口蹄疫病毒(fmdv)共有蛋白、其编码序列以及由其制造的疫苗
1.本技术是申请日为2014年3月17日的题为“口蹄疫病毒(fmdv)共有蛋白、其编码序列以及由其制造的疫苗”的中国专利申请no.201480010741.6的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及合成的共有口蹄疫病毒(fmdv)免疫原性蛋白和编码所述蛋白的核酸分子，涉及抗fmdv的疫苗，涉及用于诱导抗fmvd的免疫反应的方法，涉及用于区分感染了fmdv的个体与那些接种fmdv疫苗的个体的方法，以及预防性和/或治疗性免疫个体抗fmdv的方法。
背景技术：
3.口蹄疫(fmd)是家养和野生偶蹄类动物(包括牛、猪、山羊和鹿)的高传染性疾病，其在宿主中快速复制并且传播至接触易感性动物。该疾病的特征为发热、跛行以及舌、足、口鼻部和乳头的水疱性病变，从而导致成年动物的发病率高，但死亡率低。fmdv感染驱动牛、水牛、绵羊、山羊和猪的急性水疱性疾病，其可发展成持久性感染(不包括猪)。fmdv可感染许多其它哺乳动物种类，包括羚羊、象、刺猬等。据认为，原始fmdv的天然宿主可能是非洲水牛，因为：i)它是持久地被感染的，并且ii)极少观察到疾病。
4.fmd的病原体为口蹄疫病毒(fmdv)，其为小核糖核酸病毒科的口疮病毒属的iv族(+)ssrna病毒。fmdv发生在七种主要血清型中：o、a、c、sat-1、sat-2、sat-3和asia-1。这些血清型区域性地受限，其中世界范围内最常见的为o血清型。fmdv的单链正义rna基因组为由二十面体衣壳包围的约8500个碱基，所述二十面体衣壳具有4种结构蛋白vp1-vp4，每一种蛋白60个拷贝。病毒蛋白在抗原性上在其若干亚型内高度可变，所述亚型包括a、asia 1、o、c、sat1、sat2和sat3。
5.fmd具有经济破坏性并且偶蹄类牲畜的感染可造成重大损失。最近的爆发造成了几十亿美元的损失。爆发近期发生在许多先前没有该疾病的国家，包括2001年在英国和荷兰，并且在几个南美国家的出现已提高了对该经济破坏性病毒的认识。此外，世界范围内担忧的是利用fmdv攻击具有较大畜牧业(如1000亿美元/年的畜牧业)的目标国家的可能的经济恐怖袭击。
6.先前控制fmdv的措施包括宰杀感染或接触的动物和消毒。因fmdv暴发而宰杀其牲畜的国家只有在所述国家在最后一次暴发后3个月具有无fmdv状态时才可重新开始饲养牲畜。国家通常将给动物接种疫苗治疗fmdv暴发用作最后一招，因为已接种疫苗并且未宰杀动物的国家必须等待整整一年来恢复无fmd状态。然而，国家期望在任何fmdv暴发之前接种其动物并且将能够保持其无fmd状态。
7.过去，fmdv疫苗包括结合佐剂的化学灭活的完整病毒抗原；然而，这是有缺点的，因为这需要昂贵的高污染制造设施来生产疫苗。在过去25-30年中，研究者们一直尝试开发在单次接种后提供保护作用的疫苗。这些努力包括：从病毒颗粒纯化的vp1、生物工程改造
的vp1、vp1肽、化学合成的vp1肽、表达vp1表位的活载体的使用；利用编码vp1表位的dna的接种；以及使用由fmdv感染的培养物产生的完整衣壳蛋白vp1-vp4或通过复制缺陷型人腺病毒5型(ad5)载体进行的vp1-vp4衣壳的递送。所有这些方法仅给接种的动物提供有限数量的所有fmdv病毒亚型的表位。
8.因此，在本领域中存在对诊断fmdv感染的哺乳动物的疫苗和方法的需要，所述疫苗和方法适于针对各种fdmv亚型的fmdv的多个表位提供保护。
技术实现要素：
9.公开了包含编码病毒蛋白vp4的序列的核酸分子，病毒蛋白vp4在其c末端连接至蛋白酶切割位点，该蛋白酶切割位点在其c末端连接至病毒蛋白vp2；病毒蛋白vp2在其c末端连接至蛋白酶切割位点，该蛋白酶切割位点在其c末端连接至病毒蛋白vp3；病毒蛋白vp3在其c末端连接至蛋白酶切割位点，该蛋白酶切割位点连接至病毒蛋白vp1；病毒蛋白vp1在其c末端连接至蛋白酶切割位点，该蛋白酶切割位点连接至病毒蛋白2a。核酸分子还可包含编码处于病毒蛋白vp4的编码序列的5’末端的前导序列的核酸序列。在一些实施方案中，病毒蛋白vp4的编码序列被省略。在一些实施方案中，病毒蛋白2a的编码序列被省略。在一些实施方案中，编码n末端前导序列的编码序列被省略。在一些实施方案中，编码n末端前导序列的编码序列为ig前导序列，如igg或ige前导序列。在一些实施方案中，切割位点由弗林蛋白酶识别。
10.提供了包含核酸分子的质粒，所述质粒包括其中病毒蛋白来自选自由a、asia1、c、o、sat1、sat2和sat3组成的组的fmdv亚型的质粒。提供了包含四种质粒的疫苗，其中病毒蛋白编码核酸序列来自由a、asia1、c和o组成的组的每一种fmdv亚型。在一些实施方案中，还提供了包含七种质粒的疫苗，其中病毒蛋白编码核酸序列来自由a、asia1、c、o、sat1、sat2和sat3组成的组的每一种fmdv亚型。在一些实施方案中，提供了包含少于七种，即一种、两种、三种、四种、五种或六种质粒的疫苗，其中病毒蛋白编码核酸序列来自由a、asia1、c、o、sat1、sat2和sat3组成的组的fmdv亚型。
11.本文所公开的包含编码病毒蛋白vp4的序列的核酸分子被称为长型式或“长的”，编码病毒蛋白vp4的序列在其c末端连接至编码蛋白酶切割位点的序列，该编码蛋白酶切割位点的序列在其c末端连接至编码病毒蛋白vp2的序列；编码病毒蛋白vp2的序列在其c末端连接至编码蛋白酶切割位点的序列，该编码蛋白酶切割位点的序列在其c末端连接至编码病毒蛋白vp3的序列；编码病毒蛋白vp3的序列在其c末端连接至编码蛋白酶切割位点的序列，该编码蛋白酶切割位点的序列连接至编码病毒蛋白vp1的序列；编码病毒蛋白vp1的序列在其c末端连接至编码病毒蛋白2a的序列。本文所公开的包含编码病毒蛋白vp2的序列的核酸分子被称为短型式或“短的”，编码病毒蛋白vp2的序列在其c末端连接至编码蛋白酶切割位点的序列，该编码蛋白酶切割位点的序列在其c末端连接至编码病毒蛋白vp3的序列；编码病毒蛋白vp3的序列在其c末端连接至编码蛋白酶切割位点的序列，该编码蛋白酶切割位点的序列连接至编码病毒蛋白vp1的序列；编码病毒蛋白vp1的序列在其c末端连接至编码病毒蛋白2a的序列。在长型式和短型式中，连接至编码病毒蛋白vp1的编码序列的3’末端和所连接的病毒蛋白2a的编码序列的蛋白酶切割位点的编码序列可省略。在长型式和短型式中，n末端前导序列的编码序列，在长型式的情况下连接病毒蛋白vp4的编码序列的n末
端，并且在长序列的情况下，连接病毒蛋白vp2的编码序列的n末端。n末端前导序列优选为ig前导序列，如igg或ige信号序列。在一些实施方案中，切割位点由弗林蛋白酶识别。
12.在一些实施方案中，提供了包含核酸分子的质粒，所述质粒包括其中病毒蛋白来自选自由a、asia1、c、o、sat1、sat2和sat3组成的组的fmdv亚型的质粒。在一些实施方案中，提供了包含四种质粒的疫苗，其中病毒蛋白编码核酸序列来自由a、asia1、c和o组成的组的每一种fmdv亚型。在一些实施方案中，提供了包含七种质粒的疫苗，其中病毒蛋白编码核酸序列来自由a、asia1、c、o、sat1、sat2和sat3组成的组的每一种fmdv亚型。
13.提供通过将所公开的疫苗中的一种施用至个体来在个体中产生抗fmdv的免疫反应的方法。
14.提供通过将所公开的疫苗中的一种施用至个体来防止个体感染fmdv的方法。
15.本文提供了一种包含编码口蹄疫病毒的至少vp1-vp3，并且优选地vp1-vp4的共有氨基酸序列的序列的分离核酸，其在接种疫苗的受试者体内引发抗fmd的多个亚型(包括a、asia 1、c、o、sat1、sat2、sat3、sat4)的交叉反应性免疫反应。核酸还包括选自由以下组成的组的序列：(a)衍生自fmdv-a24cruzeiro的构建体，其包含编码如seq id no:2中所示的vp-4-vp2-vp3-vp1(长)的seq id no:1中所示的核苷酸序列；(b)衍生自fmdv-a24cruzeiro的构建体，其包含编码如seq id no:4中所示的vp2-vp3-vp1(短)的seq id no:3中所示的核苷酸序列；(c)衍生自fmdv-as1-shamir89的构建体，其包含编码如seq id no:6中所示的vp-4-vp2-vp3-vp1(长)的seq id no:5中所示的核苷酸序列；(d)衍生自fmdv-as1-shamir89的构建体，其包含编码如seq id no:8中所示的vp2-vp3-vp1(短)的seq id no:7中所示的核苷酸序列；(e)衍生自fmdv-sat2的构建体，其包含编码如seq id no:10中所示的vp-4-vp2-vp3-vp1(长)的seq id no:9中所示的核苷酸序列；(f)衍生自fmdv-sta2的构建体，其包含编码如seq id no:12中所示的vp2-vp3-vp1(短)的seq id no:11中所示的核苷酸序列。
16.本文提供了核酸分子，如选自由以下组成的组的那些：a)fmdv-a24cruzeiro衍生的修饰核苷酸序列，如插入质粒(如具有seq id no:13中所示的序列的pvax)中的seq id no:1(fmdv-a24cruzeiro-长)中所示的核苷酸序列；b)fmdv-a24cruzeiro衍生的修饰核苷酸序列，如插入质粒(如具有seq id no:14中所示的序列的pvax)中的seq id no:3(fmdv-a24cruzeiro-短)中所示的核苷酸序列；c)fmdv-as1-shamir89衍生的修饰核苷酸序列，如插入质粒(如具有seq id no:15中所示的序列的pvax)中的seq id no:5(fmdv-as1-shamir89-长)中所示的核苷酸序列；以及d)fmdv-as1-shamir89衍生的修饰核苷酸序列，如插入质粒(如具有seq id no:16中所示的序列的pvax)中的seq id no:7(fmdv-as1-shamir89-长)中所示的核苷酸序列。
17.组合物中的核酸分子可包含以下核酸序列、和/或其片段、和/或序列的同源序列、和/或所述同源序列的片段；核酸序列为：a)衍生自fmdv-as1-shamir89的编码vp4的核酸序列，如seq id no:17中所示的核酸序列；b)衍生自fmdv-a24cruzeiro的编码vp4的核酸序列，如seq id no:18中所示的核酸序列；c)衍生自fmdv-as1-shamir89的编码vp2的核酸序列，如seq id no:19中所示的核酸序列；d)衍生自fmdv-a24cruzeiro的编码vp2的核酸序列，如seq id no:20中所示的核酸序列；e)衍生自fmdv-as1-shamir89的编码2a的核酸序列，如seq id no:21中所示的核酸序列；f)衍生自fmdv-a24cruzeiro的编码2a的核酸序列，
如seq id no:21中所示的核酸序列；g)衍生自fmdv-as1-shamir89的编码vp3的核酸序列，如seq id no:23中所示的核酸序列；h)衍生自fmdv-a24cruzeiro的编码vp3的核酸序列，如seq id no:24中所示的核酸序列；i)衍生自fmdv-as1-shamir89的编码vp1的核酸序列，如seq id no:25中所示的核酸序列；j)衍生自fmdv-a24cruzeiro的编码vp2的核酸序列，如seq id no:26中所示的核酸序列。
18.由蛋白酶弗林蛋白酶识别的切割位点的氨基酸序列为seq id no:27中所示的序列。
