1.本发明属于光敏剂技术领域，具体涉及一种自供氧光敏剂的制备方法及应用。
背景技术：
2.癌症一直是危害人类健康的疾病之一,近年来光动力治疗(pdt)由于微创、副作用小、空间选择性强等优点而广受关注。实体瘤缺氧、药物在肿瘤处富集效果差、肿瘤内药物渗透性差以及激发光敏剂(ps)的光源穿透深度有限等问题成为限制pdt发展的最重要因素。目前,利用肿瘤微环境(tme)触发或光触发释放药物、光敏剂和氧气等的纳米复合诊疗材料成为研究热点。
3.现阶段，光敏剂虽然得到了广泛的改进，但在复杂的生理条件和高活性氧环境下仍存在暗毒性和光稳定性差等缺点。由于其固有的刚性平面和疏水结构，大多数的光敏剂经常遭受聚集诱导的荧光猝灭和聚集态的活性氧产量急剧下降。在一定程度上限制了pdt的抗肿瘤应用。并且，现有技术存在所需的纳米复合材料制备复杂，载氧率低，氧释放不受控制等问题。
技术实现要素：
4.为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提出了一种近红外光控制按需供氧蛭石纳米片诊疗剂，既能改善近红外光敏剂的生物相容性，又能使该纳米诊疗剂按需供氧改善组织乏氧问题，也能够通过近红外光敏剂的有效递送实现深层光动力治疗。
5.具体通过以下技术方案实现：
6.一种自供氧光敏剂，所述自供氧光敏剂的结构包括蛭石纳米片以及负载于所述蛭石纳米片表面的聚集诱导发光发光剂。
7.进一步地，所述聚集诱导发光发光剂为dcpy、dcma、dcis、dcfu中的一种或多种，
8.其中，所述dcpy的结构式为
[0009][0010]
所述dcma的结构式为
[0011][0012]
所述dcis的结构式为
[0013][0014]
所述dcfu的结构式为
[0015][0016]
优选地，所述聚集诱导发光发光剂为dcpy。
[0017]
进一步地，所述蛭石纳米片为单层结构或多层结构。
[0018]
进一步地，所述聚集诱导发光发光剂的负载量为所述蛭石纳米片重量的10-15w/w％。
[0019]
本发明还提供上述自供氧光敏剂的制备方法，包括以下步骤：
[0020]
s1：通过锂离子插层法合成蛭石纳米片；
[0021]
s2：将聚集诱导发光发光剂负载到所述蛭石纳米片表面，得到自供氧光敏剂。
[0022]
进一步地，步骤s1包括：将蛭石加入到锂盐溶液改性剂中得到蛭石纳米片。
[0023]
优选地，所述碱金属盐溶液改性剂为氯化锂溶液、乙二胺四乙酸锂溶液或柠檬酸锂溶液中的一种或多种。
[0024]
进一步地，步骤s2中，蛭石纳米片的浓度与聚集诱导发光发光剂的浓度比为2：(0.1-100)。
[0025]
进一步地，步骤s2中，通过静电吸附将聚集诱导发光发光剂负载到所述蛭石纳米片表面。
[0026]
本发明还提供上述自供氧光敏剂在制备光动力治疗药物上的应用。
[0027]
本发明的有益效果包括以下几个方面：
[0028]
1.本发明提供的自供氧光敏剂不仅能够提高光动力治疗的效果，更重要的是该自供氧光敏剂是通过蛭石纳米材料控制氧气的定点定时释放，能够有效用于癌细胞和肿瘤的诊疗中，具有较好的体内生物医学应用前景；
[0029]
2.本发明提供的自供氧光敏剂生物相容性好，比表面积高，在可视化光动力治疗方面具有良好的应用前景；
[0030]
3.本发明提供的自供氧光敏剂原料丰富，易于制备，适用范围广，可用于工业化生产。
附图说明
[0031]
为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0032]
图1为实施例1制备的自供氧光敏剂的结构示意图；
[0033]
图2为实施例1制备的自供氧光敏剂的透射电子显微镜图；
[0034]
图3为实施例1制备的自供氧光敏剂的原子力显微镜图；
[0035]
图4为实施例1制备的自供氧光敏剂的平均粒径和平均高度；
[0036]
图5为实施例1制备的自供氧光敏剂的可见-近红外光谱和荧光光谱；
[0037]
图6为实施例1制备的自供氧光敏剂的x射线光电子能谱图；
[0038]
