1.本技术涉及一种新型纳米晶探针及其生物检测领域，尤其涉及一种纳米晶探针及其制备方法和其在热疗法肿瘤治疗中用于比率型原位温度检测的应用。


背景技术：

2.热疗法是临床医学上用于杀死癌细胞的一种常用方法，治疗过程中肿瘤局部区域的温度一般会超过42℃，而人体正常组织细胞的温度安全界限约为45℃，为保障正常组织细胞安全的同时杀死癌细胞，高准确度、高精度与高空间分辨率的快速实时在线温度探测至关重要
【1-3】
。传统的温度探测方法，如热电偶、热敏电阻和热胀冷缩式温度计等，空间分辨率低、响应慢，且属于接触式测温；非接触式红外辐射测温仪是通过监测目标辐射的红外能量来实现温度探测，只能探测目标表面的温度。以上测温技术均不能用于监测生物组织内部微观区域的温度变化，因此，开发新型的细胞原位温度监控技术具有重要的科学研究意义。
3.荧光温度探测是一种新颖的非接触式温度测量技术，主要通过表征荧光中心的荧光强度、荧光寿命或者发射峰位置随温度的变化来实现温度探测，具有空间分辨率高、响应快、可远程测量等优势，最适合应用于生物组织内部微观区域的实时温度探测
【4-6】
。然而目前所报道的荧光温度探测技术在293-343k范围内的测温灵敏度低
【7-8】
，比如nay(wo4)2:yb/er纳米晶体系在293k-503k的范围内，最大相对测温灵敏度约为1.2％k-1
，六方相nayf4:yb/er@nayf4:yb/nd核壳纳米晶的最大相对测温灵敏度约为2％k-1
，均不适用于生物组织细胞的温度监控。


技术实现要素：

4.为了解决上述的技术问题，本技术的一个目的是提供一种纳米晶探针，该纳米晶探针在1530纳米激光器激发条件下，实现了细胞的比率型原位温度检测，具有非接触式、快响应、高空间分辨率与高准确度的优势。
5.为了实现上述的目的，本技术采用了以下的技术方案：
6.一种纳米晶探针，该纳米晶探针的纳米晶的分子式为caclf：bi/er。
7.优选，所述的纳米晶的分子式为caclf：10bi/20er。
8.优选，所述的纳米晶为水性纳米晶。
9.优选，所述的纳米晶为纯六方相，在1530纳米近红外激光器激发条件下，纳米晶在293k和343k条件下表现出绿光和红光上转换发射谱。
10.进一步，本技术还公开了所述的纳米晶探针的制备方法，该方法包括以下的步骤：
11.1)将所需掺杂量的乙酸铋和乙酸铒，0.7毫摩尔乙酸钙，2毫升三氟乙酸，2毫升三氯乙酸，10毫升油酸和25毫升十八烯加入到三口烧瓶中，在氮气保护气氛条件下，于100℃搅拌并保温90分钟，然后迅速升温至180℃，并保温1小时；
12.2)待溶液冷却至室温后，产物用乙醇和去离子水的混合液洗涤3-5次，获得油性氟氯化物纳米晶。
13.作为进一步改进，该方法还包括纳米晶表面处理步骤：将步骤2)制备得到的10-100mg油性氟氯化物纳米晶分散在1-3ml乙醇与浓度为0.2mol/l的hcl0.5-1ml的混合液中，将混合液超声5-10min，然后加入乙醇洗涤、离心以及烘干等处理后即可获得水性纳米晶。
14.进一步，本技术还公开了所述的纳米晶探针在生物组织细胞原位温度检测中的应用。
15.进一步，本技术还公开了所述的纳米晶探针在热疗法肿瘤治疗中用于温度检测的应用。
16.进一步，本技术还公开了一种生物组织细胞原位温度检测试剂盒，该试剂盒包括所述的纳米晶探针。
17.进一步，本技术还公开了一种热疗法肿瘤治疗中用于温度检测试剂盒，该试剂盒包括所述的纳米晶探针。
18.本技术通过一种溶剂热法制备出caclf：bi/er纳米晶，再通过hcl溶液处理，去掉纳米晶表面的油酸配体，纳米晶能够很好地分散在水溶液中。通表征纳米晶在不同温度下的荧光性能，通过拟合ho
3+