19.在一些实施方案中，构建体可包括c3共有编码序列(seq id no:28)，其编码c3蛋白酶共有蛋白(seq id no:29)。
20.本文还提供了一种能够在哺乳动物中产生抗多个口蹄疫病毒(fmdv)亚型的免疫反应的疫苗，其中疫苗包含包括可操作地连接至编码序列的启动子的dna质粒和药学上可接受的赋形剂，所述编码序列编码包含来自一种或多种fmdv亚型的衣壳蛋白vp1-vp4的共有fmdv抗原，其中dna质粒能够在哺乳动物的细胞中以有效地引发哺乳动物广泛的交叉反应性免疫反应的量表达共有fmdv抗原。疫苗可产生抗fmdv亚型a、asia 1、c、o、sat1、sat2、sat3或其组合的免疫反应。
21.本文还提供了一种能够在哺乳动物中产生抗多个口蹄疫病毒(fmdv)亚型的免疫反应的疫苗，其中疫苗包含一种或多种包含可操作地连接至编码序列的启动子的dna质粒和其药学上可接受的赋形剂，所述编码序列编码包含来自选自由亚型a、asia 1、c、o、sat1、sat2、sat3或其组合组成的组的一种或多种fmdv亚型的衣壳蛋白vp1-vp4的共有fmdv抗原，其中dna质粒能够在哺乳动物的细胞中以有效地引发哺乳动物的免疫反应的量表达共有fmdv抗原。可向哺乳动物如猪、反刍动物、人或灵长类动物施用疫苗。疫苗可引发哺乳动物的免疫反应，如体液、细胞或体液及细胞反应。
22.本文还提供了一种能够在哺乳动物中产生抗多个fdmv亚型的免疫反应的疫苗，其中疫苗包含包括编码口蹄疫病毒(fmdv)亚型a、asia 1、c、o、sat1、sat2或sat3的衣壳蛋白vp1-vp4的一个或多个共有氨基酸序列的抗原和其药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可为选自由il-2和il-15组成的组的佐剂。疫苗的药学上可接受的赋形剂可为转染促进剂。转染促进剂可以是浓度低于6mg/ml的聚阴离子、聚阳离子或脂质如聚-l-谷氨酸。可向哺乳动物如猪、反刍动物、人或灵长类动物施用疫苗。疫苗可引发哺乳动物的免疫反应，如体液、细胞或体液及细胞反应。
23.本文还提供了一种用于在哺乳动物中引发抗多个fmdv病毒亚型的免疫反应的方法，其包括将本文所述的dna质粒疫苗递送至哺乳动物的组织并且在有效地允许dna质粒进入细胞的恒定电流下利用能量脉冲对组织的细胞进行电穿孔。本文所述的dna质粒疫苗的递送可通过一种方法来完成，所述方法可包括将dna质粒疫苗注射到真皮内、皮下或肌肉组织中。可通过预设电流来递送所述方法的dna质粒，并且能量脉冲处于等于当前电流的恒定电流下。该方法的电穿孔步骤还可包括测量电穿孔细胞的阻抗，相对于所测量的阻抗调整能量脉冲的能量水平以维持电穿孔细胞中的恒定电流，其中测量和调整步骤发生在能量脉冲的持续时间内。电穿孔步骤还可包括根据以分散模式递送能量脉冲的脉冲序列模式将能量脉冲递送至多个电极。
24.还提供了一种诊断感染了fmdv的哺乳动物的方法，其中所述方法包括从哺乳动物
中分离流体样品，从哺乳动物的流体样品中分离抗体，以及将所分离的抗体与已用本文所述的疫苗接种的对照哺乳动物相比较，其中对照哺乳动物仅具有针对fmdv vp1-vp4蛋白的抗体，并且感染fmdv的哺乳动物具有针对fmdv vp1-v4蛋白和fmdv非结构蛋白的抗体。非结构蛋白可为fmdv 2c、3a和3d聚合酶。
25.提供了在哺乳动物中引发抗一种或多种fmdv病毒亚型的免疫反应的方法。包括使用本文所公开的疫苗的方法在一些实施方案中可包括将编码具有fmdv免疫原性序列的蛋白质的核酸分子施用至哺乳动物的组织，以及在有效地允许dna质粒进入细胞的恒定电流下利用能量脉冲对组织的细胞进行电穿孔的步骤。
26.还提供了一种在根据本文所公开的过程接种疫苗的哺乳动物中诊断感染fmdv的哺乳动物的方法。所述方法包括从接种疫苗的哺乳动物中分离流体样品，并且检测未被包括在所述疫苗中的fmdv蛋白和/或未被包括在所述疫苗中的抗fmdv蛋白的抗体的存在。所述fmdv蛋白和/或抗所述fmdv蛋白的抗体的存在表明接种疫苗的哺乳动物已感染了fmdv。
附图说明
27.图1示出了用于血清型asia 1的fmdv-as1-shamir-89 dna疫苗构建体的示意图，表明as1 shamir89插入物被克隆到bamh1和xho-1位点中。质粒图谱基于质粒pvax。fmdv-as1-shamir插入物的示例可为在图1中示出为pfmdv-as1 shamir-89-l的长形式，或者为在图1中示出为pfmdv-as1 shamir-89-s的短形式。
28.图2示出了示出as1-shamir89-s(左
–
seq id no:7)和as1-shamir89-l(右
–
seq id no:5)的克隆的一对染色凝胶和fmdv-as1-shamir89-l长形式(seq id no:6为fmdv-as1-shamir89-l长形式序列)的氨基酸序列。序列包括以阴影表示的n末端处的ige前导序列、以小写体表示的蛋白水解切割位点以及在ige前导序列与第一蛋白水解切割位点之间的以黑体表示的vp4序列。vp1序列以黑体示出于第三蛋白水解切割位点与第四蛋白水解切割位点之间，并且2a序列示出于最后一个(第四)蛋白水解切割位点与终止(stop)之间。
29.图3示出了fmdv-a24cruzeiro dna疫苗构建体的示意图，表明a24cruzeiro插入物被克隆到bamh1和xho-1位点中。质粒图谱基于质粒pvax。fmdv-a24cruzeiro插入物的实例可为在图3中示出为pfmdv-a24cruzeiro-l的长形式，或者为在图3中示出为pfmdv-a24cruzeiro-s的短形式。
30.图4示出了示出a24cruzeiro-s(左
–
seq id no:3)和a24cruzeiro-l(右
–
seq id no:1)的克隆的一对染色凝胶和fmdv-a24cruzeiro-l长形式(seq id no:2为fmdv-a24cruzeiro-l长形式序列)的氨基酸序列。序列包括以阴影表示的n末端处的ige前导序列、以小写体表示的蛋白水解切割位点以及示出于ige前导序列与第一蛋白水解切割位点之间的vp4序列。vp1序列示出于第三蛋白水解切割位点与第四蛋白水解切割位点之间，并且2a序列示出于最后一个(第四)蛋白水解切割位点与终止之间。
31.图5示出了fmdv-sat2 dna疫苗构建体的示意图，表明sat2插入物被克隆到bamh1和xho-1位点中。质粒图谱基于质粒pvax。fmdv-sat插入物的实例可为在图5中示出为pfmdv-as1-sat2-l的长形式，或者为在图5中示出为pfmdv-sat2-s的短形式。
32.图6示出了示出sat2-s(左
–
seq id no:11)和sat2-l(右
–
seq id no:9)的克隆的一对染色凝胶和fmdv-sat2-l长形式(seq id no:10为fmdv-sat2-l长形式序列)的氨基酸
序列。序列包括以阴影表示的n末端处的ige前导序列、以小写体表示的蛋白水解切割位点以及示出于ige前导序列与第一蛋白水解切割位点之间的vp4序列。vp1序列示出于第三蛋白水解切割位点与第四蛋白水解切割位点之间，并且2a序列示出于最后一个(第四)蛋白水解切割位点与终止之间。
33.图7示出了蛋白表达的实验结果。
34.图8示出了使用电穿孔来评估相对于空白在施用以下各项后的免疫反应的免疫实验的实验方案：1)pvax、2)fmdv-a24cruzeiro-l、3)fmdv-a24cruzeiro-s、4)fmdv-shamir89-l、5)fmdv-shamir89-s、fmdv-sat2-l、fmdv-sat2-s。
35.图9示出了由fmdv-a24cruzeiro-l和fmdv-a24cruzeiro-s疫苗引发的细胞免疫反应的数据。
36.图10示出了由fmdv-as1-sharma89-l和fmdv-as1-sharma89-s疫苗引发的细胞免疫反应的数据。
37.图11示出了由fmdv-sat2-l和fmdv-sat2-s疫苗引发的细胞免疫反应的数据。
38.图12示出了用于elisa分析的dna转染和细胞裂解物制备的实验方案。
39.图13示出了由fmdv-a24cruzeiro-l和fmdv-a24cruzeiro-s疫苗以及fmdv-as1-sharma89-l和fmdv-as1-sharma89-s疫苗在小鼠中引发的抗体诱导的数据。
40.图14示出了使用由fmdv-a24cruzeiro-l转染细胞和fmdv-as1-sharma89-l转染细胞制备的蛋白裂解物进行的抗体结合的elisa分析的数据。
41.图15示出了sharir序列与cruzeiro序列之间的氨基酸序列对比。shamir vp4序列(seq id no:17)示出为与cruzeiro vp4序列(seq id no:18)对比；shamir vp2序列(seq id no:19)示出为与cruzeiro vp2序列(seq id no:20)对比；并且shamir 2a序列(seq id no:21)示出为与cruzeiro 2a(seq id no:22)对比。
42.图16示出了sharir序列与cruzeiro序列之间的氨基酸序列对比。shamir vp3序列(seq id no:23)示出为与cruzeiro vp3序列(seq id no:24)对比；并且shamir vp1序列(seq id no:25)示出为与cruzeiro vp1序列(seq id no:26)对比。
43.图17示出了一般fmdv dna疫苗构建体的示意图，表明该插入物被克隆到bamh1和xho-1位点中。一般fmdv疫苗的质粒图谱基于质粒pvax。fmdv插入物的实例可为在图17中示出为长形式插入物的长形式，或者为在图7中示出为短形式插入物的短形式。示出于每个形式中的ige前导序列被指示为任选的或可被不同的前导序列取代。2a序列被指示为任选的并且弗林蛋白酶切割位点(rgrkrrs
–
seq id no:27)被指示为可取代的。
具体实施方式
44.已产生了包含多种fmdv蛋白的融合蛋白和来自多种血清型的单个fmdv蛋白的共有氨基酸序列。还产生了编码所述蛋白质的核酸分子。
45.在本发明的一个方面，存在包含fmdv蛋白vp1、vp2、vp3、vp4和/或2a和/或3c的融合蛋白和编码所述蛋白的核酸序列，所述融合蛋白和所述核酸序列可被产生并且用于疫苗中，以针对一种或多种fmdv亚型(包括a、asia 1、o、c、sat1、sat2和sat3)的口蹄疫为哺乳动物提供保护。优选地，vp1基因对于所选择的fmdv亚型(例如本文描述为fmdv-sat2)是共有的，其中vp1为sat2共有vp1。
46.不受科学理论的限制，直接对抗一种或多种fmdv亚型的vp1、vp2、vp3和/或vp4的共有氨基酸序列的疫苗将提供有效地引发抗每一种fmdv亚型内的大部分种类的有效免疫反应(体液、细胞或两者)的一大组表位。不受科学理论的束缚，vp1为直接对抗vp1的共有氨基酸序列的疫苗的优良的免疫原性靶。vp1为显性免疫原(predominant immunogen)。
47.一些实施方案的构建体包括长形式和短形式。一些实施方案的构建体提供特定顺序vp4-vp2-vp3-vp1的病毒蛋白vp1、vp2、vp3和vp4。还提供了任选的尾巴2a。构建体具有任选的ige前导序列。在表达时，蛋白水解切割位点“cs”提供于vp4、vp2、vp3、vp1和2a(当存在时)中的每一个之间。可处理所述位点的蛋白酶在一些实施方案中可为氟林蛋白酶或者在一些实施方案中可为fmdv蛋白酶。可使用其它蛋白酶位点。位点必须由表达疫苗的细胞中常见的蛋白酶识别。
