1.本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种提取生物组织样品中核酸的方法。
背景技术：
2.核酸的提取和纯化是进行后续核酸扩增和检测等研究的基础，现有的核酸提取方法包括例如酚/氯仿抽提法、十六烷基三甲基溴化铵(ctab)裂解法、磁珠法等，然而这些方法相对耗时较长，且技术步骤繁琐，尤其是不适合在野外现场提取核酸的情况。因此，有必要开发一种简单便捷的、耗时短、适合各种生物组织样品核酸提取的新的方法。
3.钨针等金属针或其他硬质材料针状物，在直径小于细胞直径的情况下，可以刺穿细胞，通过在针表面修饰核酸结合基团，可以将生物组织样品中的核酸提取出来。目前未见有利用钨针或其他金属针以及硬质非金属针材料针状物进行生物组织样品核酸提取方面的相关报道，基于此，本发明提供了一种利用钨针或其他硬质材料针状物提取生物组织样品中核酸的新方法。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于提供一种提取生物组织样品中核酸的方法，本发明的提取方法使得提取时间大幅缩短，成本低，无需复杂的仪器设备，适用于现场快速提取和检测核酸的情况。
5.本发明提供的技术方案如下：
6.在一个方面，本发明提供了一种提取生物组织样品中核酸的方法，包括使用表面修饰核酸结合基团的金属针或其他硬质材料针状物刺穿生物组织样品进行所述核酸的提取。
7.在一个实施方案中，所述金属针包括钨针或不锈钢针或其他金属针，优选钨针；所述金属针的直径0.1～10微米之间，优选直径1微米。
8.在一个实施方案中，所述硬质材料针状物包括硬质塑料或硅针；所述硬质材料针状物包括聚二甲基硅氧烷针状物，优选聚二甲基硅氧烷针；更优选的，所述硬质材料针状物的直径为1～20微米，优选20微米。
9.在一个实施方案中，所述表面修饰核酸结合基团包括但不限于羟基、二氧化硅(sio2)、壳聚糖(cta)、聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda)等可与核酸结合的基团。
10.在一个实施方案中，所述表面修饰核酸结合基团的方法包括在所述钨针的表面应用氢氧化钠溶液镀覆铝膜，在钨针表面形成一层羟基基团，用于核酸结合。
11.在一个实施方案中，所述表面修饰核酸结合基团的方法包括在所述聚二甲基硅氧烷针的表面镀覆pva(聚乙烯醇)，然后修饰pdda(聚二烯丙基二甲基氯化铵)，用于核酸结合。
12.在一个实施方案中，所述提取方法包括将所述金属针或硬质材料针状物清洗干净
后，生物组织样品在生物组织样品反复穿刺1-20次，然后用洗脱液进行洗脱，优选地，所述洗脱液为te缓冲液；更优选地，洗脱液的用量为每次3～6μl。
13.在本发明的一个具体实施方案中，使用羟基修饰的金属钨针刺穿生物组织样品进行核酸提取。
14.在本发明的另一个具体实施方案中，使用了pdda修饰的聚二甲基硅氧烷真进行生物组织样品进行核酸提取。
15.当用钨针刺破生物组织样品结构后，由于钨针的直径比较小，因此可以直接刺破细胞以及细胞核，使核酸释放出来，然后与亲水性的钨针表面进行结合。然后利用洗脱液te缓冲液再将钨针表面的核酸洗脱下来，可直接用于核酸扩增与检测。
16.本发明发现在对钨针进行表面修饰后，可进一步增加钨针在生物组织样品内与核酸结合的能力，基于此，提供了一种基于表面修饰钨针提取生物样品核酸的可行性极高的方法。
17.在一个实施方案中，所述表面修饰是对钨针进行表面羟基修饰，制备步骤包括在钨针表面镀覆一层铝膜，在所述铝膜表面修饰羟基。对钨针镀铝膜增加亲水性后，在铝模表面修饰羟基再次增加与核酸的亲和力。
18.在一个实施方案中，所述金属针或硬质材料针状物为单个金属针或硬质材料针状物或金属针或硬质材料针状物的多针阵列，通过组合固定形成多针阵列同时使用，可以提高提取效率。
