1.本发明属于海洋生物繁育技术领域，涉及一种侏儒蛤的引种繁育方法。


背景技术：

2.侏儒蛤(mulinia lateralis)自然分布于北美大西洋沿岸和加勒比海域，属于软体动物门，帘蛤目，蛤蜊科，是一种小型的双壳埋栖贝类。它具有发育繁殖周期短(2个月左右)、体型小、早期发育贝壳透明等特点。软体动物所属的冠轮动物，作为地球上三大主要动物类群之一，其代表了海洋中主要动物种类。但相对应的陆生动物已有成熟的模式动物系统，如小鼠、果蝇、斑马鱼等，软体动物至今没有模式生物；而侏儒蛤作为模式贝的潜力为国际社会所公认。
3.侏儒蛤的研究可以追溯到上世纪50年代，然而，由于缺乏有效的人工育苗技术，其研究对象是以采捕野生群体为主，而国内就没有其自然分布，也未见有国内人工繁育侏儒蛤的报道。目前，发明人所在团队首次将侏儒蛤从美国引种到国内，而解决侏儒蛤在国内的人工繁育成为了首要任务，这对于推动侏儒蛤深入研究及所代表的整个软体动物生物学研究都具有积极重要的意义，这也将有助于海洋模式贝类平台的建立，实现填补国际上冠轮动物尚缺乏模式生物领域的空白。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种侏儒蛤的人工繁育方法，实现侏儒蛤在国内的引种与繁育，本发明也可以快速规模化繁殖侏儒蛤，获取侏儒蛤幼虫各个发育时期和成体材料，从而克服国内没有侏儒蛤自然分布和材料获取困难的局限。
5.本发明所提供的侏儒蛤的人工繁育方法，包括如下的步骤：
6.(1)亲本促熟：
7.挑选40日龄壳长3～5mm的侏儒蛤幼贝置于预先使用0.2％高锰酸钾溶液消毒处理好的促熟池进行性腺促熟；
8.预先消毒处理好的促熟池中投放有附着基，取粒径为0.25～0.5mm的细沙为附着基，沙子投放之前先用60～100目筛网过滤，除去较大杂质，然后使用0.02％次氯酸钠溶液浸泡消毒6h，接着用淡水冲洗多遍，直到水质变得澄澈，将沙子均匀铺在池底，厚度为2cm～3cm，沙子铺完加满海水；
9.所述的促熟池中，亲本培育密度为400～600枚/m2；
10.所述的促熟池，水温20～22℃，海水盐度22～25
‰
，ph8.0～8.2；
11.在亲本促熟期间，每天投喂三次混合单胞藻，包括牟氏角毛藻、青岛大扁藻和等鞭金藻(3：1：1)，投喂量5～10万个/ml；此外每天早晨投喂1/8蛋黄，搓碎后均匀撒在池子里，晚上投喂20ppm的海洋红酵母，5ppm的em菌补充营养；
12.在经历2～3周的促熟，侏儒蛤性腺发育成熟，而性成熟侏儒蛤极易被环境影响而向水体中排放精卵，造成“流产”现象，此时在2日内逐步降温至18℃。
13.(2)催产孵化：
14.挑选性腺发育成熟饱满的雌雄亲本进行阴干，冰袋降温阴干1.5h后通过27℃水温刺激产精排卵，进行人工授精；授精完成后进行孵化，孵化水温23～24℃，孵化密度控制不高于50个/ml水体；
15.(3)幼虫培育：
16.孵化14～16h后，用400目的筛网过滤收集上浮的d形幼虫，并置于新的经过消毒的容器中，加入过滤22～23℃和25～28
‰
的海水进行培育；d形幼虫的培育密度为9～10个/ml，壳顶幼虫的培育密度为5～7个/ml，变态幼虫的培育密度为3～5个/ml，每天保证2/3的换水量；；
17.在d型时期(2-5日龄)，以金藻为开口饵料，投饵密度0.2～0.3万个/ml，在发育到壳顶时期(6-10日龄)，混合投喂等鞭金藻和青岛大扁藻(1：1)，投喂密度为0.6～1.2万个/ml；在变态幼虫时期，混合投喂等鞭金藻、青岛大扁藻和新月菱形藻(1：1：1)，投喂密度为3-4万个/ml。
18.(4)幼虫变态附着：在水温22～23℃，侏儒蛤幼虫经过10～14天的培育，幼虫面盘逐渐脱落，足和水管逐渐出现，部分幼虫从浮游变为匍匐爬行，其生活方式也由游泳生活向埋栖生活转变；在15日龄投放细沙作为附着基，初始厚度0.5cm；在20日龄，沙子加厚为2～3cm。