48.在本发明的一个方面，存在包含共有fmdv蛋白vp1、vp2、vp3、vp4和/或2a和/或3c的融合蛋白和编码所述蛋白的核酸序列，所述融合蛋白和所述核酸序列可被产生并且用于疫苗中，以针对一种或多种fmdv亚型(包括a、asia 1、o、c、sat1、sat2和sat3)的口蹄疫为哺乳动物提供保护。
49.在本发明的另一个方面，存在包含来自两种不同亚型的共有fmdv蛋白vp1的融合蛋白和编码所述蛋白的核酸序列，所述融合蛋白和所述核酸序列可被产生并且用于疫苗中，以针对一种或多种fmdv亚型(包括a、asia 1、o、c、sat1、sat2和sat3)的口蹄疫为哺乳动物提供保护。
50.在本发明的另一个方面，存在共有fmdv蛋白vp1和编码它们的核酸序列，所述蛋白质和所述核酸序列可被产生并且用于疫苗中，以针对一种或多种fmdv亚型(包括a、asia 1、o、c、sat1、sat2和sat3)的口蹄疫为哺乳动物提供保护。
51.1.定义。
52.本文所用的术语仅是出于描述特定实施方案的目的而并不旨在限制。除非上下文另外明确规定，否则如本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述(the)”包括复数指示物。
53.针对本文中数值范围的叙述，明确涵盖具有相同精确度的介于其间的每个数字。例如，针对6至9的范围，除了6和9之外还涵盖数字7和8，并且针对6.0至7.0的范围，明确涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
54.a.佐剂
55.本文中所使用的“佐剂”可以意指添加至本文中描述的dna质粒疫苗以增强口蹄疫病毒(fmdv)抗原的抗原性的任何分子，所述口蹄疫病毒(fmdv)抗原由在下文中描述的dna质粒和编码核酸序列编码。
56.b.抗体
[0057]“抗体”可意指类型igg、igm、iga、igd或ige的抗体，或片段、其片段或衍生物，包括fab、f(ab')2、fd以及单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。所述抗体可以是从哺乳动物的血清样本中分离出的抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体或其混合物，所述混合物对所需的表位或从其衍生的序列表现出足够的结合特异性。
[0058]
c.编码序列
[0059]
如本文所用的“编码序列”或“编码核酸”可意指包含编码蛋白质的核苷酸序列的
核酸(rna或dna分子)。编码序列可以进一步包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在向其施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的启动子和多腺苷酸化信号。
[0060]
d.互补序列
[0061]
如本文所用的“互补序列”或“互补的”可意指可以意味着核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(watson-crick)(例如，a-t/u和c-g)或hoogsteen碱基配对的核酸。
[0062]
e.共有或共有序列
[0063]
如本文所用的“共有”或“共有序列”可意指基于特定流感抗原的多个亚型的比对分析构建的合成核酸序列或相应多肽序列，其可用于诱导抗特定流感抗原的多个亚型或血清型的广泛免疫。共有fmdv抗原可包括vp1、vp2、vp3、vp4和c2蛋白酶核苷酸和氨基酸序列。另外，可将合成抗原如融合蛋白操作成共有序列(或共有抗原)。
[0064]
f.恒定电流
[0065]
如本文所用的“恒定电流”定义了在被递送至相同组织的电脉冲的持续时间中被组织或界定所述组织的细胞接收或经受的电流。电脉冲由本文所述的电穿孔装置来输送。因为本文提供的电穿孔装置具有优选具备即时反馈的反馈元件，所以此电流在所述组织中在电脉冲的持续时间内保持在恒定的电流强度下。反馈元件可以在整个脉冲持续时间内测量组织(或细胞)的阻抗并且导致电穿孔装置改变其电能输出(例如，增加电压)，以使得同一组织中的电流在整个电脉冲期间(大约几微秒)以及在不同脉冲之间保持恒定。在一些实施方案中，反馈元件包括控制器。
[0066]
g.电流反馈或反馈
[0067]
如本文所用的“电流反馈”或“反馈”可互换使用并且可以意指提供的电穿孔装置的活动响应，其包括测量电极之间的组织中的电流和相应地改变由ep装置递送的能量输出，以便将电流维持在恒定水平上。这一恒定水平是在启动脉冲序列或电疗之前由使用者预设的。反馈可通过电穿孔装置的电穿孔部件例如控制器来实现，因为其中的电路能够连续监测电极之间的组织中的电流并且将监测电流(或组织内的电流)与预设电流相比较，以及不断地进行能量输出调整以将监测电流维持在预设水平上。反馈回路可以是瞬时的，因为其模拟闭环反馈。
[0068]
h.分散电流
[0069]
如本文所用的“分散电流”可以意指从本文中描述的电穿孔装置的各种针电极阵列传递的电流的模式，其中所述模式最小化或优选消除电穿孔相关热应激在被电穿孔的组织的任何区域上发生。
[0070]
i.电穿孔
[0071]
如本文可互换使用的“电穿孔”、“电渗透”或“电动力学增强”(“ep”)可指使用跨膜电场脉冲在生物膜中诱导极微通道(孔)；其存在使生物分子如质粒、寡核苷酸、sirna、药物、离子和水能够从细胞膜的一侧通过至另一侧。
[0072]
j.反馈机制
[0073]
如本文所用的“反馈机制”可以指通过软件或硬件(或固件(firmware))进行的过程，该过程(在能量脉冲递送之前、期间和/或之后)接收期望组织的阻抗并且将其与当前值
(优选电流)相比较，然后调整递送的能量脉冲以达到预设值。反馈机制可通过模拟闭环电路来实现。
[0074]
k.片段
[0075]
如本文所用的“片段”可以意指一部分或核酸，所述部分或核酸编码能够在哺乳动物中引发与至少一个fmdv亚型如a、asia 1、c、o、sat1、sat2或sat3的非片段引发的免疫反应大体上相似的免疫反应的多肽。所述片段可包括由seq id no：1、3、5、7、9或11的核酸序列编码的fmdv蛋白的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。dna片段的长度可以为30或更多个核苷酸，长度可以为45或更多、60或更多、75或更多、90或更多、120或更多、150或更多、180或更多、210或更多、240或更多、270或更多、300或更多、360或更多、420或更多、480或更多、540或更多、600或更多、660或更多、720或更多、780或更多、840或更多、900或更多、960或更多、1020或更多、1080或更多、1140或更多、1200或更多、1260或更多、1320或更多、1380或更多、1440或更多、1500或更多、1560或更多、1620或更多、1680或更多、1740或更多、1800或更多、1860或更多、1820或更多、1880或更多、1940或更多、2000或更多、2600或更多、2700或更多、2800或更多、2900或更多、2910或更多、2920或更多、2930或更多、2931或更多、2932或更多、2933或更多、2934或更多、2935或更多、2936或更多、2937或更多，或2938或更多个核苷酸。
[0076]
dna片段可以包含用于免疫球蛋白前导序列如ige或igg序列的编码序列。
[0077]
dna片段可少于10个核苷酸、少于20、少于30、少于40、少于50、少于60、少于75、少于90、少于120、少于150、少于180、少于210、少于240、少于270、少于300、少于360、少于420、少于480、少于540、少于600、少于660、少于720、少于780、少于840、少于900、少于960、少于1020、少于1080、少于1140、少于1200、少于1260、少于1320、少于1380、少于1440、少于1500、少于1560、少于1620、少于1680或少于1740个核苷酸、少于1800、少于1860、少于1820、少于1880、少于1940、少于2000、少于2600、少于2700、少于2800、少于2900、少于2910、少于2920、少于2930、少于2931、少于2932、少于2933、少于2934、少于2935、少于2936、少于2937或少于2938个核苷酸。
[0078]“片段”还可指能够在哺乳动物中引发与至少一个fmdv亚型诸如a、asia 1、c、o、sat1、sat2或sat3的非片段引发的免疫反应大体上相似的免疫反应的多肽片段。片段可以是选自本发明的各种编码多肽序列的至少一个的多肽片段，所述编码多肽序列包括seq id no：2、4、6、8、10、12。可对多肽片段进行分析，以接触如由公众可用的数据库如los alamos国家实验室的fmdv序列数据库提供的至少一个抗原表位。蛋白质的片段可包括seq id no：2、4、6、8、10或12中示出的多蛋白中所述的fmdv蛋白的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。多肽可包括免疫球蛋白前导序列如ige或igg的氨基酸序列。多肽片段的长度可为30或更多个氨基酸，长度可为45或更多、60或更多、75或更多、90或更多、120或更多、150或更多、180或更多、210或更多、240或更多、270或更多、300或更多、360或更多、420或更多、480或更多、540或更多、600或更多、660或更多，或710个氨基酸或更多个氨基酸。多肽片段的长度可少于10个氨基酸、少于20、少于30、少于40、少于50、少于60、少于75、少于90、少于120、少于150、少于180、少于210、少于240、少于270、少于300、少于360、少于420、少于480、少于540、少于600、少于660、少于700、少于701、少于702、少于703、少于704、少于705、少于706、少于707、少于708、少于
709或少于710个氨基酸。
[0079]
l.同源性
[0080]
可使用clustalw(http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2/index.html)产生多序列比对的同源性。
[0081]
m.相同的
[0082]
如本文所用的"相同的"或"同一性"在两个或更多个核酸或多肽序列的背景中，可意指序列具有指定百分比的在指定的区域上为相同的残基。可通过以下方式计算百分比：最佳地对齐两个序列，在指定的区域上比较两个序列，测定两个序列中在其上存在相同残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以指定区域中位置的总数，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。在其中两个序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端以及指定的比较区域只包括单个序列的情况下，将单个序列的残基包括在计算的分母中而非分子中。在比较dna和rna时，胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)可被认为是等同的。可手动地或使用计算机序列算法如blast或blast 2.0来计算同一性。
