1.本发明涉及水产养殖用的免疫增强剂，属于中草药复方制剂，具体是指一种复方中草药免疫增强剂、制备方法及其在水产鱼类养殖中作为免疫增强剂的应用。


背景技术：

2.近些年来，随着我国水产养殖业迅速发展。伴随着如今高密度、集约化水产鱼类养殖的高产量和低成本，养殖密度过大会直接给水体环境带来极大的负荷，鱼体也会产生应激，降低鱼类对疾病的抵抗力，生理机能降低，直接导致了病害日趋严重。比如罗非鱼中链球菌、鳃霉菌感染，江团中细菌感染、黄颡鱼爱德华氏菌等病害频发，造成了严重经济损失。传统的抗生素治疗方法起到了很好的作用，但同时防病、治病药物使用愈加频繁，使用量越来越大，药物残留给环境造成极大破坏，给水产品的品质造成极大伤害，导致现如今生态和食品安全等问题，严重制约我国水产鱼业的健康发展，也带来了严重生态和社会问题。
3.免疫增强剂指的是单独使用或是与抗原联合使用后，加强动物机体免疫活力，并因此增强动物体对病毒、细菌、真菌和寄生虫引起的疾病的抵抗力的物质。根据作用性质可分为非特异性免疫增强剂和特异性免疫增强剂两大类。针对于水产鱼类而言，其在抵抗异物入侵时主要发挥自身巨大的非特异性免疫系统。因此，在水产鱼类养殖行业，主要还是希望通过利用非特异性免疫增强剂，提高水产鱼类自身的免疫力这一途径来探讨解决鱼体病害问题。免疫增强剂在我国水产鱼类养殖上的应用起步晚，但是发展迅速。水产上常用的免疫增强剂有黄芪多糖、葡聚糖、乳铁传递蛋白、左旋咪唑、壳聚糖、生长激素、维生素c、芦荟以及分枝杆菌的胞外产物等，其中的西药类和激素类药物容易造成环境污染、药物残留、致癌、致畸等。因此迫切期望寻找更多的无污染、无残留、安全有效的免疫增强剂。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了解决水产鱼类养殖的病害问题，寻找一种无污染、无残留、安全有效的免疫增强剂。
5.本技术的发明人经过对百余种补益类上品中草药进行研究后，意外地筛选出：利用女贞子和茯苓这2种物美价廉的中草药及其制备方法的的优化就可以制成本发明所述的免疫增强剂。
6.为达到上述目的，本发明要求保护一种水产鱼类免疫增强剂，包括如下重量份数的中草药：茯苓10-25份和女贞子10-25份。
7.本发明要求保护一种水产鱼类免疫增强剂，其中茯苓和女贞子的优选重量比为1:1。
8.本发明还提供了一种水产鱼类免疫增强剂的制备方法，包括5个主要步骤，分别是：
9.1)初步粉碎：分别称取10-25份女贞子和10-25份茯苓，各自粉碎过200目筛，分别得到女贞子粉和茯苓粉；
10.2)水提：所述女贞子粉用三步水提，得到先后三步的滤液和最终的滤渣，三步的滤液合并得到总滤液；
11.3)旋转蒸发浓缩：所述总滤液3000r/min离心15min，取上清液水浴浓缩，得到初步浓缩液；
12.4)醇沉：向所述初步浓缩液中加入95％乙醇至浓缩液中乙醇浓度为80％，静置24h，取上清液浓缩，得到最终浓缩液；
13.5)混合：向所述最终浓缩液中加入所述茯苓粉，混合均匀后过100目筛，得到水产鱼类免疫增强剂。
14.本发明要求保护所述水产鱼类免疫增强剂的制备方法，其中，步骤2)中，第一步水提过程是，加入所述女贞子粉重量10倍的蒸馏水浸泡0.5h后，100℃水浴1.5h，过300目筛，分别得到第一步的滤液和滤渣；第二步水提过程是，加入与第一步的滤渣相同体积的蒸馏水，100℃水浴1.5h，过300目筛，分别得到第二步的滤液和滤渣；步骤2)中的第三次水提过程是，加入与第二步的滤渣相同体积的蒸馏水，100℃水浴1.5h，过300目筛，分别得到第三步的滤液和最终的滤渣。
15.本发明要求保护所述水产鱼类免疫增强剂的制备方法，其中，步骤3)中的初步浓缩液的密度为1.1-1.3g/ml，步骤4)中的最终浓缩液的密度为1.0-1.2g/ml。
