-cys12，cys7-cys15。
3.普卡那肽制备中，通常由树脂固相载体和fmoc-leu-oh偶联得到fmoc-leu-树脂，通过固相合成法，按照普卡那肽主链肽顺序依次偶联具有n端fmoc保护且侧链保护的氨基酸，按照普卡那肽主链肽序依次进行氨基酸的偶联，合成完毕之后进行裂解，在水溶液或者dmso溶液中进行液相环化，最后纯化，冻干后得到普卡那肽；但是在高氧化能力下，二硫键错配程度高，导致最终纯化困难。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种收率高、纯化效果好的普卡那肽的制备及纯化方法。
5.本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种普卡那肽的制备方法，包括：通过半胱氨酸与二苯基乙醛反应后生成半胱氨酸衍生物，然后向半胱氨酸衍生物中引入保护基团得到fmoc-半胱氨酸衍生物；将首批氨基酸类试剂活化后，首先将fmoc-leu-oh试剂与wang树脂偶联，然后按普卡那肽的氨基酸顺序依次偶联9种氨基酸类试剂得到十肽树脂；首批氨基酸类试剂中含有fmoc-半胱氨酸衍生物；采用初环氧化试剂对十肽树脂处理得到初环十肽树脂；将初环十肽树脂与次批活化的氨基酸类试剂按普卡那肽的氨基酸顺序依次偶联得到单环普卡那肽-wang树脂，经切割试剂处理，得到单环普卡那肽；采用双环氧化试剂对单环普卡那肽处理及纯化得到普卡那肽。普卡那肽制备中存在着二硫键错配问题，本发明通过半胱氨酸与二苯基乙醛反应后制备半胱氨酸衍生物，然后再与fmoc-osu反应引入保护基团，然后将fmoc-(r)cys-oh与其他氨基酸类试剂分别活化后，通过树脂偶联合成普卡那肽，本方法先合成十肽树脂，并且其中使用fmoc-(r)cys-oh，fmoc-(r)cys-oh于十肽树脂中首次fmoc-cys(mmt)-oh使用后使用，在十肽树脂中最后一个fmoc-cys(mmt)-oh偶联后，经处理后采用氧化试剂形成二硫键，最后再偶联其余氨基酸类试剂，再氧化制备得到普卡那肽，本发明中fmoc-(r)cys-oh的使用，对肽的合成中可以阻止肽链中氢键的缔合，使反应位点暴露出来，提高普卡那肽的收率，并且采用分段氧化，可以避免二硫键的错配，同样有助于普卡那肽收率的提高。
6.优选地，首批氨基酸类试剂的偶联中fmoc-半胱氨酸衍生物的使用次序为第五。
7.优选地，首批氨基酸类试剂分别为fmoc-leu-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(
t
bu)-oh、fmoc-(r)cys-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(mmt)-oh。
8.优选地，初环氧化试剂为双氧水。
9.优选地，次批活化的氨基酸类试剂分别为fmoc-leu-oh、fmoc-glu(o
t
bu)-oh、fmoc-cys(mmt)-oh、fmoc-asp(o
t
bu)-oh、fmoc-asn(trt)-oh。
10.优选地，切割试剂为tfa、tis、edt和水的混合液。
11.优选地，双环氧化试剂为i2。
12.优选地，半胱氨酸衍生物制备中，将半胱氨酸与二苯基乙醛加入混合溶剂中，加入醋酸钠，搅拌混合，在20-40℃的温度下反应6-24 h，反应完成后，过滤，洗涤，干燥，得到半胱氨酸衍生物。
13.更优选地，混合溶剂为去离子水和dmf的混合液，混合溶剂中去离子水的使用量为dmf的80-120 wt%。
14.更优选地，半胱氨酸的使用量为混合溶剂的3-9 wt%。
15.更优选地，二苯基乙醛的使用量为半胱氨酸摩尔量的100-160%。
16.更优选地，醋酸钠的使用量为混合溶剂的1-5 wt%。
