1.本发明涉及杂交水稻选育技术领域，特别涉及一种带香味基因水稻的育种方法。


背景技术：

2.主要的水稻育种技术仍然是常规杂交育种,然而,利用传统育种方法来培育香稻新品种费时费力。由于香味基因主要由隐性基因控制,传统育种先要通过杂交和回交的方法,将badh2突变的基因导入现有的优良品种中,然后在后代群体中进行筛选,可是这一过程在苗期很难快速鉴定。随着分子标记尤其是badh2基因功能标记的开发,分子标记辅助选择已经广泛应用于水稻遗传育种,大大加快了香稻新品种的筛选与培育进程。
3.目前,已建立多种方法用于检测水稻材料中的香味,其中咀嚼法和koh法是传统育种过程中最为常用的方法(bradbury etal.,2005b),但是这2种方法主要依靠人的感官来进行判定香味,准确性较差,且难以大规模应用于香稻新品种的筛选与培育。因此,如何简单、准确而又快速地鉴定香稻中的香味一直是水稻育种工作者亟须解决的难题之一。
4.含香味的水稻杂交育种中存在诸多问题：第一，水稻香味成分复杂多样，检测鉴定比较困难。而且鉴定方法、技术并不十分完善，不能快速准确地鉴定出具体的香味成分，降低香味鉴定的精确度。第二，水稻香味基因的遗传机制较为复杂，遗传模式较为多样。虽然许多研究表明其是受一对隐性基因控制的，但是也有受2对或是更多对基因控制的，可能是单隐性基因控制，也可能是单显性基因，还可能是多隐性或是多显性基因控制。而随着基因的增多，杂交后代个体含有香稻基因的几率也逐渐减少；第三，在香稻育种中，特别是常规育种中，存在着香味分离的现象，即有的稻米有香味，有的则没有。在杂交后代中，很难将香味和产量、抗逆性很好地结合在一起。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题：解决杂交育种过程中香味基因导入无香品种后，香味基因与抗逆性基因连锁不稳定的问题。
6.为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：
7.一种带香味基因水稻的育种方法，步骤如下：
8.(a)将含香味基因的水稻品种作为供体f0，将含抗逆基因的无香水稻作为受体f0，杂交后获得f1代；
9.(b)f1代种植后鉴定筛选含香味基因的个体，将含香味基因的个体作为母本回交供体f0获得f2；
10.(c)以f2中鉴定筛选含香味基因的个体作为母本继续回交供体f0，如此重复回交若干代后获得fn代；
11.(d)将fn代种植后于分蘖期取叶片抽提基因组dna，采用引物进行基因鉴定获得香味纯合基因型单株，保留香味纯合基因型单株继续栽培，抽穗时套袋进行自交获得fm代；
12.(e)继续种植fm代，种植全程施加选择压力，收获后继续种植，重复施加选择压力
并自交若干代后采用步骤(d)中的引物鉴定香味基因，即可获得香味基因与抗逆基因连锁的杂交水稻。
13.优选地，所述供体f0为保持系或恢复系，所述受体f0为不育系。
14.优选地，所述步骤(c)中的回交代数为2～4代，步骤(e)中重复自交代数为2～4代。
15.优选地，所述选择压力包括干旱或白叶枯病。
16.优选地，所述步骤(c)中鉴定筛选步骤为：取f2代叶片采用ctab法抽提基因组dna，利用如下引物进行pcr反应：
17.上游：tgttgtggcatgtccatgctgcaagc；
18.下游：gaatgatgctcaaagtgtct。
19.使用pcr扩增技术，40μl反应体系包括基因组模板dna(约20ng/μl)2μl、上游引物(10μmol/μl)1μl、下游引物(10μmol/μl)1μl、2
×
mixture 4μl、灭菌双蒸水32μl。在pcr仪上扩增，反应条件为：(1)94℃，预变性5min；(2)94℃30s，55℃40s，72℃45s，共35个循环；(3)72℃延伸10min。反应产物经1％的琼脂糖(含0.1％gelred)凝胶电泳分离，检测472bp附近是否有条带，有条带的即为含香味基因的个体。
20.本发明获得的有益效果：
21.本发明能够将香味基因快速导入抗逆性品种内，且能够稳定连锁抗逆性基因和香味基因，能够稳定遗传不产生分离。本发明在前期回交过程中采用pcr方法鉴定香味基因，不断富集香味基因，能够快速获得香味纯合基因型单株，并借助分子标记辅助选择快速筛分离香味纯合基因型单株，此时再进行自交可防止香味纯合基因的分离，保证后续的选择压力下香味纯合基因能够稳定存留，选择压力则能够通过生存压力快速筛选具有抗逆性基因的个体，并在不断的自交过程中纯化抗逆性基因，这样就能够保存香味基因的同时连锁抗逆性基因，保证后代中两个基因稳定连锁表达，使杂交水稻同时具备抗逆性和香味性状，不易分离。
具体实施方式
22.下面通过对实施例的描述，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
23.实施例1：一种带香味基因水稻的育种方法，步骤如下：
24.(a)将含香味基因的恢复系川香29r作为供体f0，将含抗旱基因的无香不育系徽旱s作为受体f0，杂交后获得f1代；
