1.本发明一般涉及针对由霉菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)(也称为呕吐毒素)诱导的霉菌毒素中毒的防护。don是b型单端孢霉烯，其主要存在于谷物(如小麦、大麦、燕麦、黑麦和玉米)中，但也存在于稻、高粱和黑小麦中。脱氧雪腐镰刀菌烯醇的出现主要与禾谷镰刀菌(玉蜀黍赤霉)和黄色镰刀菌相关，这二者都是引起小麦中赤霉病和玉米中赤霉菌或镰刀菌耳腐病的重要植物病原体。已经建立了赤霉病的发病与脱氧雪腐镰刀菌烯醇对小麦的污染之间的直接关系。赤霉病的发病与开花时的湿度密切相关，并且最关键的因素是降雨的时机，而不是降雨量。此外，don含量受到栽培品种对镰刀菌属种类的易感性、前作物、耕作方法和杀真菌剂使用的显著影响。禾谷镰刀菌在25℃的温度下生长最佳，而黄色镰刀菌在21℃下生长最佳。因此，禾谷镰刀菌是在更温暖的气候中存在的更常见的种类。
2.don与人类和农场动物中霉菌毒素中毒事件相关。该毒素属于单端孢霉烯类，是蛋白质合成的强抑制剂。暴露于don导致大脑降低了其对氨基酸色氨酸的摄取，进而降低其5-羟色胺的合成。5-羟色胺水平的降低被认为是导致don的厌食效果的原因。胃肠道刺激也可在降低进食量中发挥作用，并且也可部分解释拒食期间在母猪中观察到的食管旁胃溃疡的高发病率。
3.don诱导的霉菌毒素中毒的预防性治疗目前只限于良好的农业实践以减少作物上的霉菌毒素产生以及食品和饲料商品的控制程序以确保霉菌毒素水平保持低于某些限度。
背景技术：
4.真菌在动物中引起广泛的疾病，包括器官和组织的寄生以及过敏性表现。但是，除了通过摄入非食用蘑菇导致中毒之外，真菌还可产生霉菌毒素和有机化学物质，这些霉菌毒素和有机化学物质可引起被称为霉菌毒素中毒的各种毒性作用。这种疾病是由暴露于霉菌毒素引起的，所述霉菌毒素是由污染食物或动物饲料的丝状真菌产生的药理活性化合物。霉菌毒素是一种对真菌生理不重要的次级代谢物，其在摄入、吸入或皮肤接触时在最小浓度下对脊椎动物具有剧毒。目前已知的霉菌毒素约400种，细分为具有相似生物学和结构特性的化学相关分子家族。其中，大约12组作为对动物健康的威胁经常受到关注。具有最大公共利益和农业经济意义的霉菌毒素的示例包括黄曲霉毒素(af)、赭曲霉毒素(ot)、单端孢霉烯类(t；包括don)、玉米赤霉烯酮(zen)、伏马菌素(f)、震颤毒素(tremorgenic toxin)和麦角生物碱。霉菌毒素与急性和慢性疾病相关，其生物效应主要根据其化学结构的多样性而变化，并且还涉及生物、营养和环境因素。霉菌毒素中毒的病理生理学是霉菌毒素与动物细胞中的功能性分子和细胞器相互作用的结果，其可导致致癌性、遗传毒性、蛋白质合成的抑制、免疫抑制、皮肤刺激和其它代谢紊乱。在敏感的动物物种中，霉菌毒素可能引起复杂和重叠的毒性作用。霉菌毒素中毒不具有接触传染性，对免疫系统也不具有显著刺激。用药物或抗生素治疗对病程几乎没有或没有影响。迄今为止，没有可用于对抗霉菌毒素中毒的人类或动物疫苗。
5.因此，越来越多的工作集中在开发具有针对广泛的真菌类的功效的疫苗和/或免
疫疗法，作为在特定真菌疾病的预防中对抗真菌病(即真菌的感染而不是毒素)的有力工具。与真菌病相反，霉菌毒素中毒不需要产生毒素的真菌的参与，而且，虽然具有生物起源，但其被认为是非生物危害。在这种意义上，霉菌毒素中毒已经被认为是通过自然方式中毒的示例，并且防护策略主要集中于暴露预防。人类和动物暴露主要发生于植物性食物中的霉菌毒素的摄入。摄取的霉菌毒素的代谢可导致在不同器官或组织中积累；因此，霉菌毒素可以通过动物肉、奶或蛋(携带)进入食物链。由于产生毒素的真菌污染多种人类和动物食用的作物，因此霉菌毒素可能存在于所有种类的农业原材料、商品和饮料中。联合国粮食及农业组织(fao)估计世界粮食作物的25％受到霉菌毒素的严重污染。目前，预防霉菌毒素中毒的最佳策略包括良好的农业实践以减少作物上的霉菌毒素产生以及食品和饲料商品的控制程序以确保霉菌毒素水平低于预定的阈值限度。这些策略可以限制某些霉菌毒素污染商品的问题，但其具有高成本且效果不稳定。除了支持性治疗(例如饮食、饮水)之外，几乎没有针对霉菌毒素暴露的治疗，并且通常没有针对霉菌毒素的解毒剂，虽然在暴露于af的个体中，一些保护剂(例如叶绿酸、绿茶多酚和dithiolethiones(奥替普拉))获得了一些令人鼓舞的结果。