16.本发明要求保护所述水产鱼类免疫增强剂的制备方法，其中，步骤4)中醇沉的最佳温度为4-10℃。
17.本发明还提供了一种水产鱼类免疫增强剂的应用，其中，免疫增强剂用于制备水产鱼类的投喂饲料，水产鱼类包括罗非鱼、鲫鱼、黄鳝。
18.本发明要求保护所述水产鱼类免疫增强剂的应用，其中，按照每公斤基础饲料配比4g免疫增强剂的比例，称取所需量的免疫增强剂、免疫增强剂总重量0.2％的饲料粘合剂，两者混匀，加水调成糊状混合物；将所述糊状混合物加入到基础饲料中，搅拌混匀；晾干后得到所述投喂饲料。
19.本发明还提供了一种水产鱼类的复方中草药饲料，包括每公斤的基础饲料含4g免疫增强剂，其中，免疫增强剂包括茯苓和女贞子，两者的重量份数分别是茯苓10-25份和女贞子10-25份。
20.本发明要求保护所述水产鱼类的复方中草药饲料，其中，茯苓和女贞子的优选重量比为1:1。
21.本发明的有益效果是:
22.本发明按照标本兼治的中兽医理论，筛选出了提高水产鱼类免疫力的免疫增强剂，主要包括茯苓和女贞子这两种中草药，由于源于植物的天然成分，无毒无害，价格低廉。茯苓和女贞子作为上品中草药常用无毒，副作用少，还不存在抗生素类药物的抗药性。
23.本发明所述的中草药类免疫增强剂，相对于发病后的抗生素治疗，不含抗生素，绿色环保，无残留、无抗药性、安全健康，有利于保持水体环境的生态平衡，食用含本免疫增强剂投喂的水产鱼类，也不会影响人们的身体健康。本发明所述的免疫增强剂，适合应用于水产鱼类养殖中，比如应用于罗非鱼的养殖中，能够有效增强养殖动物的非特异性免疫力，而且不影响水体环境，保证了水产鱼类养殖过程中的生态和食品安全。
24.本发明所述的免疫增强剂，作为基础饲料的添加剂直接添加使用，使用简单，口服
投喂，对饲料适口性无不良影响，尤其适用于当前水产鱼业的集约化、规模化生产的需要，便于进行养殖鱼类病害的群体防治。
25.女贞子，作为本发明所述的免疫增强剂主要成分之一，无臭，性味苦甘。女贞子中含有齐墩果酸、乙酰齐墩果酸、女贞子苷、油酸、亚麻仁酸、棕榈酸、甘露醇及葡萄糖等；其中，齐墩果酸具有抗氧化应激，提高免疫力、保护肝脏的特性，其他活性成分还具有抗菌功效，对金黄色葡萄球菌、福氏痢疾杆菌、伤寒杆菌等均有抑制作用。女贞子还含有多糖，维生素、生物碱、氨基酸、矿物元素、蛋白质等生物活性成分，可刺激畜禽生长，维持动物体内环境正常平衡，充分发挥和提高机体本身预防疾病的潜在能力；其中多种营养物质是饲料营养价值的有益补充，为水产鱼类生长提供了营养物质，促进生长。
26.茯苓，作为本发明所述的免疫增强剂主要成分之一，味甘、淡，药性平和，具有抗氧化，防衰老，增加免疫力，提高大脑细胞活性的作用。茯苓的主要活性成分为茯苓多糖，具有抗氧化、抗病毒、保肝等功效，还能有效提高细胞免疫和体液免疫。茯苓还含有茯苓酸，可松弛消化道平滑肌，抑制胃酸分泌，防止肝细胞坏死，抗菌等功效。此外，关于茯苓的应用，主要集中在人药和抗肿瘤、抗病毒方面，对于其他应用领域少见相关报道。
27.此外，本发明成功地完善了含有女贞子和茯苓的复方中草药免疫增强剂的制备方法。相对于传统兽用制剂简单粗暴将中草药饮片粉碎混合的方法，本发明优化了制备工艺，针对不同的成分采取不同的提取方式，有效保留了药物的有效成分，具体表现在：
28.首先，茯苓和女贞子这2味药物分别进行预处理，分别粉碎过筛，分别处理可以尽量保存2味药物各自的有效成份，粉碎处理可以使药物细胞间和细胞内的淀粉、蛋白质等有效活性成分在后续步骤更充分直接释放出来，提高生物利用度，更利于后续的制剂制备过程；其次，不同的中草药性味各异，功效存在着巨大的差异，不同的中草药组合后存在着复杂的相互作用关系，且中草药之间的配比比例尤为重要，本发明提供的茯苓和女贞子重量份配比比例为1:1，配比即简化、合理，效果又非常显著，实验也证明本技术免疫增强剂取得了无法预