1.本发明属于烟草工业应用领域，具体涉及一种高包封率的普洱茶多酚纳米脂质体的制备及在卷烟中的缓释应用。


背景技术：

2.普洱茶是一种滇南特色植物原材料，目前对其功效成分进行现代加工提取分离受到越来越广泛的关注，尤其是在普洱茶多酚的提取方面做了很多的研究，如何充分发挥特色植物资源优势，将其与卷烟加工工艺协调配合，形成基于特色植物资源在卷烟中应用的系列性、开创性技术愈发的迫切。
3.用于包封多酚的技术主要包括喷雾干燥、凝聚、内含包封、共结晶、纳米粒、冷冻干燥、酵母包封、乳液和脂质体。脂质体(liposome)是由双亲性(亲水的极性头部和疏水的非极性尾部)脂质双分子层包裹某些活性物质后自组装形成的具有双层膜结构的微型泡囊。当采用包封技术来包埋多酚化合物时，可以克服多酚化合物本身的不稳定性，掩盖或者减缓不愉悦的口感和风味。
4.目前的研究主要集中在脂质体的制备技术开发上，对如何提高纳米脂质体的包封率没有深入的研究，对高包封率的普洱茶多酚纳米脂质体在卷烟中的应用及效果也没有报道。
5.因此，开发一种高包封率的普洱茶多酚纳米脂质体，并将其应用于提高卷烟品质就显得非常必要。
6.为了解决以上问题，提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明首先意识到具备高包封率的普洱茶多酚纳米脂质体可以显著提高多酚化合物生物利用率，延长多酚化合物的半衰期，从而提升植物多酚在卷烟品质改善、卷烟产品的整体功能特性和香气品质加强等方面的应用效果。进一步的本发明通过系统考察，明确了各关键指标的合理用量区间及最优配比，制备得到高包封率的普洱茶多酚纳米脂质体。
8.本发明为制备高包封率的普洱茶多酚纳米脂质体，采用乙醇注入
‑
超声法，确定了影响包封率的关键指标，通过系统考察，明确了各关键指标的合理用量区间及最优配比，将高包封率的普洱茶多酚纳米脂质体成功应用于卷烟中，实现了普洱茶多酚在卷烟中的缓释应用及对抽吸品质的提升作用，与现有技术相比，本发明显著提高了普洱茶多酚纳米脂质体的包封率，且易于实现，应用效果显著。
9.本发明提供一种高包封率的普洱茶多酚纳米脂质体的制备方法，包括以下步骤：
10.(1)称取一定量茶多酚溶于一定离子强度的磷酸盐缓冲液pbs中，调节温度，将适量的吐温tween80溶于其中，搅拌，得到第一溶液；
11.(2)将胆固醇和卵磷脂按一定比例溶于无水乙醇中，得到第二溶液，将所述第二溶
液并使用注射器以一定速度注入所述第一溶液中，水相立即变成乳化的脂质体悬浮液，恒温搅拌一定时间；
12.(3)将步骤(2)得到的脂质体悬浮液采用一定功率的超声处理，将超声处理后的脂质体悬浮液转移至圆底烧瓶中，40℃低压旋转蒸发10～15min。
13.优选地，步骤(1)中，pbs的离子强度选择在0.02～0.05mol/l，pbs的ph7.0。从本发明实施例可以看出，pbs的离子强度低于0.02mol/l时，包封率很低，过高的离子强度也会造成包封率明显下降，pbs的离子强度选择在0.02～0.05mol/l。
14.优选地，步骤(1)中，茶多酚和吐温tween80的质量比为(4
‑
6):(1
‑
4)，优选地为5:3，tween80与卵磷脂质量比应不超过2:3，其中单独茶多酚用量不超过25mg，pbs用量为30
‑
60ml。从本发明实施例可以看出，当茶多酚添加量超过25mg并继续增加时，包封率会呈下降趋势，因此茶多酚用量不超过25mg。
