本发明涉及一种通过利用透明质酸捕获具有皮肤保湿以及皮肤再生功能的乳酸菌发酵物而将真皮细胞的皮肤保湿以及皮肤再生效果极大化的皮肤益生菌块组合物。
具体来讲，本发明涉及一种在对通过将皮肤保湿以及皮肤再生功能性乳酸菌即皮肤益生菌利用包含透明质酸或壳聚糖的已知成分培养基进行发酵而生成的各个发酵物进行加热之后进行过滤，从而通过发酵物的不同pH的混合反应而诱导球形块粒子的合成并借此利用透明质酸捕获乳酸菌发酵物的皮肤益生菌块组合物的制造方法。本组合物可以通过利用皮肤亲和力高的透明质酸捕获具有皮肤保湿以及皮肤再生功能性的乳酸菌发酵物而有效地将乳酸菌发酵物传递到皮肤真皮细胞并借此将皮肤保湿以及皮肤再生的效果极大化。
背景技术
皮肤是由角质层、表皮层以及真皮层等三层的多层结构构成。在皮肤结构中位于最外侧的角质层的是由厚度约为0.5mm的极薄的层构成。由25～30个凋亡皮肤细胞构成的角质层可以起到保护人类皮肤的作用，完成所述作用的皮肤角质将自行脱落且在皮肤新生细胞生长成为新的皮肤之后再成为角质，而通过重复执行如上所述的构成，可以构成人类的皮肤并提供保护。表皮层位于皮肤角质层的正下方，可以起到如渗透屏障、先天性免疫、紫外线防护、伤口恢复以及合成维生素D的功能。真皮层是用于向表皮供应养分并负责皮肤再生的层，可以起到抑制病原体侵入、伤口修复和皮肤结构以及弹性维持的功能。
益生菌(Probiotics)在拉丁语中的含义为“为了生命(for life)”，主要是指活细胞(live cell)，也是指在摄入适当的量时可以对宿主的健康起到帮助作用的微生物(WHO/FAO，2002)。如乳杆菌属(Lactobacillus sp.)、双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)以及链球菌属(Streptococcus sp.)等微生物属于最具代表性的益生菌，可以从肠道中分离获得。如上所述的乳酸菌在肠道内与肠粘膜的亲和性较高，因此可以通过在附着之后与存在于肠粘膜中的免疫细胞进行相互作用而提升人体各个器官的免疫力并借此对疾病进行预防。最近通过对益生菌的功能进行确认，已有研究结果指出益生菌不仅对肠道健康有益，而且还具有皮肤保湿效果。因此，可以通过对链球菌属、乳杆菌属以及乳球菌属等进行发酵之后再进行过滤或提取而适用于化妆品领域。
自从2014年开始，在学术领域已经开始对2002年提出的益生菌概念中的一部分内容进行修订。即，有别于在2002年由WHO/FAO对益生菌做出的概念性定义，伴随着并不是只有存活细菌才会呈现出益生菌效果的研究结果的系统化，出现了非活性益生菌(paraprobiotics，杀菌+发酵有机酸)的全新概念(Taverniti&Guglielmetti，2011；Ananta&Knorr，2009)。
虽然人们正在积极开展如上所述的非活性益生菌的剂型研究，但是在以现有技术作为基础利用乳酸菌作为原料制造生物化妆品时，如果直接使用在厌氧条件下生长的乳酸菌，会因为乳酸菌暴露在皮肤表面的空气中而轻易地发生凋亡并导致与皮肤胶质细胞一起从皮肤脱落的问题发生。此外，最近有很多功能性成分的功效优秀但因为难以被皮肤吸收而无法达成所期待的功效的情况发生。因此，人们正在积极开展用于促进功能性成分的皮肤渗透的研究活动。如上所述，虽然乳酸菌发酵物的开发非常重要，但是用于将原料物质的功效极大化的剂型技术同样必不可少。
透明质酸盐以及透明质酸是一种带有负电荷的糖胺聚糖多糖类，存在于身体的各个部位，尤其是大量存在于皮肤上。透明质酸作为包含对如表皮的角质形成细胞以及真皮的成纤维细胞等细胞进行围绕的胶原蛋白以及其他蛋白质的细胞基质中的一部分存在，其在真皮以及表皮层中的含量均非常丰富。透明质酸对皮肤起到非常重要的作用，可以提升皮肤的保湿能力、维持皮肤的弹性并在皮肤受损时减轻皮肤下层部所受到的损伤，还可以起到确保皮肤的主要构成成分即胶原蛋白在细胞之间顺利移动的类似于润滑油的作用。尤其是，因为亲水性非常优秀而堪称为天然保湿剂，可以在皮肤表面起到顶级保湿因子的功能。但是，目前已经得知400kDa以上的透明质酸无法穿透皮肤屏障，而且即使是透明质酸可以穿透皮肤屏障，其穿透比例也是非常的小，因此无法在真皮层呈现出其功效。
本发明旨在解决如上所述的现有问题，为了可以将在生理学/生态学方面与皮肤常驻菌群存在差异的不同类型的具有皮肤保湿以及皮肤再生功能性的乳酸菌无排斥反应地进行移植，利用透明质酸捕获乳酸菌发酵物并制造球形块，从而制造出具有真皮细胞的皮肤保湿以及皮肤再生功能性的乳酸菌发酵物即皮肤益生菌块组合物。
现有技术文献
专利文献
(专利文献1)大韩民国注册专利第10-1967809号(发明的名称：含有纳米化的泡菜乳酸菌的皮肤皱纹改善或皮肤保湿用化妆品组合物，申请人：BIOGENICS KOREA株式会社外1人，注册日期：2019年04月04日)