料到的技术效果；其三，本发明的制备过程中包括多次并过不同(200目、300目、100目)筛，能使药材粉末更蓬松，密度更均匀，分量更准确，后续制备的混合过程更容易；其四，女贞子的制备过程包括浸泡、水提和醇沉；经纯化水浸泡一段时间，药材变软，细胞膨胀，有效成分容易被煎出，浸泡还可以防止在水提时，药材表面的淀粉糊化，蛋白质凝固，堵塞药材表面的毛细孔道，使在水提时水分进不去，有效成分不易被水提煎出，影响药物最终疗效；高温水提可以改变药物的刺激性作用，更易于吸收，药效作用更温和；醇沉中乙醇含量为80％，几乎可以除去全部蛋白质、多糖、无机盐等杂质，有利于减少最终制剂的用药量，醇沉后的最终浓缩液，使后续制备容易产生沉淀，便于制剂混合；乙醇还具有杀菌作用，经过乙醇处理的物料不易发霉变质；其五，本发明的制备方法中，茯苓避免了传统使用中的煎煮工艺，粉碎处理成细粉后直接混匀使用，更好地保留了其中的有效成份。
29.本发明还完善了所述免疫增强剂作为水产鱼类基础饲料的添加剂的应用方式，试验证明每公斤基础饲料添加4g所述免疫增强剂，对罗非鱼的生长和免疫指标具有更经济、更显著的优势。
30.本发明经过试验证明，所述免疫增强剂不影响血液生理指标，但可以促进鱼体的生长，刺激免疫细胞，增加免疫球蛋白m(igm)抗体的形成，增加非特异性免疫活性，比如白蛋白(alb)、白细胞介素-2(il-2)、过氧化物酶(pod)、超氧化物歧化酶(sod)、总抗氧化能力
(t-aoc)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)等显著高于空白对照组，因此，本发明的免疫增强剂有利于提高鱼体整体的免疫力。
31.总之本发明所述的免疫增强剂、制备方法及其应用，材料简单、制备方法科学，应用成本低，疗效显著，具有明显的经济效益与社会效益。
具体实施方式
32.下面结合实际应用详细描述本发明的示例性的实施例，在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本披露实施例的全面理解。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。然而明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
33.下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
34.一、免疫增强剂的制备
35.实施例1：茯苓称取10份，女贞子称取20份。
36.1)初步粉碎：分别称取20份女贞子和10份茯苓，各自粉碎后过200目筛，分别得到女贞子粉和茯苓粉；
37.2)水提：取女贞子粉，加入其总重量10倍的蒸馏水浸泡0.5h后，100℃水浴1.5h，过300目筛，分别得到第一步水提的滤液和滤渣，第一步的滤液备用；向第一步的滤渣中加入相同体积蒸馏水，100℃水浴1.5h，过300目筛，分别得到第二步水提的滤液和滤渣，第二步的滤液备用；向第二步的滤渣中加入相同体积蒸馏水，100℃水浴1.5h，过300目筛，分别得到第三步水提的滤液和最终的滤渣，将这三步的滤液合并得到总滤液；
38.3)旋转蒸发浓缩：将总滤液3000r/min离心15min，取上清液水浴浓缩至密度为1.1-1.3g/ml，得到初步浓缩液；
39.4)醇沉：向初步浓缩液中加入95％乙醇至浓缩液中乙醇浓度为80％，4-10℃静置24h，取上清液浓缩至密度为1.0-1.2g/ml，得到最终浓缩液；
40.5)混合：向最终浓缩液中加入粉碎过筛后的10份的茯苓粉，混合均匀后过100目筛，得到免疫增强剂。
41.实施例2：茯苓和女贞子各称取10份。
42.1)初步粉碎：分别称取10份女贞子和10份茯苓，各自粉碎后过200目筛，分别得到女贞子粉和茯苓粉；