17.优选地，fmoc-半胱氨酸衍生物（以下用fmoc-(r)cys-oh代替）的制备中，将半胱氨酸衍生物配制成半胱氨酸衍生物溶液，加入fmoc-osu，在冰水浴中，滴加入diea，滴加完成后，在20-40℃的温度下反应3-9 h，反应完成后，加入去离子水洗涤，分离有机相后旋干溶剂，乙醚洗涤，干燥，得到fmoc-(r)cys-oh。
18.更优选地，半胱氨酸衍生物溶液由半胱氨酸衍生物加入dmf中得到，半胱氨酸衍生物溶液中含有2-8 wt%的半胱氨酸衍生物。
19.更优选地，fmoc-osu的使用量为半胱氨酸衍生物的150-300 wt%。
20.更优选地，diea的使用量为半胱氨酸衍生物溶液的1-4 wt%。
21.优选地，首批氨基酸类试剂的活化处理中，将氨基酸类试剂加入活化溶液中，冰浴下活化5-30 min。活化溶液中含有hobt、dic和dmf，活化溶液中hobt的含量为3-6 wt%，活化溶液中dic的含量为2-5 wt%，氨基酸类试剂的使用量为活化溶液的20-40 wt%。
22.更优选地，首批氨基酸类试剂分别为fmoc-leu-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(
t
bu)-oh、fmoc-(r)cys-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(mmt)-oh。
23.优选地，fmoc-leu-wang树脂的制备中，氮气氛围下，将wang树脂于预处理液中溶胀处理10-60 min，抽干后依次采用dmf和二氯甲烷洗涤，将预处理后的wang树脂转移至反应柱中，加入活化后的fmoc-leu-oh试剂，在20-40℃的温度下充氮气反应2-6 h，反应完成后抽干溶液，依次采用dmf和二氯甲烷洗涤，抽干后得到fmoc-leu-wang树脂。
24.更优选地，预处理液为二氯甲烷溶液，活化后的fmoc-leu-oh试剂的使用量为wang树脂的180-320 wt%。
25.优选地，普卡那肽中间体十肽-wang树脂的制备中，氮气氛围下，向fmoc-leu-wang树脂的反应柱中加入dmf溶胀10-60 min，抽干后进行脱fmoc保护处理，然后加入活化后的氨基酸类试剂进行偶联处理2-8 h，重复脱fmoc保护处理和偶联处理，直至得到普卡那肽中间体十肽-wang树脂（简称十肽树脂）。
26.更优选地，氨基酸类试剂按次序依次为fmoc-cys(mmt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(
t
bu)-oh、fmoc-(r)cys-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-cys(mmt)-oh。
27.更优选地，以首个fmoc-leu-oh摩尔量作基准计量，活化后的氨基酸类试剂的使用量为首个fmoc-leu-oh摩尔量的100-150%。
28.优选地，脱fmoc保护处理中，向待脱fmoc保护的样品中加入脱fmoc保护试剂，脱除10-30 min后，抽干脱fmoc保护试剂，依次采用dmf和二氯甲烷洗涤，抽干。
29.更优选地，以wang树脂的量作基准计量，脱fmoc保护试剂为dblk溶液，dblk溶液为哌啶加入dmf中混合得到，dblk溶液中哌啶的含量为15-25 wt%，脱fmoc保护试剂的使用量为wang树脂的200-500 wt%。
30.优选地，偶联处理中，氨基酸类试剂偶联反应完成后，需依次采用dmf和二氯甲烷洗涤，抽干。
31.优选地，十肽树脂的环化中，氮气氛围下，向十肽树脂的反应柱中加入脱fmoc保护试剂进行脱fmoc保护处理，然后加入脱mmt保护试剂进行脱mmt保护处理0.5-3 h，加入初环氧化试剂反应1-5 h，抽干后，依次采用dmf和二氯甲烷洗涤，抽干得到初环十肽树脂。
32.更优选地，脱mmt保护试剂为tfa、tis、dcm的混合液。