15.优选地，步骤(1)中，tween80与卵磷脂质量比应不超过2:3。从本发明实施例可以看出，当tween80的浓度超过一定范围时，脂质体对茶多酚的包封率开始下降，tween80与卵磷脂质量比应不超过2:3。
16.优选地，步骤(2)中，卵磷脂浓度为0.5
‑
2％，优选地，卵磷脂浓度为1％。从本发明实施例可以看出，过高或过低的卵磷脂浓度都会导致茶多酚纳米脂质体的包封率下降，选择卵磷脂浓度为1％。
17.优选地，步骤(2)中，所述胆固醇和所述卵磷脂合适的质量比0.05
‑
0.2，优选地质量比不超过0.2。从本发明实施例可以看出，合适的胆固醇和卵磷脂质量比是达到脂质体最高包封率的重要因素，胆固醇/卵磷脂合适的质量比不超过0.2。
18.优选地，步骤(2)中，乙醇的用量与茶多酚的质量比为20％
‑
70％。单独的乙醇的用量应为7
‑
9ml。乙醇用量少的情况下，卵磷脂不易分散均匀，所得脂质体粒径大，乙醇用量过大，体系中残留的乙醇多，需要较长的时间才能除去，残留的乙醇也会破坏脂质体双分子层结构，被包封的物质容易泄漏，造成包封率下降。因此，乙醇的用量应为7
‑
9ml。
19.优选地，步骤(2)中，水合过程恒温搅拌温度为40℃—60℃，搅拌时间为25
‑
40min。水合温度应控制在40℃—60℃，温度过高，脂质体的包封率显著下降。水合时间过短，则水合不完全，体系中的乙醇也会大量残余；但水合时间过长，则会加速卵磷脂的氧化，水合时间应控制在25
‑
40min。
20.优选地，步骤(3)中，超声处理时间为4min，超声功率为360w
‑
380w，超声处理过程为1s开，1s停。超声处理可以有利于获得粒径大小均一的小单层脂质体。为防止超声强度太大，产生大量的热，导致体系温度过高而加速卵磷脂的氧化，使得包封率显著下降。超声功率为360w
‑
380w。
21.本发明第二方面提供一种本发明第一方面所述的高包封率的普洱茶多酚纳米脂质体在卷烟中的缓释应用，将所制备的普洱茶多酚纳米脂质体以3％
‑
8％的比例添加在卷烟滤嘴材料中，高包封率的普洱茶多酚纳米脂质体可以起到缓释普洱茶多酚的作用。
22.对添加了普洱茶多酚纳米脂质体的卷烟滤嘴所制成的卷烟进行感官评吸。
23.包封率的测定方法如下：
24.精确称取100.0mg茶多酚样品溶解于蒸馏水中，定容至100ml，分别稀释成2.5、5、10、20、30、40、50mg/100ml，各取1ml置于25ml容量瓶中，加入水4ml和硫酸亚铁溶液5ml，充
分混匀，加入ph7.5、浓度为1/15mol/l的磷酸氢二钠
‑
磷酸二氢钾缓冲液至刻度。用10mm比色皿，在波长540nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度(od)。可以得出茶多酚水溶液在2.5～50mg/100ml范围内的标准曲线方程。
25.将一定体积的茶多酚纳米脂质体悬浮液用超滤离心管离心10min，取外管中的清液1ml，置于25ml容量瓶中，其余步骤同标准曲线制作，根据回归方程计算清液中游离的茶多酚含量。包封率的计算公式如下：
[0026][0027]
其中，w为添加的茶多酚的总量(g)，c为离心清液中茶多酚的浓度(g/ml)，v为悬浮液的总体积(ml)。
[0028]
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0029]
1、本发明首先意识到具备高包封率的普洱茶多酚纳米脂质体可以显著提高多酚化合物生物利用率，延长多酚化合物的半衰期，从而提升植物多酚在卷烟品质改善、卷烟产品的整体功能特性和香气品质加强等方面的应用效果。进一步的本发明通过系统考察，明确了各关键指标的合理用量区间及最优配比，制备得到高包封率的普洱茶多酚纳米脂质体。
