1.本发明涉及添加剂领域，具体涉及一种石斛发酵物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.石斛属(dendrobium)，兰科(orchidaceous)植物的第二大属，中药石斛为多年生草本植物，全球约有500属1500多种，中国大约有76种，其中有33个品种作为商品石斛的原植物被收购流通。2005年《中华人民共和国药典》收录了三种能够作为中药用的石斛包括：铁皮石解、金钗石斛、马鞭石斛。2010和2015年《中华人民共和国药典》收录的三种石斛为金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛的茎，而铁皮石斛被单独列出。其中最常见的品种为铁皮石斛和金钗石斛两种。而功效物质中铁皮石斛以多糖为主，金钗石斛以生物碱为主。《本草纲目》：“石斛除痹下气，补五脏虚劳赢瘦，强阴益精，久服，厚肠胃，补内绝不足，平胃气，长肌肉，逐皮肤邪热痱气，脚膝疼冷痹弱，定志除惊，轻身延年，益气除热，治男子腰膝软弱，健阳，逐皮肤风痹，骨中久冷，补肾益力，壮筋骨，暖水休，益智清气，治发热自汗，痈疽排脓内塞。
3.现代科学研究石斛所含的活性成份主要是生物碱、黄酮类、多糖、萜类和酚类化合物等。该类物质具有提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化、降血脂及血压、调节肠道菌群平衡等功效。在石斛原料的基础上利用微生物进行发酵，利用微生物的发酵能力及丰富的代谢产物，可以实现石斛中功效物在发酵过程的温和释放及转化，避免了高温提取对功效物质造成的损失。不同的微生物个体存在不同的发酵特性，以多糖为益生元的条件下，促进各类有益微生物的代谢生长，并分泌短链脂肪酸、多肽、氨基酸并代谢产生各种酶类。发酵后的石斛产物具有更多益于人体的成分，并有更好的功能体现，在药品、保健食品、普通食品、护肤品的开发中具有重要价值，通过内服外用的方法解决当前各类现代人的机体问题。
4.目前现有技术公开的技术方案包括：
5.cn 104585762 a：一种铁皮石斛发酵制品及其制备方法，采用了明珠串球菌、乳酸菌、酵母菌混合果蔬汁进行发酵
6.cn 104940644 a：一种铁皮石斛的乳酸菌发酵方法及其发酵产物和应用；单独乳酸菌发酵铁皮石斛，制备成石斛乳酸菌冻干粉。
7.cn 105534876 a：一种石斛发酵原浆及其制备方法与应用；石斛粉与乳杆菌发酵的原浆，为一种针对护肤品的专利研究。
8.cn 105962368 a：一种铁皮石斛发酵液的制备方法，该专利使用原料较多包含紫米、小米、薏米、茯苓、红枣、乌梅、陈皮、焦山楂等多种辅料进行发酵的产物。发酵菌采用乳酸菌。
9.cn 107629965 a：一种铁皮石斛真菌发酵制品的制备方法及其发酵制品与应用，该专利采用了真菌进行发酵，真菌的种类包括灰树花、凸圆灵芝、茯苓、云芝、红灵芝、猴头。
10.cn 108042456 a：一种铁皮石斛发酵物的制备方法和应用，枯草芽孢杆菌和凝固芽孢杆菌发酵铁皮石斛制备铁皮石斛发酵物，主要用于改善皮肤。


技术实现要素：

11.通过上述现有技术，首先发酵用菌种及发酵工艺的不全面，多见乳酸菌发酵，个别真菌、枯草芽孢杆菌和凝固芽孢杆菌等；发酵方式以单独发酵为主，单独发酵不能体现出菌群竞争发酵的优势，部分专利涉及多菌种的分步发酵，但发酵用菌种，发酵方式相对单一；同时在诸多发酵工艺中使用了大量的辅料作为发酵底物，该类辅料含量高，成分复杂，最终的发酵液虽然有功效体现，但不能代表石斛的真实特性，也不是发酵后石斛的表现。
12.现有技术中存在的技术问题为：现有技术中发酵用菌种及发酵工艺的不全面，发酵用菌种，发酵方式相对单一，以及在诸多发酵工艺中使用了大量的辅料作为发酵底物，该类辅料含量高，成分复杂，最终的发酵液虽然有功效体现，但不能代表石斛的真实特性，也不是发酵后石斛的表现。
13.本发明为解决上述技术问题，提供了一种以石斛为主要原料，通过微生物发酵得到石斛发酵物的工艺以及石斛发酵物的产品；同时提供了所述石斛发酵物的制备工艺，包括：(1)菌种的活化培养；(2)石斛原料的处理； (3)酶解处理(4)接种发酵；和(5)后处理。所得的石斛发酵物外用具有良好的抗氧化、抑制酪氨酸酶活性作用，内服可以改善肠道，提高机体免疫力的作用。
14.具体来说，本发明提出了如下技术方案：
15.一种具有抗氧化性、提高免疫能力的石斛发酵物，通过含有石斛、酶解剂和发酵菌体的原料发酵得到；
16.其中，所述酶解剂选自蛋白分解酶、淀粉分解酶、果胶质分解酶、糖化酶、纤维分解酶中的一种或两种以上的混合应用；
17.所述发酵菌体选自酵母菌、乳酸菌、黑曲霉、醋酸菌中的一种或两种以上的混合应用。
18.可选地，对于所述的石斛发酵物，其中，原料中所述石斛选自铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛中的一种或两种以上，优选为铁皮石斛；
19.优选所述石斛的使用部位包括石斛茎、石斛叶、石斛花中的至少一种；进一步优选为石斛茎；
20.优选所述石斛的使用形式包括新鲜存活状态、半干燥状态、干燥状态以及提取物形式中的至少一种。
21.可选地，对于所述的石斛发酵物，其中，酶解剂中所述蛋白分解酶选自木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶或肽酶中的一种或两种以上，优选为菠萝蛋白酶和/或胃蛋白酶；
22.其中，酶解剂中所述淀粉分解酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、高温淀粉酶和糖化酶中的一种或两种以上，优选为高温淀粉酶和/或糖化酶；
23.其中，酶解剂中所述果胶质分解酶选自果胶解聚酶、果胶裂解酶或果胶脱甲氧酶中的一种或两种以上，优选为果胶裂解酶；
24.其中，酶解剂中所述纤维素分解酶选自纤维素酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、木质素酶或葡聚糖酶中的一种或两种以上，优选为纤维素酶和/或木质素酶，进一步优选为木质素酶。