43.2)水提：取女贞子粉，加入其总重量10倍的蒸馏水浸泡0.5h后，100℃水浴1.5h，过300目筛，分别得到第一步水提的滤液和滤渣，第一步的滤液备用；向第一步的滤渣中加入相同体积蒸馏水，100℃水浴1.5h，过300目筛，分别得到第二步水提的滤液和滤渣，第二步的滤液备用；向第二步的滤渣中加入相同体积蒸馏水，100℃水浴1.5h，过300目筛，分别得到第三步水提的滤液和最终的滤渣，将这三步的滤液合并得到总滤液；
44.3)旋转蒸发浓缩：将总滤液3000r/min离心15min，取上清液水浴浓缩至密度为1.1-1.3g/ml，得到初步浓缩液；
45.4)醇沉：向初步浓缩液中加入95％乙醇至浓缩液中乙醇浓度为80％，4-10℃静置
24h，取上清液浓缩至密度为1.0-1.2g/ml，得到最终浓缩液；
46.5)混合：向最终浓缩液中加入粉碎过筛后的10份的茯苓粉，混合均匀后过100目筛，得到免疫增强剂。
47.实施例3：茯苓和女贞子各称取15份。
48.1)初步粉碎：分别称取15份的女贞子和15份的茯苓，各自粉碎后过200目筛，分别得到女贞子粉和茯苓粉；
49.2)水提：取女贞子粉，加入其总重量10倍的蒸馏水浸泡0.5h后，100℃水浴1.5h，过300目筛，分别得到第一步水提的滤液和滤渣，第一步的滤液备用；向第一步的滤渣中加入相同体积蒸馏水，100℃水浴1.5h，过300目筛，分别得到第二步水提的滤液和滤渣，第二步的滤液备用；向第二步的滤渣中加入相同体积蒸馏水，100℃水浴1.5h，过300目筛，分别得到第三步水提的滤液和最终的滤渣，将这三步的滤液合并得到总滤液；
50.3)旋转蒸发浓缩：将总滤液3000r/min离心15min，取上清液水浴浓缩至密度为1.1-1.3g/ml，得到初步浓缩液；
51.4)醇沉：向初步浓缩液中加入95％乙醇至浓缩液中乙醇浓度为80％，4-10℃静置24h，取上清液浓缩至密度为1.0-1.2g/ml，得到最终浓缩液；
52.5)混合：向最终浓缩液中加入粉碎过筛后的15份的茯苓粉，混合均匀后过100目筛，得到免疫增强剂。
53.实施例4：茯苓和女贞子各称取20份。
54.1)初步粉碎：分别称取20份的女贞子和20份的茯苓，各自粉碎后过200目筛，分别得到女贞子粉和茯苓粉；
55.2)水提：取女贞子粉，加入其总重量10倍的蒸馏水浸泡0.5h后，100℃水浴1.5h，过300目筛，分别得到第一步水提的滤液和滤渣，第一步的滤液备用；向第一步的滤渣中加入相同体积蒸馏水，100℃水浴1.5h，过300目筛，分别得到第二步水提的滤液和滤渣，第二步的滤液备用；向第二步的滤渣中加入相同体积蒸馏水，100℃水浴1.5h，过300目筛，分别得到第三步水提的滤液和最终的滤渣，将这三步的滤液合并得到总滤液；
56.3)旋转蒸发浓缩：将总滤液3000r/min离心15min，取上清液水浴浓缩至密度为1.1-1.3g/ml，得到初步浓缩液；
57.4)醇沉：向初步浓缩液中加入95％乙醇至浓缩液中乙醇浓度为80％，4-10℃静置24h，取上清液浓缩至密度为1.0-1.2g/ml，得到最终浓缩液；
58.5)混合：向最终浓缩液中加入粉碎过筛后的20份的茯苓粉，混合均匀后过100目筛，得到免疫增强剂。
59.实施例5：茯苓和女贞子各称取25份。
60.1)初步粉碎：分别称取25份的女贞子和25份的茯苓，各自粉碎后过200目筛，分别得到女贞子粉和茯苓粉；
61.2)水提：取女贞子粉，加入其总重量10倍的蒸馏水浸泡0.5h后，100℃水浴1.5h，过300目筛，分别得到第一步水提的滤液和滤渣，第一步的滤液备用；向第一步的滤渣中加入相同体积蒸馏水，100℃水浴1.5h，过300目筛，分别得到第二步水提的滤液和滤渣，第二步的滤液备用；向第二步的滤渣中加入相同体积蒸馏水，100℃水浴1.5h，过300目筛，分别得到第三步水提的滤液和最终的滤渣，将这三步的滤液合并得到总滤液；