6.针对特定霉菌毒素的疫苗接种已被提议用于预防家畜中的霉菌毒素中毒和重要的动物来源的食品中的霉菌毒素污染，其策略是基于能够通过免疫拦截特异性阻断动物产品(例如奶)中霉菌毒素、它们的毒性和/或分泌物的初始吸收或生物活化的抗体的产生。
7.但是，生产防止霉菌毒素中毒的疫苗是非常具有挑战性的，主要涉及与霉菌毒素相关的广泛的结构、化学性质和毒性。霉菌毒素是低分子量的，通常是非蛋白质性分子，其通常不具有免疫原性(半抗原)，但当其与大载体分子(例如蛋白质)连接时可能引发免疫应答。用于将霉菌毒素与蛋白质或多肽载体缀合的方法及动物免疫条件的优化已被广泛研究，其目的在于生产具有不同特异性的单克隆或多克隆抗体，以用于筛选供动物和人类食用的产品中的霉菌毒素的免疫分析。这些研究中使用的偶联蛋白包括牛血清白蛋白(bsa)、钥孔血蓝蛋白(klh)、甲状腺球蛋白(tg)和聚赖氨酸等。在过去的几十年中，已经在开发可与蛋白质结合同时保留足够的原始结构以使得产生的抗体能够识别天然毒素的霉菌毒素衍生物方面作出了许多努力。通过这些方法，可以获得抗多种霉菌毒素的抗体，证明与蛋白质的缀合可能是免疫的有效工具。由于可能在体内释放的分子的毒性特性，将该策略应用于人类和动物疫苗接种，从而实现防护同时对接受者安全，目前还未成功。例如，毒素(例如t-2)与蛋白质载体的缀合已被发现产生不稳定的复合物，其可能释放活性形式的游离毒素(chanh等，monoclonal anti-idiotype induces protection against the cytotoxicity of the trichothecene mycotoxin t-2,in j immunol.1990,144:4721-4728)。类似于可赋予抗细菌毒素病理作用的防护状态的类毒素疫苗，抗霉菌毒素的疫苗的开发的合理方法可基于缀合的“类霉菌毒素”，其被定义为霉菌毒素的修饰形式，虽然保持抗原性但没有毒性(giovati l等，anaflatoxin b1 as the paradigm of a new class of vaccines based on“mycotoxoids”,ann vaccines immunization 2(1):1010,2015)。鉴于霉菌毒素的非蛋白质性质，转化为类霉菌毒素的方法应依赖于化学衍生化。向相关母体霉菌毒素的策略位置引入特定基团可导致具有不同物理化学特性的分子的形成，但仍能够诱导与天然毒素具有足够交叉反应的抗体。因此，霉菌毒素疫苗接种的共同基本原理是基于产生抗类霉菌毒素的抗体，与细胞靶标相比，该抗体具有增强的结合天然霉菌毒素的能力，从而中和
毒素并在暴露的情况下预防疾病的发展。这种策略的潜在应用已在属于af组的霉菌毒素的情况下得到证实(giovati等，2015)，但在任何其他霉菌毒素情况下还未得到证实。此外，这种防护作用还未被证实可抵抗接种疫苗的动物中的霉菌毒素中毒，但是仅防止奶牛携带至牛奶中，以保护食用奶或由其制成的产品的人免受霉菌毒素中毒。
8.发明目的
9.本发明的目的在于提供一种保护动物免受由脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导的霉菌毒素中毒的方法，所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇是动物饲料中最广泛分布的霉菌毒素之一。
技术实现要素：
10.为了实现本发明的目的，现发现缀合脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)适用于保护动物免受don诱导的霉菌毒素中毒的方法。发现不需要将don转化为类毒素，缀合的毒素对于治疗的宿主动物表现为是安全的。而且，令人惊讶地发现，诱导的免疫应答足够强以保护动物自身对抗处理后don摄入的霉菌毒素中毒。在本领域内，这种通过诱导针对霉菌毒素本身的免疫应答的实际保护还未表明用于任何霉菌毒素，更不用说用于高丰度且极高毒性的化合物脱氧雪腐镰刀菌烯醇。
11.定义