[0083]
n.阻抗
[0084]
如本文所用，当论述反馈机制时可使用“阻抗”，可根据欧姆定律将其转变成电流值，从而使其能够与预设电流相比较。
[0085]
o.免疫反应
[0086]
如本文所用的“免疫反应”意指宿主免疫系统例如哺乳动物的免疫系统响应于通过提供的dna质粒疫苗进行的fmdv共有抗原的引入的激活。免疫反应可以呈细胞或体液反应或两者兼有的形式。
[0087]
p.核酸
[0088]
如本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”可意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描绘也定义互补链的序列。因此，核酸还涵盖所描绘的单链的互补链。核酸的许多变体可以用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖大致上相同的核酸及其互补序列。单链提供可以在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。
[0089]
核酸可以是单链或双链的，或可以含有双链序列和单链序列的部分。核酸可以是dna、基因组和cdna、rna或杂交体，其中核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合以及碱基的组合，所述碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。可以通过化学合成方法或通过重组方法获得核酸。
[0090]
核酸将通常含有磷酸二酯键，但是可包括核酸类似物，所述核酸类似物可具有至少一个不同的键联，例如，氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或o-甲基亚磷酰胺键联以及肽核酸主链和键联。其它核酸类似物包括具有阳性主链、非离子主链和非核糖主链的那些，包括美国专利号5,235,033和5,034,506中描述的那些，所述专利通过引用并入。含有一个或多个非天然存在的核苷酸或修饰核苷酸的核酸也包括在核酸的定义内。修饰核苷酸类似物可位于例如核酸分子的5
′
末端和/或3
′
末端。核苷酸类似物的代表性实例可选自糖修饰的核糖核苷酸或主链修饰的核糖核苷酸。然而，应当指出，核碱基修饰的核糖核苷酸，即含有非天然存在的核碱基而不是天然存在的核碱基的核糖核苷酸，如在5-位上修饰的尿苷或胞苷，例如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；在8-位上修饰的腺苷和鸟苷，例如8-溴鸟
苷；脱氮核苷酸，例如7-脱氮-腺苷；o-和n-烷基化核苷酸，例如n6-甲基腺苷也是合适的。2
′‑
oh-基团可被选自h、or、r、卤素、sh、sr、nh2、nhr、nr2或cn的基团代替，其中r为c
1-c6烷基、烯基或炔基并且卤素为f、cl、br或i。修饰核苷酸还包括通过例如羟脯氨醇键联与胆固醇缀合的核苷酸，如krutzfeldt等，nature(2005年10月30日)、soutschek等，nature 432:173-178(2004)和美国专利公布号20050107325中所描述的，所述文献和专利公布通过引用并入本文。修饰核苷酸和核酸还可包括锁核酸(lna)，如美国专利号20020115080中所描述的，所述专利通过引用并入本文。其它修饰核苷酸和核酸在美国专利公布号20050182005中有所描述，所述专利通过引用并入本文。磷酸核糖主链的修饰可出于各种原因来完成，例如增加所述分子在生理环境中的稳定性和半衰期、增强穿过细胞膜的扩散，或作为生物芯片上的探针。可制备天然存在的核酸和类似物的混合物；或者，可制备不同核酸类似物的混合物，和天然存在的核酸和类似物的混合物。
[0091]
q.可操作地连接
[0092]
如本文所用的“可操作地连接”可意指基因的表达处于与其在空间上连接的启动子的控制之下。启动子可定位于处于其控制下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子与基因之间的距离可以与启动子所源自的基因中启动子与其控制的基因之间的距离大致相同。如本领域中已知的，该距离的变化可被容许而不丧失启动子功能。
[0093]
r.启动子
[0094]
如本文所用的“启动子”可意指能够在细胞中赋予核酸的表达、激活或增强所述表达的合成或天然来源的分子。启动子可包括一个或多个特异性转录调控序列以进一步增强所述基因的表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可包括远端增强子或阻遏物元件，所述元件可位于距离转录起始位点多达数千个碱基对处。启动子可来源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子对于其中表达发生的组织或器官，对于表达发生所处的发育阶段或响应于外部刺激如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂，可组成型地或差异地调控基因组件的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体t7启动子、噬菌体t3启动子、sp6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、sv40晚期启动子、sv40早期启动子、rsv-ltr启动子、cmv ie启动子、sv40早期启动子或sv40晚期启动子和cmv ie启动子。
[0095]
s.严格杂交条件
[0096]
如本文所用的“严格杂交条件”可意指在其下第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶)如在核酸的复杂混合物中杂交的条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同的环境中将为不同的。严格条件可经选择比限定离子强度ph下特定序列的热熔点(tm)低约5-10℃。tm可以是(在限定的离子强度、ph和核酸浓度下)50％的与靶互补的探针与靶序列平衡杂交时所处的温度(当靶序列过量存在时，在tm下，50％的探针被平衡地占据)。严格条件可以是这样的条件，其中在ph 7.0至8.3下盐浓度低于约1.0m钠离子，如约0.01-1.0m的钠离子浓度(或其它盐)并且温度为至少约30℃(对于短探针，例如约10-50个核苷酸)和至少约60℃(对于长探针，例如大于约50个核苷酸)。严格条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可为本底杂交的至少2至10倍。示例性严格杂交条件包括下列条件：在42℃下于50％甲酰胺、5x ssc和1％sds中温育，或在65℃下于5x ssc、1％sds中温育，以及在65℃下于0.2x ssc和0.1％sds中洗涤。
[0097]
t.基本上互补
[0098]
如本文所用的“基本上互补”可意指第一序列与第二序列的互补序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸或氨基酸的区域内具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性，或两个序列在严格杂交条件下杂交。
[0099]
u.基本上相同的
[0100]
如本文所用的“基本上相同的”可意指第一序列和第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸或氨基酸的区域内具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性，或就核酸而言，如果第一序列与第二序列的互补序列基本上互补，则第一序列和第二序列基本上相同。
[0101]
v.亚型或血清型
[0102]“亚型”或“血清型”如本文互换使用的并且关于fmdv病毒，意指fmdv病毒抗原的基因变体，以使得一种亚型被免疫系统识别而从不同的亚型中分离。
[0103]
w.变体
[0104]
本文关于核酸所用的“变体”可意指(i)参照核苷酸序列的部分或片段；(ii)参照核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与参照核酸或其互补序列基本上相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参照核酸、其互补序列或与其基本上相同的序列杂交的核酸。
[0105]
关于肽或多肽的“变体”在氨基酸序列上的不同在于氨基酸的插入、缺失或保守性取代但保留至少一种生物活性。变体还可意指其氨基酸序列与参照蛋白质的氨基酸序列基本上相同的蛋白质，其保留至少一种生物活性。氨基酸的保守性取代，即用具有相似性质(例如，亲水性、带电荷区域的程度和分布)的不同氨基酸替代氨基酸，在本领域通常被认为包括小的变化。这些小的变化可部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定，如本领域中所理解的。kyte等，j.mol.biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数基于其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知具有相似亲水指数的氨基酸可被取代并且仍然保留蛋白质功能。在一方面，具有
±
2的亲水指数的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可用于揭示可产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的上下文中氨基酸的亲水性的考虑允许计算所述肽的最大局部平均亲水性，已报道与抗原性和免疫原性良好相关的有用的测量。美国专利号4,554,101，通过引用全部并入本文。具有相似亲水性值的氨基酸的取代可产生保留生物活性例如免疫原性的肽，如本领域中所理解的。可利用具有在
±
2内的亲水性值的氨基酸彼此进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值受所述氨基酸的具体侧链影响。与所述观察一致，应理解与生物功能相容的氨基酸取代依赖于氨基酸的相对相似性，特别地所述氨基酸的侧链的相对相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其它特性所揭示的。
[0106]
x.载体
[0107]
如本文所用的"载体"可意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是dna载体或rna载体。载体可以是自主复制的染色体外载体，或整合到宿主基因组中的载体。
[0108]
2.fmdv蛋白和编码序列
[0109]
亚型a、c、o、asia、sat1、sat2和sat3中的每一个的基因组可以以下登录号见于genbank中：
[0110]
a：jf749843
[0111]
c：nc_002554
[0112]
o：jf749851
[0113]
asia：dq533483
[0114]
sat-1：jf749860
[0115]
sat-2：jf749862
[0116]
sat-3：nc_011452.