(专利文献2)大韩民国注册专利第10-1764412号(发明的名称：功能性水合透明质酸以及利用所述水合透明质酸的肠黏膜附着能力优秀且起到选择性拮抗作用的包膜乳酸菌的制造方法，申请人：ILDONG BIOSCIENCE(株)，注册日期：2017年07月27日)
(专利文献3)大韩民国注册专利第10-1280232号(发明的名称：四重包膜乳酸菌的制造方法以及利用所述方法制造的四重包膜乳酸菌，申请人：ILDONG制药株式会社，注册日期：2013年06月25日)
(专利文献4)大韩民国注册专利第10-1742542号(发明的名称：作为有效成分包含间歇灭菌化乳酸菌死菌体的皮肤保湿或皱纹改善用组合物，申请人：韩国韩医学研究院，注册日期：2017年05月26日)
(专利文献5)大韩民国注册专利第10-1106077号(发明的名称：保湿剂，申请人：House Wellness Foods Corporation，注册日期：2012年01月09日)
(专利文献6)大韩民国公开专利第10-2018-0108209号(发明的名称，包含鼠李糖乳杆菌JC1225菌株的用于治疗皮肤损伤的组合物，申请人：Myeon-Yeog Biolab(株)外1人，公开日期：2018年10月04日)
(专利文献7)日本公开专利第2006-199608号(发明的名称：皮肤外用剂，申请人：ACE BIO PRODUCT KK，注册日期：2005年01月19日)
非专利文献
(非专利文献1)Hyaluronic Acid Coated Chitosan Nanoparticles Reduced the Immunogenicity of the Formed Protein Corona,Abdulaziz Almalik,SCIENTIFIC REPORTS,7:10542,DOI:10.1038/s41598-017-10836-7(www.nature.com)
(非专利文献2)The immunomodulatory properties of probiotic microorganisms beyond their viability(ghost probiotics:proposal of paraprobiotic concept),2011,Genes Nutr.6:261-274
(非专利文献3)Comparison of inactivation pathways of thermal or high pressure inactivatd Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103by flow cytometry analysis,E.Ananta,D.Knorr,ScienceDirect,Volume 26,Issue 5,August 2009,Pages 542-556
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种通过利用透明质酸捕获具有皮肤保湿以及皮肤再生功能的乳酸菌发酵物而将真皮细胞的皮肤保湿以及皮肤再生效果极大化的皮肤益生菌块组合物。具体来讲，本发明涉及一种在对通过将皮肤保湿以及皮肤再生功能性乳酸菌即皮肤益生菌利用包含透明质酸或壳聚糖的已知成分培养基进行发酵而生成的各个发酵物进行加热之后进行过滤，并通过发酵物的不同pH的混合反应而诱导球形块的合成，从而利用透明质酸捕获皮肤功能性乳酸菌发酵物的皮肤益生菌块组合物的制造方法。本组合物可以通过利用皮肤亲和力高的透明质酸捕获具有皮肤保湿以及皮肤再生功能性的乳酸菌发酵物而有效地将乳酸菌发酵物传递到皮肤真皮细胞并借此将皮肤保湿以及皮肤再生的效果极大化。所述皮肤益生菌块组合物可以作为原材料以如各种化妆品组合物、皮肤用贴片以及面膜等形态提供。
为了解决如上所述的课题，本发明的皮肤微生物块组合物的制造方法包括如下所述的步骤。
较佳地，可以包括：(第一步骤)准备含有透明质酸以及葡萄糖的第一已知成分培养基和含有壳聚糖以及葡萄糖的第二已知成分培养基的步骤；
(第二步骤)通过向所述第一已知成分培养基接种乳酸菌并进行发酵而制造出透明质酸乳酸菌发酵物，并通过向所述第二已知成分培养基接种乳酸菌并进行发酵而制造出壳聚糖乳酸菌发酵物的步骤；
(第三步骤)通过对所述透明质酸乳酸菌发酵物以及壳聚糖乳酸菌发酵物分别进行加热处理而制造出非活性益生菌的步骤；以及，
(第四步骤)通过对透明质酸非活性益生菌以及壳聚糖非活性益生菌进行滴入混合而制造出皮肤益生菌块组合物的步骤。
本发明的特征在于：在第一步骤中，所述第一已知成分培养基为包含中分子量透明质酸(1,500～2,000kDa)0.1～1.0(w/v)％以及葡萄糖0.1～2.0(w/v)％的水溶液，而所述第二已知成分培养基为包含壳聚糖0.1～1.0(w/v)％以及葡萄糖0.1～2.0(w/v)％的水溶液。各个已知成分培养基在利用通常的培养基制造方法进行灭菌之后使用为宜。具体来讲，在110～125℃以及1.1～1.3气压条件下进行10～60分钟的灭菌为宜。在使用如上所述的已知成分培养基的情况下，可以显著减少在培养乳酸菌时不可避免地产生的发酵气味。