离子的绿光/红光强度比随温度变化的关系曲线，在低于343k的温度范围内，得到的最大相对灵敏度高达3.6％k-1
。在此基础上，通过内吞纳米晶，本技术实现了细胞原位温度监控。
附图说明
19.图1(a)和(b)分别为产物的xrd图谱和透射电子显微镜图。
20.图2(a)caclf：10bi/20er纳米晶在1530纳米近红外激光器激发条件下的上转换发射谱，(b)上转换发光强度随er3+离子掺杂浓度的变化曲线，(c)上转换发光机理示意图，(d)产物的发光强度随掺杂离子bi3+的变化关系曲线。
21.图3(a)caclf：10bi/20er纳米晶的上转换发光强度随温度变化的关系曲线，(b)不同温度条件下的相对测温灵敏度曲线。
22.图4在不同功率条件下(0.3w和0.8w)，caclf：10bi/20er纳米晶的绿光(a)与绿光/红光强度比(b)随温度变化的关系曲线。
23.图5在1530纳米近红外激光器激发条件下，caclf：10bi/20er纳米晶在293k和343k条件下的上转换发射谱。
具体实施方式
24.1.实验部分
25.1.1主要仪器和试剂：
26.乙酸铋(99.0％)，三氯乙酸(99.0％)，三氟乙酸(99.0％)，醋酸钙(99.0％)，乙酸铒(99.9％)，油酸(90.0％)与十八烯(90.0％)购买于sigma-aldrich公司，sp20细胞购买于普诺塞生命科技有限公司，无水乙醇和浓盐酸购买于国药集团化学试剂有限公司。
27.1.2caclf：bi/er纳米晶的制备：
28.以caclf：10bi/20er纳米晶为例，0.1毫摩尔乙酸铋，0.7毫摩尔乙酸钙，0.2毫摩尔
乙酸铒，2毫升三氟乙酸，2毫升三氯乙酸，10毫升油酸和25毫升十八烯加入到三口烧瓶中，在氮气保护气氛条件下，于100
℃
搅拌并保温90分钟，然后迅速升温至180℃，并保温1小时。待溶液冷却至室温后，产物用乙醇和去离子水的混合液洗涤3-5次。
29.不同浓度或种类的离子掺杂样品，通过改变前驱溶液中相应的离子浓度或种类来实现。
30.纳米晶表面处理：将10-100mg油性氟氯化物纳米晶分散在1-3ml乙醇与hcl(0.2mol/l,0.5-1ml)的混合液中，将混合液超声5-10min，然后加入乙醇洗涤、离心以及烘干等处理后即可获得水性纳米晶。
31.1.3表征仪器
32.x射线衍射图谱(brukerd8advance，cu-kα)，透射电子显微镜(tem,feitecnaig2f20)，光谱仪(flurohub-b,horibajobinyvon)，紫外灯功率为50w，1530nm近红外激光器(功率范围为0-1w)。
33.x射线衍射样品的制备：将烘干的纳米晶铺满样品支架的凹槽；
34.透射电子显微镜样品的制备：将每次合成的全部纳米晶溶于4毫升乙醇溶液中，超声5分钟后，滴3-6滴液体于超薄碳膜上。
35.细胞原位温度检测方法：将纳米晶溶于细胞培养液中，通过外部加热源，改变细胞培养液温度，并在1530纳米激光器激发条件下，表征产物的上转换发光性能，并拟合红绿比随温度变化的关系曲线。
36.2.数据分析与讨论
37.caclf：10bi/20er纳米晶的x射线衍射图谱如图1a所示，所有衍射峰均与标准pdf卡片jcpds24-0185号一一对应，且无多余的衍射峰，表明本技术得到的产物为纯六方相。透射电子显微镜分析结果表明产物为均匀的块状，分散性很好。需要说明的是，用盐酸处理后的纳米晶晶体结构没有发生改变。
38.在1530nm近红外光激发条件下，产物在绿光和红光区域表现出很强的上转换发光(图2a)，绿光对应于er
3+
离子2h
11/2
/4s
3/2
→4i
15/2
的跃迁，红光对应于er
3+
