1.本发明公开了一种高通量快速筛选高产咖啡酸菌种的方法，本发明属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.咖啡酸是一种天然酚酸类化合物，来源于植物中的苯丙氨酸途径。苯基丙酸，特别是咖啡因，由于其具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗病毒、抗糖尿病和抗抑郁等重要药理作用，越来越受到人们的关注。
3.然而由于咖啡酸在植物体中提取困难，成本高昂，无法满足工业生产需要。为了满足咖啡酸市场需求并实现高水平生产，己有研究人员利用代谢工程等手段使得大肠杆菌发酵生产咖啡酸，在发酵法咖啡酸的过程中，生产菌种的产酸能力是决定生产成本的关键一环,获得咖啡酸高产菌种十分重要，现有技术中通常采用高效液相色谱法逐一对发酵液中咖啡酸的含量进行检测，以筛选高产咖啡酸菌种，这种筛选过程耗时长、处理步骤繁琐、成本较高，很难实现高产咖啡酸菌种的高通量的筛选。
4.为了克服上述现有技术的不足，因此急需找到一种在大批量待测菌种中，能够高效、低成本、快速筛选出咖啡酸高产菌种的方法。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种高通量快速筛选高产咖啡酸菌种的方法，利用此方法，可以大幅提高菌株的筛选效率，大幅增加单批次筛选的菌株数量，缩短咖啡酸高产菌株的筛选实验周期。
6.本发明所采用的技术方案如下：
7.本发明提供的一种高通量快速筛选高产咖啡酸菌种的方法，所述方法具体包括：
8.将待筛选的菌株进行发酵培养，得到发酵液，离心获得发酵上清液；将所述发酵上清液转移至多孔板中，所述多孔板可以是常规的96微孔板或384微孔板，向发酵上清液中加入3价铁离子反应液进行显色反应后，再将发酵上清液放入全波长酶标仪中检测，检测出菌株对应的发酵上清液在680nm下的od值，所得od值即可反映相应菌株生产咖啡酸的能力，所述显色反应、od值检测均在多孔板中进行，不需要进行发酵上清液的转移和重复取样。
9.作为本发明的一种实施方式，本发明所述高通量快速筛选高产咖啡酸菌种的方法，以大肠杆菌作为工程底盘菌株，以香豆酸为底物进行发酵生产咖啡酸，需要说明的是，发酵底物中的成分对检测结果并不会产生干扰，发酵底物中的对香豆酸虽也能与氯化铁反应，但是对香豆酸与氯化铁反应呈黄褐色，咖啡酸与氯化铁反应呈墨绿色，通过反应产物的颜色也可初步判断待筛的菌株中的产咖啡酸菌株，也可通过所呈现的墨绿色深度初步判断咖啡酸的产量高低，且对香豆酸与氯化铁的反应产物在680nm下吸光度是极低的，因此，对香豆酸和咖啡酸虽然都能够与氯化铁反应显色，但是反应后两者的最大吸收波长不同，故在680nm下可完全排除对香豆酸的干扰；另外发酵液中葡萄糖浓度较低，加入显色剂后无明
显颜色反应，即使50％高浓度的葡萄糖溶液与氯化铁反应显淡黄色，其在680nm处的od值也极低；其他中间代谢物酪氨酸与氯化铁也不会有颜色反应。
10.本发明的一种较佳的实施方式中，所述发酵培养采用p-5052自动诱导培养基，于32～38℃、100～240rpm摇床中进行96深孔板震荡发酵培养，每升所述的p-5052自动诱导培养基含na2hpo
4 50～60mm，kh2po
4 50～60mm，(nh4)2so
4 20～30mm，mgso
4 2～3mm，甘油0.2％～0.5％，乳糖0.1％～0.2％，葡萄糖0.04％～0.05％，对香豆酸0.1～0.4mm，ph为7.0～7.4。
11.本发明的一种较佳的实施方式中，所述的p-5052自动诱导培养基含na2hpo
4 50mm，kh2po
4 50mm，(nh4)2so
4 25mm，mgso
4 2mm，甘油0.5％，乳糖0.2％，葡萄糖0.05％，对香豆酸0.3mm，ph为7.0～7.4；进一步优选的，所述的p-5052自动诱导培养基ph为7.2。