在所述第一已知成分培养基内的透明质酸的分子量低于1,500kDa或超过2,000kDa的情况下，可能会导致乳酸菌培养不良或皮肤益生菌块形成不良的问题。此外，在所述第二已知成分培养基内的壳聚糖的分子量超过100kDa的情况下，可能会导致皮肤益生菌块形成不良的问题。此外，在第一已知成分培养基的透明质酸、葡萄糖的含量超出所述浓度范围或第二已知成分培养基的壳聚糖、葡萄糖的含量超出所述浓度范围的情况下，也可能会导致乳酸菌培养不良或皮肤益生菌块形成不良的问题。
此外，在第二步骤中，在向第一已知成分培养基中接种乳酸菌并进行发酵时，以pH 3.0～4.5的状态制造透明质酸乳酸菌发酵物(最较佳地为pH 4.0)，而在向所述第二已知成分培养基中接种乳酸菌并进行发酵时，以pH 5.0～6.5的状态制造壳聚糖乳酸菌发酵物(最较佳地为pH 5.5)为宜。
所述第二步骤中的皮肤功能性乳酸菌可以从由乳杆菌属(Lactobacillus sp.)、双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)、链球菌属(Streptococcus sp.)、乳球菌属(Lactococcus sp.)、肠球菌属(Enterococcus sp.)、片球菌属(Pediococcus sp.)、明串珠菌属(Leuconostoc sp.)以及魏斯氏菌属(Weissella sp.)构成的组中进行选择，但是并不限定于此。
所述乳杆菌属乳酸菌包括如干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus culvatus)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)以及加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)等，但是并不限定于此。
所述双歧杆菌属乳酸菌包括如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)以及两岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)等，但是并不限定于此。
所述链球菌属乳酸菌包括如嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)以及内脏链球菌(Streptococcus entericus)等，但是并不限定于此。
所述乳球菌属乳酸菌包括如乳酸乳球菌(Lacotococcus lactis)以及格氏乳球菌(Lacotococcus garvieae)等，但是并不限定于此。
所述肠球菌属乳酸菌包括如屎肠球菌(Enterococcus faecium)以及粪肠球菌(Enterococcus faecalis)等，但是并不限定于此。
所述片球菌属乳酸菌包括如戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、有害片球菌(Pediococcus damnosus)以及酒窖片球菌(Pediococcus cellicola)等，但是并不限定于此。
所述明串珠菌属乳酸菌包括如乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)等，但是并不限定于此。
所述魏斯氏菌属乳酸菌包括如融合魏斯氏菌(Weissella confusa)以及类肠膜魏斯氏菌(Weissella paramensenteroides)等，但是并不限定于此。
在所述第三步骤中，用于制造各个非活性益生菌的乳酸菌发酵物的加热处理是在90～100℃下执行5～15分钟(最较佳地在100℃下执行10分钟)为宜。此时，在加热处理条件低于90℃或超过100℃、加热时间小于5分钟或超过15分钟的情况下，可能会导致在后续过程中的皮肤益生菌块形成不良的问题。
在第四步骤中，在对透明质酸非活性益生菌以及壳聚糖非活性益生菌进行混合时，可以通过在对透明质酸非活性益生菌进行搅拌的同时滴入壳聚糖非活性益生菌的方式执行。或者，也可以通过在对壳聚糖非活性益生菌进行搅拌的同时滴入透明质酸非活性益生菌的方式执行。此时，如果不使用滴入方法而是直接对各个非活性益生菌进行混合，会导致皮肤益生菌块的形成收率显著下降的问题。
此时，在制造皮肤益生菌块的过程中对透明质酸非活性益生菌以及壳聚糖非活性益生菌进行混合时，在对pH 5.5的壳聚糖非活性益生菌进行搅拌的同时滴入pH 4.0的透明质酸非活性益生菌为宜。
