1.本发明属于生物防治技术领域，特别是涉及一种利用海洋原生动物尖颈虫防治对虾养殖弧菌病的方法。


背景技术：

2.目前我国是世界第一水产养殖大国，约占世界养殖总产量的70％。随着规模化、集约化水产养殖业的迅速发展，疾病的感染和传播是目前限制产业发展的一个主要因素，比如由病原菌(弧菌、嗜水气单胞菌等)引发的疾病具有很高的致死率，造成巨大的经济损失。为了控制疾病，养殖户大量使用抗生素药物，集约式水产养殖区水体(水和沉积物)中抗生素含量普遍偏高，沉积物土霉素含量可高达285mg/kg。抗生素的滥用对养殖业对人类的危害日益显现。不仅造成环境中药物残留、细菌耐药性增加，而且由于水体环境的流动性，耐药基因更容易水平转移，造成更多耐药株的出现。为了应对耐药性，养殖中不得不加大用量并不断更换药物种类，使细菌耐药性产生的速度越来越快，进而造成恶性循环，而新型抗生素的研发却越来越慢。如果不能尽快解决这一问题，那人类将进入无药可用的“后抗生素时代”。同时，虽然抗生素可治疗疾病，但同时亦能破坏或降低动物的免疫。另一方面，药物的大量使用，药物在水产动物体内残留造成的食品安全问题也日益引起关注。在我国，抗生素残留使我国的动物产品出口遭受巨大损失。随着我国加入wto，环保养殖方式的建立愈显重要。因此，替代抗生素的的生物防治(biocontrol)措施成为当前水产养殖的热点。裂解性噬菌体和原生动物是自然界微生物群体中导致微生物死亡的主要生物拮抗体。因此，噬菌体和原生动物是病原性细菌的潜在抗生素替代品，在生物防治中发挥作用。噬菌体能特异性裂解细菌，可开发为一种生态友好的抗菌药，限制抗生素的试用。噬菌体应用于治疗人体细菌性疾病感染，如痤疮、金黄色葡萄球菌引起的感染等具有良好效果。缺点在于噬菌体宿主谱较窄，造成治疗上的局限性。目前，多采用噬菌体鸡尾酒疗法将不同宿主谱的噬菌体混合在一起来扩大噬菌谱。其安全性问题也有待进一步研究。噬菌体作为病毒，会被免疫系统视为入侵者，刺激细胞免疫反应发挥作用使其失活，长期使用出现效果降低的情况。以及噬菌体裂解病原菌造成的细胞内物质包括内毒素释放等问题都有待解决。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种利用海洋原生动物尖颈虫防治对虾养殖弧菌病的方法，以解决了现有的问题：抗生素的滥用对养殖业对人类的危害日益显现。不仅造成环境中药物残留、细菌耐药性增加，而且由于水体环境的流动性，耐药基因更容易水平转移，造成更多耐药株的出现，同时，虽然抗生素可治疗疾病，但同时亦能破坏或降低动物的免疫。另一方面，药物的大量使用，药物在水产动物体内残留造成的食品安全问题也日益引起关注。而噬菌体宿主谱较窄，造成治疗上的局限性。目前，多采用噬菌体鸡尾酒疗法将不同宿主谱的噬菌体混合在一起来扩大噬菌谱。其安全性问题也有待进一步研究。噬菌体作为病毒，会被免疫系统视为入侵者，刺激细胞免疫反应发挥作用使其失活，长期使用出现效果降低的
情况。以及噬菌体裂解病原菌造成的细胞内物质包括内毒素释放等问题。
4.为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
5.本发明为一种利用海洋原生动物尖颈虫防治对虾养殖弧菌病的方法，包括海水取样、原生动物种群分离、细菌清除率对比、生物安全性分析、生物鉴定、清除机制分析、弧菌预防应用。
6.进一步地，所述海水取样采集厦门南美白对虾养殖海水水样，用采样瓶轻微搅动，使水体变浑浊，底部的沉积物泛起，后拿广口瓶直接采水；同时掺入部分表层沉积物样品。盖上瓶盖，瓶盖未拧紧以保证瓶内有充足氧气。同时取500ml原位水一起带回实验室供后期培养使用。
7.进一步地，所述原生动物种群分离中，在取样的海水样品拿回实验室后，马上打开瓶盖透气，并轻微晃动后适量倒入培养皿中，培养皿中加入2-3粒米粒，25℃培养3-4天在显微镜下进行镜检，取不同形态的个体分别接入六孔板中，每个孔中加入原位海水和1粒米粒进行扩大培养，共获得7种原生动物的单一种群，分别命名为pw01～pw07。