19.在一个具体实施方案中，使用表面修饰有羟基的钨针刺穿生物组织样品进行所述核酸的提取包括：将所述钨针清洗干净后，用夹持物夹住钨针刺穿生物组织样品，重复1～5次得到所述核酸。
20.在一个实施方案中，所述修饰羟基的方法包括使用氢氧化钠溶液浸泡镀完铝膜的钨针，清洗后保存。
21.在一个实施方案中，使用磁控溅射系统在钨针表面镀覆铝膜；优选地，使用cevp ltd gamma 1000c磁控溅射系统；更优选地，溅射速率为7～8nm/min，溅射功率为80～120w，最终溅射厚度为15～25nm。
22.在一个实施方案中，所述清洗包括使用sds溶液完全浸润钨针或聚二甲基硅氧烷针进行超声清洗；优选地，使用0.3～0.6mol/l sds溶液完全浸润钨针或聚二甲基硅氧烷针超声清洗8～12min；更优选地，所述超声清洗后，再用超纯水清洗至不再出现泡沫。
23.在一个具体的实施方案中，将钨针用0.5mol/l sds溶液完全浸润，超声清洗10min，使用ddh2o(超纯水/双蒸水)清洗数次，直至不再有泡沫洗出。
24.在一个实施方案中，所述刺穿生物组织样品之后，使用洗脱液进行洗脱后再进行下一次刺穿生物组织样品操作；优选地，所述洗脱液为te缓冲液；更优选地，洗脱液的用量为每次3～6μl。
25.在一个具体的实施方案中，用镊子夹住钨针，挑选生物组织样品上一个较为平整的表面，进行刺穿操作，每次穿一次，使用5μl的te进行洗脱操作，重复3次，即可得到样品中的核酸(如dna)。
26.在一个实施方案中，在铝膜表面修饰羟基的过程中，将所述镀完铝膜的钨针进行浸泡的时间为10～20min；进一步地，浸泡后钨针使用超纯水(ddh2o)进行清洗，并保存在超
纯水中。
27.在本发明的一个具体实施方案中，使用了聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda)修饰的聚二甲基硅氧烷针刺穿生物组织样品进行核酸提取。聚二甲基硅氧烷针修饰pdda的方法为将pdda溶解在含有1.5m氯化钠20mm tris-hcl缓冲液(ph 8.3)中制备pdda溶液(2％，w/v)，然后在钨针表面吸附浸泡20小时，清洗后保存备用。
28.在本发明中，所述核酸包括dna和/rna，优选dna。本发明的方法适合多种样品的核酸提取，例如从动物组织样品、植物组织样品以及微生物组织样品(如真菌)中进行核酸提取。
29.在另一个方面，本发明提供了一种核酸提取试剂盒，所述核酸提取试剂盒含有表面修饰核酸结合基团的金属针或硬质材料针状物；优选地，所述试剂盒还包含sds溶液、洗脱液、超纯水中的一种或多种。
30.在另一个方面，本发明还保护所述表面修饰核酸结合基团的金属针或硬质材料针状物或者含有表面修饰核酸结合基团的金属针或硬质材料针状物的试剂盒在核酸提取中的应用。
31.有益效果：
32.(1)本发明提供的提取方法操作简单，不依赖专业的设备和人员；与传统核酸提取试剂盒相比，使用钨针提取植物核酸的时间缩短了近两个小时，最终优化的提取系统的总时间不超过1分钟；
33.(2)本发明利用改性的金属针或硬质材料针状物，提高了金属针或硬质材料针状物对核酸的萃取效率；
34.(3)本发明所提取的核酸可以完全满足扩增反应的标准，而且不需要纯化，具有良好的便捷性和经济性；
35.(4)本发明可适用于野外用于快速植物疫情检测；
36.(5)与传统的试剂盒提取法相比，本方法的检测时间可增加约7个ct值，但相应的检测成本将降低到商品试剂盒检测法的十分之一。
附图说明
37.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
38.图1为本发明实施例1对钨板和钨针镀膜前后的对比图；
39.图2为本发明实施例1羟基改性后的钨针与未进行羟基改性的钨针的拉曼光谱对比结果；
40.图3为实施例3动物猪肉生物组织样品实时荧光pcr扩增曲线；