12.霉菌毒素中毒是由暴露于霉菌毒素引起的疾病。临床体征、靶器官和结果取决于霉菌毒素的内在毒性特征及暴露量和时间长度，以及暴露动物的健康状况。
13.防止霉菌毒素中毒是指预防或减少动物体内霉菌毒素的不良生理作用的一种或多种，例如平均每日体重增加的降低。
14.脱氧雪腐镰刀菌烯醇(也称为呕吐毒素或vom)是由真菌禾谷镰刀菌产生的霉菌毒素，禾谷镰刀菌引起小粒谷类作物的赤霉病(fhb)或疮痂病。don可引起拒食和呕吐。基本化合物的分子式为c
15h20
o6。
15.缀合的分子是免疫原性化合物通过共价键与之偶联的分子。通常，免疫原性化合物是大蛋白质如klh、bsa或ova。
16.佐剂是非特异性免疫刺激剂。原则上，能够促进或放大免疫事件的级联反应中的特定过程，最终导致更好的免疫应答(即，针对抗原的综合身体反应，特别是由淋巴细胞介导且通常涉及特异性抗体或先前致敏的淋巴细胞对抗原的识别的反应)的各种物质可以被定义为佐剂。一般来讲，佐剂不是所述特定过程的发生必需的，而是仅促进或放大所述过程。
具体实施方式
17.在本发明的进一步实施方案中，缀合don系统性施用于动物。虽然已知局部施用(例如通过胃肠道内(口腔或肛门腔)或眼睛内(例如当免疫鸡时)的粘膜组织)是各种动物中诱导免疫应答的有效途径，但是发现系统性施用可引发足够的免疫应答以保护动物免受don诱导的霉菌毒素中毒。特别地发现通过肌内、口服和/或皮内施用可获得有效的免疫。
18.虽然优选在动物能够摄取被大量don污染的饲料之前进行施用，但施用的年龄不是关键的。因此，施用时的优选年龄为6周龄或更小。进一步优选4周龄或更小，例如1-3周龄。
19.在本发明的另一个实施方案中，将缀合don施用于动物至少两次。虽然许多动物(特别是猪、鸡、反刍动物)通常仅通过注射一次免疫原性组合物即可免疫，但据信为了经济可行的抗don保护，优选注射两次。这是因为在实践中动物的免疫系统不会通过自然暴露于don而触发产生抗don抗体，仅因为天然存在的don不具有免疫原性。因此，动物的免疫系统完全依赖于缀合don的施用。缀合don的两次注射之间的时间可以是1周至1-2年之间的任何时间。对于幼年动物，据信初次免疫(例如在1-3周龄时)，然后1-4周后(通常为1-3周后，例如2周后)加强施用的方案是足够的。年长的动物可能需要每几个月(如最后一次施用后4、5、6个月)加强施用，或根据已知的用于动物的其他商业应用的免疫方案，每年或每两年进行。
20.在另一个实施方案中，缀合don被用于除缀合don以外还包含佐剂的组合物中。如果缀合物自身不能诱导免疫应答以获得预定水平的保护，则可使用佐剂。虽然已知缀合分子能够在没有额外的佐剂的情况下充分刺激免疫系统，例如klh或bsa，但使用额外的佐剂可能是有利的。这可以消除对加强施用的需要或延长其施用间隔。所有这些均取决于在特定情况下需要的保护水平。当使用缀合don作为免疫原时，展现出能够并且诱导针对don的良好的免疫应答的佐剂的类型是水和油的乳液，例如油包水乳液或水包油乳液。前者通常用于家禽，而后者通常用于更易发生佐剂诱导的部位反应的动物，例如猪和反刍动物。
21.在又一个实施方案中，缀合don包含缀合至具有大于10.000da分子量的蛋白质的don。这些蛋白质(特别是钥孔血蓝蛋白(klh)和卵清蛋白(ova))已被发现在动物中(特别是在猪和鸡中)能够并且诱导足够的免疫应答。蛋白质的实际上限可能是100mda。
22.关于针对霉菌毒素中毒的防护，特别地发现使用本发明，可保护动物免于平均每日体重增加的降低、肝损伤、胃溃疡和/或肾损伤，从而避免霉菌毒素中毒的这些体征中的一种或多种。
23.现在将使用以下实施例进一步解释本发明。
24.实施例
25.实施例1：使用缀合don的免疫激发实验
26.目的
27.本研究的目的是评估缀合脱氧雪腐镰刀菌烯醇保护动物免受由don摄取引起的霉菌毒素中毒的功效。为了检测这一点，在面临毒性don挑战前，猪用don-klh免疫两次。使用不同的免疫途径来研究施用途径的影响。
28.研究设计