图7为实施例1制备的自供氧光敏剂的zeta电位图；
[0039]
图8为实施例1制备的自供氧光敏剂的氧气生产浓度；
[0040]
图9为实施例1制备的自供氧光敏剂的1o2电子自旋共振振幅；
[0041]
图10为实施例1制备的自供氧光敏剂的
·
oh电子自旋共振振幅；
[0042]
图11为实验例3的激光共聚焦扫描显微镜(clsm)图；
[0043]
图12为balb/c小鼠的延时生物成像；
[0044]
图13为24小时静脉注射后主要器官和肿瘤的生物成像；
[0045]
图14为dcpy和nss@dpcy在小鼠的主要器官和肿瘤上的平均荧光强度测量结果；
[0046]
图15为对活体小鼠全身给药pbs、nss、dcpy和nss-dcpy在不用光照射或用光照射5分钟后的肿瘤生长曲线图；
[0047]
图16为caspase3表达的免疫组化分析结果图(比例尺为100μm)；
[0048]
图17为gpx4表达的免疫组织化学分析结果图(比例尺为100μm)；
[0049]
图18为从不同组的活体小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏获得的苏木精和伊红染色图像(比例尺为1000μm)；
[0050]
图19为平均红细胞血红蛋白浓度测定结果；
[0051]
图20为平均血小板体积测定结果；
[0052]
图21为血红蛋白浓度测定结果；
[0053]
图22为白细胞计数测定结果；
[0054]
图23为平均红细胞血红蛋白测定结果；
[0055]
图24为红细胞分布宽度变异系数分析结果；
[0056]
图25为红细胞测定结果；
[0057]
图26为血小板测定结果；
[0058]
图27为尿素氮测定结果；
[0059]
图28为天冬氨酸转氨酶测定结果；
[0060]
图29为谷丙转氨酶测定结果；
[0061]
图30为白蛋白测定结果。
具体实施方式
[0062]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0063]
由于肿瘤的光动力治疗(pdt)的效率依赖于氧气浓度，所以pdt治疗技术受到缺氧的限制。为了克服肿瘤缺氧诱导的pdt耐药，本发明提出了一种新的氧自给光动力癌症治疗
策略。采用简单的锂离子插层法合成了蛭石纳米片(nss)，然后通过静电吸附将聚集诱导发光发光剂(dcpy)负载到纳米片表面。nss@dpcy一旦被缺氧的肿瘤细胞吸收，暴露在可见光下，nss不仅催化过氧化氢分解生成氧气，还同时催化过氧化氢和氧气生成多个活性氧ros(
·
oh和1o2)。此外，nss持续产生氧气，缓解缺氧，极大地提高了pdt的疗效。值得关注的是，nss能够通过消耗引起肿瘤细胞铁下垂的谷胱甘肽来调节肿瘤微环境(tme)。因此，本发明为蛭石纳米片nss的合成提供了一种新的方法，而且开发了一种基于蛭石纳米片nss的智能治疗平台，用于铁中毒辅助氧自给光动力癌症治疗。
[0064]
实施例1
[0065]
一种自供氧光敏剂，自供氧光敏剂的结构包括蛭石纳米片以及负载于蛭石纳米片表面的聚集诱导发光发光剂dcpy，dcpy的结构式为
[0066][0067]
蛭石纳米片的层数为1层，聚集诱导发光发光剂的负载量为蛭石纳米片重量的10.1w/w％。
[0068]
制备方法包括以下步骤：
[0069]
s1、通过锂离子插层法合成蛭石纳米片：
[0070]
s2、将聚集诱导发光发光剂负载到蛭石纳米片表面：将200μg/ml蛭石纳米片(nss)分散体与浓度为1.0mg/ml的dcpy在pbs中混合，超声处理30min，室温搅拌过夜。多余的卸料在amicon管(mwco 100kda；millipore)，3500rpm,30分钟，然后用pbs洗三次，得到自供氧光敏剂。
[0071]
dcpy的浓度是通过在452nm处的紫外-可见吸收光谱减去相应的nss峰值测定。
[0072]
本发明还提供上述供氧光敏剂在制备光动力治疗药物上的应用。
[0073]
实施例2
[0074]
