1.本发明涉及一种近红外第二光学窗口发射的多响应纳米温度检测探针的制备方法及其在活体中温度检测的应用，属于光学纳米探针技术领域。


背景技术：

2.温度检测在生物医学中具有深远的意义。它有助于揭示热产生和热传导机制，可在细胞及亚细胞水平以更精确的方式调节热效应，为解释生物体内的疾病进展和生理过程开辟了新的途径。然而，对于微观层面的温度检测，传统的基于热电偶、光纤或热像仪等宏观器件的测量方法具有空间精度不够高，只能给出某个区域的平均温度值等缺陷，所以并不适用。同时，使用热电偶和光纤的方法也存在侵入性问题，因此，有必要开发和被观察物体尺度匹配的基于纳米/微米材料的温度计。近年来，已经报道了几种利用光学、声学和磁效应的纳米温度计。其中，光学纳米温度计由于具有灵敏度高、采集速度快、实时连续测量、检测结果无创、可视化、范围广等优点，越来越受到该领域的关注，具有很高的实际应用前景。
3.量子点、有机荧光团和稀土掺杂纳米颗粒等发光材料已被用于建立光学纳米温度计，但目前在材料设计方面仍存在一些挑战。量子点通常含有重元素，包括pb、hg和as等，会带来毒性问题。另一方面，有机荧光染料的光稳定性较差，而且其发射波长扩展到近红外(nir)区域，尤其是在近红外第二光学窗口(nir-ii)即1000-1700nm处，仍然较为困难。稀土掺杂的发光纳米粒子具有不闪烁、优异的光稳定性、发射覆盖范围广、波长可调等独特优点，是作为光学纳米温度计的理想材料。然而目前稀土掺杂的发光纳米材料感测温度的发射波长通常低于1200nm。与较短波长相比，nir-ii窗口中较长的波长(》1200nm)表现出更好的成像分辨率和灵敏度，因此开发具有更长工作波长的nir-ii纳米温度计以提高基于成像的测温性能是极其有意义的。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是：提供一种非侵入性的活体光学测温材料。该材料可在700-1000nm激光激发下产生位于1210-1500nm波段的1-3条近红外发射带，实现同一纳米温度检测探针中1-2种光学测温比率计的构筑，测温比率计的热灵敏度在0.6-1.3％℃-1
。利用所得纳米温度检测探针，通过光学成像的方式可以对生物体生理过程中的温度变化进行实时监控。这一类材料的显著特点是能够在近红外光激发下，产生多条位于活体近红外第二光学窗口的温度响应性发射带，在生物组织中具有良好的穿透深度和成像分辨率，可用于活体温度的非侵入式成像检测。
5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种多响应纳米温度检测探针，其为一种光致发光的核-多壳结构纳米材料，其结构通式为：nal
1-a-b
ybatmbf4@nam
1-c
ybcf4@nal
1-d-e
ybdndef4@nalf4，其从内至外依次包括第一层nal
1-a-b
ybatmbf4、第二层nam
1-c
ybcf4、第三层nal
1-d-e
ybdndef4、第四层nalf4共4层结构，其中，m、l各自选自y、gd元素中的一种，0.1≤a≤
0.6，0.005≤b≤0.03，0.1≤c≤0.5，0.1≤d≤0.3，0.1≤e≤0.3。
6.优选地，所述结构式为nay
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nay
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nayf4或nagd
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nagd
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nagdf4。
7.本发明还提供了上述多响应纳米温度检测探针的制备方法，包括以下步骤：
8.步骤1)：根据第一层nal
1-a-b
ybatmbf4称量对应的稀土以及碱金属氯化物，然后加入溶剂，在120～150℃下加热搅拌5～30分钟，溶解形成均一的溶液，然后敞口蒸去甲醇；
9.步骤2)：将步骤1)得到的溶液在氮气保护下升温至290～330℃，反应30～90分钟，然后冷却到室温；
10.步骤3)：向步骤2)得到的溶液加入乙醇，通过离心分离得到固体，再用乙醇和环己烷的混合溶液洗涤所得固体多次；
11.步骤4)：根据第二层nam
1-c
ybcf4称量对应的稀土以及碱金属氯化物，加入溶剂，在120～150℃下加热搅拌5～30分钟，溶解形成均一的溶液，然后敞口蒸去甲醇；
12.步骤5)：向步骤4)得到的溶液中加入步骤3)得到的固体，在80～100℃下加热搅拌10～20分钟，然后在氮气保护下升温至290～330℃，反应30～90分钟，然后冷却到室温；
13.步骤6)：向步骤5)得到的溶液中加入乙醇，通过离心分离得到固体，再用乙醇和环己烷的混合溶液洗涤所得固体多次；
14.步骤7)：根据第三层nal
1-d-e
ybdndef4称量对应的稀土以及碱金属氯化物，加入溶剂，在120～150℃下加热搅拌5～30分钟，溶解形成均一的溶液，然后敞口蒸去甲醇；
15.步骤8)：向步骤7)得到的溶液中加入步骤6)得到的固体，在80～100℃下加热搅拌10～20分钟，然后在氮气保护下升温至290～330℃，反应30～90分钟，然后冷却到室温；