29.本研究中使用来自8头母猪的40头1周龄的猪，分成5组。第1-3组的24头仔猪在1和3周龄时免疫两次。第1组在两个年龄进行肌内(im)免疫。第2组在1周龄时接受im注射，在3周龄时接受口服加强。第3组皮内(id)免疫两次。从51/2周龄起，第1-3组在4周期间内通过液体中口服施用don进行挑战。第4组未免疫，但按照第1-3组所述仅用don进行挑战。第5组作为对照，仅从5.5周龄时接受对照液体，持续4周。
30.液体制剂中的don浓度对应于5.4mg/kg饲料的量。这相当于每天平均2.5mg的don的量。挑战四周后，对所有动物进行尸检研究，特别注意肝脏、肾脏和胃。此外，在研究的第0天、第34天、第41天、第49天、第55天、第64天(安乐死后)进行血液采样，除了第5组仅在第0天、第34天、第49天以及直接在安乐死后进行血液采样。
31.测试品
32.配制三种不同的免疫原性组合物，即用于im免疫的注射用水包油乳液(x-solve 50，msd ah，boxmeer)中包含50μg/ml的don-klh的测试品1；用于口服免疫的油包水乳液(gne，msd ah，boxmeer)中包含50μg/ml的don-klh的测试品2和用于id免疫的注射用水包油乳液(x-solve 50)中包含500μg/ml的don-klh的测试品3。
33.在100％甲醇中以100mg/ml的最终浓度稀释刺激脱氧雪腐镰刀菌烯醇(获自fermentek，israel)，并储存在《-15℃。在使用之前，don被进一步稀释并用于施用的治疗中。
34.入选标准
35.仅使用健康动物。为了排除不健康的动物，在研究开始之前检查所有动物的一般身体外观和临床异常或疾病的不存在。使用来自不同母猪的每组仔猪。在日常实践中，即使当通过摄取don污染的饲料预先暴露于don时，所有动物都将被免疫。因为don本身不诱发免疫应答，所以认为在预先暴露于don的动物和未接触过don的动物之间没有原则上的差异。
36.结果
37.没有动物具有与用don-klh免疫相关的不良影响。因此，该组合物似乎是安全的。
38.在实验开始时，所有猪的抗don滴度均为血清阴性。在挑战期间，肌内免疫组(第1组)和皮内免疫组(第3组)产生抗don的抗体应答，如通过用天然don-bsa作为包被抗原的elisa测量的。表1描述了研究期间的4个时间点上的平均igg值及其sd值。肌内免疫和皮内免疫均诱导了明显的抗don的滴度。
39.表1.igg滴度
[0040] 第1组第2组第3组第4组第5组t＝0《4.3《4.3《4.3《4.3《4.3t＝3511.24.869.994.34.19t＝499.564.648.814.713.97t＝648.484.37.564.33.31
[0041]
如表2所示，与挑战动物相比，所有免疫动物(包括未表现出明显抗don igg滴度增加的第2组的动物)在前15天内展现出明显更高的体重增加。对于挑战的动物，所有动物在研究过程中的体重均增加。
[0042]
表2.体重分析
[0043][0044]1挑战的前15天的平均每日体重增加
[0045]2挑战的最后13天的平均每日体重增加
[0046]
还监测小肠的状况(由空肠中的绒毛/隐窝比率确定)。表3中描述了绒毛/隐窝比率。可见，第3组中的动物具有与健康对照(第5组)相当的平均绒毛隐窝/隐窝比率，而未免疫的挑战组(第4组)具有低得多的(统计学上显著的)绒毛隐窝比率。此外，相比于未免疫的挑战对照组，第1组和第2组具有明显更好(即更高)的绒毛/隐窝比率。这表明免疫防止了由don引发的肠损伤。
[0047]
表3.绒毛/隐窝比率
[0048] 第1组第2组第3组第4组第5组平均1.571.411.781.091.71std0.240.220.120.100.23
[0049]
还监测了其他器官的一般状况，更具体地是肝、肾和胃。观察到所有三个测试组(第1-3组)比未免疫的挑战对照组(第4组)的健康状况更好。表4中描述了一般健康数据的总结。胃溃疡的程度报告为－(没有溃疡形成的证据)到++(多发性溃疡)。胃炎症的程度报告为－(没有炎症的证明)至++/－(胃炎症的开始)。
[0050]
表4.一般健康数据
[0051] 肝颜色胃溃疡胃炎肾脏第1组正常-黄
‑‑
pail第2组正常+/
‑‑‑
正常第3组正常+/-+/
‑‑
正常第4组pail++++/-pail第5组正常+++/-正常
[0052]
实施例2：免疫对don水平的影响