25.可选地，对于所述的石斛发酵物，其中，发酵菌体中所述酵母菌选自酿酒酵母、布
拉氏酵母bld、毕赤酵母、假丝酵母或扣囊复膜酵母中的一种或两种以上；优选为选自布拉氏酵母bld、假丝酵母或扣囊复膜酵母中的一种或两种以上，进一步优选为假丝酵母或扣囊复膜酵母中的一种；
26.其中，发酵菌体中所述乳酸菌选自戊糖乳杆菌、干酪乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、lgg或bb12 中的一种或两种以上；优选为选自戊糖乳杆菌、植物乳杆菌或嗜酸乳杆菌中的一种或两种以上；进一步优选为戊糖乳杆菌。
27.一种前述的石斛发酵物的制备方法，包括以下步骤：
28.(1)发酵菌体活化培养；
29.(2)石斛原料处理；
30.(3)对步骤(2)中处理后的石斛进行酶解；
31.(4)向步骤(3)酶解产物中接种步骤(1)活化后的发酵菌体进行发酵；
32.(5)将步骤(4)所得产物进行后续处理，得到石斛发酵物。
33.可选地，对于所述的制备方法，其中，步骤(4)中所述向步骤(3)酶解产物中接种步骤(1)活化后的发酵菌体进行发酵包括以下四种发酵方法中的至少一种：
34.a.每种微生物单独发酵：将每种活化后的发酵菌体分别接种，每种发酵菌体单独发酵；
35.b.混合同步发酵：将至少两种活化后的发酵菌体共同接种，混合同步发酵；
36.c.单独发酵后混合使用:采用至少两种活化后发酵菌体，将其中每一种单独接种，单独发酵后，将不同发酵菌种的发酵产物混合；
37.d.分步梯度发酵：采用至少两种活化后发酵菌体，将其中一种菌体先进行发酵，然后在发酵产物基础上接种其他菌体再进行发酵，其中每阶段仅接种一种菌体。
38.可选地，对于所述的制备方法，其中，步骤(1)所述发酵菌体活化培养包括：
39.将原始菌株放入液体培养基中，培养至od值为0.5-1.0；优选培养至菌体浓度为1
×
108cfu/ml以上。
40.可选地，对于所述的制备方法，其中，步骤(2)所述石斛原料处理包括：
41.方式a.对干制石斛打粉过筛，优选打粉至60-100目；和/或
42.方式b.对新鲜石斛打浆处理，优选打浆过程中石斛原料与水的质量体积比1:100-1:1，进一步优选为1:100-1:5；和/或
43.方式c.对石斛进行提取；
44.其中，步骤(5)所述后续处理的操作包括：离心、过滤得到澄清液体，和/或通过冻干或喷雾干燥得到粉末产品。
45.可选地，对于所述的制备方法，其中，方式c中，对石斛进行提取的试剂选自水、低级醇类、高级醇类、多元醇类、酯类、酮类以及烃系溶剂中的一种或两种以上；
46.优选地，所述低级醇类包括甲醇、乙醇和丙醇；
47.优选地，所述高级醇类包括油醇、硬脂醇和辛基十二醇；
48.优选地，所述酯类包括乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸甲酯和三辛酸甘油酯；
49.优选地，所述酮类包括丙酮和甲乙酮；
50.优选地，所述醚类包括乙醚和异丙醚；
51.优选地，所述烃系溶剂包括正己烷、甲苯和氯仿；
52.进一步优选，所述提取试剂为水与乙醇的混合溶剂，优选质量比水：乙醇为1:1-25:1；进一步优选为水与甘油的混合溶剂，优选体积比水：甘油为1:1-20:1；进一步优选为水与1,3-丙二醇或水与1,3-丁二醇的混合溶剂，优选体积比水：1,3-丙二醇或水：1,3-丁二醇为1:1-15:1。
53.可选地，对于所述的制备方法，其中，步骤(3)所述对步骤(2)中处理后的石斛进行酶解包括：
54.酶解剂：调节石斛原料总质量的质量比为1:10000-1:100；优选为1:1000；
55.酶解环境的ph为2-9，优选ph为4-7；
56.酶解的温度为30-100℃，优选为30-60℃，进一步优选，对于高温淀粉酶，酶解温度为60-100℃；
57.酶解时间为0.5-24h，优选为2-6h。
58.可选地，对于所述的制备方法，其中，所述b混合同步发酵包括：黑曲霉和酵母菌组合、或黑曲霉、乳酸菌和醋酸菌组合、或酵母菌和乳酸菌组合、或酵母和醋酸菌组合；
59.所述d分步梯度发酵包括：先乳酸菌后酵母菌再醋酸菌、或先霉菌后酵母菌再乳酸菌，或先酵母菌后乳酸菌再醋酸菌。
60.可选地，对于所述的制备方法，其中，步骤(4)所述向步骤(3)酶解产物中接种步骤(1)活化后的发酵菌体进行发酵，
61.其中，发酵时所用的发酵培养基包括所述酶解产物、碳源和氮源；
62.其中，以步骤(3)所得酶解产物总体积计，碳源与所述酶解产物的体积比为1:2-1:1000，氮源与所述酶解产物的体积比为1:3-1:1000；
63.优选碳源与所述酶解产物的体积比为1:50，氮源与所述酶解产物的体积比为1:100；
64.所述碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、水解淀粉中的一种或两种以上，优选为葡萄糖、蔗糖和水解淀粉；
65.所述氮源选自硫酸铵、氯化铵、大豆水解物、牛肉膏、奶粉、酵母水解物中的一种或两种以上，优选为硫酸铵、氯化铵、水解大豆蛋和酵母提取物。
66.可选地，对于所述的制备方法，其中，步骤(4)所述向步骤(3)酶解产物中接种步骤(1)活化后的发酵菌体进行发酵，其中，以所述发酵培养基总体积计，所述活化后的发酵菌体的添加量为1:10000-1:100g/ml；
67.优选发酵温度25℃-45℃；优选发酵培养时间为0.5-10天；优选通气量在0～100l/min；优选转速控制在20～100r/min；
68.优选地，菌株lgg和bb12添加量为1
×
105cfu/ml
×
10
10
cfu/ml。
69.一种石斛发酵物，其通过前述的制备方法制备得到。
70.一种护肤外用石斛发酵物，其特征在于，通过前述的制备方法制备得到；
71.其中，步骤(4)中所述向步骤(3)酶解产物中接种步骤(1)活化后的发酵菌体进行发酵包括：所述进行发酵过程中发酵培养基中加入醇类溶剂；
72.优选所述醇类溶剂包括乙醇、异丙醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇、己二醇、戊二醇和甘油中的至少一种；优选为丁二醇和甘油；