[0030]
2、本发明为制备高包封率的普洱茶多酚纳米脂质体，采用乙醇注入
‑
超声法，确定了影响包封率的关键指标，进一步的本发明明确了各关键指标的合理用量区间及最优配比，与现有技术相比，本发明显著提高了普洱茶多酚纳米脂质体的包封率。在制备高包封率的普洱茶多酚纳米脂质体，本发明首次意识到磷酸盐缓冲液pbs离子强度对于包封率的影响，这是本领域技术人员往往忽略的一个因素，而经过本发明实施例可以看出，磷酸盐缓冲液pbs离子强度确实影响最终产品的包封率，从本发明实施例可以看出，pbs的离子强度低于0.02mol/l时，包封率很低，过高的离子强度也会造成包封率明显下降，pbs的离子强度选择在0.02～0.05mol/l。
[0031]
除了上述关键指标以外，让技术人员意料之外的是，胆固醇和卵磷脂质量比对于包封率的影响非常大，质量比例细微的调节，都使得产品包封率的重大差距，从本发明实施例可以看出，合适的胆固醇和卵磷脂质量比是达到脂质体最高包封率的重要因素，胆固醇/卵磷脂合适的质量比不超过0.2。
[0032]
3、本发明将高包封率的普洱茶多酚纳米脂质体成功应用于卷烟中，实现了了普洱茶多酚在卷烟中的缓释应用及对抽吸品质的提升作用，显著改善了卷烟品质、卷烟产品的整体功能特性和香气品质等。与现有技术相比，本发明不仅易于实现，且应用效果非常显著。
具体实施方式
[0033]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0034]
对比例1
[0035]
按照现有技术根据如下步骤制备普洱茶多酚纳米脂质体，将普洱茶多酚制成乳化
的脂质体悬浮液，经减压蒸发、dhpm处理后得到所需的普洱茶多酚纳米脂质体，然后均匀添加到开松的醋酸纤维丝束上，卷制成卷烟进行感官评吸。样品记作a。
[0036]
对比例2
[0037]
为对比pbs离子强度对普洱茶多酚纳米脂质体包封率的影响，选择0.01、0.08、0.02、0.05四种离子强度的pbs缓冲液分别进行试验，所得样品记作b1、b2、b3、b4。其余操作与实施例1相同。
[0038]
对比例3
[0039]
为对比胆固醇和卵磷脂质量比对普洱茶多酚纳米脂质体包封率的影响，选择0.3、0.5、1三种胆固醇和卵磷脂质量比进行试验，所得样品记作c1、c2、c3。其余操作与实施例1相同。
[0040]
实施例1
[0041]
(1)称取10mg茶多酚溶于离子强度为0.03的磷酸盐缓冲液(pbs，ph7.0)中，调节温度，将tween80(tween80/卵磷脂质量比为1:3)溶于其中，搅拌。胆固醇和1％的卵磷脂按0.1的质量比溶于8ml无水乙醇中，水合温度为40℃，并使用注射器以一定速度注入pbs中，水相立即变成乳化的脂质体悬浮液，恒温搅拌25min。将得到的脂质体悬浮液转移至150ml烧瓶中，40℃低压旋转蒸发15min。
[0042]
(2)为了获得粒径大小均一的小单层脂质体，脂质体悬浮液采用一定功率的超声处理，时间为4min，1s开，1s停，超声功率为360w。
[0043]
(3)将所制备的普洱茶多酚纳米脂质体以5％的比例添加在卷烟滤嘴材料中。
[0044]
(4)对添加了普洱茶多酚纳米脂质体的卷烟滤嘴所制成的卷烟进行感官评吸，除普洱茶多酚纳米脂质体外，其余所有卷烟卷制所需材料均与对比例一致。
[0045]
实施例2
[0046]