62.3)旋转蒸发浓缩：将总滤液3000r/min离心15min，取上清液水浴浓缩至密度为1.1-1.3g/ml，得到初步浓缩液；
63.4)醇沉：向初步浓缩液中加入95％乙醇至浓缩液中乙醇浓度为80％，4-10℃静置24h，取上清液浓缩至密度为1.0-1.2g/ml，得到最终浓缩液；
64.5)混合：向最终浓缩液中加入粉碎过筛后的25份的茯苓粉，混合均匀后过100目筛，得到免疫增强剂。
65.二、免疫增强剂的应用
66.实施例6：免疫增强剂用于罗非鱼的投喂与测定。
67.a、预实验：免疫增强剂组分含量的验证
68.1)投喂饲料的制备：设置6组对比试验，前5组分别以0.4％的添加量加入实施例1-实施例5制备的免疫增强剂，第6组为不含免疫增强剂的基础饲料(即空白对照组)，再分别称取免疫增强剂总重量0.2％的饲料粘合剂，两种成分按对应组分混匀，再加水调成糊状混合物；将所述5组糊状混合物加入到基础饲料中，搅拌混匀；混合物晾干后分别得到6组投喂饲料。
69.2)分组：取60尾健康且体重均匀的罗非鱼，随机分为6个实验组每组10尾饲养于不同的水桶中。
70.4)投喂：每日投喂2次，每次按每个重复组水桶中的罗非鱼体重3％的比例向饲养水桶中加入对应组的投喂饲料，连续饲养7天。
71.5)结果测定：包括生长性能和血清免疫指标，具体检测结果如下表1-表2所示。其中，表中结果测定数据的表示方式为m
±
sd,m为每个实验组的平均数，sd为标准差；同一行数字肩标的大小写字母均相同者或者无肩标者表示差异不显著(p》0.05)；大写字母相同而小写字母不同者为差异显著(p《0.05)；大写字母不同者为差异极显著(p《0.01)。
72.表1：不同比例免疫增强剂对罗非鱼生长性能的测定结果
[0073][0074]
表2：不同比例免疫增强剂对罗非鱼血清非特异性免疫的测定结果
[0075]
[0076][0077]
b、中草药组分单用和混用对比效果的验证试验
[0078]
1)投喂饲料的制备：设置3组含不同种类中草药提取物：茯苓组、女贞子组和女贞子+茯苓(1:1)组，以0.4％的添加量加入，再分别称取各组总重量0.2％的饲料粘合剂，两种成分按对应组分混匀，再加水调成糊状混合物；将所述3组糊状混合物加入到基础饲料中，搅拌混匀；混合物晾干后分别得到3组投喂饲料。
[0079]
2)分组：取60尾健康且体重均匀的罗非鱼，随机分为3个实验组每组20尾饲养于不同的水桶中。
[0080]
4)投喂：每日投喂2次，每次按每个重复组水桶中的罗非鱼体重3％的比例向饲养水桶中加入对应组的投喂饲料，连续饲养7天。
[0081]
5)结果测定：包括生长性能和血清免疫指标，具体检测结果如下表1-表2所示。其中，表中结果测定数据的表示方式为m
±
sd,m为每个实验组的平均数，sd为标准差；同一行数字肩标的大小写字母均相同者或者无肩标者表示差异不显著(p》0.05)；大写字母相同而小写字母不同者为差异显著(p《0.05)；大写字母不同者为差异极显著(p《0.01)。
[0082]
表3：不同中草药对罗非鱼生长性能的测定结果
[0083]
指标茯苓组女贞子组女贞子+茯苓组初体重(g)41.22
±
0.8741.43
±
1.0241.4
±
1.03末体重(g)69.32
±
1.69
bb
70.49
±
1.23
aabb
71.77
±
1.5
aa
增重率(％)0.68
±
0.04b0.7
±
0.05
ab
0.73
±
0.05a饲料系数2.14
±
0.11
bb
2.07
±
0.1
aabb
1.98
±
0.11
aa
[0084]
表4：不同中草药对罗非鱼血清非特异性免疫的测定结果
[0085][0086]
c、免疫增强剂的效果验证试验