73.所述醇类溶剂与所述发酵培养基总体积的体积比为1:1000-1:5。
74.前述的石斛发酵物、或前述的护肤外用石斛发酵物，在护肤品、化妆品、药品、保健食品及食品领域的应用。
75.本发明的有益效果：
76.(1)本发明技术中，使用不同品种及不同部位的石斛作为发酵原料，尽可能少的添加其他天然产物，可以更直接的发酵石斛天然产物，体现石斛的发酵价值。
77.(2)本发明的制备方法以及得到的石斛发酵物使用酵母菌、乳酸菌、霉菌、醋酸菌等不同的微生物。
78.(3)本发明中国的发酵工艺使用了单独发酵，混合发酵，混合梯度发酵等不同的发酵方式，同时配合有机试剂的使用，可以更全面的体现出发酵石斛的药用、护肤、保健等方面的价值，对于发酵行业或者石斛产业都有好的指导借鉴作用。
具体实施方式
79.本发明旨在提供一种具有抗氧化性、提高免疫力的石斛发酵物及其制备方法和应用，所得的石斛发酵物外用具有良好的抗氧化、抑制酪氨酸酶活性作用，内服可以改善肠道，提高机体免疫力的作用，可以广泛应用到食品、药品、保健食品、护肤品诸多行业中。
80.具体来说，本发明提供了如下技术方案：
81.一方面，本发明提供了一种石斛发酵产物，其中，所用原料包括：石斛、酶解剂以及发酵菌剂。
82.本发明以石斛属作为主要原料，选自铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛及石斛属植物中的一种或两种以上。
83.在本发明一个优选实施方案中，石斛原料采用了铁皮石斛。
84.本发明中石斛原料使用部位包括石斛茎、石斛叶、石斛花及上述三种的混合状态
85.在本发明一个优选实施方案中，使用部位为石斛茎。
86.本发明石斛原料。原料包括石斛天然存在形式(包括新鲜状态、半干燥状态和干燥状态)和其相应提取物(提取试剂包括水；甲醇、乙醇、丙醇等低级醇类；油醇、硬脂醇、辛基十二醇等高级醇类；乙二醇、1,3-丙二醇、1,2
-ꢀ
戊二醇、1,3-丁二醇、甘油等多元醇类；乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸甲酯、三辛酸甘油酯等酯类；丙酮、甲乙酮等酮类；乙醚、异丙醚等醚类；正己烷、甲苯、氯仿等烃系溶剂等，可以单独使用或者混合使用两种以上)。
87.在本发明一个优选实施方案中，提取试剂包括：水与乙醇的混合溶剂，优选质量比(水：乙醇)为1:1-25:1；水与甘油的混合溶剂，优选体积比(水：甘油)为1:1-20:1；水与1,3-丙二醇或水与1,3-丁二醇的混合溶剂，优选体积比(水：1,3-丙二醇或水：1,3-丁二醇)为1:1-15:1。
88.在本发明一个优选实施方案中，对石斛原料处理方法为：对石斛新鲜原料的打浆处理，其中，所述石斛新鲜原料选自石斛的半干和/或全干燥制品；打浆过程中石斛原料与水的质量体积比1:100-1:1，进一步优选为1:100-1:5；打粉至60-100目。
89.本发明所用酶解剂选自蛋白分解酶、淀粉分解酶、果胶质分解酶、纤维分解酶中的一种或两种以上的混合应用，其中蛋白分解酶包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和肽酶；淀粉分解酶包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、高温淀粉酶；果胶质分解酶包括果胶解聚酶、果胶裂解酶、果胶脱甲氧酶；纤维素分解酶包括纤维素酶、半纤维素酶、甘露聚糖
酶、木聚糖酶、木质素酶和葡聚糖酶。
90.本发明所用发酵菌剂选自酵母菌、乳酸菌、黑曲霉、醋酸菌中的一种或两种以上，其中，酵母菌包括酿酒酵母、布拉氏酵母bld、毕赤酵母、假丝酵母和扣囊复膜酵母；乳酸菌包括戊糖乳杆菌、干酪乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及包括lgg和bb12 的商品菌株。
91.另一方面，本发明提供了一种石斛发酵物的制备方法，包括下述步骤：
92.1)菌体活化培养；
93.2)石斛原料处理；
94.3)对步骤(2)中处理后的石斛进行酶解；
95.4)对步骤(3)中酶解后的物质进行接种发酵；
96.5)后续处理。
97.在本发明的一个优选实施方案中，步骤(4)发酵方法包括：单独各种微生单独发酵、混合同步发酵、单独发酵后混合使用以及分步梯度发酵。
98.在本发明的一个优选实施方案中，步骤(5)包括离心、过滤得到澄清液体，和/或通过冻干或喷雾干燥得到粉末产品。
99.另外，本发明还提供了一种护肤外用石斛发酵物，其在步骤(4)进行发酵过程中培养基组成还包括醇类溶剂，所述醇类溶剂与发酵液总体积的比值为1:1000-1:5(体积比)。
100.在本发明的一个优选实施方案中，在酶解完成后采用高温或调节ph值使酶失活后再进行发酵。
101.在本发明的一个优选实施方案中，所述石斛发酵物可以应用于护肤品、化妆品、药品、保健食品及食品领域，其中，食用石斛发酵物选择石斛天然原料及可用于食品加工的提取试剂(如乙醇或乙醇水混合物)加工的提取物作为发酵底物，护肤外用石斛发酵物发酵所用的石斛提取物使用的水之外的溶剂或者水和溶剂的混合物不受此限制。
102.菌株保藏信息
103.1.布拉氏酵母bld：布拉迪酵母安琪1.27(saccharomyces boularidi安琪1.27)于2012年4月16日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no:m2012116，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。该菌株已在授权公告号为 cn103374531b的授权专利文本中公开。
104.2.醋酸菌：食糖驹形杆菌ayc1.2(komagataeibacter saccharivoransayc1.2)于2019年7月19日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no:m2019569，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