12.本发明的一种较佳的实施方式中，所述发酵培养采用p-5052自动诱导培养基，在96深孔板中于37℃、220rpm摇床中进行振摇发酵培养，培养时间为18～24h。
13.本发明的一种较佳的实施方式中，所述发酵上清液通过在14,000rpm下离心2min后获得。
14.本发明的一种较佳的实施方式中，所述菌种筛选在96孔板中进行，吸取的发酵上清液体积为100～250μl；优选的，所述吸取的发酵上清液体积为200μl。
15.本发明的一种实施方式中，所述3价铁离子反应液为氯化铁水溶液；进一步的，所述为氯化铁水溶液浓度为25～28g/l；优选的，氯化铁水溶液浓度为27.03g/l。
16.本发明的一种实施方式中，所述的3价铁离子反应液加入量为发酵上清液体积的1/5～1/20；优选的，所述3价铁离子反应液加入量为发酵上清液体积的1/10。
17.本发明的一种实施方式中，为了更加快速方便的通过od值对待筛选菌株生产咖啡酸的能力进行定量，本发明提供的一种咖啡酸生产菌种高通量快速筛选的方法，还包括咖啡酸产量与od值对应关系的标准曲线的建立，待筛选菌株发酵上清液测得od值带入标准曲线即可获得相应菌株的咖啡酸产量值，所述标准曲线建立过程包括：称取咖啡酸标准品粉末适量，加入适量体积的甲醇配制为适量浓度的咖啡酸母液，将所述咖啡酸母液用超纯水分别稀释为1mg/ml、800μg/ml、600μg/ml、300μg/ml、150μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml的梯度溶液，并以超纯水作为空白对照；将咖啡酸稀释溶液以及进一步稀释后的溶液、空白对照溶液分别等量吸取不超过多孔板容积的三份之二的量到多孔板中，向每个孔中再加入适量的3价铁离子反应液，室温放置至少1min，将多孔板放入多功能酶标仪中，振摇3s，在680nm下读取od值，以咖啡酸浓度为横坐标，以680nm下的od值为纵坐标做标准曲线。
18.本发明的一种实施方式中，以大肠杆菌作为工程底盘菌株，所述待筛选的菌株选自述生产咖啡酸的突变菌株文库，所述生产咖啡酸的突变体文库建立过程包括：以所述羟化酶基因为模板，设计引物进行易错pcr扩增，获得目的基因片段，重组质粒后载入大肠杆菌中，构建突变菌株文库。
19.本发明的一种较佳实施方式中，所述羟化酶基因为复合物4-羟化苯乙酸-3-羟化酶基因，以下简称4hpa3h基因。进一步的，所述4hpa3h基因序列如seq id no.1所示。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
21.在特定的菌种群中，通过筛选得到高产、高转化效率、发酵时间短的特定产物的菌种的过程中，特定产物的产量检测是关键性的环节，目前，咖啡酸高产菌种的产量检测一般
使用高效液相hplc检测法，这种方法在待筛选的菌种量较少的情况下，是实用的，但是对于本发明的建立的大批量系列菌株库中，利用此法来筛选高产菌种则存在效率低下、处理步骤繁琐、成本高的问题，因此传统的筛选方法是不适用的。
22.本发明直接在96孔板或其他多孔板中直接对发酵上清液进行反应、显色，不仅大幅减少取样量、氯化铁反应液的使用量；而且极大地缩短了发酵上清液的显色反应时间以及筛选咖啡酸生产菌种的速度。因此，利用本发明的方法可以高效、快速筛选出咖啡酸高产菌种。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1a为具体实施方式中咖啡酸标准品溶液加入显色溶液后的照片；
25.图1b为图1a显色溶液相应的波长扫描图；
26.图2为具体实施方式中重组质粒pet24a(+)-4hpa3h图谱；
27.图3为固定波长下的加入显色溶液后的咖啡酸的吸光度图；
28.图4为0～0.3mg/ml的浓度范围内的拟合曲线图。
具体实施方式