16.步骤9)：向步骤8)得到的溶液中加入乙醇，通过离心分离得到固体，再用乙醇和环己烷的混合溶液洗涤所得固体多次；
17.步骤10)：根据第四层nalf4称量对应的稀土以及碱金属氯化物，加入溶剂，在120～150℃下加热搅拌5～30分钟，溶解形成均一的溶液，然后敞口蒸去甲醇；
18.步骤11)：向步骤10)得到的溶液中加入步骤9)得到的固体，在80～100℃下加热搅拌10～20分钟，然后在氮气保护下升温至290～330℃，反应30～90分钟，然后冷却到室温；
19.步骤12)：向步骤11)得到的溶液中加入相同体积的乙醇，通过离心分离得到固体，再用乙醇和环己烷的混合溶液洗涤所得固体多次，最后固体超声分散在环己烷中；
20.步骤13)：向步骤12)得到的环己烷溶液中加入1～2倍体积的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的二氯甲烷溶液，然后离心分离得到固体，将固体分散在水中，即得多响应纳米温度检测探针。
21.优选地，所述步骤1)、步骤4)、步骤7)、步骤10)中，所述溶剂为油酸、1-十八烯中至少一种。
22.优选地，所述步骤1)、步骤4)、步骤7)、步骤10)中，敞口蒸去甲醇的时间为30～60分钟。
23.优选地，所述步骤3)、步骤6)、步骤9)、步骤12)中，乙醇和环己烷的混合溶液中乙醇与环己烷的体积比为1:1～5:1，洗涤所得固体2-3次。
24.优选地，所述步骤12)中，固体超声分散在环己烷中，浓度为10～20mg/ml。
25.优选地，所述步骤13)中，将固体超声分散在去离子水中，浓度为0.1～10mg/ml。
26.本发明还提供了上述多响应纳米温度检测探针的应用，用于实时温度监控，包括以下步骤：
27.将含有所述多响应纳米温度检测探针的水分散液0.1-10mg/ml，使用功率密度50～500mw/cm2，波长为700～1000nm的近红外激光进行照射，实现其在水溶液中10～90℃的微观升温；该材料在700～1000nm的近红外激光照射下，所发射的不同发射带的积分强度比值随温度的变化呈现线性趋势，即ia/ib＝ct+d，其中，ia为其中一条发射带a的积分荧光强度，ib为其中一条发射带b的积分荧光强度，d为常数，t为温度，c为比率计随温度的变化率，c和d根据变温曲线进行拟合，采用此数学关系即实现温度检测；
28.将含所述多响应纳米温度检测探针浓度为0.1-10mg/ml的生理盐水分散液注射入(炎症小鼠)病灶中，待2～24小时后，根据微观温度监控的指导结果，使用100～1000mw/cm2的700～1000nm激光对小鼠的炎症区域进行照射，从而对标记纳米颗粒的生物组织进行活体实时、非侵入性的温度变化监控。
29.本发明通过对纳米材料基质进行调控，利用稀土元素铥(tm
3+
)、钕(nd
3+
)的近红外精细能级来作为光学温度探针的监控波段，使温度检测的发光波长拓展至1200nm以上，能够进一步提高组织穿透深度。而且这些精细能级的多谱带发射具有温度响应功能，因而能实现多通道响应的比率型发光温度检测，由此避免了单一谱带检测的误差。通过铥(tm
3+
)、钕(nd
3+
)和钆(gd
3+
)之间的交叉弛豫过程可以增强nir-ii发射，以优化体内温度传感的性能。受波长为700-1000nm激光的激发，本发明所述材料能产生1-3条大于1200nm的发射带，用于建立1-2个独立的比率型温度传感系统，实现了在同一个体系中1-2个温度检测单元的独立工作。通过简单的原料混合与加热，就可以实现用于活体温度检测的温度探针的制备。本发明是研究纳米级热传导过程以及活体温度监控的强大工具，对稀土元素发光材料的温度探针在生物成像、生物传感和其他生物医学的应用做出巨大的贡献。
30.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
31.1.本发明可以在近红外第二光学窗口实现比率型发光温度监测，具有不闪烁、稳定性好、生物组织自发荧光低、高信噪比和出色的穿透深度等优点。
32.2.本发明可以实现多通道响应的发光温度测定，在一个体系里同时获得1-2种光学测温比率计。在细胞、组织、动物体内实现减少检测的系统误差，增加准确度。
附图说明
33.图1为实施例1的透射电子显微镜照片；
34.图2为实施例1的x射线粉末衍射分析；
35.图3为实施例2的傅里叶变换红外光谱；
36.图4为实施例2的动态光散射分析；
37.图5为实施例3的近红外(nir)发光光谱；
38.图6为实施例4的透射电子显微镜图；
39.图7为实施例6在水溶液中的近红外(nir)发光光谱；
40.图8为实施例7的变温发射光谱；
41.图9为实施例7的温度-发光校正曲线，以1470nm和1215nm发射进行比值；
42.图10为实施例7的温度-发光校正曲线，以1330nm和1215nm发射进行比值；
43.图11为实施例8的变温发射光谱；
44.图12为实施例8的温度-发光校正曲线，以1470nm和1215nm发射进行比值；
45.图13为实施例8的温度-发光校正曲线，以1330nm和1215nm发射进行比值；
46.图14为实施例9的活体温度成像检测。
具体实施方式