8.进一步地，所述细菌清除率对比中，将大肠杆菌escherichiacolidh5α,创伤弧菌vibrio vulnificus gdmcc 1.733，哈维氏弧菌v.harveyi gdmcc 1.781，铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosa cmcc 10104单菌落分别接种至80ml的lb培养基，25℃下以120rpm转速培养48小时。3000rpm/min离心，无菌海水洗涤5次，然后用无菌海水重悬，浓度调整为1
×
107cfu/ml，所述原生动物单一种群样品分别离心，无菌海水将沉淀虫体洗涤三次后，无菌海水重悬至浓度约100cells/ml。静置禁食24h后，取100只原生动物至100ml浓度为1
×
107cfu/ml的不同细菌中，以未添加原生动物的细菌设为对照组，每组实验设置3个重复，25℃静置培养一周后，通过酶标仪测定od
600
。将原生动物添加入菌液时间点的od设置为100％，共培养7天后od
600
变化百分率如图3所示，结果可见，与未添加原生动物的对照组相比，5种原生动物包括pw02、pw04、pw05、pw06和pw07均对4株受试细菌均有显著清除效果。
9.进一步地，所述生物安全性分析中，毒性试验生物采用卤虫，卤虫是一种鳃足纲的小型甲壳动物，在肠道形成后的幼体对毒性敏感，被广泛应用于毒性试验生物。为此用卤虫对原生动物的毒性进行分析。取卤虫卵2g放入1l大烧杯中，加入600ml海水，适量通气使其孵化。将具有明显细菌清除效果的原生动物培养液稀释5个不同浓度，每个浓度设3个平行。培养液注入6孔培养板中，每孔放入个体大小均匀的四日龄卤虫10只，在温度25℃下培养24小时。显微镜观察，用解剖针触动卤虫5秒内卤虫触角不动为死亡标准，测定不同浓度下卤虫的死亡率，计算卤虫死亡率达到50％时不同原生动物的半致死浓度lc
50
。结果如图4所示，可见原生动物pw06半致死浓度最高，说明其对卤虫的毒性最低。
10.进一步地，所述生物鉴定中，应用小亚基核糖体rna(small subunit ribosome rna,ssu rrna)通用引物，正向引物为euk a(5
’‑
aacctggttgatcctgccagt-3’)，反向引物为euk b(5
’‑
tgatccttctgcaggttcacctac-3’)，扩增海洋原生动物pw06的ssu rrna序列，经过扩增产物测序得到大小为586bp的基因片段，碱基序列如seq id no:1所示。将测序结果与ncbi数据库中的ssu rrna序列进行同源性比对，结果显示海洋原生动物pw06与条形尖颈虫trachelostyla pediculiformis亲缘关系最近，同源性达到98.96％，通过ssu rrna序列和显微镜形态观察可以确定pw06为条形尖颈虫trachelostyla pediculiformis，ssu rrna序列：
[0011][0012]
显微镜形态观察如图8所示。
[0013]
进一步地，所述清除机制分析中，原生动物一般是通过分泌毒素杀灭或吞食等途径清除细菌，将经过120℃高温灭菌20min的米粒海水培养液和未灭菌的海水米粒培养液分别用于pw06的培养，结果显示，pw06无法在经过灭菌的海水米粒培养液中生存，说明米粒培养基中生长的细菌可能是pw06的营养来源，所述清除机制分析中，进一步分析pw06对细菌的吞食，将荧光表达质粒pet-28a-mcherry质粒转到大肠杆菌e.coli bl21中。pet-28a-mcherry质粒带有卡那霉素抗性。大肠杆菌在添加卡那霉素的lb培养基中37℃过夜培养后，以1:50的接种量接种到新鲜培养液中，37℃培养2小时，实验组培养液加入1mm iptg诱导mcherry的表达，对照组未加入iptg诱导。