33.更优选地，脱mmt保护试剂中tfa的含量为1-5 wt%，脱mmt保护试剂中tis的含量为2-8 wt%。
34.更优选地，脱mmt保护试剂的使用量为十肽树脂的200-500 wt%。
35.更优选地，初环氧化试剂为双氧水，初环氧化试剂的使用量为十肽树脂的10-30 wt%。
36.优选地，次批氨基酸类试剂的活化处理中，将氨基酸类试剂加入活化溶液中，冰浴下活化20 min。
37.更优选地，活化溶液中含有hobt、dic和dmf。
38.更优选地，活化溶液中hobt的含量为5 wt%，活化溶液中dic的含量为3 wt%，氨基酸类试剂的使用量为活化溶液的30 wt%。
39.更优选地，次批活化的氨基酸类试剂分别为fmoc-leu-oh、fmoc-glu(o
t
bu)-oh、fmoc-cys(mmt)-oh、fmoc-asp(o
t
bu)-oh、fmoc-asn(trt)-oh。
40.更优选地，次批氨基酸类试剂的活化处理中可以加入环己烷羧酸异丙酯和4-甲基苯乙醚，环己烷羧酸异丙酯的使用量为活化溶液的0.2-0.8 wt%，4-甲基苯乙醚的使用量为活化溶液的0.1-0.5 wt%。在活化试剂中加入环己烷羧酸异丙酯和4-甲基苯乙醚后，可以与多肽中的(r)cys基团具有特异性作用，可以降低长链多肽序列的缩聚，提高普卡那肽的收率。
41.优选地，单环普卡那肽的制备中，氮气氛围下，向初环十肽树脂的反应柱中加入活化后的氨基酸类试剂进行偶联处理2-8 h，重复脱fmoc保护处理和偶联处理，得到单环普卡那肽-wang树脂，加入切割试剂处理0.5-3 h，砂芯漏斗过滤，滤液浓缩，加入冷无水乙醚沉淀，离心，去上清液后的沉淀经冷无水乙醚洗涤，干燥，得到单环普卡那肽。
42.更优选地，以首个fmoc-leu-oh摩尔量作基准计量，活化后的氨基酸类试剂的使用量为首个fmoc-leu-oh摩尔量的100-150%。
43.更优选地，切割试剂为tfa、tis、edt和水的混合液。
44.更优选地，切割试剂中tis的含量为4-11 wt%，切割试剂中edt的含量为1-4 wt%，切割试剂中水的含量为2-7 wt%。
45.更优选地，切割试剂的使用量为单环普卡那肽-wang树脂的600-1000 wt%。
46.更优选地，氨基酸类试剂按次序依次为fmoc-leu-oh、fmoc-glu(o
t
bu)-oh、fmoc-cys(mmt)-oh、fmoc-glu(o
t
bu)-oh、fmoc-asp(o
t
bu)-oh、fmoc-asn(trt)-oh。
47.优选地，普卡那肽的制备：氮气氛围下，将单环普卡那肽加入醋酸铵溶液中混合得到单环普卡那肽溶液，向单环普卡那肽溶液中加入双环氧化试剂反应1-5 h，得到普卡那肽粗液，经rphplc纯化得到普卡那肽。
48.更优选地，醋酸铵溶液中含有0.06-0.18 wt%的醋酸铵。
49.更优选地，单环普卡那肽的使用量为醋酸铵溶液的10-30 wt%。
50.更优选地，双环氧化试剂为i2，双环氧化试剂的使用量为单环普卡那肽溶液的0.8-6 wt%。
51.本发明公开了半胱氨酸衍生物，包括：通过半胱氨酸与二苯基乙醛反应后生成半胱氨酸衍生物。
52.本发明公开了上述半胱氨酸衍生物引入保护基团得到的fmoc-半胱氨酸衍生物。
53.本发明公开了半胱氨酸衍生物在制备普卡那肽中的用途。
54.本发明由于采用了半胱氨酸与二苯基乙醛反应生成半胱氨酸衍生物，然后将半胱氨酸衍生物与fmoc-osu反应得到fmoc-(r)cys-oh，通过将上述fmoc-(r)cys-oh用于制备普卡那肽，并成功制得普卡那肽，本发明对氨基酸类试剂活化中加入环己烷羧酸异丙酯和4-甲基苯乙醚后，可以提高普卡那肽的收率。因此，本发明是一种收率高、纯化效果好的普卡那肽的制备及纯化方法。
附图说明