19.(5)稚贝及成体培育：
20.变态幼虫逐渐经历匍匐幼虫、稚贝、单水管稚贝和双水管稚贝阶段，逐渐进入稚贝培育阶段营埋栖生活。在28-30日龄，侏儒蛤逐渐发育为幼贝。在稚贝阶段，养殖密度为2万/m2以下，投喂饵料为等鞭金藻、青岛大扁藻和新月菱形藻(1：1：1)，投喂密度为3～4万个/ml。在幼贝阶段，养殖密度为800～1000个/m2，饵料以富含蛋白质的蛋白核小球藻为主，投喂密度为5万个/ml，同时辅以少量牟氏角毛藻，密度为1万个/ml。在稚贝阶段依旧在15l或者50l玻璃缸中养殖，幼贝转入循环系统中养殖。温度稳定在20～22℃，盐度为22～25
‰
，饵料每日投喂三次。待子代长至40日龄壳长为3～5mm时，即可投入新的促熟阶段。
21.本发明提供了侏儒蛤的引种繁育方法，成功实现侏儒蛤在国内的引种繁育，并且可以成功实现了侏儒蛤繁育周期的控制，并且周期控制在两个月左右，与侏儒蛤在自然条件下的最快生长速度相当。本发明实现了侏儒蛤快速大批量的繁殖，并且能保证侏儒蛤各个发育时期材料的获取。此外，与自然条件下的侏儒蛤相比，本发明侏儒蛤的存活率高，幼虫和成体的生长发育速度较快。在贯穿整个繁育周期，温度一直维持较高的23℃左右，来保证侏儒蛤的快速生长发育；同时在促熟阶段温度降低2～3℃来刺激性腺的快速发育，并且温度不至于过低影响生长发育速度，同时增加充氧量和降低养殖密度来促进亲贝性腺的发育；在催产环节使用冰块降温阴干和27℃的高温海水刺激，实现侏儒蛤在1h之内排放精卵；在幼虫培育阶段使用24℃的水温来促使侏儒蛤快速完成幼虫阶段的发育，此温度条件下的幼虫存活率高、生长速度快；同时为了提高侏儒蛤幼虫的成活率，结合侏儒蛤的滩涂生活环境，本发明养殖所用海水的盐度维持在28～30
‰
，低于青岛海域正常海水盐度30～32
‰
；在幼虫变态期和成体养殖期，本发明投放细沙作为附着基来模拟自然条件下侏儒蛤的埋栖生活环境，增加侏儒蛤的变态率和成体存活能力，同时随着生长发育，增加附着基的厚度来保证侏儒蛤的顺利潜沙；由于侏儒蛤相对其他贝类发育速度较快，饵料投喂量和种类要及时
变化，尤其在长次生壳和附着变态两个节点，及时补充营养。
附图说明
22.图1：壳长3～5mm的侏儒蛤成体形态观察图；
23.图2：侏儒蛤循环养殖系统图；
24.图3：性腺发育成熟的侏儒蛤形态观察图；
25.图4：阴干升温后侏儒蛤排出白色雾状的精液图；
26.图5：阴干升温后侏儒蛤排出颗粒状的卵子图；
27.图6：侏儒蛤幼虫在15l玻璃缸中孵化图；
28.图7：d型幼虫时期，侏儒蛤的形态观察图；
29.图8：发育到18d时，侏儒蛤的形态观察图。
具体实施方式
30.以下通过实施例的具体操作对本发明做进一步的说明。
31.实施例1亲本促熟及催产孵化
32.挑选侏儒蛤第二代群体500枚壳长为3～5mm左右的成体进行人工繁育，所挑出的侏儒蛤成体如图1所示。
33.1、亲本促熟：
34.将挑选出的侏儒蛤个体放入亲本促熟池中，使用循环水进行养殖，如图2所示，或是常用的水产养殖用的循环系统；具体操作如下：
35.亲本促熟池：将池子先用淡水洗刷干净(包括气管，气石和池塞)，然后加满淡水，加上10ml 84消毒液浸泡至少6个小时，结束后用淡水仔细刷洗2遍，接着再用海水冲干净，最后加4/5左右的海水，通上氧气。
36.附着基(沙子)的投放：侏儒蛤为埋栖型贝类，为了模拟其自然底栖环境，本发明选取细沙为附着基(取自黄岛金沙滩)，沙子投放之前先用60～100目筛网过滤，除去较大杂质，然后消毒液浸泡消毒，接着用淡水冲洗多遍，直到水质变得澄澈，将沙子均匀铺在池底，大约2cm～3cm厚即可，沙子铺完，即可将池子加满水。