诱导4小时后，荧光显微镜观察确定mcherry红色荧光在细胞中表达，然后将禁食24h后不同浓度pw06个体、50cell/ml和150cell/ml)和e.coli pet-28a-mcherry共同培养，mcherry荧光强度用酶标仪(synergy 4,biotek)在激发波长588nm和发射波长618nm下检测,结果如图5。结果显示与e.coli pet-28a-mcherry共同培养1小时后，添加pw06实验组荧光强度均开始下降，下降趋势一致保持到观察结束的6小时。其中pw06高浓度组荧光强度下降较低浓度组下降更显著，对pw06细胞用dapi染色后，通过共聚焦显微镜分别观察共培养不同时间点明场以及dapi和mcherry荧光通道图像，结果显示如图6，共培养1小时后pw06体内出现多个高强度荧光亮点，说明pw06吞食了众多带荧光的大肠杆菌。这些亮点在2小时荧光强度降低，在3小时几乎无法观察到pw06体内的荧光。图5中未添加pw06的对照组的荧光强度在培养6小时内荧光强度没有显著变化，说明pw06体内mcherry荧光消失不是由于大肠杆菌表达mcherry荧光蛋白淬灭，而是由于大肠杆菌被pw06吞食消化导致荧光消失。
[0014]
进一步地，所述弧菌预防应用生物安全性实验中，选用体长约1.5cm的健康南美白对虾幼虾300尾，暂养在循环水养殖系统1周。然后随机分成未处理对照组、尖颈虫对照组、弧菌感染组和尖颈虫弧菌感染组，每个处理组三个平行，每个平行放对虾20尾。尖颈虫对照组和尖颈虫弧菌感染组的养殖海水中分别加入终浓度为150cell/ml尖颈虫。培养一天后养殖海水中加入3
×
107cell/ml的哈维氏弧菌v.harveyi gdmcc 1.781，进行弧菌感染。实验
期间对虾每天投喂基础饲料。感染7天后统计各组南美白对虾死亡数目。尖颈虫pw06对南美白对虾弧菌病预防效果实验结果如图7所示，可见在弧菌感染前一天水体中添加尖颈虫pw06能显著降低南美白对虾感染弧菌死亡率。与未处理对照组相比，饲养海水中添加尖颈虫pw06浓度达到150cell/ml的尖颈虫对照组南美白对虾的死亡率没有显著差别，说明pw06对南美白对虾的生物安全性较高。
[0015]
本发明具有以下有益效果：
[0016]
1、本发明通过筛选获得的条形尖颈虫(trachelostyla pediculiformis)pw06分离于南美白对虾养殖海水，能够吞食大肠杆菌、弧菌、金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌、对环境生物毒性低，生物安全性高。将pw06培养后加入海水养殖动物饲养海水中，可以有效降低弧菌感染后动物的死亡率。
[0017]
2、本发明抗生素药物的大量使用下，药物在水产动物体内残留造成的食品安全问题也受到广泛关注，将pw06研制成天然抗致病菌制剂，将会取得良好的经济效益和生态效益，具有广阔的应用前景。
[0018]
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
[0019]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020]
图1为本发明的实施步骤图；
[0021]
图2为本发明的实施步骤图；
[0022]
图3为本发明4株受试细菌在不同原生动物作用后od
600
值的对照图；
[0023]
图4为本发明原生动物对卤虫的毒性效应对照图；
[0024]
图5为本发明荧光强度变化图；
[0025]
图6为本发明荧光强度对比图；
[0026]
图7为本发明尖颈虫pw06对南美白对虾弧菌病预防效果图。
[0027]
图8为本发明中pw06的形态图。
具体实施方式
[0028]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0029]
请参阅图1-5所示，本发明为一种利用海洋原生动物尖颈虫防治对虾养殖弧菌病的方法，包括海水取样一、原生动物种群分离二、细菌清除率对比三、生物安全性分析四、生物鉴定五、清除机制分析六、弧菌预防应用七。