55.图1为半胱氨酸衍生物红外光谱图；图2为fmoc-(r)cys-oh红外光谱图；图3为fmoc-(r)cys-gly-oh红外光谱图；图4为普卡那肽hplc图；图5为普卡那肽收率图。
具体实施方式
56.以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：实施例1：一种普卡那肽的制备及纯化方法，半胱氨酸衍生物制备：将半胱氨酸与二苯基乙醛加入混合溶剂中，加入醋酸钠，搅拌混合，在30℃的温度下反应12 h，反应完成后，过滤，洗涤，干燥，得到半胱氨酸衍生物。混合溶剂为去离子水和dmf的混合液，混合溶剂中去离子水的使用量为dmf的100 wt%，半胱氨酸的使用量为混合溶剂的6 wt%，二苯基乙醛的使用量为半胱氨酸摩尔量的120%，醋酸钠的使用量为混合溶剂的3 wt%。
57.fmoc-(r)cys-oh的制备：将半胱氨酸衍生物配制成半胱氨酸衍生物溶液，加入fmoc-osu，在冰水浴中，滴加入diea，滴加完成后，在30℃的温度下反应6 h，反应完成后，加入去离子水洗涤，分离有机相后旋干溶剂，乙醚洗涤，干燥，得到fmoc-(r)cys-oh。半胱氨酸衍生物溶液由半胱氨酸衍生物加入dmf中得到，半胱氨酸衍生物溶液中含有6 wt%的半胱氨酸衍生物，fmoc-osu的使用量为半胱氨酸衍生物的200 wt%，diea的使用量为半胱氨酸衍生物溶液的3 wt%。
58.首批氨基酸类试剂的活化处理：将氨基酸类试剂加入活化溶液中，冰浴下活化20 min。活化溶液中含有hobt、dic和dmf，活化溶液中hobt的含量为5 wt%，活化溶液中dic的含量为3 wt%，氨基酸类试剂的使用量为活化溶液的30 wt%。首批氨基酸类试剂分别为fmoc-leu-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(
t
bu)-oh、fmoc-(r)cys-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(mmt)-oh。
59.fmoc-leu-wang树脂的制备：氮气氛围下，将wang树脂于预处理液中溶胀处理30 min，抽干后依次采用dmf和二氯甲烷洗涤，将预处理后的wang树脂转移至反应柱中，加入活化后的fmoc-leu-oh试剂，在30℃的温度下充氮气反应4 h，反应完成后抽干溶液，依次采用dmf和二氯甲烷洗涤，抽干后得到fmoc-leu-wang树脂。预处理液为二氯甲烷溶液，活化后的fmoc-leu-oh试剂的使用量为wang树脂的240 wt%。
60.普卡那肽中间体十肽-wang树脂的制备：氮气氛围下，向fmoc-leu-wang树脂的反应柱中加入dmf溶胀30 min，抽干后进行脱fmoc保护处理，然后加入活化后的氨基酸类试剂进行偶联处理6 h，重复脱fmoc保护处理和偶联处理，直至得到普卡那肽中间体十肽-wang树脂（简称十肽树脂）。氨基酸类试剂按次序依次为fmoc-cys(mmt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(
t
bu)-oh、fmoc-(r)cys-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-cys(mmt)-oh。以首个fmoc-leu-oh摩尔量作基准计量，活化后的氨基酸类试剂的使用量为首个fmoc-leu-oh摩尔量的120%。
61.脱fmoc保护处理：向待脱fmoc保护的样品中加入脱fmoc保护试剂，脱除20 min后，抽干脱fmoc保护试剂，依次采用dmf和二氯甲烷洗涤，抽干。以wang树脂的量作基准计量，脱fmoc保护试剂为dblk溶液，dblk溶液为哌啶加入dmf中混合得到，dblk溶液中哌啶的含量为20 wt%，脱fmoc保护试剂的使用量为wang树脂的400 wt%。
