1.本发明涉及一种疫苗的制备方法及其应用，更具体一点说，涉及一种猪肺炎支原体和猪圆环病毒2型二联基因工程活疫苗的制备方法及其应用，属于生物基因工程领域。


背景技术：

2.猪肺炎支原体(mycoplasma hyopneumonia,mhp)是引起猪肺炎支原体(mycoplasmal pneumoniae of swine,mps)又称“猪气喘病”或“猪地方性肺炎(porcine enzootic pneumonia,pep)”的主要病原体。该病具有高发病率和低死亡率的特点，临床症状主要表现为慢性干咳、发热以及食欲不振等。猪肺炎支原体的感染会抑制宿主免疫系统，极易引发继发性感染，常见的继发性感染病原体包括猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,pcv2)，猪繁殖和呼吸道综合病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,prrsv)、多杀性巴氏杆菌(p.multocida)等，多种病原体之间的相互作用，严重恶化了单一病原体感染的症状，继而引起呼吸系统疾病综合症(porcine respiratory disease complex,prdc)，造成全球猪养殖业巨大的经济损失。
3.猪圆环病毒2型是一种单链环状dna病毒，属于圆环病毒属。pcv2可以引起猪皮炎和肾病综合征，导致断奶仔猪发生衰竭。pcv2基因组大小约为1.7kb，共有11个orfs，分别命名为orf1-orf11。


技术实现要素：

4.为了解决上述现有技术问题，本发明提供具有可以作为有效防控猪肺炎支原体和猪圆环病毒2型二联活载体疫苗使用等技术特点的一种猪肺炎支原体和猪圆环病毒2型二联基因工程活疫苗的制备方法及其应用。
5.为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
6.本发明一种重组猪肺炎支原体，所述的重组猪肺炎支原体包含表达异源蛋白的质粒。
7.作为优选，所述的表达异源蛋白的质粒为表达猪圆环病毒2型cap蛋白的重组质粒。
8.作为优选，所述的表达猪圆环病毒2型cap蛋白的重组质粒为puc57-oric-p97pro-tetm-p97pro-cap。
9.作为优选，所述的puc57-oric-p97pro-tetm-p97pro-cap由oric、p97pro、tetm、cap的片段克隆而成，所述oric、p97pro、tetm、cap的片段序列分别为seq id no.1、seq id no.2、seq id no.4、seq id no.5。
10.本发明一种猪肺炎支原体和猪圆环病毒2型二联基因工程活疫苗，所述的疫苗包含权利要求1所述的猪肺炎支原体，所述的猪肺炎支原体包括表达猪圆环病毒2型cap蛋白的重组质粒。
no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5所示，构建的puc57-oric-p97pro-tetm-p97pro-gfp和puc57-oric-p97pro-tetm-p97pro-cap重组载体示意图分别如图1和图2所示。
47.2)mhp的分离或培养，转化和筛选：
48.从猪场采集疑似mhp病理变化的肺脏组织，将病料研磨过滤后进行病原分离，经过改良friis液体、固体培养基培养、纯化、生化鉴定、分子生物学鉴定证实分离得到mhp菌株。或者用改良friis培养基溶解mhp活疫苗冻干粉，并以10％的比例加入到10ml的改良friis培养基中培养得到mhp株，分别以从病变肺脏组织中或疫苗中分离得到的mhp为菌株，构建重组mhp。
49.待20ml的mhp生长至对数期(约1
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108ccu)后，在4℃,10000
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g条件下离心15min收集mhp，用电转缓冲液将mhp菌体洗涤三次后置冰上20min完成mhp感受态细胞的制备。用100μl的电转缓冲液重悬mhp感受态细胞后，加入10mg的质粒dna，将反应体系转移至预冷的0.2cm的电转杯(bio-rad,hercules,ca,usa)中并在冰上放置20min，设置电转仪(bio-rad ltd,hemel hempstead,uk)的条件为2.5kv、125w以及25mf，并进行电转。电转结束后立即加入预冷的900μl改良friis培养基并在冰上放置20min后，将体系在37℃培养5h。
50.离心收集电转后的mhp，去掉部分上清，重悬mhp菌体并涂布到含0.02μg/ml(最小抑菌浓度)四环素的改良friis固体培养基上，在37℃，5％co2条件下生长7-14天。待生长出单克隆菌落后，将生长的单克隆菌落转移到5ml含0.02μg/ml四环素的改良friis中生长，对经鉴定成功的重组mhp进行冻存和传代培养。