[0030]
海水取样一采集厦门南美白对虾养殖海水水样，用采样瓶轻微搅动，使水体变浑浊，底部的沉积物泛起，后拿广口瓶直接采水；同时掺入部分表层沉积物样品。盖上瓶盖，瓶
盖未拧紧以保证瓶内有充足氧气。同时取500ml原位水一起带回实验室供后期培养使用。
[0031]
原生动物种群分离二中，在取样的海水样品拿回实验室后，马上打开瓶盖透气，并轻微晃动后适量倒入培养皿中，培养皿中加入2-3粒米粒，25℃培养3-4天在显微镜下进行镜检，取不同形态的个体分别接入六孔板中，每个孔中加入原位海水和1粒米粒进行扩大培养，共获得7种原生动物的单一种群，分别命名为pw01～pw07。
[0032]
细菌清除率对比三中，将大肠杆菌escherichia coli dh5α,创伤弧菌vibrio vulnificus gdmcc 1.733，哈维氏弧菌v.harveyigdmcc 1.781，铜绿假单胞菌pseudomonas aeruginosacmcc 10104单菌落分别接种至80ml的lb培养基，25℃下以120rpm转速培养48小时。3000rpm/min离心，无菌海水洗涤5次，然后用无菌海水重悬，浓度调整为1
×
107cfu/ml，原生动物单一种群样品分别离心1500rpm，15min，无菌海水将沉淀虫体洗涤三次后，无菌海水重悬至浓度约100cells/ml。静置禁食24h后，取100只原生动物至100ml浓度为1
×
107cfu/ml的不同细菌中，以未添加原生动物的细菌设为对照组，每组实验设置3个重复，25℃静置培养一周后，通过酶标仪测定od
600
。将原生动物添加入菌液时间点的od设置为100％，共培养7天后od
600
变化百分率如图3所示，结果可见，与未添加原生动物的对照组相比，5种原生动物包括pw02、pw04、pw05、pw06和pw07均对4株受试细菌均有显著清除效果。
[0033]
生物安全性分析四中，毒性试验生物采用卤虫，卤虫是一种鳃足纲的小型甲壳动物，在肠道形成后的幼体对毒性敏感，被广泛应用于毒性试验生物。为此用卤虫对原生动物的毒性进行分析。取卤虫卵2g放入1l大烧杯中，加入600ml海水，适量通气使其孵化。将具有明显细菌清除效果的原生动物培养液稀释5个不同浓度，每个浓度设3个平行。培养液注入6孔培养板中，每孔放入个体大小均匀的四日龄卤虫10只，在温度25℃下培养24小时。显微镜观察，用解剖针触动卤虫5秒内卤虫触角不动为死亡标准，测定不同浓度下卤虫的死亡率，计算卤虫死亡率达到50％时不同原生动物的半致死浓度lc
50
。结果如图4所示，可见原生动物pw06半致死浓度最高，说明其对卤虫的毒性最低。
[0034]
生物鉴定五中，应用小亚基核糖体rna(small subunit ribosome rna,ssu rrna)通用引物，正向引物为euk a(5
’‑
aacctggttgatcctgccagt-3’)，反向引物为euk b(5
’‑
tgatccttctgcaggttcacctac-3’)，扩增海洋原生动物pw06的ssu rrna序列，经过扩增产物测序得到大小为586bp的基因片段，碱基序列如seq id no:1所示。将测序结果与ncbi数据库中的ssu rrna序列进行同源性比对，结果显示海洋原生动物pw06与条形尖颈虫trachelostylapediculiformis亲缘关系最近，同源性达到98.96％，通过ssu rrna序列和显微镜形态观察可以确定pw06为条形尖颈虫trachelostyla pediculiformis，ssu rrna序列：
[0035][0036]
显微镜形态观察如图8所示。
[0037]