本发明还可以提供含有通过如上所述的方法制造出的皮肤益生菌块的化妆品组合物。所述化妆品组合物的皮肤保湿以及皮肤再生功能尤其优秀，更较佳地可以提升皮肤真皮细胞的皮肤保湿以及皮肤再生功能。在所述化妆品组合物中，可以包含通常所使用的所有成分。例如，可以包含如乳化剂、增稠剂、乳剂、表面活性剂、润滑剂、醇类、水溶性聚合物、胶凝剂、稳定剂、维生素、无机盐类、乳化剂以及香料等一般的辅助成分。更具体来讲，在本发明的化妆品组合物的剂型为糊剂、霜剂或凝胶剂的情况下，作为载体成分可以使用如动物纤维、植物纤维、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅树脂、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等。在本发明的化妆品组合物的剂型为粉剂或喷雾剂的情况下，作为载体成分可以使用如乳糖、滑石粉、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末，尤其是在喷雾剂的情况下，还可以追加包含如氯氟烃、丙烷-丁烷或二甲醚等推进物。在本发明的化妆品组合物的剂型为溶液剂或乳剂的情况下，作为载体成分可以使用如溶剂、溶剂化剂或乳化剂，例如可以使用如水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇油、甘油脂肪酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇的脂肪酸酯。
在本发明的化妆品组合物的剂型为悬浮剂的情况下，作为载体成分可以使用如水或乙醇或丙二醇等液状稀释剂、如乙氧基化异硬脂醇和聚氧乙烯山梨糖醇酯以及聚氧乙烯山梨糖醇酯等悬浮剂、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄芪胶等。在本发明的化妆品组合物的剂型为含有表面活性剂的清洁剂的情况下，作为载体成分可以使用如脂肪醇硫酸酯、脂肪醇醚硫酸酯、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸酯、咪唑啉衍生物、牛磺酸甲酯、肌氨酸酯、脂肪酸酰胺醚硫酸酯、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、亚麻碱衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。本发明的化妆品组合物，还可以追加含有包括如荧光物质、杀真菌剂、趋水性诱发物质、保湿剂、芳香剂、芳香剂载体、蛋白质、增溶剂、糖衍生物、日光阻隔剂、维生素以及植物提取物等在内的赋形剂。所述成分的添加量可以根据剂型或使用目的在不会对化妆品组合物的固有效果造成损伤的范围内进行选择。例如，相对于组合物总重量的所述成分的添加量可以是0.1～10重量％，较佳地可以是0.1～6重量％，但是并不限定于此。
此外，化妆品组合物的剂型种类并不受到特殊限定，例如，可以是如化妆水、乳液、凝胶、面霜、精华、面膜、安瓿、润肤霜、洗剂、香皂、身体磨砂膏、香皂以及精油等护肤化妆品和如口红、粉底等美妆化妆品以及护发用化妆品等，其剂型并不受到特殊的限定。
本发明还可以提供含有所述皮肤益生菌块组合物的皮肤贴片、皮肤外用剂以及面膜等。所述皮肤贴片或皮肤外用剂可以与一般的贴片组合物或外用剂组合物中含有的各种赋形剂混合制造。
在本发明中，可以通过对在包含透明质酸或壳聚糖的已知成分培养基中对皮肤功能性乳酸菌进行发酵而生产出的不同pH的透明质酸或壳聚糖乳酸菌发酵物进行加热处理而制造成非活性益生菌之后进行反应，从而形成利用透明质酸捕获非活性益生菌的球形的皮肤益生菌块组合物。在将所述皮肤益生菌块组合物适用于皮肤时，可以将非活性益生菌在表皮细胞中的水通道蛋白3(AQP-3)的表达、在真皮细胞中的透明质酸合酶2(HAS-2)的表达以及伤口愈合(wound healing)效果极大化，从而提升皮肤保湿以及皮肤再生功能。通过如上所述的方式形成的皮肤益生菌块组合物对皮肤保湿以及皮肤再生方面呈现出有益的效果，因此可以有效地将其作为如功能性化妆品组合物、功能性皮肤贴片以及功能性面膜等尖端生物原材料使用。
附图说明
图1是在对实施例1-3-2的pH 5.5的壳聚糖非活性益生菌进行搅拌的同时滴入pH 4.0的透明质酸非活性益生菌，从而对皮肤益生菌块组合物进行离心分离回收以及冻结干燥之后拍摄的扫描显微镜照片。
图2是对实施例1-1的pH 4.0的透明质酸非活性益生菌和实施例1-2的pH 5.5的壳聚糖非活性益生菌以及实施例1-3-2的皮肤益生菌块组合物对表皮细胞的皮肤保湿效果进行图示的图表。
图3是对实施例1-1的pH 4.0的透明质酸非活性益生菌和实施例1-2的pH 5.5的壳聚糖非活性益生菌以及实施例1-3-2的皮肤益生菌块组合物的真皮细胞的皮肤保湿效果进行图示的图表。
图4是对实施例1-3-2的皮肤益生菌块组合物以及实施例2对真皮细胞的皮肤保湿效果进行图示的图表。
图5至图12是实施例1-1的pH 4.0的透明质酸非活性益生菌、实施例1-2的pH 5.5的壳聚糖非活性益生菌以及实施例1-3-2的皮肤益生菌等各种块组合物(包括比较条件)的与皮肤再生相关的伤口愈合(wound healing)效果的测定照片(细胞密度确认)。