105.3.植物乳杆菌：植物乳杆菌rpc5(lactobacillus plantarum rpc5)于 2019年7月19日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为 cctcc no:m2019566，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
106.4.假丝酵母：假丝酵母c1.7(wickerhamomyces anomalus c1.7)于2017 年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccno:m2017782，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话： (027)-68754052。
107.5.黑曲霉：黑曲霉d5.23(aspergillus nigerd5.23)于2017年12月04 日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no: m2017756，保藏地址：中国.武汉.
武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)
ꢀ-
68754052。
108.6.戊糖乳杆菌：戊糖乳杆菌001(pediococcus pentosaceus 001)于2017 年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccno:m2017625，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话： (027)-68754052。
109.7.扣囊复膜酵母：扣囊复膜酵母菌d6.16(saccharomycopsis fibuligerad6.16)于2019年7月19日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no:m2019570，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
110.8.酿酒酵母：酿酒酵母a3.12(saccharomyces cerevisiae a3.12)于2017 年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccno:m2017781，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话： (027)-68754052。
111.9.嗜酸乳杆菌：嗜酸乳杆菌001(lactobacillus acidophilus 001)于2017 年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccno:m2017628，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话： (027)-68754052。
112.本发明实施例中所用到各试剂和仪器来源如下：
113.表1实施例所用试剂和仪器
114.[0115][0116]
在本发明中，采用的商业菌株不需要进行活化可直接投入使用。
[0117]
上述表格中未列举的原料均可以通过商购渠道获得。
[0118]
下面将通过实施例来进一步说明本发明石斛发酵物的制备。
[0119]
实施例
[0120]
实施例1
[0121]
(1)菌种的活化培养：
[0122]
将布拉迪酵母安琪1.27(saccharomyces boularidi安琪1.27)，保藏编号为cctcc no:m2012116，斜面中菌落挑取一环放入500mlpbd液体培养基中，进行摇床培养，其中摇床培养的温度为28℃，摇床上活化培养16h，进行离心，离心速率为5000r/min，离心时间为10min，得到酵母菌体；
[0123]
其中，pdb液体培养基组成包括：水1l，马铃薯提取物4.0g，葡萄糖 20.0g，并调节ph为5.6
±
0.2；
[0124]
经检测，培养完成时，od值为0.8。
[0125]
其中od值的测试方法具体包括：分光光度计，可见光区a＝600nm,以纯水为参比试剂，直接测定od值。
[0126]
(2)石斛原料处理：
[0127]
新鲜铁皮石斛茎，清洗后打浆处理，得到的石斛浆液加入水进行调制，按照新鲜石斛与水的质量体积比1:10进行调制，得到石斛原料。
[0128]
(3)酶解：
[0129]
将步骤(2)调制好的石斛原料升温至80℃，之后按照1:10000质量比 (以调制后的石斛原料总质量计)加入高温淀粉酶，搅拌进行酶解反应，酶解1h后，再降温至40℃后，然后按照1:10000(以调制后的石斛原料总质量计)的比例添加胃蛋白酶，再进行反应4h。
[0130]
(4)发酵：
[0131]
取步骤(3)酶解后得到的全部产物，并以此为质量基准添加营养物质：
[0132]
碳源：按照碳源：酶解产物为1:10的质量比例添加葡萄糖；氮源：按照氮源：酶解产物为1:20的比例添加大豆水解物；搅拌均匀后100℃加热灭菌30min，得到培养基，并将温度冷却至室温；
[0133]
然后，将步骤(1)所得产物：活化布拉氏酵母菌按照质量体积比1:1000 加入上述培养基中(以培养基总质量计)，进行进行发酵，发酵温度28℃，通气量在50l/min，转速控制在100r/min，发酵培养2天。
[0134]
(5)后处理
[0135]
发酵结束后先板框200-400nm过滤，再通过10000d膜过滤得到澄清石斛发酵物，130℃，灭菌3s，得到最终石斛发酵物澄清液体。
[0136]
实施例2
[0137]
(1)菌种的活化培养：
[0138]
a.酿酒酵母活化：采取酿酒酵母：酿酒酵母a3.12(saccharomyces cerevisiae a3.12)，斜面中菌落挑取一环放入pdb液体培养基中，摇床上 30℃活化培养，摇床转速200r/min，摇床培养20h时结束培养，离心分离得到酵母菌菌体.