37.水质条件的控制：养殖所用海水取自青岛麦岛海区沙滤水，养殖所用海水参数是结合侏儒蛤的生物习性和生活环境而定的，侏儒蛤是滩涂埋栖贝，同时又分布在低纬度海区，其生存环境属于温水低盐海域，所以促熟水温为20～22℃(略低于养殖水温22～23℃，既可以启动性腺发育，又不会因为温度过低导致发育太慢)，养殖海水所用盐度为28～30
‰
(低于青岛海域海水盐度30～32
‰
)，ph8.0～8.2。
38.饵料投喂：侏儒蛤为杂食性贝类，养殖所用饵料参照贝类养殖，同时增加发酵饵料来补充蛋白、氨基酸、b族维生素、不饱和脂肪酸，主要包括硅藻，扁藻，金藻，角毛藻，红酵母，em菌和蛋黄。具体为，一天投喂三次养殖单胞藻，以硅藻为主，混合其他单胞藻，投放量为5～6万个/ml，正常实验室饵料养殖密度可达百万/ml，即大约投喂15～20l；晚上增加投喂20ppm浓缩红酵母20ppm，5ppm em菌，具体还需在投喂后两小时，取水样观察水色，如果有饵料残余较多，可以适当减少，反之增加。既要保证充足的营养，又要注意观察排便情况，避免暴饮暴食和消化不良。此外每天早晨投喂1/8个蛋黄，用300目筛绢搓碎，均匀撒在池子
里，补充卵磷脂等营养。
39.换水、吸底&换沙子：池子两天换一次水即可，早晨投饵之前换水，换水量为1/3～1/2，水可以用水管吸出，并且每次换水之前将海水控温(防止温差过大)再加入池子里，在催熟后期减少换水量，尽量减少刺激；每天早晨将沙子上积累的粪便用水管吸出；沙子两周左右换一次，在催熟后期可以停止换沙子。
40.本发明中，侏儒蛤的促熟时间持续20～30天，侏儒蛤个体壳长可达7～10mm，侏儒蛤的性腺发育饱满完全，雌性个体中可以观察到明显的红色，雄性个体可以观察到乳白色或者浅黄色，如图3所示，此时侏儒蛤可以投入到下一步的繁殖阶段。在本发明中首次成功地实现了侏儒蛤在国内的人工催熟，相较于自然条件的成熟，本发明实现了侏儒蛤性腺成熟时间点的灵活可控，并且相对于自然条件下发育的不均一性，本发明通过人工调控可实现侏儒蛤规模化的性成熟，有助于实现精卵的批量获取。
41.2、催产孵化：
42.亲本的挑选：挑选步骤1所催熟的性腺发育成熟，饱满的亲本侏儒蛤亲本，根据实验需要选择亲本数量，注意区分雌雄。
43.催产：催产所使用方法为阴干升温法，同时结合侏儒蛤的习性来确定阴干时间为1.5h和产卵所用海水温度为27℃。操作如下：将挑选出来的侏儒蛤雌雄个体放在洁净干燥的环境阴干，在周围放上冰袋，覆盖黑塑料袋，并且关闭灯光。大概1.5h后，加入27℃的过滤海水，一般0.5～1h后，待侏儒蛤水管出现频繁伸缩时，会有精和卵分别从雌雄侏儒蛤右侧的水管排出，通常情况下，排精会先于产卵。侏儒蛤的产精量较大，呈现白色雾状，如图4所示；侏儒蛤个体初次产卵量为1
ⅹ
105～5
ⅹ
105个，呈现浅粉色的颗粒状，如图5所示。
44.授精：在侏儒蛤排出精卵之后，先取卵样进行观察，一般选取形态比较圆润，卵黄比较均匀饱满的优质卵进行授精，如果优质卵所占比例低于50％则不建议进行授精，因为后续存活率比较低。加入精液后，先进行搅拌以保证精液在水中分布均匀。稍等1～2min后，取样镜检，一般一个卵子周围有3～5个精子便可。如果精子量较大，则用500目筛绢用沉淀法洗卵。此外，随着时间推移，精卵的受精能力逐渐下降，尽量在2个小时以内完成。
45.孵化：授精以后将受精卵转移到15l或者50l玻璃缸进行培育，结合侏儒蛤的习性，本发明使用24℃过滤海水孵化，确保侏儒蛤快速发育，一般密度控制在50个/ml以下，在此间通常不用换水。尤其值得注意的是，侏儒蛤的卵是沉性卵，孵化期间应进行搅拌充气供氧，防止沉底挤压影响孵化，充气大小控制在水面刚泛起气泡，如图6所示。