41.图4为实施例3植物欧洲油菜实时荧光pcr扩增曲线；
42.图5为实施例3真菌松口蘑实时荧光pcr扩增曲线；
43.图6为实施例4植物欧洲油菜实时荧光pcr扩增曲线；
44.图7为本发明实施例3钨针提取和试剂盒提取dna的可视化lamp结果。
具体实施方式
45.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
46.实施例1.钨针的改性与修饰
47.1.1镀铝膜
48.磁控溅射镀铝膜方法：
49.用cevp ltd gamma 1000c磁控溅射系统进行镀膜，溅射速率为7.5nm/min，溅射功率为100w，最终溅射厚度为20nm。图1为磁控溅射镀铝膜后钨板和钨针的对比图。图1中：a中1为磁控溅射铝模后的钨板，a中2为未磁控溅射铝膜的钨板，很明显，镀膜后的钨板颜色变为银白色；图1中：b中1为磁控溅射铝模后的钨针，b中2为未磁控溅射铝膜的钨针，很明显，镀膜后的钨针颜色变为银白色；c为钨针针尖放大40倍的图。
50.1.2羟基改性
51.在铝膜表面修饰羟基的方法：使用标准氢氧化钠溶液浸泡镀完铝模的钨针，浸泡15min左右，使用ddh2o清洗，保存在ddh2o中即可。图2为羟基改性后的钨针与未进行羟基改性的钨针的拉曼光谱对比，羟基改性后的钨针在3450cm-1
附近出现明显的羟基特征峰，说明羟基改性是成功的。
52.实施例2.聚二甲基硅氧烷针的制备与修饰
53.聚二甲基硅氧烷针是使用聚二甲基硅氧烷模具制造的。这些模具是通过激光烧蚀制作的，每个模具的尺寸约为10mm
×
10mm，其中有15
×
15个微针锥形腔阵列。每个型腔的高度为800μm，尖端和底座的直径分别为10和300μm。为了制备微针贴片，在每个硅胶模具中加入0.5ml的聚乙烯醇。之后，将模具放置在真空(600毫米汞柱)室中20分钟，将pva溶液吸引到空腔中，并达到所需的粘度。然后，这些模具被保存在25℃在化学罩真空一夜。在干燥后，将微针贴片从模具中分离出来，并在25℃储存在密封的培养皿中。
54.聚二甲基硅氧烷针修饰pdda的方法为将pdda溶解在含有1.5m氯化钠20mm tris-hcl缓冲液(ph 8.3)中制备pdda溶液(2％，w/v)，然后在聚二甲基硅氧烷针表面吸附浸泡20小时，清洗后保存备用。
55.实施例3.基于修饰钨针的dna提取与检测
56.2.1 dna提取
57.待提取的动植物样品如下：松口蘑、猪肉、欧洲油菜。
58.提取步骤如下：
59.(1)清洗经实施例1改性步骤改性后的钨针，使用0.5mol/l sds溶液完全浸润钨针，超声清晰10min，使用ddh2o清洗数次，直至不再有泡沫洗出；
60.(2)用镊子夹住钨针，挑选生物组织样品一个较为平整的表面，进行刺穿操作，每次穿一次，使用5μl的te进行洗脱操作，重复3次，即可得到样品dna。
61.2.2 dna浓度检测
62.使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值a
260
和a
280
。dna的浓度按照式(1)计算，每个样品重复测三次，取平均值。通过od
260
/od
280
比值判断
提取出的dna的纯度。若od
260
/od
280
值在1.7～2.1之间，说明dna纯度较高。
63.c＝a
×n×
50/1000
ꢀꢀꢀ
(1)
64.c——dna浓度，单位为微克每微升(μg/μl)；
65.a——260nm处的吸光值；
66.n——核酸稀释倍数。
67.如下表1示出了本发明提取方法所提取dna的浓度检测结果。
68.表1.核酸蛋白分析仪测试数据
69.样品名称dna浓度260/280松口蘑55ng/μl1.71猪肉62ng/μl1.86欧洲油菜153ng/μl1.82
70.使用dna紫外可见分光光度计进行检测，260/280数据大多集中在