一种自供氧光敏剂，自供氧光敏剂的结构包括蛭石纳米片以及负载于蛭石纳米片表面的聚集诱导发光发光剂dcpy，dcpy的结构式为
[0075][0076]
蛭石纳米片的层数为2层，聚集诱导发光发光剂的负载量为蛭石纳米片重量的12w/w％。
[0077]
制备方法包括以下步骤：
[0078]
s1、通过锂离子插层法合成蛭石纳米片：
[0079]
s2、将聚集诱导发光发光剂负载到蛭石纳米片表面：将200μg/ml蛭石纳米片(nss)分散体与浓度为2.0mg/ml的dcpy在pbs中混合，超声处理30min，室温搅拌过夜。多余的卸料在amicon管(mwco 100kda；millipore)，3500rpm,30分钟，然后用pbs洗三次，得到自供氧光敏剂。
[0080]
dcpy的浓度是通过在452nm处的紫外-可见吸收光谱减去相应的nss峰值测定。
[0081]
本发明还提供上述供氧光敏剂在制备光动力治疗药物上的应用。
[0082]
实施例3
[0083]
一种自供氧光敏剂，自供氧光敏剂的结构包括蛭石纳米片以及负载于蛭石纳米片表面的聚集诱导发光发光剂dcpy，dcpy的结构式为
[0084][0085]
蛭石纳米片的层数为3层，聚集诱导发光发光剂的负载量为蛭石纳米片重量的15w/w％。
[0086]
制备方法包括以下步骤：
[0087]
s1、通过锂离子插层法合成蛭石纳米片：
[0088]
s2、将聚集诱导发光发光剂负载到蛭石纳米片表面：将200μg/ml蛭石纳米片(nss)分散体与浓度为10mg/ml的dcpy在pbs中混合，超声处理20min，室温搅拌过夜。多余的卸料在amicon管(mwco 100kda；millipore)，3500rpm,30分钟，然后用pbs洗三次，得到自供氧光敏剂。
[0089]
dcpy的浓度是通过在452nm处的紫外-可见吸收光谱减去相应的nss峰值测定。
[0090]
本发明还提供上述供氧光敏剂在制备光动力治疗药物上的应用。
[0091]
实施例4
[0092]
一种自供氧光敏剂，自供氧光敏剂的结构包括蛭石纳米片以及负载于蛭石纳米片表面的聚集诱导发光发光剂dcpy，dcpy的结构式为
[0093][0094]
蛭石纳米片的层数为1层，聚集诱导发光发光剂的负载量为蛭石纳米片重量的10w/w％。
[0095]
制备方法包括以下步骤：
[0096]
s1、通过锂离子插层法合成蛭石纳米片：
[0097]
s2、将聚集诱导发光发光剂负载到蛭石纳米片表面：将200μg/ml蛭石纳米片(nss)分散体与浓度为0.01mg/ml的dcpy在pbs中混合，超声处理30min，室温搅拌过夜。多余的卸料在amicon管(mwco 100kda；millipore)，3500rpm,30分钟，然后用pbs洗三次，得到自供氧光敏剂。
[0098]
dcpy的浓度是通过在452nm处的紫外-可见吸收光谱减去相应的nss峰值测定。
[0099]
本发明还提供上述供氧光敏剂在制备光动力治疗药物上的应用。
[0100]
实验例1
[0101]
细胞外o2生产试验：在终浓度为10mm的h2o2溶液中加入终浓度为0.2mg/ml的nss@dcpy、dcpy以及nss，用溶解氧计测量溶液产生的o2。结果参见图8，可见，nss@dcpy组的产氧
量远大于dcpy组和nss组。可以证明，本发明提供的自供氧光敏剂具有优秀的供氧能力。
[0102]
实验例2
[0103]
实施例1中提供的纳米片中，由于al
3+
杂质的取代引起nss层上的负电荷，而由于静电作用，aie光敏剂dcpy能够被静电吸引，吸附在nss的负电荷表面，如图1所示。图2、图3分别是通过透射电子显微镜(tem)和原子力显微镜(afm)对nss@dcpy的表面形貌进行表征。从图4可以看出nss@dcpy的平均宽度为320nm，nss的平均高度约为1.2nm。nss微增厚的原因是ns表面有少量的dcpy包覆。nss表面的dcpy包覆量为nss@dcpy的≈10.1％(w/w％)，该包覆量由nss@dcpy的吸光度测定。