具体实施方式
接下来，将对本发明的较佳实施例进行详细的说明。但是，本发明并不限定于在此进行说明的实施例，而是可以通过其他形态具体实现。相反，所述实施例只是为了确保在此介绍的内容更加彻底和完整，并向相关从业人员充分地传递本发明的思想。
<实施例1.皮肤益生菌块组合物的最佳制造条件的确定>
为了制造皮肤益生菌块组合物，利用透明质酸以及葡萄糖的已知成分培养基制造出具有一定数量的乳酸菌的pH 3.0～4.5的培养物，而作为另一方法，利用壳聚糖以及葡萄糖的已知成分培养基制造出具有一定数量的乳酸菌的pH 5.0～6.5的培养物之后，对分别具有不同的pH的培养物进行混合，采用透明质酸通过离子结合形成球形的原理。
即，使得在透明质酸以及葡萄糖的已知成分培养基中培养出的发酵物内的透明质酸的羧基(pka：3.19)带负电荷，并使得在壳聚糖以及葡萄糖的已知成分培养基中培养出的发酵物内的壳聚糖(pka：6.5)带正电荷，从而诱导两种物质的离子结合并对非活性益生菌培养物进行捕获并借此制造出球形的皮肤益生菌块。
实施例1-1.pH 3.0～4.5的透明质酸非活性益生菌的制造
在将乳杆菌(L.paracasei SKB1192)乳酸菌接种到MRS培养基中之后在37℃下进行20小时的培养，所制造的菌数为109～1010CFU/ml。
对在MRS培养基中培养的乳杆菌(L.paracasei SKB1192)乳酸菌进行离心分离回收，并利用灭菌水进行2次洗涤。
通过在三级蒸馏水中溶解中分子量透明质酸(1,500～2,000kDa)0.5％(w/v)以及葡萄糖2.0％(w/v)并进行灭菌(121℃，15分钟)而准备第一已知成分培养基之后，向所述第一已知成分培养基接种完成洗涤的乳杆菌(L.paracasei SKB1192)乳酸菌并在37℃下进行24小时的发酵，而且在发酵过程中从pH 4.5开始到pH 3.0为止以0.5单位分别回收了不同pH的发酵物。将所回收的各个不同pH的发酵物在100℃下进行10分钟的热处理之后利用0.45μm的过滤器进行过滤，从而制造出不同pH的透明质酸非活性益生菌。
实施例1-2.pH 5.0～6.5的壳聚糖非活性益生菌的制造
在将乳杆菌(L.paracasei SKB1192)乳酸菌接种到MRS培养基中之后在37℃下进行20小时的培养，所制造的菌数为109～1010CFU/ml。
对在MRS培养基中培养的乳杆菌(L.paracasei SKB1192)乳酸菌进行离心分离回收，并利用灭菌水进行2次洗涤。
通过在三级蒸馏水中溶解壳聚糖0.4％(w/v)以及葡萄糖2.0％(w/v)并进行灭菌(121℃，15分钟)而准备第二已知成分培养基之后，向所述第二已知成分培养基接种完成洗涤的乳杆菌(L.paracasei SKB1192)乳酸菌并在37℃下进行24小时的发酵，而且在发酵过程中从pH 6.5开始到pH 5.0为止以0.5单位分别回收了不同pH的发酵物。将所回收的各个不同pH的发酵物在100℃下进行10分钟的热处理之后利用0.45μm的过滤器进行过滤，从而制造出不同pH的壳聚糖非活性益生菌。
实施例1-3.用于形成皮肤益生菌块的不同pH的透明质酸非活性益生菌以及壳聚糖非活性益生菌的最佳混合条件的确认
实施例1-3-1.在向pH 3.0～4.5的透明质酸非活性益生菌滴入pH5.0～6.5的壳聚糖非活性益生菌时所形成的皮肤益生菌块的收率特性
在将通过实施例1-1制造出的pH 3.0～4.5的各个透明质酸非活性益生菌以100rpm进行搅拌的同时，滴入(dripping)通过实施例1-2制造出的pH 5.0～6.5的各个壳聚糖非活性益生菌。借此，引起皮肤益生菌块形成反应，接下来对通过以4,000rpm进行20分钟的离心分离而形成的皮肤益生菌块进行回收并对其收率进行测定。可以确认，最佳条件为在向pH 4.0的透明质酸非活性益生菌滴入pH 6.0的壳聚糖非活性益生菌时的最大收率即42％【表1】。皮肤益生菌块收率是以皮肤益生菌块反应液的总固态成分除以通过离心分离回收到的皮肤益生菌块的总固态成分的百分比进行计算(％，w/w)。
【表1】
实施例1-3-2.在向pH 5.0～6.5的壳聚糖非活性益生菌滴入pH3.0～4.5的透明质酸非活性益生菌时所形成的皮肤益生菌块的收率特性
在将通过实施例1-2制造出的pH 5.0～6.5的各个壳聚糖非活性益生菌以100rpm进行搅拌的同时，滴入(dripping)通过实施例1-1制造出的pH 3.0～4.5的各个透明质酸非活性益生菌。借此，引起皮肤益生菌块形成反应，接下来对通过以4,000rpm进行20分钟的离心分离而形成的皮肤益生菌块进行回收并对其收率进行测定。可以确认，最佳条件为在向pH 5.5的壳聚糖非活性益生菌滴入pH 4.0的透明质酸非活性益生菌时的最大收率即58％【表2】。皮肤益生菌块收率是以皮肤益生菌块反应液的总固态成分除以通过离心分离回收到的皮肤益生菌块的总固态成分的百分比进行计算(％，w/w)。