(1)称取10mg茶多酚溶于离子强度为0.03的磷酸盐缓冲液(pbs，ph7.0)中，调节温度，将tween80(tween80/卵磷脂质量比为1:3)溶于其中，搅拌。1％的胆固醇和卵磷脂按0.2的质量比溶于8ml无水乙醇中，水合温度为40℃，并使用注射器以一定速度注入pbs中，水相立即变成乳化的脂质体悬浮液，恒温搅拌25min。将得到的脂质体悬浮液转移至150ml烧瓶中，40℃低压旋转蒸发15min。
[0047]
(2)为了获得粒径大小均一的小单层脂质体，脂质体悬浮液采用一定功率的超声处理，时间为4min，1s开，1s停，超声功率为360w。
[0048]
(3)将所制备的普洱茶多酚纳米脂质体以5％的比例添加在卷烟滤嘴材料中。
[0049]
(4)对添加了普洱茶多酚纳米脂质体的卷烟滤嘴所制成的卷烟进行感官评吸，除普洱茶多酚纳米脂质体外，其余所有卷烟卷制所需材料均与对比例一致。
[0050]
实施例3
‑4[0051]
实施例3
‑
4分别为样品d1和d2的制备，其制备方法和条件与实施例1相同，区别仅在于实施例3中tween80/卵磷脂质量比为2:3，而实施例4中tween80/卵磷脂质量比为4:5。
[0052]
对比实施例1和实施例3
‑
4样品在表1中的数据可以看出，当tween80的浓度超过2:3后，脂质体对茶多酚的包封率开始下降，tween80与卵磷脂质量比应不超过2:3。
[0053]
实施例5
‑8[0054]
实施例5
‑
8为样品e1
‑
e4的制备，其制备方法和条件与实施例1相同，区别仅在于实
施例5中胆固醇和0.1％的卵磷脂按0.1的质量比溶于8ml无水乙醇中，实施例6中胆固醇和0.5％的卵磷脂按0.1的质量比溶于8ml无水乙醇中，实施例7中胆固醇和2％的卵磷脂按0.1的质量比溶于8ml无水乙醇中；实施例8中胆固醇和2.5％的卵磷脂按0.1的质量比溶于8ml无水乙醇中。
[0055]
对比实施例1和实施例5
‑
8样品在表1中的数据可以看出，过高或过低的卵磷脂浓度都会导致茶多酚纳米脂质体的包封率下降，选择卵磷脂浓度为1％。
[0056]
实施例9
‑
10
[0057]
实施例9
‑
10为样品f1和f2的制备，其制备方法和条件与实施例1相同，区别仅在于实施例9中称取的茶多酚质量为25mg，实施例10中称取的茶多酚质量为30mg。
[0058]
对比实施例1和实施例9
‑
10样品在表1中的数据可以看出，当茶多酚添加量超过25mg并继续增加时，包封率会呈下降趋势，因此茶多酚用量不超过25mg。
[0059]
对比例与实施例的普洱茶多酚纳米脂质体包封率及其在卷烟中应用效果评价见表1。
[0060]
表1:对比情况
[0061]
[0062][0063]
从表中的对比情况，可以明显看出，本发明所制备的普洱茶多酚纳米脂质体的包封率明显高于现有技术，也明显高于不同pbs离子强度、不同胆固醇和卵磷脂质量比的条件下，采用本发明技术所制备出的普洱茶多酚纳米脂质体。这说明本发明中所关注到的pbs离子强度、胆固醇和卵磷脂质量比和普洱茶多酚纳米脂质体的包封率密切相关，这是现有技术所忽略的。
[0064]
而所制备的脂质体应用在卷烟产品中，其感官评吸指标也表面，本发明在杂气、刺激性、干燥感、干净程度和回甜等指标上，其评吸结果明显优于对比例，说明本发明所制备的高包封率普洱茶多酚纳米脂质体，显著提高多酚化合物的生物利用率，延长多酚化合物的半衰期，从而提升植物多酚在卷烟品质改善、卷烟产品的整体功能特性和香气品质加强等方面的应用效果。高包封率的普洱茶多酚纳米脂质体在卷烟中应用，很好的实现了普洱茶多酚缓释的目的，这也是之前的技术没有注意到的。