62.偶联处理中，氨基酸类试剂偶联反应完成后，需依次采用dmf和二氯甲烷洗涤，抽干。
63.十肽树脂的环化：氮气氛围下，向十肽树脂的反应柱中加入脱fmoc保护试剂进行脱fmoc保护处理，然后加入脱mmt保护试剂进行脱mmt保护处理2 h，加入初环氧化试剂反应3 h，抽干后，依次采用dmf和二氯甲烷洗涤，抽干得到初环十肽树脂。脱mmt保护试剂为tfa、tis、dcm的混合液，脱mmt保护试剂中tfa的含量为3 wt%，脱mmt保护试剂中tis的含量为5 wt%，脱mmt保护试剂的使用量为十肽树脂的300 wt%，初环氧化试剂为双氧水，初环氧化试剂的使用量为十肽树脂的20 wt%。
64.次批氨基酸类试剂的活化处理：将氨基酸类试剂加入活化溶液中，冰浴下活化20 min。活化溶液中含有hobt、dic和dmf，活化溶液中hobt的含量为5 wt%，活化溶液中dic的含量为3 wt%，氨基酸类试剂的使用量为活化溶液的30 wt%。次批活化的氨基酸类试剂分别为fmoc-leu-oh、fmoc-glu(o
t
bu)-oh、fmoc-cys(mmt)-oh、fmoc-asp(o
t
bu)-oh、fmoc-asn
(trt)-oh。
65.单环普卡那肽的制备：氮气氛围下，向初环十肽树脂的反应柱中加入活化后的氨基酸类试剂进行偶联处理6 h，重复脱fmoc保护处理和偶联处理，得到单环普卡那肽-wang树脂，加入切割试剂处理2 h，砂芯漏斗过滤，滤液浓缩，加入冷无水乙醚沉淀，离心，去上清液后的沉淀经冷无水乙醚洗涤，干燥，得到单环普卡那肽。以首个fmoc-leu-oh摩尔量作基准计量，活化后的氨基酸类试剂的使用量为首个fmoc-leu-oh摩尔量的120%，切割试剂为tfa、tis、edt和水的混合液，切割试剂中tis的含量为8 wt%，切割试剂中edt的含量为3 wt%，切割试剂中水的含量为5 wt%，切割试剂的使用量为单环普卡那肽-wang树脂的800 wt%；氨基酸类试剂按次序依次为fmoc-leu-oh、fmoc-glu(o
t
bu)-oh、fmoc-cys(mmt)-oh、fmoc-glu(o
t
bu)-oh、fmoc-asp(o
t
bu)-oh、fmoc-asn(trt)-oh。
66.普卡那肽的制备：氮气氛围下，将单环普卡那肽加入醋酸铵溶液中混合得到单环普卡那肽溶液，向单环普卡那肽溶液中加入双环氧化试剂反应3 h，经hplc纯化得到普卡那肽。醋酸铵溶液中含有0.12 wt%的醋酸铵，单环普卡那肽的使用量为醋酸铵溶液的20 wt%，双环氧化试剂为i2，双环氧化试剂的使用量为单环普卡那肽溶液的4.2 wt%。
67.rphplc纯化处理：将普卡那肽粗液经过rphplc纯化得到普卡那肽；以反相十八烷基硅烷作为固定相，采用0.1 wt%的三氟乙酸水溶液作为流动相a，采用乙腈作为流动相b，收集目标组分，浓缩冻干。
68.实施例2：一种普卡那肽的制备及纯化方法，半胱氨酸衍生物制备：将半胱氨酸与二苯基乙醛加入混合溶剂中，加入醋酸钠，搅拌混合，在30℃的温度下反应12 h，反应完成后，过滤，洗涤，干燥，得到半胱氨酸衍生物。混合溶剂为去离子水和dmf的混合液，混合溶剂中去离子水的使用量为dmf的100 wt%，半胱氨酸的使用量为混合溶剂的6 wt%，二苯基乙醛的使用量为半胱氨酸摩尔量的120%，醋酸钠的使用量为混合溶剂的3 wt%。
69.fmoc-(r)cys-oh的制备：将半胱氨酸衍生物配制成半胱氨酸衍生物溶液，加入fmoc-osu，在冰水浴中，滴加入diea，滴加完成后，在30℃的温度下反应6 h，反应完成后，加入去离子水洗涤，分离有机相后旋干溶剂，乙醚洗涤，干燥，得到fmoc-(r)cys-oh。半胱氨酸衍生物溶液由半胱氨酸衍生物加入dmf中得到，半胱氨酸衍生物溶液中含有6 wt%的半胱氨酸衍生物，fmoc-osu的使用量为半胱氨酸衍生物的200 wt%，diea的使用量为半胱氨酸衍生物溶液的3 wt%。