[0139]
经检测，培养完成时，od值为0.7。
[0140]
其中，pdb液体培养基组成包括：水1l，马铃薯提取物4.0g，葡萄糖 20.0g，并调节ph为5.6
±
0.2；
[0141]
b.醋酸菌活化：将醋酸菌：食糖驹形杆菌ayc1.2(komagataeibacter saccharivorans ayc1,2)，保藏编号为cctcc no:m2019569，挑取一环到液体培养基中，30℃活化摇床培养24h，离心分离得到醋酸菌菌体，
[0142]
其中，所用培养基组成包括：水1l，1％酵母膏、1％葡萄糖、1.5％caco3、 3％无水乙醇，调节ph＝5.5；
[0143]
c.植物乳杆菌活化：将植物乳酸杆菌：植物乳杆菌rpc5(lactobacillus plantarum rpc5)，保藏编号为cctcc no:m2019566，挑取一环接种到相应mrs液体培养基中，35℃静置培养24h，离心分离得到乳酸菌菌体，
[0144]
其中，所述mrs液体培养基组成包括：水1l，蛋白胨0.0g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0ml，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，ph调节至6.2-6.6。
[0145]
(2)石斛原料处理：
[0146]
采用干制金钗石斛茎打粉后过60目筛，石斛花粉碎，按照石斛茎：石斛花＝10:1混合，然后按照石斛混合粉与水的质量体积比1:200进行调制，得到石斛原料。
[0147]
(3)酶解：
[0148]
将步骤(2)调制后的石斛原料升温至40℃，之后按照1:1000质量比(以调制后的石斛原料总质量计)加入糖化酶，搅拌进行酶解，酶解2h；
[0149]
然后按照1:10000质量比(以调制后的石斛原料总质量计)添加纤维素酶，再进行酶解2h，温度保持不变，得到酶解产物。
[0150]
(4)发酵
[0151]
取步骤(3)酶解得到的全部产物，并以此为质量基准添加营养物质：
[0152]
碳源：按照碳源：酶解产物1:10的质量比添加蔗糖；氮源：按照氮源：酶解产物1:50的质量比添加酵母水解物、按照氮源：酶解产物1:200的质量比添加硫酸铵；搅拌均匀后120℃加热灭菌15min，得到培养基。
[0153]
待温度冷却至室温后，将步骤(1)活化后的酿酒酵母菌按照质量体积比 1:1000(以培养基总质量计)，醋酸菌按照质量体积比1:1000(以培养基总质量计)，乳酸菌按照质量体积比1:1000(以培养基总质量计)分别加入后进行同时发酵，发酵温度30℃，通气量在8l/min，转速控制在20r/min，发酵培养5天。
[0154]
(5)后处理：
[0155]
待发酵结束后，先板框200-400nm过滤，然后冷冻干燥处理：将发酵液置于物料盘中，冷冻干燥机中按照正常冻干工艺进行，冻干结束后将产品取出，得到石斛发酵物冻干粉。
[0156]
实施例3
[0157]
(1)菌种的活化培养：
[0158]
a.采取假丝酵母：假丝酵母c1.7(wickerhamomyces anomalus c1.7)，保藏编号为cctcc no:m2017782，在斜面菌落中挑取一环放入液体培养基中，摇床上28℃活化摇床培养36h，离心分离得到酵母菌菌体，
[0159]
其中，培养基组成包括：水1l，马铃薯提取物4.0g，葡萄糖20.0g，并调节ph为5.6
±
0.2；；
[0160]
经过检测，培养结束时od值为0.75。
[0161]
b.采取黑曲霉：黑曲霉d5.23(aspergillus niger d5.23)，保藏编号为 cctcc no:m2017756，挑取一环接种至液体培养基中，摇床培养，培养温度30℃，培养时间24h，得到黑曲霉菌体。
[0162]
其中，所用固体培养基组成包括：水1l，蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、氯霉素0.1g最终ph为5.6
±
0.2。
[0163]
c.采用戊糖乳杆菌：戊糖乳杆菌001(pediococcus pentosaceus 001)， cctcc no:m2017625，在菌落中挑取一环接种到mrs液体培养基中，在 35℃下静置培养24h，离心分离得到菌体。
[0164]
其中，所用液体培养基组成包括：水1l，蛋白胨0.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0ml，乙酸钠 5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，ph调节至6.2-6.6；
[0165]
经过检测，培养结束时od值为0.6。
[0166]
(2)石斛原料处理：制备石斛提取物
[0167]
干制流苏石斛茎打粉后过60目筛，石斛花粉碎，按照石斛茎：石斛花＝3:1混合，然后按照石斛混合粉与：75％乙醇水溶液的质量体积比1:10进行提取，提取温度60℃，提取时间6h，提取后抽真空减压浓缩至干物质浓度到20％，喷粉进风温度120℃，出风温度90℃，得到石斛提取物。
[0168]
(3)酶解：
[0169]
将步骤(2)所得全部石斛提取物按照与水的质量体积比为1：10，添加到水中，得到石斛原料，升温至80℃后；
[0170]
将按照质量比(以石斛原料总质量计)高温淀粉酶：石斛原料为1:10000 的比例加入高温淀粉酶，搅拌进行酶解，酶解30min；