清除机制分析六中，原生动物一般是通过分泌毒素杀灭或吞食等途径清除细菌，将经过120℃高温灭菌20min的米粒海水培养液和未灭菌的海水米粒培养液分别用于pw06的培养，结果显示，pw06无法在经过灭菌的海水米粒培养液中生存，说明米粒培养基中生长的细菌可能是pw06的营养来源，清除机制分析六中，进一步分析pw06对细菌的吞食，将荧光表达质粒pet-28a-mcherry质粒转到大肠杆菌e.coli bl21中。pet-28a-mcherry质粒带有卡那霉素抗性。大肠杆菌在添加卡那霉素的lb培养基中37℃过夜培养后，以1:50的接种量接种到新鲜培养液中，37℃培养2小时，实验组培养液加入1mm iptg诱导mcherry的表达，对照组未加入iptg诱导。诱导4小时后，荧光显微镜观察确定mcherry红色荧光在细胞中表达，然后将禁食24h后不同浓度pw06个体终浓度为0对照组、50cell/ml和150cell/ml和e.coli pet-28a-mcherry终浓度3
×
107cell/ml共同培养，mcherry荧光强度用酶标仪(synergy 4,biotek)在激发波长588nm和发射波长618nm下检测,结果如图5。结果显示与e.coli pet-28a-mcherry共同培养1小时后，添加pw06实验组荧光强度均开始下降，下降趋势一致保持到观察结束的6小时。其中pw06高浓度组150cell/ml荧光强度下降较低浓度组50cell/ml下降更显著，对pw06细胞用dapi染色后，通过共聚焦显微镜分别观察共培养不同时间点明场以及dapi和mcherry荧光通道图像，结果显示如图6，共培养1小时后pw06体内出现多个高强度荧光亮点，说明pw06吞食了众多带荧光的大肠杆菌。这些亮点在2小时荧光强度降低，在3小时几乎无法观察到pw06体内的荧光。图5中未添加pw06的对照组的荧光强度在培养6小时内荧光强度没有显著变化，说明pw06体内mcherry荧光消失不是由于大肠杆菌表达mcherry荧光蛋白淬灭，而是由于大肠杆菌被pw06吞食消化导致荧光消失。
[0038]
弧菌预防应用七生物安全性实验中，选用体长约1.5cm的健康南美白对虾幼虾300尾，暂养在循环水养殖系统1周。然后随机分成未处理对照组、尖颈虫对照组、弧菌感染组和尖颈虫弧菌感染组，每个处理组三个平行，每个平行放对虾20尾。尖颈虫对照组和尖颈虫弧菌感染组的养殖海水中分别加入终浓度为150cell/ml尖颈虫。培养一天后养殖海水中加入3
×
107cell/ml的哈维氏弧菌v.harveyi gdmcc 1.781，进行弧菌感染。实验期间对虾每天
投喂基础饲料。感染7天后统计各组南美白对虾死亡数目。尖颈虫pw06对南美白对虾弧菌病预防效果实验结果如图7所示，可见在弧菌感染前一天水体中添加尖颈虫pw06能显著降低南美白对虾感染弧菌死亡率。与未处理对照组相比，饲养海水中添加尖颈虫pw06浓度达到150cell/ml的尖颈虫对照组南美白对虾的死亡率没有显著差别，说明pw06对南美白对虾的生物安全性较高。
[0039]
本实施例的一个具体应用为：采集厦门南美白对虾养殖海水水样，取样的海水样品进行原生动物种群分离，分别命名为pw01～pw07，5种原生动物包括pw02、pw04、pw05、pw06和pw07均对4株受试细菌(大肠杆菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌、铜绿假单胞菌)均有显著清除效果，如图4所示，原生动物pw06半致死浓度最高，说明其对卤虫的毒性最低，通过ssu rrna序列和显微镜形态观察可以确定pw06为条形尖颈虫trachelostyla pediculiformis，清除机制分析确定pw06通过吞食途径清除细菌，与未处理对照组相比，饲养海水中添加尖颈虫pw06浓度达到150cell/ml的尖颈虫对照组南美白对虾的死亡率没有显著差别，说明pw06对南美白对虾的生物安全性较高。
[0040]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0041]
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。