【表2】
通过如上所述的实施例1-3-1以及实施例1-3-2的皮肤益生菌块形成结果可以确认，实施例1-3-2中的在对pH 5.5的壳聚糖非活性益生菌进行搅拌的同时滴入pH 4.0的透明质酸非活性益生菌时的皮肤益生菌块的形成收率可以达到58％，属于最佳条件。
在接下来的实施例中，将实施例1-3-2中的在对pH 5.5的壳聚糖非活性益生菌进行搅拌的同时滴入pH 4.0的透明质酸非活性益生菌并在4,000rpm下进行20分钟的离心分离而形成的皮肤益生菌块进行回收，并将其作为用于确认形态学性状的标准样本使用，接下来将所回收到的皮肤益生菌块利用等量的三级蒸馏水进行悬浮，并将其作为用于确认皮肤保湿以及皮肤再生功能性的标准样本使用。
<比较例1.单纯混合乳酸菌发酵物>
在将通过实施例1-2制造出的pH 5.0～6.5的各个壳聚糖非活性益生菌以100rpm进行搅拌的同时快速混合通过实施例1-1制造出的pH 3.0～4.5的各个透明质酸非活性益生菌，从而引起皮肤益生菌块形成反应。通过其结果可以确认，因为发生凝聚现象而无法形成皮肤益生菌块。
<实施例2.利用不同乳酸菌的非活性益生菌的皮肤益生菌块组合物的制造>
实施例2-1.利用长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)的皮肤益生菌块组合物的制造
将利用长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)制造出的透明质酸非活性益生菌以及壳聚糖非活性益生菌，按照实施例1-3-2的经过优化的皮肤益生菌块组合物的制造方法(在对pH 5.5的壳聚糖非活性益生菌进行搅拌的同时滴入pH 4.0的透明质酸非活性益生菌，下同)制造出皮肤益生菌块组合物。
实施例2-2.利用嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的皮肤益生菌块组合物的制造
将利用嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)制造出的透明质酸非活性益生菌以及壳聚糖非活性益生菌，按照实施例1-3-2的经过优化的皮肤益生菌块组合物的制造方法制造出皮肤益生菌块组合物。
实施例2-3.利用乳酸乳球菌(Lacotococcus lactis)的皮肤益生菌块组合物的制造
将利用乳酸乳球菌(Lacotococcus lactis)制造出的透明质酸非活性益生菌以及壳聚糖非活性益生菌，按照实施例1-3-2的经过优化的皮肤益生菌块组合物的制造方法制造出皮肤益生菌块组合物。
实施例2-4.利用屎肠球菌(Enterococcus faecium)的皮肤益生菌块组合物的制造
将利用屎肠球菌(Enterococcus faecium)制造出的透明质酸非活性益生菌以及壳聚糖非活性益生菌，按照实施例1-3-2的经过优化的皮肤益生菌块组合物的制造方法制造出皮肤益生菌块组合物。
实施例2-5.利用戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)的皮肤益生菌块组合物的制造
将利用戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)制造出的透明质酸非活性益生菌以及壳聚糖非活性益生菌，按照实施例1-3-2的经过优化的皮肤益生菌块组合物的制造方法制造出皮肤益生菌块组合物。
实施例2-6.利用乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)的皮肤益生菌块组合物的制造
将利用乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)制造出的透明质酸非活性益生菌以及壳聚糖非活性益生菌，按照实施例1-3-2的经过优化的皮肤益生菌块组合物的制造方法制造出皮肤益生菌块组合物。
实施例2-7.利用融合魏斯氏菌(Weisslla confusa)的皮肤益生菌块组合物的制造
将利用融合魏斯氏菌(Weisslla confusa)制造出的透明质酸非活性益生菌以及壳聚糖非活性益生菌，按照实施例1的经过优化的皮肤益生菌块组合物的制造方法制造出皮肤益生菌块组合物。
<比较例2.透明质酸第一已知成分培养基以及壳聚糖第二已知成分培养基的制造>
在对皮肤保湿以及皮肤再生的功能性进行确认时，出于比较目的制造出透明质酸第一已知成分培养基以及壳聚糖第二已知成分培养基并作为比较例使用。
比较例2-1.透明质酸第一已知成分培养基的制造
通过在三级蒸馏水中溶解中分子量透明质酸(1,500～2,000kDa)0.5％(w/v)以及葡萄糖2.0％(w/v)并在利用乳酸补正为pH 4.0之后进行灭菌(121℃，15分钟)而制造出透明质酸第一已知成分培养基。
比较例2-2.壳聚糖第二已知成分培养基的制造