[0053]
目的
[0054]
本研究的目的在于评估用don缀合物免疫对don摄取的毒代动力学的影响。为了检测这一点，在喂食毒性don之前，猪用don-klh免疫两次。
[0055]
研究设计
[0056]
本研究使用10头3周龄的猪，分成2组，每组5头。第1组猪在3周龄和6周龄时用don-klh(测试品1；实施例1)im免疫两次。第2组作为对照，仅接受对照液。在11周龄时，通过浓注向每个动物以0.05mg/kg的剂量施用don(fermentek，israel)，该剂量类似于1mg/kg饲料的污染水平(基于每日饲料摄取)。紧接在don施用前和在don施用后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8和12小时采集猪的血液样品。
[0057]
入选标准
[0058]
仅使用健康动物。
[0059]
血浆don分析
[0060]
在与tq-sms仪器(waters，zellik，belgium)偶联的uplc系统上使用经过验证的lc-ms/ms方法进行未结合don的血浆分析。使用该方法的猪血浆中don的定量下限为0.1ng/ml。
[0061]
毒代动力学分析
[0062]
通过非区室分析(phoenix，pharsightcorporation，usa)对don的血浆浓度-时间曲线进行毒代动力学建模。计算以下参数：从时间零至无穷大的曲线下面积(auc0→
∞
)，最大血浆浓度(c
max
)和最大血浆浓度的时间(t
max
)。
[0063]
结果
[0064]
毒代动力学结果如下表5所示。如可见的，用don-klh免疫降低了所有毒性动力学参数。由于发挥毒性作用的是未结合的don，因此可以得出结论，用don-klh免疫将通过减少动物血液中未结合的don的量来降低由don引起的毒性作用。
[0065]
表5.未结合don的毒代动力学参数
[0066]
毒代动力学参数don-klh对照auc0→
∞
77.3
±
23.6187
±
33c
max
12.5
±
2.730.8
±
2.5t
max
1.69
±
1.032.19
±
1.07
[0067]
实施例3：针对各种don缀合物的血清学反应
[0068]
目的
[0069]
本研究的目的在于评估不同的缀合脱氧雪腐镰刀菌烯醇产物的功效。
[0070]
研究设计
[0071]
本研究使用18头3周龄的猪，分成3组，每组6头。第1组的猪在3周龄和5周龄用don-klh肌内免疫两次(使用实施例1的测试品1)。第2组相应地用don-ova免疫。第3组作为阴性对照。在3周龄、5周龄和8周龄时检测所有动物的抗don igg反应。
[0072]
结果
[0073]
血清学结果在下表中以log2抗体滴度表示。
[0074]
表6.抗don igg反应
[0075]
测试品3周龄5周龄8周龄don-klh3.56.68.3don-ova3.33.911.8对照4.83.33.3
[0076]
两种缀合物均表现为适用于引发抗don igg反应。而且，反应表现为由仅一次注射引发。
[0077]
实施例4：鸡中的血清学反应
[0078]
目的
[0079]
本研究的目的在于评估don-klh在鸡中的血清学反应。
[0080]
研究设计
[0081]
对于该研究，使用30只4周龄的鸡，分成三组，每组10只鸡。鸡用don-klh肌内免疫。第1组用作对照，仅接受pbs。第2组接受没有任何佐剂的don-klh，第3组接受gne佐剂(购自msd animal health，boxmeer)中配制的don-klh。第0天时用0.5ml疫苗对右腿进行初次免疫。第14天时，在鸡的左腿接受相当的加强免疫。
[0082]
在第0天和第14天以及第35天、第56天、第70天和第84天进行血液取样。分离血清用于测定抗don的igy。在第0天和第14天，紧接在免疫前分离血样。
[0083]
结果
[0084]
血清学结果在表7中以log2抗体滴度表示。已从数据中减去pbs背景。
[0085]
表7.抗don igy反应
[0086][0087]
如可见的，缀合don在鸡中也诱导抗don滴度。gne佐剂显著增强应答，但似乎不是获得这样的净反应必需的。