通过紫外-可见-近红外光谱和荧光光谱对nss@dcpy的光学性能进行了评价，如图5所示，其中，标号1-3分别表示nss、dcpy、nss@dcpy的吸光度，标号4-6分布表示nss、dcpy、nss@dcpy的荧光发射强度，由结果可以看出，nss@dcpy表现出从紫外到近红外的宽吸收带。此外，nss@dcpy在672nm处有一个较宽的发光带，并且负载的dcpy荧光部分猝灭，这可能是由于dcpy与蛭石nss之间的强相互作用造成的。通过x射线光电子能谱(xps)进一步证实了nss@dcpy的化学组成和晶体结构，如图6所示，1表示nss的x射线光电子能谱图，2表示nss@dcpy的x射线光电子能谱图，从图6可以看出，nss@dcpy与nss一致的峰位，表示两种材料主要元素相同。如图7所示，dcpy在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的zeta电位为+12.8mv，可以推测其正电荷特征会通过静电作用促进负电荷nss材料的吸附。测定了nss的zeta电位(图7)，观察到nss@dcpy的表面电荷相对先前nss的增加(-40.3mv vs-45.4mv)，说明nss成功修饰上了dcpy。此外，如图8所示，纵坐标表示氧含量，说明fe
3+
与h2o2之间的氧化还原反应可以持续产生o2，缓解了肿瘤微环境中的缺氧。考虑到
·
oh和1o2的生命周期短、化学活性高，采用非常可靠的电子顺磁共振(epr)技术进一步检测ros的种类。两种ros(
·
oh和1o2)均表现出明显的epr信号，进一步说明nss@dcpy具有较强的ros生成能力(图9,10)。
[0104]
实验例3
[0105]
为了探索制备的nss@dcpy在活细胞中的亚细胞位置(图11)，本实施例用nss@dcpy和不同的商业细胞器特异性荧光探针(mito tracker green用于线粒体染色，er tracker green用于内质网染色，lyso tracker green用于溶酶体染色)对mc38细胞进行了共染色。结果表明，nss@dcpy的红色荧光与mito tracker green、er tracker green和lyso tracker green的绿色荧光具有较高的共定位(线粒体的pearson相关系数为0.900，内质网的pearson相关系数为0.906，溶酶体的pearson相关系数为0.846)。共定位实验表明nss@dcpy能进入癌细胞并在多个细胞器中广泛积累。
[0106]
实验例4
[0107]
将mc38荷瘤balb/c小鼠分为8组(每组5只):(1)pbs(20μl)；(2)pbs(20μl)+(白光90mw/cm2,5min)；(3)nss(20mg/kg,20μl)；(4)nss(20mg/kg,20μl)+(白光90mw/cm2,5min)；(5)dcpy(20mg/kg,20μl)；(6)dcpy(20mg/kg,20μl)+(白光90mw/cm2,5min)；(7)nss@dcpy(20mg/kg,20μl)；(8)nss@dcpy(20mg/kg,20μl)+(白光90mw/cm2,5min)。这些小鼠接受了不同溶液的静脉注射。12h后，用白光照射肿瘤区域。每2天记录小鼠肿瘤体积和重量。这些小鼠在第14天被处死，以获取主要器官、血液和肿瘤进行检查。
[0108]
评估dcpy和nss@dcpy在mc38荷瘤小鼠(n＝3/组)中的生物分布。在注射后1、12和24小时，一个带有cy5通道的ivis小动物成像系统来可视化这些动物的生物分布概况。24h后处死另一组小鼠，采集肿瘤及主要器官标本进行组织特异性成像(图12-14)。图12为
balb/c小鼠的延时生物成像，其中，肿瘤部位用白色虚线标出；图13是24小时静脉注射后小鼠的主要器官和肿瘤的生物成像，其中，h表示心脏；li表示肝脏；s表示脾脏；lu表示肺；k表示肾；t表示肿瘤。将图12、13测量得到的dcpy和nss@dpcy在主要器官和肿瘤部位的平均荧光强度处理成数据图，得图14，由图14可以看出，nss@dcpy组比dcpy组的信号更强，进一步证明nss@dcpy通过血液循环的体内靶向作用和药物载体nss的增强渗透性保留(epr)作用。