通过在三级蒸馏水中溶解壳聚糖0.4％(w/v)以及葡萄糖2.0％(w/v)并在利用乳酸补正为pH 5.5之后进行灭菌(121℃，15分钟)而制造出壳聚糖第二已知成分培养基。
<比较例3.透明质酸第一已知成分培养基以及壳聚糖第二已知成分培养基的块组合物的制造>
在对比较例2-2的壳聚糖第二已知成分培养基以100rpm进行搅拌的同时滴入(dripping)比较例2-1的透明质酸第一已知成分培养基。借此，引起壳聚糖-透明质酸块形成反应。为了对通过如上所述的方式形成的块组合物的收率进行确认，对通过在4,000rpm下进行20分钟的离心分离而形成的壳聚糖-透明质酸块组合物进行了回收，可以确认壳聚糖-透明质酸块的收率为54％。
<试验例1.皮肤益生菌块的形态学性状的确认>
对通过实施例1-3-2制造出的皮肤益生菌块的形态学性状进行确认。将所述标准样本块组合物在4,000rpm下进行20分钟的离心分离，并在仅对所形成的块进行回收之后再进行冻结干燥。利用扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope：SEM)对其进行拍摄，确认其具有球形粒子性状的形态学特征【图1-1】。
此外，为了比较试验而对比较例1中发生凝聚现象的物质进行冻结干燥，并利用扫描电子显微镜进行拍摄【图1-2】。
<试验例2.皮肤益生菌块组合物的皮肤保湿效果>
通过对存在于皮肤表皮以及真皮中的保湿基因表达效果进行测定，对皮肤益生菌块组合物的皮肤保湿效果进行确认。
试验例2-1.皮肤益生菌块组合物的水通道蛋白3信使核糖核酸表达(Aquaporin(AQP)-3mRNA expression)效果
水通道蛋白(Aquaporin(AQP))是可以起到在阻碍其他离子或溶质通过的同时选择性地诱导皮肤内水分子进出的水通道(water channel)作用的膜孔蛋白(membrane pore protein)，其中水通道蛋白3(AQP-3)可以使得丙三醇(glycerol)与水一起通过，因此也被称之为水甘油通道蛋白(aquaglyceroporin)，存在于人角质形成细胞(human keratinocyte)，可以通过防止水分子的损失而起到如皮肤保湿(skin hydration)、伤口愈合(wound healing)以及体内平衡(homeostasis)等功能。因此，可以通过水通道蛋白3(AQP-3)的表达增加对原料的保湿功效进行确认。
为了执行实时荧光定量聚合酶链反应(Real time PCR)而在培养皿(culture dish)中接种人类正常角质形成细胞(human normal keratinocyte，gibco)并进行24小时(37℃、CO2 5％)的培养之后更换成无血清(Serum-free)培养基(Epilife，gibco)，接下来分别利用实施例1-1的透明质酸非活性益生菌(pH 4.0)、实施例1-2的壳聚糖非活性益生菌(pH 5.5)以及实施例1-3-2的皮肤益生菌块组合物(通过在对pH 5.5的壳聚糖非活性益生菌进行搅拌的同时滴入pH 4.0的透明质酸非活性益生菌的方式进行制造)的样本以3％(w/v)的浓度进行处理并进行5天的培养。利用TRIzol收集经过培养之后的细胞并按照制造企业的方法对核糖核酸(RNA)进行分离。在对所分离出的核糖核酸(RNA)进行定量之后，利用1μg的核糖核酸(RNA)合成出互补脱氧核糖核酸(cDNA)并执行了实时荧光定量聚合酶链反应(Real time PCR)。在聚合酶链反应(PCR)中所使用的水通道蛋白3(Aquaporin(AQP)-3)以及β肌动蛋白(β-Actin)引物(primer)是由COSMO GENTECH公司(Korea)进行合成，水通道蛋白3(AQP-3)的引物序列(primer sequence)如【表3】所示。
为了进行比较试验，按照相同的方法利用比较例2-1、比较例2-2以及比较例3以3％(w/v)的浓度进行对照处理，而作为阳性对照组使用50nM的视黄酸(retinoic acid)进行。
【表3】
试验结果如【图2】所示，可以确认与以相同浓度进行的比较例以及实施例相比，实施例1-3-2的皮肤益生菌块组合物可以显著诱导水通道蛋白3(AQP-3)的表达。这表明壳聚糖或透明质酸非活性益生菌所保有的皮肤保湿效果通过制造成皮肤益生菌块形态进行传递，作用于人类角质形成细胞(human keratinocyte)的效果得到进一步提升。借此，可以确认本发明的皮肤益生菌块组合物可以通过在皮肤的表皮细胞激活水分的水通道(water channel)而提升皮肤保湿(skin hydration)效果，属于可以在表皮乃至于真皮细胞的保湿维持方面做出贡献的组合物。
试验例2-2.皮肤益生菌块组合物的透明质酸合酶2信使核糖核酸表达(HAS-2mRNA expression)效果