25.(b)f1代种植后采用koh法鉴定筛选含香味基因的个体，将含香味基因的个体作为母本回交供体f0获得f2；
26.(c)常规种植f2代，鉴定筛选f2代中含香味基因的个体，鉴定筛选步骤为：取f2代叶片采用ctab法抽提基因组dna，利用如下引物进行pcr反应：
27.上游：tgttgtggcatgtccatgctgcaagc；
28.下游：gaatgatgctcaaagtgtct。
29.使用实验室常规pcr扩增技术，40μl反应体系包括基因组模板dna(约20ng/μl)2μl、上游引物(10μmol/μl)1μl、下游引物(10μmol/μl)1μl、2
×
mixture 4μl、灭菌双蒸水32μl。在pcr仪上扩增，反应条件为：(1)94℃，预变性5min；(2)94℃30s，55℃40s，72℃45s，共35
个循环；(3)72℃延伸10min。反应产物经1％的琼脂糖(含0.1％gelred)凝胶电泳分离，检测472bp附近是否有条带，筛选有条带的个体作为母本继续回交供体f0，如此重复回交2代后获得fn代；
30.(d)将fn代种植后于分蘖期取叶片，采用ctab法抽提基因组dna，采用引物进行基因鉴定获得香味纯合基因型单株，其中引物序列为ssr标记(微卫星引物)：8号染色体上的rm5911和rm7191。
31.反应混合液体积为25μl，其中微卫星引物0.2μm,taqdna聚合酶1.5u，基因组模板dna50-100 ng，dntp各200μm，2.5μl 10
×
pcr buffer:100mm tris.cl ph 9.0；500mm kc1；18mm mgcl2；1％triton x-100。
32.pcr的反应参数为:(1)94℃5min；(2)94℃50sec,48℃50sec,72℃2min,共40个循环；(3)72℃5min。
33.pcr扩增产物加入0.1倍体积的凝胶加样缓冲液，用加有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶于0.5
×
tbe缓冲液中恒压120-150v电泳3h，用凝胶成像系统扫描记录电泳结果；或于6％聚丙烯凝胶电泳上检测。凝胶加样缓冲液:0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青ff；40％(w/v)蔗糖水溶液；保留有条带的香味纯合基因型单株继续栽培，抽穗时套袋进行自交获得fm代；
34.(e)继续种植fm代，种植全程施加干旱选择压力，存活并结实个体收获后继续种植，重复施加干旱压力并自交2代后采用步骤(d)中的引物鉴定香味基因，即可获得香味基因与抗逆基因连锁的杂交水稻。
35.实施例2：一种带香味基因水稻的育种方法，步骤如下：
36.(a)将含香味基因的保持系川香29b作为供体f0，将含抗白叶枯病基因的无香不育系抗a(冯锐,郭辉,秦学毅,等.利用广西普通野生稻创新选育抗白叶枯病优质水稻三系不育系[j].作物杂志,2014(4):4.)作为受体f0，杂交后获得f1代；
[0037]
(b)f1代种植后采用koh法鉴定筛选含香味基因的个体，将含香味基因的个体作为母本回交供体f0获得f2；
[0038]
(c)常规种植f2代，鉴定筛选f2代中含香味基因的个体，鉴定筛选步骤为：取f2代叶片采用ctab法抽提基因组dna，利用如下引物进行pcr反应：
[0039]
上游：tgttgtggcatgtccatgctgcaagc；
[0040]
下游：gaatgatgctcaaagtgtct。
[0041]
使用实验室常规pcr扩增技术，40μl反应体系包括基因组模板dna(约20ng/μl)2μl、上游引物(10μmol/μl)1μl、下游引物(10μmol/μl)1μl、2
×
mixture 4μl、灭菌双蒸水32μl。在pcr仪上扩增，反应条件为：(1)94℃，预变性5min；(2)94℃30s，55℃40s，72℃45s，共35个循环；(3)72℃延伸10min。反应产物经1％的琼脂糖(含0.1％gelred)凝胶电泳分离，检测472bp附近是否有条带，筛选有条带的个体作为母本继续回交供体f0，如此重复回交4代后获得fn代；
[0042]
(d)将fn代种植后于分蘖期取叶片，采用ctab法抽提基因组dna，采用引物进行基因鉴定获得香味纯合基因型单株，其中引物序列为ssr标记(微卫星引物)：rm23120和rm7191。
[0043]
反应混合液体积为25μl，其中微卫星引物0.2μm,taqdna聚合酶1.5u，基因组模板dna50-100 ng，dntp各200μm，2.5μl 10
×
pcr buffer:100mm tris.cl ph 9.0；500mm kc1；
18mm mgcl2；1％triton x-100。
[0044]
pcr的反应参数为:(1)94℃5min；(2)94℃50sec,48℃50sec,72℃2min,共40个循环；(3)72℃5min。