51.3)重组mhp中gfp和cap蛋白的表达鉴定：
52.将电转了puc57-oric-p97pro-tetm-p97pro-gfp质粒的mhp置于固体培养基上生长，待出现单克隆菌落后在荧光显微镜下观察是否有荧光，结果如图4所示(注：图中箭头指向的绿色已经去色)，当在固体平板上可见呈现绿色荧光的mhp，说明gfp的自复制型质粒经电转后成功在mhp中表达。挑取表达gfp的mhp单克隆菌落于改良friis培养基中生长约7天，离心收集菌体后提取mhp的总rna，以rna反转录后的cdna为模板扩增gfp的基因片段，在转录组水平验证gfp基因的表达，结果如图5所示，在重组mhp的cdna中成功扩增出gfp的基因片段，说明gfp的自复制型质粒在mhp中成功进行了转录。
53.在固体培养基上挑取电转了puc57-oric-p97pro-tetm-p97pro-cap质粒的mhp的单克隆菌落于改良friis培养基中生长约7天，离心收集菌体后分别提取其基因组和总rna，以基因组和rna反转录的cdna为模板扩增cap的基因片段，在基因组和转录组水平验证cap的表达，结果如图6-7所示，在提取的mhp的基因组和cdna中均成功扩增出cap基因片段，说明cap的自复制型质粒成功电转入mhp中，并在mhp中进行了转录。分别离心收集表达cap蛋白的mhp和未电转质粒的mhp，并提取总蛋白，用western blot检测cap蛋白的表达，结果如图8所示，未电转cap自复制型质粒的mhp中没有出现cap的条带，而电转了cap自复制型质粒的mhp出现了cap蛋白的条带，说明mhp中成功表达了cap蛋白。分别离心收集表达cap蛋白的mhp和未电转质粒的mhp，经多聚甲醛固定后，用破膜剂重悬菌体，分别孵育小鼠cap单抗和fitc标记的鼠二抗，在流式细胞仪中检测是否有fitc标记的荧光信号，结果如图9所示，数字“2”峰(可以用蓝色标记)表示未电转包含cap基因重组质粒的mhp的荧光信号，数字“1”峰(可以用橙色标记)表示电转了包含cap基因的重组质粒的荧光信号，数字“1”峰的荧光信号
明显增强，说明cap蛋白成功在mhp中表达。
54.4)动物免疫实验：
55.将40只6-8周龄的雌性balb/c小鼠随机平均分成以下五组：1、pbs组；2、mhp商业疫苗组(支必宁，兆丰华生物科技有限公司)；3、pcv2商业疫苗组(圆柯欣，普莱柯生物工程股份有限公司)；4、表达cap的mhp 1
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106ccu组；5、表达cap的mhp 1
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107ccu组。采用肌肉注射途径，分别在第0d和14d进行免疫，pbs组每只小鼠注射200μl pbs，mhp商业疫苗组每只小鼠注射100μl“支必宁”疫苗，pcv2商业疫苗组每只小鼠注射100μl“圆柯欣”疫苗，表达cap的mhp免疫组每只小鼠注射200μl混合物(组成为：100μl 1
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106ccu表达cap的mhp和100μl佐剂或100μl 1
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107ccu表达cap的mhp和100μl佐剂，其中首次免疫使用弗式完全佐剂，第二次免疫使用弗式不完全佐剂)。分别在第一次免疫后7、14、21、28d进行取血，在21和28d分别对每组3只小鼠进行内眦取血和分离脾淋巴细胞。具体检测步骤如下：
56.(a)抗体水平检测：为了评估小鼠对于抗原所产生的体液免疫效应，采用间接elisa法检测抗体水平。分别将抗原包被缓冲液稀释后的p97p46p42和cap蛋白以1μg/ml浓度包板，elisa封闭液封闭，分别孵育以上四个时间段采集分离的血清(抗体稀释液1:200稀释)，然后再孵育二抗，加显色液显色，其中上述每两步间均用elisa洗涤液洗板4次，每次1min。最后加入elisa终止液终止显色反应，检测450nm波长下的光密度(od)值。结果如图10-11显示，表达cap的mhp免疫组小鼠的血清针对p97p46p42和cap两种病原体的抗原均能表现出显著的特异性igg反应，且随着免疫时间的增加，浓度升高，说明上述表达cap的mhp免疫后能激发小鼠体内产生特异性的体液免疫效应。
57.(b)小鼠总igg1和il-4含量的检测：为了检测小鼠血清中由b细胞产生的总igg1和ii型辅助t细胞(th2细胞)产生的il-4的含量变化，同样采用间接elisa法进行检测。分别购买了小鼠igg1 elisa试剂盒和小鼠il-4elisa试剂盒(solarbio)，根据试剂盒的使用说明书进行检测，小鼠血清抗体稀释倍数为1:200，最后检测450nm波长下的od值。结果如图12-13所示，随着免疫时间的增加，表达cap的mhp免疫组表现出显著的效果，且随着免疫剂量和时间的增加，igg1和il-4浓度随之升高，说明表达cap的mhp能够激发小鼠体内的细胞免疫效应。