已有报告指出人类皮肤中的透明质酸的量会随着老化逐渐减少，而这被认为是伴随老化出现的皮肤弹性下降以及水分含量减少的直接原因之一。如上所述的透明质酸的合成是由透明质酸合酶(HAS，Hyaluronic Acid Synthase)执行，而通过透明质酸合酶2(HAS-2)的表达的增加，可以对皮肤保湿以及皮肤再生效果进行确认。
为了执行实时荧光定量聚合酶链反应(Real time PCR)而在培养皿(culture dish)中接种人类正常成纤维细胞(human normal fibroblast，gibco)并进行24小时(37℃、CO2 5％)的培养之后更换成无血清(Serum-free)培养基(Epilife，gibco)，接下来分别利用实施例1-1的透明质酸非活性益生菌(pH 4.0)、实施例1-2的壳聚糖非活性益生菌(pH 5.5)以及实施例1-3-2的皮肤益生菌块组合物(通过在对pH 5.5的壳聚糖非活性益生菌进行搅拌的同时滴入pH 4.0的透明质酸非活性益生菌的方式进行制造)的样本以3％(w/v)的浓度进行处理并进行5天的培养。利用TRIzol收集经过培养之后的细胞并按照制造企业的方法对核糖核酸(RNA)进行分离。在对所分离出的核糖核酸(RNA)进行定量之后，利用1μg的核糖核酸(RNA)合成出互补脱氧核糖核酸(cDNA)并执行了实时荧光定量聚合酶链反应(Real time PCR)。在聚合酶链反应(PCR)中所使用的透明质酸合酶2(HAS-2)以及β肌动蛋白(β-Actin)引物(primer)是由COSMO GENTECH公司(Korea)进行合成，透明质酸合酶2(HAS-2)的引物序列(primer sequence)如【表4】所示。
为了进行比较试验，按照相同的方法利用比较例1-1、比较例1-2以及比较例2以3％(w/v)的浓度进行对照处理，而作为阳性对照组使用50nM的视黄酸(retinoic acid)进行。
此外，为了确认在利用其它乳酸菌制造的情况下是否可以维持类似的皮肤益生菌块的特性，按照相同的方法利用实施例2-1至实施例2-7以3％(w/v)的浓度进行处理，而作为阳性对照组使用50nM的视黄酸(retinoic acid)进行。
【表4】
通过实时荧光定量聚合酶链反应(Real time PCR)对基因的表达进行确认的结果如【图3】所示，可以确认与以相同浓度进行的比较例以及实施例相比，实施例1-3-2的皮肤益生菌块组合物可以显著诱导透明质酸合酶2(HAS-2)的表达。这表明壳聚糖或透明质酸非活性益生菌所保有的皮肤保湿效果通过制造成皮肤益生菌块形态进行传递，作用于真皮细胞即人类成纤维细胞(human fibroblast)的效果得到进一步提升。借此，可以确认本发明的皮肤益生菌块组合物属于一种可以在真皮细胞中通过透明质酸合成的皮肤再生过程促进皮肤保湿效果的优秀的组合物。
此外，如【图4】所示，可以确认在利用其它乳酸菌非活性益生菌制造出的皮肤益生菌块组合物中可以观察到与实施例1-3-2的结果相同的对透明质酸合酶2(HAS-2)的表达的诱导效果。如上所述，可以确认利用乳酸菌非活性益生菌制造出的皮肤益生菌块全部在真皮细胞中具有皮肤保湿以及再生功能性。
<试验例3.皮肤益生菌块组合物的皮肤再生效果>
为了对皮肤益生菌块的皮肤再生效果进行确认，执行了伤口愈合(wound healing)试验。在将人类正常成纤维细胞(Human normal fibroblast)接种到细胞皿(cell dish)中并进行24小时的培养滞后，利用SPLScar Scratcher在细胞(cell)中形成划痕。在利用汉可氏平衡盐溶液(HBSS，Hank's balanced Salt Solution，Gibco，USA)进行洗涤之后，利用实施例1-1的透明质酸非活性益生菌、实施例1-2的壳聚糖非活性益生菌以及实施例1-3-2、实施例2的皮肤益生菌块组合物样本分别以3％(w/v)的浓度进行处理并进行48小时的培养。在培养之后利用显微镜对划痕(scratch)部分的细胞进行拍摄并对细胞数量进行测定，进而计算出与对照组(control)细胞数量相比的实施例以及比较例的细胞密度(％)。
为了进行比较试验，按照相同的方法利用比较例2-1、比较例2-2以及比较例3以3％(w/v)的浓度进行对照处理，而作为阳性对照组使用7μg/ml的腺苷(adenosine)进行。试验结果如【图5】至【图12】所示，通过利用显微镜照片对划痕(scratch)部分的细胞密度进行比较的结果可以确认，与对照组(control)以及比较例相比，实施例1-3-2的皮肤益生菌块的细胞增殖呈现出了更加稠密的增加效果，而且呈现出了与阳性对照组即7μg/ml的腺苷(adenosine)类似的细胞密度。借此可以确认，实施例1-3-2的细胞益生菌块可以诱导受损皮肤细胞的增殖并呈现出得到提升的皮肤再生效果。
参阅如上所述的实施例对本发明进行了详细的说明，但这仅为示例性目的，具有本发明所属技术领域之一般知识的人员应该可以理解，本发明还可以通过多种变形以及均等的其他实施例实现。因此，本发明的真正的技术保护范围应通过所附的权利要求书中的技术事项做出定义。