[0087]
1)投喂饲料的制备：设置3组含不同比例免疫增强剂的投喂饲料：低剂量组(含0.2％的免疫增强剂)、推荐剂量组(含0.4％的免疫增强剂)和高剂量组(含0.8％的免疫增强剂)，按比例称取这3组投喂饲料所需量的免疫增强剂，再分别称取免疫增强剂总重量0.2％的饲料粘合剂，两种成分按对应组分混匀，再加水调成糊状混合物；将所述3组糊状混合物加入到基础饲料中，搅拌混匀；混合物晾干后分别得到3组投喂饲料。
[0088]
2)对照组饲料的制备：包括药物对照组和空白对照组，其中药物对照组为根据北
京生泰尔公司生产的同为免疫增强剂的芪黄素(黄芪多糖粉)100g/袋的最佳推荐剂量(在饲料中添加200mg/kg的黄芪多糖)，空白对照组为不含任何免疫增强剂的基础饲料。
[0089]
3)分组：取225尾健康且体重均匀的罗非鱼，随机分为5个实验组每组45尾，每组设3个重复，即每个重复15尾，将每个重复组饲养于不同的水桶中。
[0090]
4)投喂：每日投喂2次，每次按每个重复组水桶中的罗非鱼体重3％的比例向饲养水桶中加入对应组的投喂饲料和对照组饲料，连续饲养一个周期即28天。
[0091]
5)结果测定：包括生长性能、血液生理指标、血液生化指标、血清免疫指标和肝脏免疫功能，具体检测结果如下表1-表6所示。其中，表中结果测定数据的表示方式为m
±
sd,m为每个实验组的3个重复组的平均数，每个重复组的样本量为15尾罗非鱼，sd为标准差；同一行数字肩标的大小写字母均相同者或者无肩标者表示差异不显著(p》0.05)；大写字母相同而小写字母不同者为差异显著(p《0.05)；大写字母不同者为差异极显著(p《0.01)。
[0092]
表5：免疫增强剂对罗非鱼生长性能的测定结果
[0093][0094]
表6：免疫增强剂对罗非鱼血液生理指标的测定结果
[0095][0096][0097]
表7：免疫增强剂对罗非鱼血液生化指标的测定结果
[0098][0099]
表8：免疫增强剂对罗非鱼血清非特异性免疫指标的测定结果
[0100][0101]
表9：免疫增强剂对罗非鱼血清非特异性免疫指标的测定结果
[0102][0103]
表10：免疫增强剂对罗非鱼肝脏免疫功能的测定结果
[0104][0105][0106]
本实施例选择将免疫增强剂用于罗非鱼的投喂与测定，原因在于，罗非鱼已成为我国乃至世界水产鱼业的优质养殖鱼类之一，其肉质细嫩，味道鲜美，富含不饱和脂肪酸和蛋白质。但是，本发明的免疫增强剂不排除应用于其他水产鱼类，比如鲫鱼、鲤鱼、黄鳝等等。
[0107]
三、免疫增强剂的效果
[0108]
实施例7：免疫增强剂的效果分析。
[0109]
d、免疫增强剂组分含量的验证效果
[0110]
从表1可见，饲养7天后，实施例1组的罗非鱼末体重明显优于空白对照组，差异显著(p《0.05)，实施例2-实施例5组的罗非鱼末体重极显著高于空白组以及实施例1组(p《0.01)。实施例1组的罗非鱼增重率与空白对照组相比无显著差异显著(p》0.05)，但实施例2-实施例5组的罗非鱼增重率极显著高于空白组以及实施例1组(p《0.01)。从表2可见，实施例4组的lzm与空白组相比显著性升高(p《0.05)，但其他各组间无显著差异的。因此，本发明免疫增强剂所述中草药的重量份数为：茯苓10-25份和女贞子10-25份，且茯苓和女贞子的
最优重量比为1:1。
[0111]
e、中草药组分单用和混用对比效果的验证试验效果。
[0112]
从表3可见：饲养7天后，末体重、饲料系数方面：女贞子+茯苓组极显著优于于茯苓组(p《0.01)，显著优于女贞子组(p《0.05)；增重率方面：女贞子+茯苓组显著高于茯苓组(p《0.05)，略高于女贞子组。从表4可见：acp、sod和lzm这3个指标：3组间均无显著差异(p》0.05)，总体数值上，女贞子+茯苓组》女贞子组》茯苓组。因此，可见本发明免疫增强剂所述中草药茯苓+女贞子组效果最优。