[0171]
调整温度为50℃，按照质量比(以石斛原料总质量计)菠萝蛋白酶：石斛原料1:1000添加菠萝蛋白酶，并进行水解4h；
[0172]
然后按照质量比(以石斛原料总质量计)1:10000的质量比例添加木质素酶，并进行水解2h，水解温度为55℃。
[0173]
(4)发酵
[0174]
取步骤(3)酶解后全部产物，以此为质量基准，进行添加营养物质：
[0175]
碳源：按照碳源：酶解产物质量比为1:100的比例进行添加水解淀粉；氮源：按照氮源：酶解产物质量比为1:50的比例添加氯化铵，将上述物质混合搅拌均匀后，80℃加热灭菌60min后；将上述物质平均分配到三个体积为5l的发酵罐1-3中。
[0176]
待温度冷却后，向三个发酵罐中分别接种步骤(1)中培养得到的三种菌种：将假丝酵母菌按照假丝酵母菌：培养基质量体积比1:500，将黑曲霉按照黑曲霉：培养基质量体积比1:10000，将乳酸菌按照乳酸菌：培养基质量体积比1:1000，分别加入到各自的发酵罐1-3中进行发酵；其中：
[0177]
假丝酵母发酵温度31℃，通气量在20l/min，转速控制在80r/min，发酵培养2天(24h)；
[0178]
黑曲霉发酵温度33℃，通气量65l/min，转速控制在50r/min，发酵培养 3天(36h)；
[0179]
戊糖乳杆菌发酵温度36℃，通气量5l/min，转速控制在10r/min，发酵培养3天(36h)。
[0180]
上述三个发酵罐中物质发酵结束后，将三个发酵罐中的发酵产物混合均匀，并在在90℃下加热60min，得到发酵混合物。
[0181]
(5)后处理
[0182]
将步骤(4)得到的发酵混合物浓缩后抽真空浓缩至干物质到30％；塔干燥，进风温度115℃，出风温度95℃，喷粉得到石斛发酵物冻干粉。
[0183]
实施例4
[0184]
(1)菌种的活化培养：
[0185]
a.采用扣囊复膜酵母：扣囊复膜酵母菌d6.16(saccharomycopsis fibuligera d6.16)，保藏编号为cctcc no:m2019570，斜面中菌落挑取一环放入液体培养基中，进行摇床培养，培养温度为28℃，培养时间为36h，离心分离得到酵母菌菌体
[0186]
其中，所用培养基组成包括：水1l，马铃薯提取物4.0g，葡萄糖20.0g，并调节ph为5.6
±
0.2；；
[0187]
经过检测，培养结束时od值为0.76。
[0188]
b.将醋酸菌：食糖驹形杆菌ayc1.2(komagataeibacter saccharivorans ayc1.2)，保藏编号为cctcc no:m2019569，挑取一环接种到液体培养基中，30℃活化摇床培养24h，得到醋酸菌菌体；
[0189]
其中，所用培养基组成包括：水1l、1％酵母膏、1％葡萄糖、1.5％caco3、3％无水乙醇调节ph＝5.5；
[0190]
经过检测，培养结束时od值为0.67。
[0191]
(2)石斛原料准备
[0192]
采取干制流苏鼓槌石斛茎打粉后过100目筛，得石斛细粉。
[0193]
(3)发酵
[0194]
取步骤(2)所得全部石斛细粉，按照1:50添加到水中进行混合，得到石斛原料，并以混合后的石斛原料总质量为基准，进行添加营养物质：
[0195]
碳源：按照碳源：石斛原料1:100的质量比例添加葡萄糖；氮源：按照氮源：石斛原料1:100的质量比例添加牛肉膏。将上述物质将混合均匀；
[0196]
将上述混合后的物质平均分配到三个5l发酵罐中，在80℃下加热灭菌 60min；
[0197]
待温度冷却至室温后，向三个发酵罐中分别接种步骤(1)已经活化后的两种菌株，以及商用菌株bb12(商品菌株不需进行活化，直接使用即可)，具体接种方式为：
[0198]
接种扣囊复膜酵母：酵母菌体按照质量体积比1:1000，发酵温度28-30℃，通气量在50-60l/min，转速控制在80r/min，发酵时间2天；
[0199]
接种醋酸菌；按照质量体积比1:1000接入发酵罐中，温度30-32℃，转速 100r/min，发酵时间2天，以培养基总质量计，按照1:50一次性补加蔗糖(所用蔗糖预先在120℃下灭菌15min)；
[0200]
接种商品菌bb12(商品菌株不需进行活化，直接使用即可)：按照1:1000 添加进行发酵，温度36℃，通气量5l/min，转速控制在10r/min，发酵培养 3天。
[0201]
将三种发酵产物混合均匀，不进行灭菌处理。
[0202]
(5)后处理
[0203]
将步骤(4)得到的混合发酵产物直接冻干，得到石斛发酵物冻干粉。
[0204]
实施例5
[0205]
步骤(1)-(2)与实施例1中相同；
[0206]
(3)将步骤(2)调制好的全部石斛原料升温至100℃，将高温淀粉酶按照1:1000添加(酶解剂：调制后石斛原料总体积，搅拌进行酶解反应，酶解1h后，降温至40℃，按照1:1000的比例添加胃蛋白酶后水解4h。
[0207]
(4)取步骤(3)酶解后全部混合物，并以此为质量基准添加营养物质：
[0208]
碳源：按照1:10的比例添加葡萄糖；氮源：按照1:20的比例进行添加大豆水解物；以及按照1:20的比例进行添加甘油；搅拌均匀后100℃加热灭菌30min。
[0209]
待温度冷却至室温后，将步骤(1)所得活化布拉氏酵母菌按照质量体积比1:1000加入(以搅拌后总质量计)进行发酵，发酵温度28℃，通气量在 50l/min，转速控制在100r/min，发酵培养2d。