[0045]
pcr扩增产物加入0.1倍体积的凝胶加样缓冲液，用加有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶于0.5
×
tbe缓冲液中恒压120-150v电泳3h，用凝胶成像系统扫描记录电泳结果；或于6％聚丙烯凝胶电泳上检测。凝胶加样缓冲液:0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青ff；40％(w/v)蔗糖水溶液；保留有条带的香味纯合基因型单株继续栽培，抽穗时套袋进行自交获得fm代；
[0046]
(e)继续种植fm代，种植全程施加白叶枯病选择压力，未感染并结实个体收获后继续种植，重复施加白叶枯病压力并自交4代后采用步骤(d)中的引物鉴定香味基因，即可获得香味基因与抗病基因连锁的杂交水稻。
[0047]
实施例3：一种带香味基因水稻的育种方法，步骤如下：
[0048]
(a)将含香味基因的川香29r作为供体f0，将含抗旱基因的无香不育系徽旱s作为受体f0，杂交后获得f1代；
[0049]
(b)f1代种植后koh法鉴定筛选含香味基因的个体，将含香味基因的个体作为母本回交供体f0获得f2；
[0050]
(c)常规种植f2代，鉴定筛选f2代中含香味基因的个体，鉴定筛选步骤为：取f2代叶片采用ctab法抽提基因组dna，利用如下引物进行pcr反应：
[0051]
上游：tgttgtggcatgtccatgctgcaagc；
[0052]
下游：gaatgatgctcaaagtgtct。
[0053]
使用实验室常规pcr扩增技术，40μl反应体系包括基因组模板dna(约20ng/μl)2μl、上游引物(10μmol/μl)1μl、下游引物(10μmol/μl)1μl、2
×
mixture 4μl、灭菌双蒸水32μl。在pcr仪上扩增，反应条件为：(1)94℃，预变性5min；(2)94℃30s，55℃40s，72℃45s，共35个循环；(3)72℃延伸10min。反应产物经1％的琼脂糖(含0.1％gelred)凝胶电泳分离，检测472bp附近是否有条带，筛选有条带的个体作为母本继续回交供体f0，如此重复回交3代后获得fn代；
[0054]
(d)将fn代种植后于分蘖期取叶片，采用ctab法抽提基因组dna，采用引物进行基因鉴定获得香味纯合基因型单株，其中引物序列为ssr标记微卫星引物：rm3459和rm7191。
[0055]
反应混合液体积为25μl，其中微卫星引物0.2μm,taqdna聚合酶1.5u，基因组模板dna50-100 ng，dntp各200μm，2.5μl 10
×
pcr buffer:100mm tris.cl ph 9.0；500mm kc1；18mm mgcl2；1％triton x-100。
[0056]
pcr的反应参数为:(1)94℃5min；(2)94℃50sec,48℃50sec,72℃2min,共40个循环；(3)72℃5min。
[0057]
pcr扩增产物加入0.1倍体积的凝胶加样缓冲液，用加有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶于0.5
×
tbe缓冲液中恒压120-150v电泳3h，用凝胶成像系统扫描记录电泳结果；或于6％聚丙烯凝胶电泳上检测。凝胶加样缓冲液:0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青ff；40％(w/v)蔗糖水溶液；保留有条带的香味纯合基因型单株继续栽培，抽穗时套袋进行自交获得fm代；
[0058]
(e)继续种植fm代，种植全程施加干旱选择压力，存活并结实个体收获后继续种植，重复施加干旱压力并自交3代后采用步骤(d)中的引物鉴定香味基因，即可获得香味基因与抗旱基因连锁的杂交水稻。
[0059]
对照实施例：杂交材料均与实施例3相同，采用普通杂交1代后回交3代的方法将香味基因导入抗旱品种内，自交3代后筛选具有香味和抗旱特性的杂交新品种。
[0060]
将实施例3和对照实施例中获取的杂交水稻种子300粒复种后均给予干旱栽种条件，统计成活率、结实率和含香籽粒比例，通过咀嚼法测定籽粒是否含香，结果见表1：
[0061]
表1抗旱和含香性状连锁稳定性测试结果
[0062]
组别成活率(％)结实率(％)含香籽粒比例(％)实施例397.789.392.3对照实施例53.764.238.3
[0063]
上述结果可见，传统的杂交回交自交手段没有同步配合多种筛选鉴定手段，导致抗旱和含香基因的连锁不稳定，杂交后代性状极易分离，不能稳定的保留抗逆性和含香基因，而本技术能够有效将香味基因导入抗逆性品种内，且能够保持抗逆基因和香味的基因的稳定连锁，同时稳定表达抗逆和香味性状。
[0064]
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。