71.1.8左右，浓度基本在100以上，可见该方法提取的dna不仅质量好，且浓度高。
72.2.3钨针提取与核酸提取试剂盒效果对比
73.表2.提取效果对比
[0074][0075]
所用样品为欧洲油菜、松口蘑和猪肉，分别用钨针提取和北京天根新型植物基因组dna提取试剂盒提取的方式提取dna样品，比较十次提取的平均值。如表2所示，钨针可以稳定的提取各种生物组织样品中的dna，尤其是对于具有细胞壁结构的植物样品以及真菌蘑菇样品，提取的dna浓度均显著高于商品dna提取试剂盒提取的dna浓度，而猪肉样品的dna浓度则低于试剂盒提取的dna浓度。但是都可以提取出dna来。表明本发明提取方法对于植物以及真菌的dna的提取具有更大的优势。
[0076]
2.4实时荧光pcr
[0077]
2.4.1动物组织样品实时荧光pcr试验
[0078]
(1)实验材料：新鲜猪肉；
[0079]
(2)引物信息：
[0080]
f：5
’‑
acccagacgaactgctcaa-3’(seq id no.1)
[0081]
r：5
’‑
tggcgtcactgataggtaaat-3’(seq id no.2)
[0082]
p：5
’‑
(fam)-tcacaggcgtgggctttctgc-(bhq1)-3’(seq id no.3)。
[0083]
(3)实时荧光pcr反应体系：
[0084]
pcrmix(kapa)10
f(10μm)1.6r(10μm)1.6p(10μm)0.8rox0.4dna模板2ddh2o3.6total20(μl)
[0085]
实时荧光pcr程序参数：95℃，10min；95℃，15s；60℃，1分钟，循环45次。图3为动物猪肉组织样品实时荧光pcr扩增曲线。
[0086]
2.4.2植物组织样品实时荧光pcr试验
[0087]
(1)实验材料：新鲜欧洲油菜；
[0088]
(2)引物信息：
[0089]
f：5
’‑
ggtcgtcctcctaaggcgaaag-3’(seq id no.4)
[0090]
r：5
’‑
cttcttcggcggtcgtccac-3’(seq id no.5)
[0091]
p：5
’‑
cggagccactcggtgccgcaactt-3’(seq id no.6)。
[0092]
(3)实时荧光pcr反应体系：
[0093]
pcrmix(kapa)10f(10μm)0.8r(10μm)0.8p(10μm)0.4rox0.4dna模板2ddh2o5.6total20(μl)
[0094]
实时荧光pcr程序参数：95℃，10min；95℃，15s，60℃，1分钟，循环45次。图4为植物欧洲油菜实时荧光pcr扩增曲线。
[0095]
2.4.3真菌实时荧光pcr试验
[0096]
(1)实验材料：新鲜松口蘑；
[0097]
(2)引物信息：
[0098]
f：5
’‑
gactcccatactgaagccaat-3’(seq id no.7)
[0099]
r：5
’‑
actcctttccatgcccatac-3’(seq id no.8)
[0100]
p：5
’‑
(fam)-tggctcctactccaaacactgacac-(tamra)-3’(seq id no.9)。
[0101]
(3)实时荧光pcr反应体系：
[0102]
[0103][0104]
实时荧光pcr程序参数：95℃，10min；95℃，15s，60℃，1分钟，循环45次。图5为真菌松口蘑实时荧光pcr扩增曲线。
[0105]
实施例4.基于聚二甲基硅氧烷针的dna提取与检测
[0106]
待提取的样品为欧洲油菜。
[0107]
提取步骤如下：
[0108]
将聚二甲基硅氧烷针轻轻地放置在叶子表面。通过手指按压几秒钟，将贴片剥离，用100μl te缓冲液冲洗
[0109]
dna浓度检测