[0117]
这些可用于定位亚型a、c、o、asia、sat1、sat2和sat3中的每一个的vp1、vp2、vp3和vp4中的每一个的编码序列。类似地，如上所述，wo 2011/054011公开了具有来自fmdv亚型a、c、o、asia、sat1、sat2和sat3的vp1、vp2、vp3、vp4的fmdv疫苗，但是采用不同设计。使用wo 2011/054011和genbank中的信息，本领域技术人员能够鉴定来自亚型a、c、o、asia、sat1，sat2和sat3的fmdv蛋白vp1、vp2、vp3、vp4中的每一个的编码序列。
[0118]
与来自亚型a、c、o、asia、sat1、sat2或sat3的fmdv蛋白vp1、vp2、vp3或vp4具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或99％或更多同源性的同源蛋白可用于一些构建体中。
[0119]
来自亚型a、c、o、asia、sat1、sat2或sat3的fmdv蛋白vp1、vp2、vp3或vp4的具有其全长序列的95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或99％或更多的片段可用于一些构建体中。
[0120]
与来自亚型a、c、o、asia、sat1，sat2或sat3的fmdv蛋白vp1、vp2、vp3或vp4具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或99％或更多同源性并且具有其全长序列的95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或99％或更多的蛋白质的片段可用于一些构建体中。
[0121]
这些fmdv蛋白、同源蛋白、fmdv蛋白的片段和同源蛋白的片段的编码序列可用于构建体中。
[0122]
天然蛋白水解切割位点可存在于每个共有抗原序列之间，如氨基酸序列：rgrkrrs。
[0123]
本文提供了一种能够在哺乳动物中引发抗一种或多种口蹄疫病毒(fmdv)亚型的免疫反应的抗原。所述抗原可以是包含衣壳蛋白vp1、vp2、vp3、vp4、其共有序列、其变体、其片段或其组合的fmdv抗原。fmdv抗原可来自fmdv亚型a、asia 1、c、o、sat1、sat2或sat3。fmdv抗原可含有至少一个抗原表位，所述表位对于可对其诱导免疫反应的特定fmdv免疫原可以是有效的。fmdv抗原的空病毒衣壳蛋白vp1-vp4提供了一整套存在于完整fmdv病毒中的免疫原性位点和表位。共有fmdv抗原序列可来源于来自一个fmdv亚型的多种fmdv病毒的fmdv抗原序列。共有fmdv抗原可包括vp1、vp2、vp3和vp4 fmdv亚型共有蛋白序列，其可以是共有vp1-vp4蛋白。共有vp1-vp4蛋白可包括至少一个fmdv蛋白3c切割位点。蛋白3c切割位点可存在于共有vp1-4蛋白的每一个共有vp1、vp2、vp3和vp4序列之间。蛋白3c对共有vp1-vp4蛋白的切割可切割共有vp1-vp4蛋白以产生共有vp1蛋白、共有vp2蛋白、共有vp3蛋白和共有vp4蛋白。可选地，天然蛋白水解切割位点可存在于每个共有抗原序列之间，如氨基酸序列：rgrkrrs。
[0124]
在一些实施方案中，蛋白质为80％同源的。在一些实施方案中，蛋白质为90％同源
的。在一些实施方案中，蛋白质为95％同源的。在一些实施方案中，蛋白质为96％同源的。在一些实施方案中，蛋白质为97％同源的。在一些实施方案中，蛋白质为98％同源的。在一些实施方案中，蛋白质为99％同源的。
[0125]
本文提供了能够在哺乳动物中引发抗一种或多种口蹄疫病毒(fmdv)亚型的免疫反应的抗原的编码序列。所述抗原可以是包含衣壳蛋白vp1、vp2、vp3、vp4、其共有序列、其变体、其片段或其组合的fmdv抗原。fmdv抗原可来自fmdv亚型a、asia 1、c、o、sat1、sat2或sat3。fmdv抗原可含有至少一个抗原表位，所述表位对于可对其诱导免疫反应的特定fmdv免疫原可以是有效的。fmdv抗原的空病毒衣壳蛋白vp1-4提供了一整套存在于完整fmdv病毒中的免疫原性位点和表位。共有fmdv抗原序列可来源于来自一个fmdv亚型的多种fmdv病毒的fmdv抗原序列。共有fmdv抗原可包括vp1、vp2、vp3和vp4 fmdv亚型共有蛋白序列，其可以是共有vp1-4蛋白。共有vp1-4蛋白可包括至少一个fmdv蛋白3c切割位点。蛋白3c切割位点可存在于共有vp1-4蛋白的每个共有vp1、vp2、vp3和vp4序列之间。蛋白3c对共有vp1-4蛋白的切割可切割共有vp1-4蛋白以产生共有vp1蛋白、共有vp2蛋白、共有vp3蛋白和共有vp4蛋白。可选地，天然蛋白水解切割位点可存在于每个共有抗原序列之间，如氨基酸序列：rgrkrrs。提供了包含蛋白酶3c的共有序列的融合蛋白的编码序列。
[0126]
此外，编码序列可编码可为本文所述的蛋白质的片段的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为共有蛋白的20％的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为共有蛋白的30％的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为共有蛋白的40％的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为共有蛋白的50％的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为共有蛋白的60％的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为共有蛋白的70％的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为共有蛋白的85％的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为共有蛋白的90％的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为共有蛋白的95％的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为共有蛋白的96％的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为共有蛋白的97％的蛋白质。i
[0127]
此外，编码序列可编码与本文所提供的蛋白质具有同源性的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码具有80％同源性的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码具有90％同源性的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码具有95％同源性的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码具有96％同源性的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码具有97％同源性的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码具有98％同源性的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码具有99％同源性的蛋白质。
[0128]
此外，编码序列编码为与本文所述的蛋白质具有同源性的蛋白质的片段的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白的20％的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白的30％的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白的40％的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白的50％的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白的60％的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白的70％的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白的80％的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白的90％的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白的95％的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白的96％的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白的97％的蛋白质。在一些实施方案
中，编码序列编码为同源蛋白的98％的蛋白质。在一些实施方案中，编码序列编码为同源蛋白的99％的蛋白质。
[0129]
3.质粒
[0130]
本文中提供了一种能够以有效地引发哺乳动物的免疫反应的量在哺乳动物的细胞中表达一种或多种fmdv抗原的载体。载体可以包含编码fmdv抗原的异源核酸。载体可以是质粒。质粒可用于利用编码fmdv抗原的核酸转染细胞，培养所转化的宿主细胞，将其在其中fmdv抗原的表达发生的条件下进行维持。
[0131]
质粒可包含编码选自本文所提供的蛋白质、其片段、其同源序列和同源序列的片段的fmdv抗原的核酸。质粒还可包含可位于编码序列上游的起始密码子或前导序列和可位于编码序列下游的终止密码子。起始密码子和终止密码子可与编码序列同框。
[0132]
质粒还可包含可操作地连接至编码序列的启动子。可操作地连接至编码序列的启动子可以是来自猿猴病毒40(sv40)的启动子、小鼠乳腺瘤病毒(mmtv)启动子、人免疫缺陷病毒(hiv)启动子如牛免疫缺陷病毒(biv)长末端重复(ltr)启动子、莫洛尼(moloney)病毒启动子、禽类白血病病毒(alv)启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子如cmv立即早期启动子、eb病毒(ebv)启动子或劳氏肉瘤病毒(rsv)启动子。启动子还可以是来自人基因的启动子，所述人基因如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。启动子还可以是组织特异性启动子，如天然或合成的肌肉或皮肤特异性启动子。所述启动子的实例在美国专利申请公布号us20040175727中进行描述，所述申请公布的整体内容并入本文。
[0133]
质粒还可包括多腺苷酸化信号，其可位于编码序列的下游。多腺苷酸化信号可以是sv40多腺苷酸化信号、ltr多腺苷酸化信号、牛生长激素(bgh)多腺苷酸化信号、人生长激素(hgh)多腺苷酸化信号或人β-珠蛋白多腺苷酸化信号。sv40多腺苷酸化信号可以是来自pcep4质粒(invitrogen,san diego,ca)的多腺苷酸化信号。
[0134]