47.为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
48.实施例1
49.nagd
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nagd
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nagdf4的合成：
50.将1mmol稀土元素氯化物(0.5mmol gdcl3、0.49mmol ybcl3和0.01mmol tmcl3)与10ml油酸(oa)和10ml 1-十八烯在100ml三颈烧瓶中混合，将溶液加热至120℃并保持30min以获得透明溶液，然后冷却至50℃。将溶解在11ml甲醇中的nh4f(3.4mmol)和naoh(2.5mmol)加入溶液，随后在90℃下脱气30分钟以去除甲醇。在氮气保护作用下，将体系升温至300℃，保持1.5小时，然后冷却至室温后，向冷却后的溶液加入相同体积的乙醇，通过离心分离得到固体，再用乙醇：环己烷(1:1v/v)的溶液洗涤所得固体三次。称取1mmol稀土元素氯化物(0.8mmol ycl3，0.2mmol ybcl3)加入到10ml油酸(oa)和10ml十八烯(ode)的混合溶液中，加热至120℃并保持30min以获得透明溶液，然后冷却至50℃，向溶液中加入之前离心得到的固体，在80～100℃下加热搅拌20分钟,冷却至室温后将溶解在11ml甲醇中的nh4f(3.4mmol)和naoh(2.5mmol)加入溶液，随后在90℃下脱气30分钟以去除甲醇。在氮气保护作用下，将体系升温至300℃，保持1.5小时，然后冷却至室温后，向冷却后的溶液加入相同体积的乙醇，通过离心分离得到固体，再用乙醇：环己烷(1:1v/v)的溶液洗涤所得固体三次。称取1mmol稀土元素氯化物(0.65mmol gdcl3，0.1mmol ybcl3和0.25mmol ndcl3)加入到10ml油酸(oa)和10ml十八烯(ode)的混合溶液中，加热至120℃并保持30min以获得透明溶液，然后冷却至50℃，向溶液中加入之前离心得到的固体，在80～100℃下加热搅拌20分钟，冷却至室温后将溶解在11ml甲醇中的nh4f(3.4mmol)和naoh(2.5mmol)加入溶液，随后在90℃下脱气30分钟以去除甲醇。在氮气保护作用下，将体系升温至300℃，保持1.5小时，然后冷却至室温后，向冷却后的溶液加入相同体积的乙醇，通过离心分离得到固体，再用乙醇：环己烷(1:1v/v)的溶液洗涤所得固体三次。后面除了添加1mmol gdcl3外，核-多壳纳米粒子的合成过程与前面的步骤几乎相同。最后固体超声分散在10ml环己烷中。最终得到的核-多壳结构纳米颗粒的形貌如图1所示，为平均尺寸为45.1nm的六边形。
51.nagd
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nagd
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nagdf4及其中间体的纯六方相如图2所示。
52.实施例2
53.二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇修饰的nagd
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nagd
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nagdf4(nagd
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nagd
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nagdf4@peg)的制备：
54.向溶有10mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的5ml ch2cl2溶液中加入10mg环己烷分散的nagd
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nagd
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nagdf4，搅拌约30min使其混合均匀，利用旋蒸的方式除去体系的有机物，随后加入3～5ml水超声分散，通过离心分
离得到固体，再用去离子水洗涤所得固体三次，最后固体超声分散在1ml水中。修饰二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇后nagd
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nagd
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nagdf4表面配体的转变如图3所示，nagd
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nagd