[0113]
f、本发明所述免疫增强剂的效果验证分析
[0114]
生长性能：从表5可见，共测定了6项生长性能指标。含免疫增强剂的不同剂量实验组的增重率(wgr)、特定生长率(sgr)、和肥满度(cf)均优于对照组，尤其是空白对照组，因此可以推测免疫增强剂对罗非鱼生长都有不同程度的促进作用；其中，除5组“脾脏指数”的测定数据差异不显著以外，其他5项指标，包括增重率(wgr)、特定生长率(sgr)、饲料系数(fcr)、肥满度(cf)和肝脏指数的测定结果显示：与其他实验组相比，推荐剂量组的测定数据与2个对照组均存在显著差异(p《0.05)，尤其是与空白对照组和药物对照组的测定数据相比，差异极显著(p《0.01)，即推荐剂量组的结果生长性能指标性能最优；推测按照推荐剂量组的免疫增强剂的含量投喂水产鱼类，可以明显促进水产鱼类的生长。值得注意的是，饲料系数(fcr)是饲养期间所投饲料总量与鱼在此期间的增重量之比，值越小，饲料效果越好，因此可知含有推荐剂量组的免疫增强剂养殖水产鱼类，饲料的消耗量最小且差异极显著，因此，使用含推荐剂量组的免疫增强剂投喂饲养，相对更经济。
[0115]
血液的生理和生化指标：从表6可见，血液的生理指标共测定了13项，与对照组相比，仅单核细胞(mo)、中性粒细胞(gr)、平均红细胞体积(mcv)、红细胞分布宽度(rdw)和红细胞分布宽度变异系数(rdw-cv)这5项指标数据，实验组的1组或2组与对照组相比存在显著差异，但是，含不同剂量的免疫增强剂的实验组的血液生理指标数据，与空白对照组相比以及实验组间相比，虽然或有显著差异的升高与降低，但均在正常范围之内。从表7可见，血液的生化指标共测定了8项，与对照组相比，仅谷草转氨酶(ast)和白蛋白(alb)这2项指标数据，推荐剂量组显著高于空白对照组(p《0.05)；具体的，谷草转氨酶(ast)指标，推荐剂量组以及药物对照组极显著高于空白对照组(p《0.01)；白蛋白(alb)指标，推荐剂量组的极显著高于药物对照组(p《0.01)；其他6项血液的生化指标实验组和对照组间均不存在显著差异，说明本技术所述免疫增强剂对鱼体的血液固有指标没有影响。
[0116]
血清免疫指标：包括血清非特异性免疫指标和特异性免疫指标。血清非特异性免疫指标检测了5项，从表8可见：酸性磷酸酶(acp)和超氧化物歧化酶(sod)这2个指标，推荐剂量组显著高于2个对照组(p《0.05)；多酚氧化酶(ppo)，低剂量组极显著高于2个对照组(p《0.01)；一氧化氮(no)，高剂量组显著高于其他4组(p《0.05)；唾液溶菌酶(lzm)，低剂量组的数值最高，但5组间没有显著差异。由此可以推测：各项非特异性免疫指标的优势值还是集中在含有免疫增强剂的3个实验组中，但不同含量对非特异性免疫效果略有不同。血清特异性免疫指标检测了6项，从表9可见：免疫球蛋白g(igg)和白细胞介素6(il-6)这2项指标，5组间没有显著性差异，但是，绝对数值上，还是可以看出推荐剂量组高于2个对照组和其他2个实验组的；免疫球蛋白m(igm)，推荐剂量组和高剂量组明显高于2个对照组和低剂量组(p《0.05)，低剂量组和药物对照组之间差异不显著(p》0.05)，总体来说，含免疫增强剂的3
个实验组与药物对照组均高于空白对照组；白细胞介素12(il-12)，药物对照组的极显著低于其他各组(p《0.05)，3个实验组均显著高于药物对照组；白细胞介素2(il-2)，3个实验组和药物对照组均极显著高于空白对照组(p《0.01)；γ干扰素(ifn-γ)，一种ⅱ型干扰素，检测γ干扰素(ifn-γ)主要用于抗感染诊断和细胞免疫状态的评价，表9可见空白对照组的数值显著高于3个实验组和药物对照组(p《0.05)，推测：空白对照组中可以存着有鱼体处于细菌或病毒感染状态。