质粒还可在编码序列的上游包含增强子。增强子可为人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子如来自cmv、fmdv、rsv或ebv之一。多核苷酸功能增强描述于美国专利号5,593,972、5,962,428和wo94/016737中，所述每个专利的内容通过引用全部并入。
[0135]
质粒还可包含哺乳动物复制起点，以便在细胞中使质粒保持于染色体外并且产生质粒的多个拷贝。质粒可以是来自invitrogen(san diego,ca)的pvax1、pcep4或prep4，其可以包含eb病毒复制起点和核抗原ebna-1编码区，其可产生高拷贝游离型复制而不整合。质粒的主链可以是pav0242。质粒可以是复制缺陷型腺病毒5型(ad5)质粒。
[0136]
质粒还可包含可良好地适应于在向其施用了质粒的细胞中的基因表达的调控序列。编码序列可包含可允许在宿主细胞中更高效地转录编码序列的密码子。
[0137]
编码序列可包含ig前导序列。前导序列可位于编码序列的5’。由该序列编码的共有蛋白可包含n-末端ig前导序列，接着是共有蛋白。n-末端ig前导序列可以为ige或igg。
[0138]
质粒可以是pse420(invitrogen,san diego,calif.)，其可用于在大肠杆菌(escherichia coli)(e.coli)中产生蛋白质。质粒还可以是pyes2(invitrogen,san diego,calif.)，其可用于在酵母的酿酒酵母株系(saccharomyces cerevisiae strains)中产生蛋白质。质粒还可具有maxbactm完全杆状病毒表达系统(invitrogen,san diego,calif.)，其可用于在昆虫细胞中产生蛋白质。质粒还可以是pcdna i或pcdna3
(invitrogen,san diego,calif.)，其可用于在哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(cho)细胞中产生蛋白质。
[0139]
质粒可包含一个或多个编码序列，所述编码序列编码来自一种或多种亚型如asia、a、o、c、sat1、sat2和sat3的vp1、vp2、vp3、vp4和3c中的一个或多个。
[0140]
在一些实施方案中，质粒包含来自亚型asia、a、o、c、sat1、sat2或sat3的多个不同的共有fmdv抗原vp1、vp2、vp3、vp4和3c的编码序列。
[0141]
在一些实施方案中，质粒包含来自亚型asia、a、o、c、sat1、sat2或sat3的多个不同的共有fmdv抗原vp1、vp2、vp3和vp4的编码序列。
[0142]
在一些实施方案中，质粒包含来自亚型asia、a、o和c中的两个的两个不同的共有fmdv抗原vp1的编码序列，如来自亚型asia的vp1和来自亚型o的vp1，或来自亚型a的vp1和来自亚型c的vp1。
[0143]
在一些实施方案中，质粒包含共有fmdv抗原vp1如vp1亚型asia、vp1亚型a、vp1亚型o或vp1亚型c的编码序列。
[0144]
编码序列可由全部由可操作地连接的启动子调控的不同dna质粒编码，例如具有由一个或多个启动子调控的编码序列的dna质粒，所述编码序列包含多个共有fmdv抗原。
[0145]
载体可以是pvax1或具有变化的pvax1变体，如本文中所描述的变异质粒。变异pvax1质粒是主链载体质粒pvax1(invitrogen,carlsbad ca)的2998个碱基对变体。cmv启动子位于碱基137-724处。t7启动子/引发位点处于碱基664-683处。多克隆位点处于碱基696-811处。牛gh多腺苷酸化信号处于碱基829-1053处。卡那霉素抗性基因处于碱基1226-2020处。puc起点处于碱基2320-2993处。
[0146]
基于从invitrogen获得的pvax1的序列，在用作本文中列出的质粒1-6的主链的pvax1的序列中发现以下突变：
[0147]
c》g241在cmv启动子中
[0148]
c》t 1942主链，牛生长激素多腺苷酸化的下游信号(bghpolya)
[0149]
a》-2876主链，卡那霉素基因的下游
[0150]
c》t 3277在高拷贝数突变的puc复制起点(ori)中(参见nucleic acid research 1985)
[0151]
g》c 3753在rnaseh位点上游的puc ori的最末端
[0152]
在主链中位于cmv启动子上游的碱基对2、3以及4由act变为ctg。
[0153]
载体的主链可以是pav0242。载体可以是复制缺陷型腺病毒5型(ad5)载体。
[0154]
质粒还可包含可良好地适应于在向其施用了质粒的细胞中的基因表达的调控序列。编码序列可包含可允许在宿主细胞中更高效地转录编码序列的密码子。
[0155]
编码序列还可包含ig前导序列。前导序列可位于编码序列的5’。由该序列编码的共有抗原可包含n-末端ig前导序列，接着是共有抗原蛋白。n-末端ig前导序列可以为ige或igg。
[0156]
质粒可以是pse420(invitrogen,san diego,calif.)，其可用于在大肠杆菌(e.coli)中产生蛋白质。质粒还可以是pyes2(invitrogen,san diego,calif.)，其可用于在酵母的酿酒酵母株系(saccharomyces cerevisiae strains)中产生蛋白质。质粒还可以具有maxbactm完全杆状病毒表达系统(invitrogen,san diego,calif.)，其可用于在昆虫
细胞中产生蛋白质。质粒还可以是pcdna i或pcdna3(invitrogen,san diego,calif.)，其可用于在哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(cho)细胞中产生蛋白质。
[0157]
4.疫苗
[0158]
不受科学理论的束缚，可用于引发广泛的抗fmdv的免疫反应(体液、细胞或两者)的疫苗可包含上文所示的一个或多个编码序列，即编码来自选自由以下组成的组的亚型的一种或多种蛋白vp1、vp2、vp3、cvp4和2a的核酸序列：fmdv亚型，如a、asia 1、c、o、sat1、sat2、sat3或其组合。在一些实施方案中，疫苗还可包含编码fmdv c3蛋白酶的核酸，其可为共有c3蛋白酶核酸。
[0159]
这包括：
[0160]
包含编码口蹄疫病毒的至少vp1-vp3，并且优选地vp1-4的共有氨基酸序列的序列的分离核酸，其在接种疫苗的受试者体内引发抗fmd的多个亚型(包括a、asia 1、c、o、sat1、sat2、sat3、sat4)的交叉反应性免疫反应。核酸可包含选自由以下组成的组的序列：(a)seq id no:1，编码seq id no:2的核苷酸序列；(b)seq id no:3，编码seq id no:4的核苷酸序列；(c)seq id no:5，编码seq id no:6的核苷酸序列；d)seq id no:7，编码seq id no:8的核苷酸序列；e)seq id no:9；编码seq id no:10的核苷酸序列；以及f)seq id no:11；编码seq id no:12的核苷酸序列。
[0161]
本文提供了一种能够在哺乳动物中产生抗一种或多种fmdv亚型的免疫反应的疫苗。疫苗可包含如以上所讨论的质粒。疫苗可包含多个质粒，所述质粒各自针对一种或多种fmdv亚型如a、asia 1、c、o、sat1、sat2、sat3或其组合。疫苗还可包含本身针对一种或多种fmdv亚型如a、asia 1、c、o、sat1、sat2、sat3或其组合的fmdv抗原。疫苗还可包括针对来自世界的特定区域例如亚洲、欧洲和南非(sub-africa)的fmdv亚型的质粒。或者或此外，疫苗可包含一种或多种fmdv亚型如a、asia 1、c、o、sat1、sat2、sat3或其组合的蛋白质。疫苗还可包含本身针对一种或多种fmdv亚型如a、asia 1、c、o、sat1、sat2、sat3或其组合的fmdv抗原。疫苗还可包含针对来自世界的特定区域例如亚洲、欧洲和南非的fmdv亚型的质粒和/或蛋白质。疫苗可提供来诱导治疗性或预防性免疫反应。
[0162]
本文提供根据本发明的药物组合物，所述组合物包含约1纳克至约10mg的dna。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含：1)至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克，或至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克，或至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg或更多；和2)至多并且包括15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克，或至多并且包括1、
5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克，或至多并且包括1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约5纳克至约10mg的dna。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约25纳克至约5mg的dna。在一些实施方案中，药物组合物含有约50纳克至约1mg的dna。在一些实施方案中，药物组合物含有约0.1微克至约500微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物含有约1微克至约350微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物含有约5微克至约250微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物含有约10微克至约200微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物含有约15微克至约150微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物含有约20微克至约100微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物含有约25微克至约75微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物含有约30微克至约50微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物含有约35微克至约40微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物含有约100微克至约200微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物包含约10微克至约100微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物包含约20微克至约80微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物包含约25微克至约60微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物包含约30纳克至约50微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物包含约35纳克至约45微克的dna。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约0.1微克至约500微克的dna。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约1微克至约350微克的dna。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约25微克至约250微克的dna。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约100微克至约200微克的dna。