离子4f
9/2
→4i
15/2
的跃迁。随着er
3+
离子浓度从5增到20mol％，纳米晶对入射光子的吸收能力增大，因此发光强度显著增强，当er
3+
离子浓度超过20mol％，er
3+
离子之间的无辐射交叉弛豫几率增大，导致发光强度下降(图2b)。以上发光机理解释如下：在1530nm近红外光激发条件下，4i
15/2
基态能级的电子吸收入射光子后，跃迁至4i
13/2
能级，由于稀土离子在激发态能级具有较长的荧光寿命，能级继续吸收下一个入射光子，跃迁至4f
9/2
能级，当电子返回基态时，发射一个红光光子，如果4f
9/2
能级态上的电子无辐射弛豫到4i
9/2
能级，且吸收下一个入射光子，会跃迁到4f
9/2
能级，电子经无辐射弛豫到2h
11/2
/4s
3/2
能级后，返回基态便发射出绿光(图2c)。通过bi
3+
离子掺杂，er
3+
离子的上转换发光强度明显增强，当bi
3+
离子掺杂浓度为10％时，总发光强度增强约5倍(图2c)。
39.如图3a所示，随着纳米晶的环境温度从室温升高至413k，er
3+
的绿光强度逐渐减弱，红光强度逐渐增强，绿光与红光的比值持续减弱，能够很好使用公式
40.41.进行拟合，拟合结果用蓝色曲线表示，其中δ表示绿光与红光的荧光强度比，i1为绿光的荧光强度，i2为红光的荧光强度，t代表温度。进一步通过相对灵敏度计算公式
[0042][0043]
拟合得到293k时的最大相对测温灵敏度高达3.6％k-1
。这种比率型荧光检测方法不受外界环境的影响，比如光源的稳定性，样品的浓度与环境温度等，具有很好高的准确度。随着温度的升高，绿光强度逐渐减弱，主要是由于绿光能级多声子辅助的无辐射弛豫几率增大，而红光增强的原因则是绿光能级的电子在高温下大量无辐射弛豫到红光能级。
[0044]
基于单一荧光峰的温度检测方法易受环境因素的影响，为了验证比率型测温技术的高准确度，本技术在不同激发功率条件下，进一步开展了基于单一绿光以及绿光/红光强度比的测温性能。如图4a所示，在0.3w和0.8w的激光功率条件下，绿光的荧光强度随温度变化的趋势有较大的变化，然而绿光/红光荧光强度比随温度变化的趋势基本一致，表明基于比率型的温度检测技术具有更好的准确性。
[0045]
由于本技术研究的caclf：10bi/20er纳米晶体系，在室温到323k的温度范围内具有很高的灵敏度，本技术将纳米晶表面用盐酸溶液处理后，纳米晶能够很好地分散在水溶液中。纳米晶尺寸小于100nm，能够通过内吞作用进入到细胞中，因此，本技术将纳米晶分散在sp20细胞培养液中，通过外部加热源使培养液温度从室温加热至343k，在0.3w的激光功率激发条件下，纳米晶的绿光与红光的上转换发光强度比发生明显的改变，表明本技术研究的caclf：10bi/20er纳米晶体系能够应用于细胞的原位温度检测。在热疗过程中，在肿瘤区域注入纳米晶，能够用于该区域的实时温度监控，具有很好的应用前景。
[0046]
3.结论
[0047]
本技术通过溶剂热法制备出油性caclf：10bi/20er纳米晶，再通过盐酸处理得到分散性好的水溶性纳米晶。在1530纳米近红外激光器激发条件下，caclf：10bi/20er纳米晶表现出很强的绿光和红光上转换发射，且bi离子掺杂能够大幅提高上转换发光强度。随着温度升高，纳米晶的上转换绿光与红光强度比逐渐减弱，经数据拟合，在293-343k的温度范围内得到最大相对测温灵敏度约为3.6％k-1
。本技术研究的这种高相对测温灵敏度纳米晶，能够具有很好的应用于细胞原位温度监控。
[0048]
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