[0109]
为进一步评价nss@dcpy抗肿瘤作用，将荷瘤小鼠随机分为以下治疗组:(1)pbs(20μl)；(2)pbs(20μl)+(白光90mw/cm2,5min)；(3)nss(20mg/kg,20μl)；(4)nss(20mg/kg,20μl)+(白光900mw/cm2,5min)；(5)dcpy(20mg/kg,20μl)；(6)dcpy(20mg/kg,20μl)+(白光900mw/cm2,5min)；(7)nss@dcpy(20mg/kg,20μl)；(8)nss@dcpy(20mg/kg,20μl)+(白光900mw/cm2,5min)。
[0110]
(4)、(6)、(8)组小鼠在注射治疗药物12h后，将白光(90mw/cm2)照射小鼠肿瘤区域5min，(1)和(7)组不进行光照射。在14天的治疗过程中，每隔一天记录肿瘤体积和体重。肿瘤体积记录结果见图15所示，其中，dark表示无光照射，light表示有光照射。pbs组、nss+light组和nss@dcpy(dark)组的肿瘤体积迅速增加，增幅几乎相同。说明与对照组(pbs组)相比，光单独照射nss或不照射nss@dcpy均不能抑制肿瘤生长。dcpy+light组(仅pdt)的治疗效果优于nss+light组(仅铁下垂)，这可能与nss浓度有限有关。nss@dcpy+light组(在pdt和铁下垂双重协同效果下)表现出了最佳的肿瘤抑制效果。
[0111]
为了进一步验证pdt联合铁下垂治疗对肿瘤的抑制作用，nss@dcpy+light治疗组小鼠于肿瘤完全消融后第1天处死。采用苏木精-伊红染色(h&e)和免疫组化染色检测肿瘤的增殖活性。
[0112]
小鼠解剖肿瘤组织上的半胱天冬酶-3(caspase 3)和gpx4的免疫组化分析结果如图16、17所示，与其他组相比，nss@dcpy+light组肿瘤细胞凋亡最为显著。肿瘤组织切片免疫组化染色结果显示nss@dcpy+light光照射下，gpx4明显下调(褐色部分减少)，说明治疗效果显著归因于铁下垂。nss@dcpy+light组在pdt辅助下表现出明显的肿瘤生长抑制作用。这些结果有力地证实了nss@dcpy通过pdt和铁下垂途径的协同治疗，能够抑制癌细胞的增殖和损伤肿瘤血管组织。此外，各组小鼠体重均缓慢增加，治疗期间无小鼠死亡，证实所有治疗均无明显副作用。
[0113]
主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的h&e染色图像见图18，由图18可以看出，不论是用nss、dcpy还是nss@dcpy在无光照或有光照条件下处理，各组小鼠主要器官心、肝、脾、肺、肾的h&e染色结果均与pbs组相近，形态都是完好的，这进一步证实了nss@dcpy具有良好的生物相容性(图18)。此外，通过血常规和血液生化分析(包括检测分析平均红细胞血红蛋白浓度、平均血小板体积、血红蛋白浓度、白细胞计数、平均红细胞血红蛋白浓度、红细胞分布宽度变异系数、红细胞、血小板、尿素氮、天冬氨酸转氨酶、谷丙转氨酶、白蛋白这些项目)，由结果可以看出所有治疗方法的毒性均可忽略不计，各组的数据几乎都在正常范围内(图19-30)，进一步说明nss@dcpy的治疗安全、无毒性。
[0114]
综上所述，本发明提供的自供氧光敏剂不仅能够提高光动力治疗的效果，更重要的是该自供氧光敏剂是通过蛭石纳米材料控制氧气的定点定时释放，自供氧光敏剂会自动聚集在肿瘤部位，能够有效用于癌细胞和肿瘤的诊疗中，具有较好的体内生物医学应用前景；本发明提供的自供氧光敏剂生物相容性好，比表面积高，在可视化光动力治疗方面具有
良好的应用前景；此外，本发明提供的自供氧光敏剂原料丰富，易于制备，适用范围广，可用于工业化生产。
[0115]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。