[0163]
根据本发明的药物组合物根据待使用的施用方式来进行配制。在药物组合物是可注射的药物组合物的情况下，它们是无菌、无热原质和无颗粒的。优选使用等渗制剂。通常，用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下，等渗溶液如磷酸盐缓冲盐水是优选的。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，将血管收缩剂添加至制剂中。
[0164]
优选地，药物组合物是疫苗，并且更优选地dna疫苗。
[0165]
疫苗可以是dna疫苗。dna疫苗可包含多个相同或不同的质粒，所述质粒包含一种或多种共有前列腺抗原的核酸编码序列。dna疫苗可包含一种或多种核酸序列，所述核酸序列编码一种或多种共有前列腺抗原。当dna疫苗包含多于一种共有前列腺抗原的编码序列时，所有所述序列可存在于单个质粒上，或每个所述序列可存在于不同的质粒上。
[0166]
在一些实施方案中，疫苗可包含编码与一种或多种共有前列腺抗原组合的一种或多种共有前列腺抗原的核酸序列。
[0167]
dna疫苗公开于美国专利号5,593,972、5,739,118、5,817,637、5,830,876、5,962,428、5,981,505、5,580,859、5,703,055和5,676,594中，所述专利通过引用全部并入本文。dna疫苗还可包含阻止其整合到染色体中的元件或试剂。疫苗可以是前列腺抗原的rna。rna疫苗可以被引入到细胞中。
[0168]
疫苗可以是包含上文所述的基因构建体或抗原的重组疫苗。疫苗还可包含一种或多种共有前列腺抗原，所述抗原呈一种或多种蛋白质亚单位或一种或多种包含一种或多种共有抗原的减毒病毒颗粒的形式。减毒疫苗可以是减毒的活疫苗、灭活疫苗和使用重组载体递送编码一种或多种共有前列腺抗原的外源基因的疫苗，以及亚单位疫苗和蛋白质疫苗。减毒的活疫苗、使用重组载体递送前列腺抗原的那些疫苗、亚单位疫苗以及糖蛋白疫苗的实例描述于美国专利号：4,510,245、4,797,368、4,722,848、4,790,987、4,920,209、5,017,487、5,077,044、5,110,587、5,112,749、5,174,993、5,223,424、5,225,336、5,240,703、5,242,829、5,294,441、5,294,548、5,310,668、5,387,744、5,389,368、5,424,065、5,451,499、5,453,364、5,462,734、5,470,734、5,474,935、5,482,713、5,591,439、5,643,579、5,650,309、5,698,202、5,955,088、6,034,298、6,042,836、6,156,319和6,589,529中，所述专利各自以引用的方式并入本文。疫苗可包含与其它疫苗组分如fmdv蛋白或编码蛋白质的表达载体组合的质粒。
[0169]
所提供的疫苗可以用来诱导免疫反应，包括治疗性或预防性免疫反应。可产生针对共有前列腺抗原的抗体和/或杀伤t细胞。可以分离所述抗体和细胞。
[0170]
疫苗还可包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可为作为媒介物、佐剂、载体或稀释剂的功能分子。药学上可接受的赋形剂可为转染促进剂，其可包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(iscoms)、弗氏(freunds)不完全佐剂、lps类似物(包括单磷酰脂质a)、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡(如角鲨烯(squalene)和角鲨烯(squalene))、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。
[0171]
转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-l-谷氨酸(lgs))或脂质。转染促进剂为聚-l-谷氨酸，并且更优选地，聚-l-谷氨酸以小于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(iscoms)、弗氏不完全佐剂、lps类似物(包括单磷酰脂质a)、胞壁酰肽、醌类似物以及囊泡(如角鲨烯和角鲨烯)，并且透明质酸还可结合基因构建体施用而使用。在一些实施方案中，dna质粒疫苗也可包括转染促进剂，如脂质、脂质体(包括卵磷脂脂质体或本领域中已知的其它脂质体，如dna-脂质体混合物(参见例如w09324640))、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子，或其它已知的转染促进剂。优选地，转染促进剂为聚阴离子、聚阳离子(包括聚-l-谷氨酸(lgs))或脂质。疫苗中的转染剂的浓度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。
[0172]
药学上可接受的赋形剂可为佐剂。佐剂可以是在替代性质粒中表达或在疫苗中以蛋白质形式与以上质粒组合递送的其它基因。佐剂可选自由以下组成的组：α-干扰素(ifn-α)、β-干扰素(ifn-β)、γ-干扰素、血小板衍生的生长因子(pdgf)、tnfα、tnfβ、gm-csf、表皮生长因子(egf)、皮肤t细胞虏获趋化因子(ctack)、上皮胸腺表达趋化因子(teck)、粘膜相关上皮趋化因子(mec)、il-12、il-15、mhc、cd80、cd86(包括缺失信号序列且任选包括来自ige的信号肽的il-15)。佐剂可以是il-12、il-15、ctack、teck、血小板衍生的生长因子
12、il-15、ctack、teck、血小板衍生的生长因子(pdgf)、tnfα、tnfβ、gm-csf、表皮生长因子(egf)、il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-10、il-12、il-18、mcp-1、mip-1a、mip-1p、il-8、rantes、l-选择素、p-选择素、e-选择素、cd34、glycam-1、madcam-1、lfa-1、vla-1、mac-1、p150.95、pecam、icam-1、icam-2、icam-3、cd2、lfa-3、m-csf、g-csf、il-4、il-18的突变体形式、cd40、cd40l、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、il-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、fas、tnf受体、flt、apo-1、p55、wsl-1、dr3、tramp、apo-3、air、lard、ngrf、dr4、dr5、killer、trail-r2、trick2、dr6、半胱天冬酶ice、fos、c-jun、sp-1、ap-1、ap-2、p38、p65rel、myd88、irak、traf6、ikb、不活化nik、sap k、sap-1、jnk、干扰素应答基因、nfkb、bax、trail、trailrec、trailrecdrc5、trail-r3、trail-r4、rank、rank配体、ox40、ox40配体、nkg2d、mica、micb、nkg2a、nkg2b、nkg2c、nkg2e、nkg2f、tap1、tap2及其功能片段或其组合。还可将疫苗与ctack蛋白、teck蛋白、mec蛋白或其功能片段组合施用。
[0182]
可通过不同途径包括口服、胃肠外、舌下、经皮肤、经直肠、经粘膜、局部、通过吸入、通过颊部施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内、鞘内以及关节内或其组合施用疫苗。对于兽医学使用，可按照正常的兽医学操作将组合物作为适当地可接受的制剂施用。兽医可容易地确定最适合于特定动物的给药方案和施用途径。可利用传统注射器、无针注射装置、“微粒轰击基因枪(microprojectile bombardment gone gun)”或其它物理方法如电穿孔(“ep”)、“水动力学法”或超声施用疫苗。
[0183]
可通过几种公知的技术将疫苗的质粒递送至哺乳动物，所述技术包括利用和不利用体内电穿孔的dna注射(也称为dna接种)、脂质体介导的、纳米颗粒促进的重组载体如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus)和重组疫苗。fmdv抗原可通过dna注射结合体内电穿孔来递送。
[0184]
b.电穿孔
[0185]
可使用电穿孔装置来实现通过疫苗的质粒的电穿孔施用疫苗，所述电穿孔装置可被配置成将能量脉冲递送至哺乳动物的期望组织，所述能量脉冲产生与由用户预设的电流输入相似的恒定电流。电穿孔装置可包括电穿孔部件和电极组件或操作组件(handle assembly)。电穿孔部件可包括和整合电穿孔装置的各种元件中的一个或多个，包括：控制器、电流波形发生器、阻抗检测器、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储器部件(memory component)、电源和电源开关。电穿孔可使用vgxp cellectra
tm
系统来实现促进质粒对细胞的转染。
[0186]
电穿孔部件可用作电穿孔装置的一个元件，并且其它元件是与电穿孔部件连通的独立元件(或部件)。电穿孔部件可用作电穿孔装置的多于一个的元件，其可与电穿孔装置的与电穿孔部件分开的其它元件连通。作为一个电机或机器装置的部件存在的电穿孔装置的元件可以不受限制，因为所述元件可用作一个装置或用作彼此连通的独立元件。电穿孔部件可以能够递送在期望组织中产生恒定电流并且包括反馈机制的能量脉冲。电极组件可包括在空间排列中具有多个电极的电极阵列，其中电极组件接收来自电穿孔部件的能量脉冲并且将所述能量脉冲通过电极递送至期望组织。多个电极中的至少一个在能量脉冲的递送过程中是中性的，并且测量期望组织中的阻抗，将阻抗通信至电穿孔部件。反馈机制可接收测量的阻抗并且可调整通过电穿孔部件递送的能量脉冲以维持恒定电流。
[0187]
多个电极可以以分散模式递送能量脉冲。多个电极可通过在编程序列下控制电极
来以分散模式递送能量脉冲，并且所述编程序列由用户输入至电穿孔部件。编程序列可包括多个按顺序递送的脉冲，其中通过至少两个有源电极(具有一个测量阻抗的中性电极)递送多个脉冲的每一个脉冲，并且其中通过至少两个有源电极(具有一个测量阻抗的中性电极)中的不同电极递送多个脉冲的后续脉冲。