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nagdf4@peg的粒径分布如图4所示，平均粒径约为72.3nm，且在水相里分散良好。
55.实施例3
56.使用荧光光谱法测定nagd
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nagd
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nagdf4@peg的近红外二区发射强度：
57.将核-多壳结构纳米材料分散于水中，配制成10mg/ml的溶液1ml置于比色皿中，利用808nm半导体激光器激发下转换荧光，如图5所示。
58.实施例4
59.nayf4，49％yb，1％tm@nayf4，20％yb@nayf4，10％yb，25％nd@nayf4的合成：
60.将1mmol稀土元素氯化物(0.5mmol ycl3、0.49mmol ybcl3和0.01mmol tmcl3)与10ml油酸(oa)和10ml 1-十八烯在100ml三颈烧瓶中混合，将溶液加热至120℃并保持30min以获得透明溶液，然后冷却至50℃。将溶解在11ml甲醇中的nh4f(3.4mmol)和naoh(2.5mmol)加入溶液，随后在90℃下脱气30分钟以去除甲醇。在氮气保护作用下，将体系升温至300℃，保持1.5小时，然后冷却至室温后，向冷却后的溶液加入相同体积的乙醇，通过离心分离得到固体，再用乙醇：环己烷(1:1v/v)的溶液洗涤所得固体三次。称取1mmol稀土元素氯化物(0.8mmol ycl3，0.2mmol ybcl3)加入到10ml油酸(oa)和10ml十八烯(ode)的混合溶液中，加热至120℃并保持30min以获得透明溶液，然后冷却至50℃，向溶液中加入之前离心得到的固体，在80～100℃下加热搅拌20分钟。冷却至室温后将溶解在11ml甲醇中的nh4f(3.4mmol)和naoh(2.5mmol)加入溶液，随后在90℃下脱气30分钟以去除甲醇。在氮气保护作用下，将体系升温至300℃，保持1.5小时，然后冷却至室温后，向冷却后的溶液加入相同体积的乙醇，通过离心分离得到固体，再用乙醇：环己烷(1:1v/v)的溶液洗涤所得固体三次。称取1mmol稀土元素氯化物(0.65mmol ycl3，0.1mmol ybcl3和0.25mmol ndcl3)加入到10ml油酸(oa)和10ml十八烯(ode)的混合溶液中，加热至120℃并保持30min以获得透明溶液，然后冷却至50℃，向溶液中加入之前离心得到的固体，在80～100℃下加热搅拌20分钟，冷却至室温后将溶解在11ml甲醇中的nh4f(3.4mmol)和naoh(2.5mmol)加入溶液，随后在90℃下脱气30分钟以去除甲醇。在氮气保护作用下，将体系升温至300℃，保持1.5小时，然后冷却至室温后，向冷却后的溶液加入相同体积的乙醇，通过离心分离得到固体，再用乙醇：环己烷(1:1v/v)的溶液洗涤所得固体三次。后面除了添加1mmol ycl3外，以y为基质的核-多壳纳米粒子的合成过程与前面的步骤几乎相同。最后固体超声分散在10ml环己烷中。最终得到的核-多壳结构纳米颗粒的形貌如图6所示，为平均尺寸为48.4nm的六边形。
61.实施例5
62.二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇修饰的nay
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nay
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nayf4(nay
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nay
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nayf4@peg)的制备：
63.向溶有10mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的5ml ch2cl2溶液中加入10mg环己烷分散的nay
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nay
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nayf4，搅拌约30min使其混合均匀，利用旋蒸的方式除去体系的有机物，随后加入3～5ml水超声分散，通过离心分离
得到固体，再用去离子水洗涤所得固体三次，最后固体超声分散在1ml水中。
64.实施例6
65.nagd
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nagd
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nagdf4@peg和nay
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nay