[0117]
肝脏免疫功能：共检测了4项指标，从表10可见：虽然5组之间无显著差异，但是过氧化物酶(pod)、超氧化物歧化酶(sod)、总抗氧化能力(t-aoc)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)这4项指标，3个含不同剂量的免疫增强剂的实验组均高于空白对照组，且高低次序是：推荐剂量组＞低剂量组＞高剂量组＞空白对照组。
[0118]
分析，该免疫增强剂中的主要有效活性成分为齐墩果酸和茯苓多糖。齐墩果酸具有抗氧化应激，提高免疫力、保护肝脏的特性。茯苓多糖在提高细胞免疫和体液免疫上发挥了重要作用，除此之外，还具有抗氧化、抗病毒、保肝等功效。通过具体的实施例和数据的对比分析也可以得出，含免疫增强剂的实验组，不影响实验动物的正常血液指标，但是对水产鱼类，尤其是本实验的罗非鱼整个实验组鱼体中，明显可见提高了鱼体群体组的生长水平和免疫能力，其中，推荐剂量组的多项性能指标均为最优值，因此，推测使用含4g/kg(即0.4％)添加量的所述免疫增强剂的投喂饲料，最为经济有效。综上，本发明的免疫增强剂能有效提高罗非鱼的免疫力，值得进一步开发利用。
[0119]
四、水产鱼类的复方中草药饲料及其制备
[0120]
实施例8：复方中草药饲料的制备过程。
[0121]
根据对含有茯苓和女贞子的免疫增强剂的系统研究，我们制备了一种直接含有该2种复方中草药的饲料，具体制备过程如下：
[0122]
1)初步粉碎：分别称取15份的女贞子和15份的茯苓，各自粉碎后过200目筛，分别得到女贞子粉和茯苓粉；
[0123]
2)水提：取女贞子粉，加入其总重量10倍的蒸馏水浸泡0.5h后，100℃水浴1.5h，过300目筛，分别得到第一步水提的滤液和滤渣，第一步的滤液备用；向第一步的滤渣中加入相同体积蒸馏水，100℃水浴1.5h，过300目筛，分别得到第二步水提的滤液和滤渣，第二步的滤液备用；向第二步的滤渣中加入相同体积蒸馏水，100℃水浴1.5h，过300目筛，分别得到第三步水提的滤液和最终的滤渣，将这三步的滤液合并得到总滤液；
[0124]
3)旋转蒸发浓缩：将总滤液3000r/min离心15min，取上清液水浴浓缩至密度为1.1-1.3g/ml，得到初步浓缩液；
[0125]
4)醇沉：向初步浓缩液中加入95％乙醇至浓缩液中乙醇浓度为80％，4-10℃静置24h，取上清液浓缩至密度为1.0-1.2g/ml，得到最终浓缩液；
[0126]
5)混合：向最终浓缩液中加入粉碎过筛后的15份的茯苓粉，混合均匀后过100目筛，先得到免疫增强剂。
[0127]
6)半成品：常规制备水产鱼类饲养用的基础饲料，取步骤5)混合后得到的免疫增强剂，按照免疫增强剂总重量0.2％添加饲料粘合剂，混匀后加水调成糊状；将该糊状混合物按照每公斤的基础饲料含4g免疫增强剂的比例加入到水产鱼类的基础饲料中，搅拌混匀为复方中草药饲料的半成品。
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7)成品：将上述复方中草药饲料的半成品混合物晾干，即得复方中草药饲料的成品。
[0129]
本实施例所得复方中草药饲料，可以直接用于水产鱼类的饲养，饲养过程可以选用按照所饲养的水产鱼类体重的2-5％的比例进行该复方中草药饲料的直接投喂。
[0130]
本发明的具体实施方式已经对本发明内容进行了详细的描述，使得本领域技术人员将会容易理解。但是根据已经公开的所有描述，可以对本发明中的某些成分或数量进行添加或改变，或者对本发明制备方法中某些步骤进行可以预见的改动，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求的描述及其任何等同描述为主。