[0210]
步骤(5)与实施例1相同，最终得到石斛发酵物澄清液体。
[0211]
实施例6
[0212]
(1)菌种的活化培养：
[0213]
a.扣囊复膜酵母活化：采取扣囊复膜酵母菌d6.16(saccharomycopsis fibuligera d6.16)，保藏编号为cctcc no:m2019570，斜面中菌落一环放入pdb液体培养基中，摇床上28℃活化，摇床转速180r/min培养12h，离心分离得到酵母菌菌体，
[0214]
其中，pdb液体培养基组成包括：水1l，马铃薯提取物4.0g，葡萄糖 20.0g，并调节ph为5.6
±
0.2
[0215]
经检测，发酵菌体体系的od值＝0.8；
[0216]
b.醋酸菌活化：将醋酸菌：食糖驹形杆菌ayc1.2(komagataeibacter saccharivorans ayc1.2)，保藏编号为cctcc no:m2019569，挑取一环同步接种到液体培养基中，30℃活化摇床培养24h，离心分离得到醋酸菌菌体，
[0217]
其中所用培养基组成包括：水1l，按照10酵母膏、10葡萄糖、15caco3、 30无水乙醇添加，调节ph＝5.5；
[0218]
c.嗜酸乳杆菌活化：将嗜酸乳杆菌001(lactobacillus acidophilus 001)，保藏编号cctcc no:m2017628，挑取一环同步接种到mrs液体培养基中 35℃静置培养24h，离心分离得到乳酸菌菌体；
[0219]
其中，所用mrs培养基组成包括：水1l，蛋白胨0.0g，牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温801.0ml、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g，ph调节至6.2-6.6
[0220]
(2)石斛原料处理：
[0221]
采用干制铁皮石斛茎打粉后过60目筛，石斛花粉碎，按照石斛茎：石斛花＝5:1混合，然后按照石斛混合粉与水的质量体积比1:100进行调制。
[0222]
(3)酶解：
[0223]
将步骤(2)调制后的石斛原料升温至50℃，将糖化酶按照1:1000添加，搅拌进行酶解，酶解2h；然后按照1:1000(酶与石斛原料质量比)添加纤维素酶。再进行酶解4h，温度保
持不变。
[0224]
(4)发酵
[0225]
取步骤(3)酶解后混合物，并以总质量为基准添加营养物质：
[0226]
碳源：按照1:10的比例添加蔗糖；氮源：按照1:50添加酵母水解物、 1:20添加硫酸铵；搅拌均匀后120℃加热灭菌15min。
[0227]
待温度冷却至室温后，将步骤(1)活化后的酿酒酵母菌按照质量体积比1:1000，30℃有氧发酵24h，通气量在,2l/min，转速控制在80r/min，发酵结束后加热至90℃，30min；
[0228]
待温度降低至30℃时调节ph至6.0-6.5，接入醋酸菌，醋酸菌按照质量体积比1:1000添加，30℃有氧发酵36h，通气量在8l/min，转速控制在20r/min, 发酵结束后加热至90℃，30min；
[0229]
待温度降低至35℃时调节ph至6.0-6.5，嗜酸乳酸菌按照质量体积比 1:500分别加入后进行厌氧发酵，发酵温度35℃，发酵时间24h。
[0230]
(5)后处理：
[0231]
待发酵结束后，先板框过滤澄清，得到石斛发酵滤液。
[0232]
对比例1
[0233]
步骤(1)-(2)与实施例1中相同；
[0234]
(5)将步骤(2)调制好的石斛原料升温至100℃，将高温淀粉酶按照 1:10000添加(以调制后的石斛原料总质量计)，搅拌进行酶解反应，酶解 1h后，降温至40℃，按照1:10000的比例添加胃蛋白酶后水解4h。
[0235]
(6)取步骤(3)酶解后全部混合物，并以此为质量基准添加培养基物质：
[0236]
碳源：按照1:200的比例添加葡萄糖；氮源：按照1:200的比例进行添加大豆水解物；以及按照1:20的比例进行添加甘油；搅拌均匀后100℃加热灭菌30min。
[0237]
待温度冷却至室温后，将步骤(1)所得活化布拉氏酵母菌按照质量体积比1:1000加入(以搅拌后总质量计)进行发酵，发酵温度28℃，通气量在 50l/min，转速控制在100r/min，发酵培养2d。
[0238]
步骤(5)与实施例1相同，最终得到石斛发酵物澄清液体。
[0239]
对比例2
[0240]
步骤(1)-(2)与实施例1中相同；
[0241]
(7)将步骤(2)调制好的全部石斛原料升温至50℃，将高温淀粉酶按照1:1000添加酶解剂进行酶解的并以此为质量基准添加培养基物质：
[0242]
碳源：按照1:10的比例添加葡萄糖；氮源：按照1:20的比例进行添加大豆水解物；以及按照1:20的比例进行添加甘油；搅拌均匀后100℃加热灭菌30min。
[0243]
待温度冷却至室温后，将步骤(1)所得活化布拉氏酵母菌按照质量体积比1:1000加入(以搅拌后总质量计)进行发酵，发酵温度20℃，通气量在50l/min，转速控制在10r/min，发酵培养2d。
[0244]
步骤(5)与实施例1相同，最终得到石斛发酵物澄清液体。
[0245]
对比例3
[0246]
(1)采用市售植物乳杆菌lp90(上海紫石生物科技有限公司)，直接进行使用，无需进行活化。
[0247]
(2)石斛原料处理：