[0110]
使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值a
260
和a
280
。dna的浓度按照式(1)计算，每个样品重复测三次，取平均值。通过od
260
/od
280
比值判断提取出的dna的纯度。若od
260
/od
280
值在1.7～2.1之间，说明dna纯度较高。
[0111]
c＝a
×n×
50/1000(1)
[0112]
c——dna浓度，单位为微克每微升(μg/μl)；
[0113]
a——260nm处的吸光值；
[0114]
n——核酸稀释倍数。
[0115]
如下表1示出了本发明提取方法所提取dna的浓度检测结果。
[0116]
核酸蛋白分析仪测试数据
[0117]
样品名称dna浓度260/280欧洲油菜44ng/μl1.42
[0118]
欧洲油菜样品实时荧光pcr试验
[0119]
(1)实验材料：新鲜欧洲油菜；
[0120]
(2)引物信息：
[0121]
f：5
’‑
ggtcgtcctcctaaggcgaaag-3’(seq id no.4)
[0122]
r：5
’‑
cttcttcggcggtcgtccac-3’(seq id no.5)
[0123]
p：5
’‑
cggagccactcggtgccgcaactt-3’(seq id no.6)。
[0124]
(3)实时荧光pcr反应体系：
[0125]
pcrmix(kapa)10f(10μm)0.8r(10μm)0.8
p(10μm)0.4rox0.4dna模板2ddh2o5.6total20(μl)
[0126]
实时荧光pcr程序参数：95℃，10min；95℃，15s，60℃，1分钟，循环45次。图6为植物欧洲油菜实时荧光pcr扩增曲线。
[0127]
实施例5.柑橘黄龙病可视化lamp检测
[0128]
反应体系：
[0129][0130][0131]
65℃90分钟，观察颜色变化，变成黄色的为被感染样品，未变色的为健康样品。
[0132]
图7为本发明实施例3钨针提取和试剂盒提取dna的可视化lamp结果(a为钨针dna可视化lamp结果；b为试剂盒提取dna可视乎lamp结果)。证明了用钨针提取可以从柑橘叶片中收集到柑橘黄龙病病毒，并且验证了这种方法的准确率为100％。对于发病时间较长的柑橘，检测结果的ct值更小，同样，可视化lamp的变色时间也越短。
[0133]
通过以上试验的验证，不仅证明了钨针提取dna技术的可行性，而且证明了该技术的普遍适用性，未来可将该技术集成为试剂盒类型或微流控芯片类型，以便现场快速检测使用。
[0134]
对比例1.钨针修饰前后提取效率对比
[0135]
为了比较表面改性钨针与非表面改性钨针的提取效率，针对不同样品进行了提取效率的比较，结果如下。
[0136]
表面修饰钨针提取的欧洲油菜的浓度为11.3ng/μl，od260/280为1.95，od260/230为0.37。松蘑菇的dna浓度为24.2ng/μl，od260/280为2.00，od260/230为0.36，猪肉的dna浓度为260/280的od浓度为8.9ng/μl、1.93，od260/230的dna浓度为0.37。
[0137]
未经表面修饰钨针获得欧洲油菜的dna浓度为10.6ng/μl，od260/280为2.73，od260/230为0.36。松蘑菇的dna浓度为20.2ng/μl，od260/280为2.12，od260/230为0.36，猪肉的dna浓度为7.4ng/μl，260/280为2.32，od260/230的dna浓度为0.33l。这些数据表明，通过表面改性成功地提高了钨针的萃取效率。
[0138]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术
方案的范围。