29.生物合成咖啡酸目前采用的工程底盘菌株主要为大肠杆菌，而实验证实效价较高的催化路径依然是采取一步催化对香豆酸为目标产物咖啡酸，此步骤有三种同工生物酶可以使用，分别是4-香豆酸-3-羟化酶(coum3h)，细胞色素酶p450 cyp199a2，羟化酶复合物4-羟化苯乙酸-3-羟化酶(4hpa3h)。
30.下述实施例以大肠杆菌作为工程底盘菌株，以香豆酸为底物进行发酵生产咖啡酸，具体大肠杆菌选用e.coli bl21(de3)strain，生物酶为羟化酶复合物4-羟化苯乙酸-3-羟化酶(4hpa3h)，结合具体实例对本发明进行进一步说明。
31.下述实施例中采用的3价铁离子反应液为27.03g/l的fecl3·
6h2o；采用的培养基为p-5052自动诱导培养基，除模板外其余均由takara购得，每升培养基中含na2hpo
4 50mm，kh2po
4 50mm，(nh4)2so
4 25mm，mgso
4 2mm，甘油0.5％，乳糖0.2％，葡萄糖0.05％，对香豆酸0.3mm，ph为7.2；多功能酶标仪型号为biotek,winooski,vt,usa。
32.实施例1：高通量快速筛选高产咖啡酸菌种的方法
33.具体步骤如下：
34.步骤(1)：将待筛选的菌株接种到含有p-5052培养基的96深孔板中，37℃下摇床220rpm培养24h；另外将不接种菌株的p-5052培养基作为空白对照；
35.步骤(2)：将步骤(1)中菌株培养所得的96深孔板发酵液，在14000rpm下离心2min，获得发酵上清液；
36.步骤(3)：分别吸取所得的不同菌株的发酵上清液以及空白对照p-5052培养基各200μl，转移到96微孔板中，再向每个微孔中加入10μl的3价铁离子反应液，用酶标仪扫描
680nm下的od值，od值高的反应液对应的菌株即为咖啡酸产量高的菌株。
37.实施例2：咖啡酸产量与od值对应关系的标准曲线的建立
38.步骤(1)：称取咖啡酸标准品粉末适量，加入适量体积的甲醇配制为10mg/ml的咖啡酸母液。
39.步骤(2)：将10mg/ml的咖啡酸母液用超纯水分别稀释为1mg/ml、800μg/ml、600μg/ml、300μg/ml、150μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml的具有浓度梯度的咖啡酸稀释溶液，以超纯水作为空白对照即0μg/ml的咖啡酸稀释溶液，将咖啡酸稀释溶液作为标准溶液，；
40.步骤(3)：反应产物最大吸收波长的选取：分别吸取上述标准溶液200μl转移到96微孔板中，再向每个孔中加入20μl的3价铁离子反应液，室温放置1min，显色反应后如图1a所示，用酶标仪扫描500～850nm下的od值如图1b所示，通过数据统计所得检测反应后产物的最大吸收波长为680nm，并通过线性拟合所得该检测方法所能检测到的咖啡酸浓度的线性范围为:0～0.3mg/ml；
41.步骤(4)：将咖啡酸稀释溶液包括空白对照溶液，分别吸取200μl到96多孔板中，向每个孔中加入10μl的3价铁离子反应液，室温放置1min，显色反应后，将96孔板放入多功能酶标仪中，振摇3s，在680nm下读取od值，如图3所示，以咖啡酸浓度为横坐标，以680nm下的od值为纵坐标，当咖啡酸浓度高于0.3mg/ml时，od
680
数值变化变缓，接近平台期；当咖啡酸浓度高于1mg/ml时，所得的od
680
数值已超限，数值大于2，即若生产菌株咖啡酸产量高于0.3mg/ml时，加入3价铁离子反应液后在680nm下检测已不能反映菌株的确切生产咖啡酸的浓度，但这可以在短时间内快速初筛出高产菌株与低产菌株，通过进一步稀释测得的od值以判断其咖啡酸的产量；
42.在0.3mg/ml的浓度范围内，通过3次独立重复试验，如图4所示，得线性拟合方程为：
43.y＝4.085c-0.04414，
44.其中，c为咖啡酸浓度(mg/ml),y为od