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nayf4@peg的近红外二区发射光谱比较：
66.将nagd
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nagd
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nagdf4@peg和nay
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nay
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nayf4@peg分散于水中，配制成10mg/ml的1ml溶液置于比色皿中，利用808nm半导体激光器激发下转换荧光，如图7所示，可得nagd
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nagd
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nagdf4@peg和nay
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nay
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nayf4@peg的核-多壳纳米结构的近红外二区发射。
67.实施例7
68.使用变温荧光光谱法测定nagd
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nagd
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nagdf4@peg分散在水中荧光发射随温度变化的标准曲线：
69.将nagd
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nagd
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nagdf4@peg分散于水中，配制成10mg/ml的溶液1ml，使用230mw/cm2的808nm激光对溶液进行持续照射，采集发射光谱。在1215nm处对谱图进行归一化处理，如图8所示，发现1470nm和1330nm的发射强度随温度升高而增强。分别进行1470nm和1215nm以及1330nm和1215nm发射强度积分的比值，获得的1470nm波长发射峰与1215nm发射峰的比值随温度变化的工作曲线如图9所示，1330nm波长发射峰与1215nm发射峰的比值随温度变化的工作曲线如图10所示，可发现其荧光强度随着温度呈现线性正相关趋势。
70.实施例8
71.使用变温荧光光谱法测定nagd
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nagd
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nagdf4@peg分散在假体中荧光发射随温度变化的标准曲线：
72.将nagd
0.5
yb
0.49
tm
0.01
f4@nay
0.8
yb
0.2
f4@nagd
0.65
yb
0.1
nd
0.25
f4@nagdf4@peg分散于假体中，配制成10mg/ml的溶液1ml，使用233mw/cm2的808nm激光对溶液进行持续照射，采集发射光谱。在1215nm处对谱图进行归一化处理，如图11所示，发现1470nm和1330nm的发射强度随温度升高而增强。分别进行1470nm和1215nm以及1330nm和1215nm发射强度积分的比值，获得的1470nm波长发射峰与1215nm发射峰的比值随温度变化的工作曲线如图12所示，1330nm波长发射峰与1215nm发射峰的比值随温度变化的工作曲线如图13所示，可发现其荧光强度随着温度呈现线性正相关趋势。
73.实施例9
74.nagd
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f4@nagdf4@peg用于体内生物成像和温度监测。
75.小鼠右后爪诱导炎症，左后爪为正常对照组，将分散在生理盐水中的nagd
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f4@nagdf4@peg(10mg/ml，20μl)注射到小鼠两只爪中。一小时后，通过nir-ii生物成像系统对小鼠进行成像。分别使用1200nm带通和1400nm长通滤波器在1215nm和1470nm波长处获取体内成像，结果如图14所示，nagd
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f4@nagdf4@peg的探针-tm给出的温度成像显示右爪温度升高，平均温度为39.6℃，而左爪平均温度为37.0℃，证明
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f4@nagdf4@peg能够在活体疾病诊断和生理过程监控中对温度进行检测以及可视化。