[0188]
反馈机制可利用硬件或软件来进行。反馈机制可通过模拟闭环电路来进行。反馈每50μs、20μs、10μs或1μs发生一次，但优选实时反馈或瞬时反馈(即，基本上同时，如通过用于测定反应时间的可获得的技术测定的)。中性电极可测量期望组织中的阻抗并将阻抗通信至反馈机制，并且反馈机制对阻抗作出反应并且调整能量脉冲以将恒定电流维持在与预设电流相似的值上。反馈机制可在能量脉冲的递送过程中连续和即时地维持恒定电流。
[0189]
可促进本发明的dna疫苗递送的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括在draghia-akli等的美国专利号7,245,963、smith等提交的美国专利公布2005/0052630中所述的那些，所述专利和专利公布的内容特此通过引用整体并入。可用于促进dna疫苗递送的其它电穿孔装置和电穿孔方法包括提供于2007年10月17日提交的共同未决和共同拥有的美国专利申请序列号11/874072中的那些，所述美国专利申请根据35usc 119(e)要求2006年10月17日提交的美国临时申请序列号60/852,149和2007年10月10日提交的60/978,982的权益，全部所述美国临时申请特此通过引用整体并入。
[0190]
draghia-akli等的美国专利号7,245,963描述了模块化电极系统及其在用于促进生物分子导入体内或植物的选定组织的细胞中的用途。模块化电极系统可包括多个针电极；皮下针；提供从可编程恒定电流脉冲控制器向多个针电极的导电性连接的电连接器；以及电源。操作员可握住固定在承载结构上的多个针电极并牢固地将其插入到体内或植物的选定组织中。然后经由皮下针将生物分子递送到所选择的组织中。激活可编程恒定电流脉冲控制器，并且将恒定电流电脉冲施加至多个针电极。所施加的恒定电流电脉冲促进生物分子导入到多个电极之间的细胞中。美国专利号7,245,963的全部内容特此以引用的方式并入。
[0191]
由smith等提交的美国专利公布2005/0052630描述了可用于有效地促进生物分子导入体内或植物的选定组织的细胞中的电穿孔装置。电穿孔装置包括由软件或固件规定其操作的电动装置(“ekd装置”)。ekd装置基于使用者控制和脉冲参数的输入在阵列中的电极之间产生一系列可编程恒定电流脉冲模式，并且允许电流波形数据的存储和获取。电穿孔装置还包括具有针电极阵列的可更换的电极盘、注射针用中心注射通道和可移动导向盘。特此将美国专利公布2005/0052630的全部内容通过引用并入。
[0192]
美国专利号7,245,963和美国专利公布2005/0052630中描述的电极阵列和方法不仅可适用于深穿透至组织如肌肉，而且可适用于深穿透至其它组织或器官。由于电极阵列的配置，注射针(用于递送所选生物分子)也完全插入到靶器官中，并且注射在由电极所预描绘的区域中垂直于靶组织施用的。美国专利号7,245,963和美国专利公布2005/005263中描述的电极优选为20mm长和21规格。
[0193]
此外，在一些实施方案中涵盖了并入电穿孔装置以及其用途，电穿孔装置有下述专利中所述的那些：1993年12月28日授权的美国专利5,273,525、2000年8月29日授权的美国专利6,110,161、2001年7月17日授权的6,261,281和2005年10月25日授权的6,958，060以及2005年9月6日授权的美国专利6,939,862。此外，本文涵盖了涵盖主题的专利，所述主题
no:5)的克隆的一对染色凝胶；图4示出了示出a24cruzeiro-s(左
–
seq id no:3)和a24cruzeiro-l(右
–
seq id no:1)的克隆的一对染色凝胶。图6示出了示出sat2-s(左
–
seq id no:11)和sat2-l(右
–
seq id no:9)的克隆的一对染色凝胶。这些数据示出插入物已适当地掺入相应的质粒中。图2示出了fmdv-as1-shamir89-l长形式的氨基酸序列。图4示出了fmdv-a24cruzeiro-l长形式的氨基酸序列。图6示出了fmdv-sat2长形式的氨基酸序列。在每个长形式中，序列包括以阴影表示的n末端处的ige前导序列、以小写体表示的蛋白水解切割位点以及ige前导序列与第一蛋白水解切割位点之间的以黑体表示的vp4序列。第一蛋白水解切割位点与第二蛋白水解切割位点之间为vp2的编码序列。第二蛋白水解切割位点与第三蛋白水解切割位点之间为vp3的编码序列。第三蛋白水解切割位点与第四蛋白水解切割位点之间为vp1的编码序列。2a序列在最后一个(第四)蛋白水解切割位点与终止之间。
[0203]
图7示出了蛋白表达的实验结果。将sds凝胶上蛋白质的免疫印迹与由fmdv-a24cruzeiro-s短形式、fmdv-a24cruzeiro-l长形式、pvax、fmdv-as1-shamir89-s短形式和fmdv-as1-shamir89-l长形式所产生的样品的蛋白表达进行对比。用抗-a24抗血清探测印迹。
[0204]
图8示出了使用电穿孔来评估相对于空白在施用以下各项后的免疫反应的免疫实验的实验方案：1)pvax、2)fmdv-a24cruzeiro-l、3)fmdv-a24cruzeiro-s、4)fmdv-shamir89-l、5)fmdv-shamir89-s、fmdv-sat2-l、fmdv-sat2-s。
[0205]
图9示出了由fmdv-a24cruzeiro-l和fmdv-a24cruzeiro-s疫苗引发的细胞免疫反应的数据。图10示出了由fmdv-as1-sharma89-l和fmdv-as1-sharma89-s疫苗引发的细胞免疫反应的数据。图11示出了由fmdv-sat2-l和fmdv-sat2-s疫苗引发的细胞免疫反应的数据。图12示出了用于elisa分析的dna转染和细胞裂解物制备的实验方案。图13示出了由fmdv-a24cruzeiro-l和fmdv-a24cruzeiro-s疫苗以及fmdv-as1-sharma89-l和fmdv-as1-sharma89-s疫苗在小鼠中引发的抗体诱导的数据。图14示出了使用由fmdv-a24cruzeiro-l转染细胞和fmdv-as1-sharma89-l转染细胞制备的蛋白裂解物进行的抗体结合的elisa分析的数据。fmdv疫苗在小鼠中是具有免疫原性的。在所有免疫动物中观察到血清转化。长形式疫苗比短形式疫苗更强效。与creuzeiro疫苗相比，体液反应看上去对于shamir疫苗更强效，但是两种疫苗都是强效的。与creuzeiro疫苗相比，细胞反应对于shamir疫苗更具交叉反应性。用牛血清反应阳性的血清进行的对比显示疫苗诱导了适当水平的免疫反应性。
[0206]
图15示出了sharir序列与cruzeiro序列之间的氨基酸序列对比。shamir vp4序列(seq id no:17)示出为与cruzeiro vp4序列(seq id no:18)对比；shamir vp2序列(seq id no:19)示出为与cruzeiro vp2序列(seq id no:20)对比；并且shamir 2a序列(seq id no:21)示出为与cruzeiro 2a(seq id no:22)对比。
[0207]
图16示出了sharir序列与cruzeiro序列之间的氨基酸序列对比。shamir vp3序列(seq id no:23)示出为与cruzeiro vp3序列(seq id no:24)对比；并且shamir vp1序列(seq id no:25)示出为与cruzeiro vp1序列(seq id no:26)对比。
[0208]
实施例2
[0209]
已设计了十四个构建体以用于制备fmdv疫苗。使用了来自七种口蹄疫病毒亚型a、asia 1、c、o、sat1、sat2、sat3、sat4的序列。可使用两种构建体设计-长型式和短型式。相应地，对于亚型a、asia 1、c、o、sat1、sat2、sat3、sat4中的每一个，存在长形式和短形式的构
建体，获得14种构建体。可使用少至4种构建体产生疫苗，并且通常为7。
[0210]
一般长形式示于图17中。免疫原编码序列以vp4、vp2、vp3、vp1的顺序布置。蛋白酶切割位点的编码序列将四个病毒蛋白中的每一个分开。可为所提供的任何任选的ige前导序列提供编码序列。同样，fmdv肽2a尾巴提供于包括蛋白酶切割位点的末端。
[0211]
一般短形式也示于图17中。免疫原编码序列以vp2、vp3、vp1的顺序布置。蛋白酶切割位点的编码序列将四个病毒蛋白中的每一个分开。可为所提供的任何任选的ige前导序列提供编码序列。同样，16个氨基酸的2a尾巴提供于包括蛋白酶切割位点的末端。
[0212]
将构建体插入质粒表达载体中，产生14种质粒。
[0213]
在一些实施方案中，疫苗包括a
–
长形式、asia 1-长、c
–
长形式、o
–
长形式、sat1
–
长形式、sat2
–
长形式、sat3
–
长形式和sat4
–
长形式。
[0214]
在一些实施方案中，疫苗包括a
–
短形式、asia 1-短、c
–
短形式、o
–
短形式、sat1
–
短形式、sat2
–
短形式、sat3
–
短形式和sat4
–
短形式。
[0215]
在一些实施方案中，疫苗包括a
–
长形式、asia 1-长、c
–
长形式和o
–
长形式。
[0216]
在一些实施方案中，疫苗包括a
–
短形式、asia 1-短、c
–
短形式和o
–
短形式。
[0217]
n末端可为前导序列，如ige或igg，或者不为前导序列。
[0218]
单个病毒蛋白将被通常存在于其中期望表达的细胞中的蛋白酶彼此分开。
[0219]
wo 2011/054011公开了fmdv疫苗。可被包括在各种实施方案中的28个序列的氨基酸序列和编码序列被包括在本公开中。十四个病毒序列为：fmdv亚型a、asia 1、o、c、sat1、sat2和sat3中每一个的vp1、vp2、vp3和vp4。本文所公开的序列可用于产生可被包括在疫苗中的构建体。
[0220]
构建体包括长形式和短形式。图1示出了各自的部分一般形式。如图17中所示，在本发明中，构建体提供特定顺序vp4-vp2-vp3
–
vp1的病毒蛋白vp1、vp2、vp3和vp4。还提供了任选的尾巴2a。构建体具有任选的ige前导序列。在表达时，蛋白水解切割位点“cs”提供于vp4、vp2、vp3、vp1和2a(当存在时)中的每一个之间。在一些实施方案中，可处理所述位点的蛋白酶可为弗林蛋白酶。可使用其它蛋白酶位点。位点必须由表达疫苗的细胞中常见的蛋白酶识别。
[0221]
在本发明的一个方面，存在包含共有fmdv蛋白vp1、vp2、vp3、vp4和/或3c的融合蛋白和编码所述蛋白的核酸序列，所述融合蛋白和所述核酸序列可被产生并且用于疫苗中，以针对一种或多种fmdv亚型(包括a、asia 1、o、c、sat1、sat2和sat3)的口蹄疫为哺乳动物提供保护。
[0222]
在本发明的另一个方面，存在包含来自两种不同亚型的共有fmdv蛋白vp1的融合蛋白和编码所述蛋白的核酸序列，所述融合蛋白和所述核酸序列可被产生并且用于疫苗中，以针对一种或多种fmdv亚型(包括a、asia 1、o、c、sat1、sat2和sat3)的口蹄疫为哺乳动物提供保护。
[0223]
在本发明的另一个方面，存在共有fmdv蛋白vp1和编码它们的核酸序列，它们可被产生并且用于疫苗中，以针对一种或多种fmdv亚型(包括a、asia 1、o、c、sat1、sat2和sat3)的口蹄疫为哺乳动物提供保护。