58.(c)脾淋巴细胞增殖检测：为了评估小鼠对于抗原所产生的细胞免疫效应，使用小鼠淋巴细胞分离液(北京达科为生物技术有限公司)对免疫后21d和28d的小鼠进行脾淋巴细胞分离，具体操作流程参见产品说明书。对分离后的各组脾淋巴细胞进行细胞计数，96孔板每孔加入100μl稀释至4
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106个/ml的细胞悬液。37℃ 5％co2培养箱中培养至细胞完全贴壁后，分别在每孔加入100μl稀释后的混合抗原(未电转质粒的mhp和cap的混合物，其中mhp的含量为105ccu，cap蛋白的浓度为10μg/ml)，1640培养基与阳性对照(刀豆蛋白a，终浓度为10μg/ml)。将细胞放入co2培养箱继续培养42h后每孔加入20μl mtt(5mg/ml)，继续培养4h，弃尽细胞培养上清，每孔加入100μl dmso，于振荡器上震荡混匀5min，最后检测490nm波长下的od值，按照以下公式计算刺激指数(si)，si＝刺激孔od平均值/未刺激孔od平均值。结果如图14所示。表达cap的mhp免疫组的小鼠相比较于其他各对照组，对于相应抗原的刺激均能表现出较高的刺激指数，说明表达cap的mhp免疫后能激发小鼠体内产生特异性的细胞免疫效应。
59.本发明涉及的试剂和培养基配方：
60.amp存储液：100mg/ml的amp水溶液；
61.tet存储液：10mg/ml的tet无水乙醇溶液；
62.pbs溶液：8g nacl，0.2g kcl，1.44g na2hpo4，0.24g kh2po4溶于ddh2o定容至1l；
63.抗原包被缓冲液：1.59g na2co3，2.93g nahco3，ddh2o定容至1l；
64.elisa洗涤液：0.05％tween-20的pbs溶液；
65.elisa封闭液：5％脱脂奶粉，5％bsa的pbs溶液；
66.elisa抗体稀释液：2％脱脂奶粉，1％bsa的pbs溶液；
67.elisa终止液：2m h2so4；
68.改良friis培养基：1.5g脑心浸液粉，1.6g pplo肉汤粉，9ml酵母浸液，12.5ml hank’s液，50ml猪血清，5ml 0.25％酚红，50mg/ml amp，定容至500ml，调节ph为7.4；
69.改良friis固体培养基：1.5g脑心浸液粉，1.6g pplo肉汤粉，9ml酵母浸液，12.5ml hank’s液，50ml猪血清，5ml 0.25％酚红，50mg/ml amp，0.02μg/ml四环素，1％琼脂糖，定容至500ml，调节ph为7.4；
70.电转缓冲液：272mm蔗糖,8mm hepes,ph 7.4。
71.表1引物序列
[0072][0073][0074]
seq id no.1 oric
[0075]
gctctagaggtactgaaatcccaatctcaaaaaaatcacttttcacataataaaatataagataattagtgacaatttgattttttttgttaattattgcttgaaattcccaattttttttaatactacgaattttttgcaaaactatctcaacaaaaattatttatcagaaacagttagtcttttccgaccttttgcgcggcgtgcagcaagaatttttcgcccgtcggctgttgacattcgcgcgcggaatccgtgtgtttttaaatgttttcttttatttggttgataagttcgcttcattttttctcctttttttgcttaaatttaagttttagaagttattttaaggtattttaaaaaaatattgttaaaatttaaaaccaaaatcaactttattaaatgtgctaaataaagttgataaaatgtttgcaaaaacatttttgttgttttaaacaaaacaaattgatttaaaaattatactacaaaattaaaggaaaatttataaaatgcaaacaaataaaaataatt
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[0076]
seq id no.2 p97 promoter
[0077]