70.首批氨基酸类试剂的活化处理：将氨基酸类试剂加入活化溶液中，冰浴下活化20 min。活化溶液中含有hobt、dic和dmf，活化溶液中hobt的含量为5 wt%，活化溶液中dic的含量为3 wt%，氨基酸类试剂的使用量为活化溶液的30 wt%。首批氨基酸类试剂分别为fmoc-leu-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(
t
bu)-oh、fmoc-(r)cys-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(mmt)-oh。
71.fmoc-leu-wang树脂的制备：氮气氛围下，将wang树脂于预处理液中溶胀处理30 min，抽干后依次采用dmf和二氯甲烷洗涤，将预处理后的wang树脂转移至反应柱中，加入活化后的fmoc-leu-oh试剂，在30℃的温度下充氮气反应4 h，反应完成后抽干溶液，依次采用dmf和二氯甲烷洗涤，抽干后得到fmoc-leu-wang树脂。预处理液为二氯甲烷溶液，活化后的
fmoc-leu-oh试剂的使用量为wang树脂的240 wt%。
72.普卡那肽中间体十肽-wang树脂的制备：氮气氛围下，向fmoc-leu-wang树脂的反应柱中加入dmf溶胀30 min，抽干后进行脱fmoc保护处理，然后加入活化后的氨基酸类试剂进行偶联处理6 h，重复脱fmoc保护处理和偶联处理，直至得到普卡那肽中间体十肽-wang树脂（简称十肽树脂）。氨基酸类试剂按次序依次为fmoc-cys(mmt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(
t
bu)-oh、fmoc-(r)cys-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-cys(mmt)-oh。以首个fmoc-leu-oh摩尔量作基准计量，活化后的氨基酸类试剂的使用量为首个fmoc-leu-oh摩尔量的120%。
73.脱fmoc保护处理：向待脱fmoc保护的样品中加入脱fmoc保护试剂，脱除20 min后，抽干脱fmoc保护试剂，依次采用dmf和二氯甲烷洗涤，抽干。以wang树脂的量作基准计量，脱fmoc保护试剂为dblk溶液，dblk溶液为哌啶加入dmf中混合得到，dblk溶液中哌啶的含量为20 wt%，脱fmoc保护试剂的使用量为wang树脂的400 wt%。
74.偶联处理中，氨基酸类试剂偶联反应完成后，需依次采用dmf和二氯甲烷洗涤，抽干。
75.十肽树脂的环化：氮气氛围下，向十肽树脂的反应柱中加入脱fmoc保护试剂进行脱fmoc保护处理，然后加入脱mmt保护试剂进行脱mmt保护处理2 h，加入初环氧化试剂反应3 h，抽干后，依次采用dmf和二氯甲烷洗涤，抽干得到初环十肽树脂。脱mmt保护试剂为tfa、tis、dcm的混合液，脱mmt保护试剂中tfa的含量为3 wt%，脱mmt保护试剂中tis的含量为5 wt%，脱mmt保护试剂的使用量为十肽树脂的300 wt%，初环氧化试剂为双氧水，初环氧化试剂的使用量为十肽树脂的20 wt%。
76.次批氨基酸类试剂的活化处理：将氨基酸类试剂、环己烷羧酸异丙酯和4-甲基苯乙醚加入活化溶液中，冰浴下活化20 min。活化溶液中含有hobt、dic和dmf，活化溶液中hobt的含量为5 wt%，活化溶液中dic的含量为3 wt%，氨基酸类试剂的使用量为活化溶液的30 wt%，环己烷羧酸异丙酯的使用量为活化溶液的0.4 wt%，4-甲基苯乙醚的使用量为活化溶液的0.2 wt%。次批活化的氨基酸类试剂分别为fmoc-leu-oh、fmoc-glu(o
t