[0248]
采用干制铁皮石斛茎打粉后过60目筛，石斛花粉碎，按照石斛茎：石斛花＝5:1混合，然后按照石斛混合粉与水的质量体积比1:100进行调制。
[0249]
(3)酶解：
[0250]
将步骤(2)调制后的全部石斛原料升温至50℃，将糖化酶按照1:1000 添加，搅拌进行酶解，酶解2h；然后按照1:1000(酶与石斛原料质量比)添加纤维素酶。再进行酶解4h，温度保持不变。
[0251]
(4)发酵
[0252]
取步骤(3)酶解后混合物，并以总质量为基准添加培养基物质：
[0253]
碳源：按照1:10的比例添加蔗糖；氮源：按照1:50添加酵母水解物；搅拌均匀后120℃加热灭菌15min。
[0254]
待温度冷却至室温后，将市售植物乳杆菌按照质量体积比1:2000加入后进行有氧发酵，发酵温度35℃，发酵时间48h，搅拌速度10r/min。
[0255]
(5)后处理：待发酵结束后，先板框过滤澄清，真空浓缩干燥至干物质 30％，喷雾干燥得到石斛发酵液粉末。
[0256]
对比例4
[0257]
在本实施例中，采用实施例2中的原料及操作，但是不进行步骤(3)酶解，在步骤(2)获得石斛原料后，以石斛原料为质量基准添加发酵所需的营养物质，并进行发酵，最终获得发酵产物。
[0258]
为了验证本发明所制备的石斛发酵物的性能，对上述实施例以及对比例中的发酵前(酶解产物，如果未进行酶解则为石斛原料)及发酵后的产物分别进行dpph自由基清除率以及酪氨酸酶抑制率测试，测试结果总结如下表所示。
[0259]
表2石斛发酵产物性能汇总表
[0260]
[0261][0262]
由上表可以看出；
[0263]
(1)本发明实施例1-6中提供的石斛发酵物与石斛原料相比，其自由基清除率提升率为176-400％，酪氨酸酶抑制率提升率为117-373％；而对比例 1-4中的石斛发酵物与石斛原料相比，自由基清除率提升率为96.8-194％，酪氨酸酶抑制率提升率为39.5-78.5％，对比例所得产物的自由基清除率以及酪氨酸酶抑制率的提升率均低于本发明实施例所提供的的石斛发酵物的提升率；
[0264]
(2)本发明实施例1-6中提供的石斛发酵物中，实施例2和实施例6提供的石斛发酵物自由基清除率提升率均为300％左右，和酪氨酸酶抑制率提升率均为200％以上。
[0265]
本发明对于所制备的石斛发酵物的性能测试包括：测试dpph自由基清除率，酪氨酸酶抑制率，具体操作为：
[0266]
(1)基于dpph自由基清除能力抗氧化活性评价
[0267]
dpph标准液的配制：烧杯称取0.003gdpph，适量无水乙醇溶解，超声 5min，转移至容量瓶定容至50ml，充分混匀。避光保存。(3.5h内使用完)
[0268]
样品溶液浓度的确定：
[0269]
步骤一：dpph3.0ml，滴加样品液，溶液颜色基本褪去时记录加样量。
[0270]
步骤二：以步骤一中的加样量为最大加样量，往前设置5-6个浓度梯度；用蒸馏水补至3ml；加入3.0ml dpph溶液；混匀；黑暗中静置30min。取出测定a值。
[0271]
关于对照的设置：
[0272]
表3
[0273][0274][0275]
关于清除率的计算：
[0276]
清除率s(％)＝[(a0-(ai-aj))/a0]*100％
[0277]
作图，计算ic50值。注意标准曲线的r2值需要在0.99以上。
[0278]
(2)酪氨酸酶抑制活性试验方法
[0279]
材料
[0280]
酪氨酸酶(试剂：25ku、-20℃保存)、l-酪氨酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、恒温仪、
紫外分光光度计、离心机。
[0281]
试剂配制
[0282]
磷酸钠缓冲液(1/15mol/l，ph＝6.8)
[0283]
精确称取1.000g磷酸二氢钠，1.186g磷酸氢二钠，加入少量去离子水溶解后，定容至500ml，4℃冰箱保存备用。
[0284]
l-酪氨酸溶液(7.5mmol/l)
[0285]
精确称取l-酪氨酸0.136g，先加入数滴浓盐酸，加去离子水约50ml， 90℃加热完全溶解后，用氢氧化钠溶液调节ph至7左右，加去离子水定容至100ml棕色容量瓶中，避光保存。
[0286]
酪氨酸酶液的制备
[0287]
试剂配置：将小包装瓶中的固体粉末酶试剂用蒸馏水溶解，然后用胶头吸管吸出，转移至250ml容量瓶中，不断重复溶解、转移过程，直到吸出的酶液从黄棕色变为澄清透明为止，最后于容量瓶中定容250ml，获得100u/ml 的酶液。将250ml酶液用小离心管分装，-20℃保存。实验过程中按需取出解冻后再使用。
[0288]
检测方法
[0289]
总反应体系为5ml。具体设计见表l。
[0290]
实验时，向试管中依次加入磷酸盐缓冲液、不同浓度梯度的受试液、酶液，于30℃水浴10min。然后加入底物l-酪氨酸，立即开始计时。测定反应40min时475nm波长下的吸光值。测定时，以相应的阴性对照为参比，用下列公式计算受试液对酪氨酸酶的抑制率。
[0291]
抑制率＝[(a-b)/a]
×
l00％
[0292]
其中，“a”为标准对照的吸光值，“b”为受试液的吸光值。每个实验做 3个平行。抑制率高表明其对酪氨酸酶活性的抑制强度高。
[0293]
表15ml试验体系设计
[0294][0295]
注：用分光光度计测量吸光值时，“受试液”、“标准对照”分别以“阴性对照1”、“阴性对照2”调零。