ggggta(gctgca)ccgaccaacaattccggcagtcaaaccaattttaaatgtttttgattttttactcatattttaaacctcaattatcttggttctaggaaataaatttttcattttctcaatcatataatataatttagatatctaatttttttaaaagttttgcaaaataaaaaaagataagtgaaaaatttatttaacttgtacaattaaaattatactttttttttttttttgcaacaaaaaagtttggaaatttttttatcattgtttttagcccacttttttgaaagatttgaatagttctaaatttctaatcagtcttcttttataatttattttagtataaaaaaatttgaacaatttaaataaataatccaatattaaaattaggattattaaaaaaacagcagtttttaatgctgtttttttaataattttagaactttactaggaaattttcttctatatttttttattaattttgaattaaaaaaggaagactaataattaaaagcaaaaatccaaaaataaatcctaaaaaaataggtaaaattgagagttctttctgtttttttttaataaaagcatagtcaatttttggagtttctgttttaaatccccgttctagagc(ccaagc)
[0078]
seq id no.3 gfp
[0079]
gctgcagatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgca
tcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaagggccc
[0080]
seq id no.4 tetm
[0081]
catatgctaggtcgaggtggcccggctccatgcaccgcgacgcaacgcggggaggcagacaaggtatagggcggcgcctacaatccatgccaacccgttccatgtgctcgccgaggcggcataaatcgccgtgacgatcagcggtccaatgatcgaagttaggctggtaagagccgcgagcgatccttgaagctgtccctgatggtcgtcatctacctgcctggacagcatggcctgcaacgcgggcatcccgatgccgccggaagcgagaagaatcataatggggaaggccatccagcctcgcgtcgcgaacgccagcaagacgtagcccagcgcgtcggccgccatgccggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctacgagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatccacaggacgggtgtggtcgccatgatcgcgtagtcgatagtggctccaagtagcgaagcgagcaggactgggcggcggccaaagcggtcggacagtgctccgagaacgggtgcgcatagaaattgcatcaacgcatatagcgctagcagcacgccatagtgactggcgatgctgtcggaatggacgatatcccgcaagaggcccggcagtaccggcataaccaagcctatgcctacagcatccagggtgacggtgccgaggatgacgatgagcgcattgttagatttcatggtacc
[0082]
seq id no.5 cap
[0083]
gctgcaatgaatgggatcttcaacacacgcctctcacgcacattcgggtatactatcaagaaaacaacagtaagaacgccatcatgagcggtggacatgatgagattcaatattaatgactttcttcctccagggggggggtcaaacccacgctcagtgccatttgaatattatagaataagaaaggttaaggttgaattctgaccatgctcaccaatcacacagggggacaggggggtggggtcaagcgctgttattctagatgataactttgtaacaaaggcgacagcgctcacatatgacccatatgtaaactattcatcgcgccacacaataacacagccattctcatatcactcacgctattttacaccaaaacctgtactagattcaactattgattatttccaaccaaacaacaaaagaaatcagctatgactcagactacaaactactgggaatgtagaccacgtagggctcgggactgcgttcgaaaacagcatatatgaccaggaatataatatccgcgtaacaatgtatgtacaattcagagaatttaatcttaaagaccctccacttaacccttaagggccc
[0084]
最后，需要注意的是，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。