bu)-oh、fmoc-cys(mmt)-oh、fmoc-asp(o
t
bu)-oh、fmoc-asn(trt)-oh。
77.单环普卡那肽的制备：氮气氛围下，向初环十肽树脂的反应柱中加入活化后的氨基酸类试剂进行偶联处理6 h，重复脱fmoc保护处理和偶联处理，得到单环普卡那肽-wang树脂，加入切割试剂处理2 h，砂芯漏斗过滤，滤液浓缩，加入冷无水乙醚沉淀，离心，去上清液后的沉淀经冷无水乙醚洗涤，干燥，得到单环普卡那肽。以首个fmoc-leu-oh摩尔量作基准计量，活化后的氨基酸类试剂的使用量为首个fmoc-leu-oh摩尔量的120%，切割试剂为tfa、tis、edt和水的混合液，切割试剂中tis的含量为8 wt%，切割试剂中edt的含量为3 wt%，切割试剂中水的含量为5 wt%，切割试剂的使用量为单环普卡那肽-wang树脂的800 wt%；氨基酸类试剂按次序依次为fmoc-leu-oh、fmoc-glu(o
t
bu)-oh、fmoc-cys(mmt)-oh、fmoc-glu(o
t
bu)-oh、fmoc-asp(o
t
bu)-oh、fmoc-asn(trt)-oh。
78.普卡那肽的制备：氮气氛围下，将单环普卡那肽加入醋酸铵溶液中混合得到单环普卡那肽溶液，向单环普卡那肽溶液中加入双环氧化试剂反应3 h，经hplc纯化得到普卡那肽。醋酸铵溶液中含有0.12 wt%的醋酸铵，单环普卡那肽的使用量为醋酸铵溶液的20 wt%，双环氧化试剂为i2，双环氧化试剂的使用量为单环普卡那肽溶液的4.2 wt%。
79.rphplc纯化处理：将普卡那肽粗液经过rphplc纯化得到普卡那肽；以反相十八烷基硅烷作为固定相，采用0.1 wt%的三氟乙酸水溶液作为流动相a，采用乙腈作为流动相b，收集目标组分，浓缩冻干。
80.实施例3：一种普卡那肽的制备及纯化方法，本实施例与实施例2相比，不同之处仅在于，次批氨基酸类试剂的活化处理中，环己烷羧酸异丙酯的使用量为活化溶液的0.6 wt%，4-甲基苯乙醚的使用量为活化溶液的0.4 wt%。
81.对比例1：本对比例与实施例3相比，不同之处仅在于，次批氨基酸类试剂的活化处理未使用4-甲基苯乙醚。
82.对比例2：本对比例与实施例3相比，不同之处仅在于，次批氨基酸类试剂的活化处理未使用环己烷羧酸异丙酯。
83.对比例3：本对比例与实施例3相比，不同之处仅在于，首批氨基酸类试剂的活化处理中，将fmoc-(r)cys-oh替换成fmoc-cys(mmt)-oh。
84.对比例4：本对比例与实施例3相比，不同之处仅在于，首批氨基酸类试剂的活化处理中，将fmoc-(r)cys-oh替换成fmoc-cys(mmt)-oh；次批氨基酸类试剂的活化处理未使用环己烷羧酸异丙酯和4-甲基苯乙醚。
85.对比例5：本对比例与实施例3相比，不同之处仅在于，首批氨基酸类试剂的活化处理中，将fmoc-(r)cys-oh替换成fmoc-cys(mmt)-oh；次批氨基酸类试剂的活化处理未使用4-甲基苯乙醚。
86.对比例6：本对比例与实施例3相比，不同之处仅在于，首批氨基酸类试剂的活化处理中，将fmoc-(r)cys-oh替换成fmoc-cys(mmt)-oh；次批氨基酸类试剂的活化处理未使用环己烷羧酸异丙酯。
87.试验例：1.红外分析测试样品：实施例1中制备得到的半胱氨酸衍生物。
88.将半胱氨酸衍生物采用溴化钾压片，红外检测分析。
89.本发明测试中半胱氨酸衍生物的红外光谱如图1所示，其中，3200-3700 cm-1
之间为羧羟基的红外吸收峰，2800-2900 cm-1
之间为亚甲基红外吸收峰，1600-1700之间为碳氧双键红外吸收峰，在1586 cm-1
、1492 cm-1
处的红外吸收峰表明有苯环存在，因此，二苯基乙醛接到半胱氨酸上得到半胱氨酸衍生物。
90.测试样品：实施例1中制备得到的fmoc-(r)cys-oh。