46.在本发明中，首次成功实现侏儒蛤引种国内后的催产孵化，与自然条件下侏儒蛤相比，其催产成功率可达90％以上。在本发明中，侏儒蛤能成功进行早期胚胎发育，一般20～30min侏儒蛤受精卵完成极体的排出，40～50min完成第一次卵裂，其受精率和卵裂率可达95％以上，14～17h即可顺利孵化到d形幼虫时期，孵化率可达70％以上。此外，对于完成繁殖的亲贝，可继续放入循环系统中恢复性养殖，初始3d，饵料减为1/3，之后恢复正常的催熟环节，在20～30d后，即可再次投入繁殖。
47.实施例2：幼虫培育：
48.选优：经过孵化过程，质量较差的幼虫及未成功发育的受精卵都会沉在玻璃缸底部。侏儒蛤的d形幼虫壳长一般小于60um，所以选用400目的筛网过滤收集上浮的幼虫，并将其转移到新的经过消毒的玻璃缸中，加入过滤的24℃海水，写好标签，沉底的全部弃去。此
外选优的工具需要用提前消毒
49.幼虫培育：选优之后，进入幼虫培育阶段，此间幼虫个体小，适应环境能力比较差，对水质要求高，必须认真管理。每天都要观察室温、水温、水色的变化，以及幼虫的摄食、生长状况，充气是否正常以及幼虫发育时期。培育密度一般为3～10个/毫升，水温不要超过26℃，盐度为28～30
‰
，保证每天2/3的换水量，定期清底和更换玻璃缸。侏儒蛤作为杂食性贝类，其饵料以等鞭金藻、牟氏角毛藻、青岛大扁藻、小新月菱形藻、盐藻为主，在d型时期开始，以纯金藻为开口饵料，最初投饵密度0.1～0.2万个/ml，在发育到壳顶时期之后，混合投喂。随着幼虫发育，逐渐增加投饵量至0.5～1万个/ml，同时逐渐降低金藻在混合藻中的比例，日投4次。此外，还需要补充2ppm浓缩红酵母和2ppm em菌作为营养饵料来补充营养，提高幼虫的存活率。一般在壳顶时期侏儒蛤会有较高的死亡率，此时换用300目筛网进行换水，并且要经常更换玻璃缸。随着幼虫发育，换水的筛网孔径需逐渐加大。
50.附着基的投放：在水温24℃，饵料充足条件下，侏儒蛤幼虫经过10～14天的培育，幼虫面盘逐渐脱落，足和水管逐渐出现，部分幼虫从浮游变为匍匐爬行，其生活方式也由游泳生活向埋栖生活转变。此时需要投放细沙作为附着基，初始厚度0.5cm即可。随着发育，沙子逐渐加厚，值得注意的是，沙子经100目筛网筛选后，需经水洗和消毒处理，尽量除去可能存在的生物和有机污物。
51.在本发明所提供的培育条件下，侏儒蛤成功从d型幼虫阶段(图7所示)发育并且快速完成了幼虫阶段的发育，并且在10～14d开始进入幼虫变态时期，使用细沙作为附着基。在本发明中，30％～50％的幼虫可从d形幼虫时期顺利经过壳顶幼虫时期存活到到变态时期，在幼虫发育的前3天，其壳长生长速度可达5um/d；在之后的一周，其壳长生长速度可达15um/d；在接下来5天，其生长速度降低，保持在5um/d，此时壳长在190～220um左右，即将进入变态期
52.2、稚贝及成体培育：
53.在附着基投放3～4天，幼虫逐渐完成变态，开始营埋栖生活，此时即进入了稚贝和成体阶段。保持适宜密度，控制在2万/m2以下，随着稚贝生长，密度需相应降低，一般在肉眼可见时(壳长1～2mm)，需要降低密度或者转入循环系统中养殖，温度稳定在22～23℃左右。此外在循环系统中，要注意调节水流大小，水流过大可能会将稚贝冲起，进入循环系统中。饵料以单胞藻(硅藻、角毛、扁藻)为主，辅以盐藻、金藻、海洋红酵母和em菌，一般投喂密度6～10万个/ml，日投喂三次。在本发明中，侏儒蛤可以顺利的完成变态，稚贝发育和成体生长，其中处于变态时期的幼虫50％～70％可以完成变态，从浮游生活转为埋栖生活，在18d时，侏儒蛤稚贝壳长可长至600～800um；在25d时，可长到1～2mm，如图8所示；大约30～40d时，侏儒蛤成体大约壳长长到3～5mm，此时可以从后代中挑选一定量的侏儒蛤降温养殖进入下一轮的繁殖周期。