680
，线性拟合方程的线性拟合常数r2为0.9618，3倍信噪比下的检出限为0.041mg/ml，如下表1所示，在线性范围内的sd值均低于0.01，精密度、重复性良好，可作为标准曲线；
45.表1：0～0.3mg/ml的浓度范围内od
680
测量值以及sd值对应表
[0046][0047]
分别向100μl含有0.1mg/ml和0.4mg/ml的咖啡酸标准品溶液中加入100μl 0.2mg/ml的咖啡酸标准品溶液，混合均匀后分别加入10μl的3价铁离子反应液，用酶标仪扫描680nm下的od值，计算回收率分别得106％、97.2％，回收率良好。
[0048]
实施例3：生产咖啡酸的突变体文库构建
[0049]
步骤(1)：以seq id no.1所示羟化酶基因为模板，设计pcr引物对进行易错pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳回收纯化得目的基因片段；
[0050]
其中，目的基因前后两端加有限制性内切酶nde i和not i酶切位点，具体如下所示：
[0051]
nde i：酶切序列及保护碱基：gggaattc
[0052]
not i：酶切序列及保护碱基：aaggaaaaaa
[0053]
易错pcr扩增体系(50μl)包括：pcr引物对包括上游引物如seq id no.2所示的f-4hpa3h 0.2μl，下游引物如seq id no.3所示的r-4hpa3h 0.2μl，10mm mn
2+ 0.6μl，dntp(25mm)4μl，dttp(100mm)4μl，dctp(100mm)4μl，模板0.4μl，10
×
pcr buffer 5μl，rtaq酶1μl，25mm mgcl
2 5μl，用ddh2o补足至50μl体积；
[0054]
步骤(2)：将目的基因以及表达载体pet24a(+)在37℃下用限制性内切酶nde i和not i消化24h，经琼脂糖凝胶电泳回收纯化酶切过后的片段；
[0055]
步骤(3)：如图2所示，将纯化过后的目的基因片段与线性化的pet24a(+)用t4 dna连接酶在16℃下连接，获得重组后的含有目的基因的质粒标记为pet24a(+)-4hpa3h，将其转化到大肠杆菌bl21(de3)中，涂布含有50μg/ml的卡那霉素lb平板，37℃下恒温倒置培养过夜；
[0056]
步骤(4)：将在平板上生长的单菌落克隆以及不含目的基因的空质粒pet24a(+)菌株(作为阴性对照菌株)俱接种到含有p-5052培养基(含0.3mm对香豆酸)的96深孔板中，37℃下摇床220rpm培养24h。另外将不接种菌株的p-5052培养基作为空白对照。
[0057]
测试例：高产咖啡酸菌株的验证
[0058]
步骤(1)：从实施例3中突变体文库中采用实施例1中所述方法筛选所得的od680值最高的突变菌株与出发菌株分别接种到种子培养基中，500ml摇瓶装50ml，于37℃、220rpm培养16h，以5％接种量转接到含有2l发酵培养基的5l发酵罐中进行发酵，初始发酵条件为初糖浓度50g/l，转速400rpm，温度37℃，通气量1vvm；
[0059]
步骤(2)：在发酵过程中还原糖浓度在20g/l以下时，添加一定量的500g/l的葡萄糖补料液；
[0060]
步骤(3)：每隔4h监测还原糖浓度，不断添加一定量的补料液维持此糖浓度；
[0061]
步骤(4)：发酵36h后分别检测出发菌株和突变菌株的咖啡酸滴度。
[0062]
检测结果为：出发菌株的咖啡酸产量为1.4g/l，产量最高的突变菌株的咖啡酸产量为4.2g/l，所述高产突变菌株的羟化酶基因序列详见seq id no.4，氨基酸序列详见seq id no.5。
[0063]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。