91.将fmoc-(r)cys-oh采用溴化钾压片，红外检测分析。
92.本发明测试中fmoc-(r)cys-oh的红外光谱如图2所示，其中，同样3200-3700 cm-1
之间为羧羟基的红外吸收峰，2800-2900 cm-1
之间为亚甲基红外吸收峰，1600-1700之间为碳氧双键红外吸收峰，在1450-1600 cm-1
间的红外吸收峰表明有苯环存在，并且fmoc-(r)cys-oh与半胱氨酸衍生物红外峰形的差异由fmoc基团引起，表明合成了fmoc-(r)cys-oh。
93.测试样品：由实施例1中的fmoc-(r)cys-oh与甘氨酸反应生成的fmoc-(r)cys-gly-oh。
94.本次测试是为了验证fmoc-(r)cys-oh的反应性。
95.fmoc-(r)cys-oh的活化：将氨基酸类试剂加入活化溶液中，冰浴下活化20 min。活化溶液中含有hobt、dic和dmf，活化溶液中hobt的含量为5 wt%，活化溶液中dic的含量为3 wt%，氨基酸类试剂的使用量为活化溶液的30 wt%。
96.fmoc-(r)cys-gly-oh的制备：氮气氛围下，将gly加入水中制备得到gly溶液，然后加入活化后的fmoc-(r)cys-oh溶液进行偶联处理6 h，反应完成后浓缩，加入冷无水乙醚沉淀，离心，去上清液后的沉淀经冷无水乙醚洗涤，干燥，得到fmoc-(r)cys-gly-oh。gly溶液中gly的含量为30 wt%，活化后的fmoc-(r)cys-gly-oh的使用量为gly摩尔量的120%。
97.将fmoc-(r)cys-gly-oh采用溴化钾压片，红外检测分析。
98.本发明测试中fmoc-(r)cys-gly-oh的红外光谱如图3所示，通过图3与图2的对比，发现峰的位置大体一致，而整体峰形不一致可以推定为由于反应新生成的物质上差异基团引起的，因而，可以表明成功得到fmoc-(r)cys-gly-oh，表明fmoc-(r)cys-oh具有正常的反应活性，可用于肽的合成。
99.2.rphplc纯化结果本发明实施例1制备得到的普卡那肽与普卡那肽标准品采用同样的条件，通过hplc进行分析。
100.普卡那肽标准品经hplc色谱分离出峰时间在14.136 min；本技术实施例1中纯化得到的普卡那肽经hplc分析如图4所示，出峰时间为14.098 min，表明本发明方法成功得到普卡那肽。
101.3.普卡那肽的收率测试通过对各实施例和对比例中得到的普卡那肽的量进行收率试算。
102.本发明各方法对普卡那肽的收率结果如图5所示，a为实施例1，b为实施例2，c为实施例3，d为对比例1，e为对比例2，f为对比例3，g为对比例4，h为对比例5，i为对比例6，实施例1的方法得到的普卡那肽的收率为23.4%，实施例2的方法得到的普卡那肽的收率为29.1%，实施例3的方法得到的普卡那肽的收率为31.6%，对比例1的方法得到的普卡那肽的收率为23.9%，对比例2的方法得到的普卡那肽的收率为23.7%，实施例3与对比例1-2相比，表明在首批氨基酸试剂活化过程中使用fmoc-(r)cys-oh后，次批氨基酸试剂活化过程中，再共同使用环己烷羧酸异丙酯和4-甲基苯乙醚，可以提高普卡那肽的收率；对比例3的方法得到的普卡那肽的收率为20.9%，对比例4的方法得到的普卡那肽的收率为20.7%，对比例5的方法得到的普卡那肽的收率为21.1%，对比例6的方法得到的普卡那肽的收率为21.3%，表明环己烷羧酸异丙酯和4-甲基苯乙醚的使用，需要在本发明方法使用fmoc-(r)cys-oh之后，才具有提高普卡那肽收率的效果。
103.以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人
员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。