多价免疫治疗组合物和用于治疗wt1阳性癌症的方法
1.相关申请的交叉引用
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3.本技术的序列表标记为“seq-list.txt”，其创建于2020年4月9日，大小为47kb。序列表的全部内容通过引用整体并入本文。
4.发明背景
5.本发明提供了治疗表达wt1的癌症、降低表达wt1的癌症的发生率和诱导针对表达wt1的癌症的免疫应答的方法，以及用于相同目的的组合物。


技术实现要素：

6.本发明提供了治疗表达wt1的癌症、降低表达wt1的癌症的发生率和诱导针对表达wt1的癌症的免疫应答的方法，以及包括用于相同目的的免疫原性组合物的组合物。在一个实施方案中，本发明提供了用于此类用途的方法，该方法包括向需要其的受试者施用至少以下七种wt1肽的组合：ymfpnapyl(seq id no:124)、rsdelvrhhnmhqrnmtkl(seq id no:1)、pgcnkryfklshlqmhsrkhtg(seq id no:2)、sgqaymfpnapylpscles(seq id no:125)、nlmnlgatl(seq id no:21)、wnlmnlgatlkgvaa(seq id no:26)和wnymnlgatlkgvaa(seq id no:205)。在一些实施方案中，七种肽全部都存在于作为多价(七价)免疫治疗组合物施用至受试者的组合物中。
7.可通过向受试者施用一种或多种wt1递送剂来向受试者施用至少七种wt1肽的组合，从而引起wt1肽的组合的递送和针对表达wt1的癌症的免疫应答的诱导。可使用的这些wt1递送剂的实例包括：(i)一种或多种单独的wt1肽本身，(ii)一种或多种编码wt1肽的核酸，和(iii)一种或多种包含或呈递wt1肽的组合的免疫细胞，或者一种或多种包含或呈递编码wt1肽的组合的核酸的免疫细胞，或(i)、(ii)或(iii)中的两个或三个的任意组合。
8.可能需要将至少七种wt1肽中的一种或多种作为肽施用，并通过其他形式的wt1递送剂(例如编码wt1肽的核酸，或通过包含或呈递wt1肽的免疫细胞)施用至少七种wt1肽中的其他肽。因此，至少七种wt1肽可通过以下形式施用：以肽的形式，或以编码该肽的核酸的形式，或以包含或呈递wt1肽或编码核酸的免疫细胞的形式，或以这些形式中的两种或全部三种形式(即肽和核酸；肽和免疫细胞；核酸和免疫细胞；或肽、核酸和免疫细胞)。因此，可以下述形式施用至少七种wt1肽的组合：(i)作为七种或更多种的肽，单独地或以任何一种或多种组合；或(ii)作为编码至少七种wt1肽的组合的核酸，单独地或以任何一种或多种组合；或(iii)包含或呈递至少七种wt1肽的组合的免疫细胞，或者包含或呈递编码至少七种或更多种的肽的组合的核酸的免疫细胞，单独地或以任何一种或多种组合。在一些实施方案中，至少七种wt1肽以作为这些形式中的两种或全部三种的组合(即(i)和(ii)；或(i)和(iii)；或(ii)和(iii)；或(i)、(ii)和(iii))来施用。
9.任选地，替代地或除了wt1递送剂(肽、编码肽的核酸和免疫细胞)之外，可向受试者施用针对表达wt1的癌症的细胞毒性t细胞(ctl)，其中ctl已经通过至少七种单独的肽的
组合被诱导，七种单独的肽为：ymfpnapyl(seq id no:124)、rsdelvrhhnmhqrnmtkl(seq id no:1)、pgcnkryfklshlqmhsrkhtg(seq id no:2)、sgqaymfpnapylpscles(seq id no:125)、nlmnlgatl(seq id no:21)、wnlmnlgatlkgvaa(seq id no:26)和wnymnlgatlkgvaa(seq id no:205)。
10.任选地，除了七种wt1肽的组合、编码七种wt1肽的核酸、包含或呈递七种wt1肽和/或包含编码wt1肽的核酸的免疫细胞，或由七种wt1肽诱导的ctl之外，一种或多种额外的wt1肽，或由一种或多种额外的wt1肽诱导的ctl可被包括在组合物中，或者以其他方式向受试者施用。一种或多种额外的wt1肽可以是其为wt1蛋白的片段的天然肽，或者它们可以是具有可增强其免疫原性的一种或多种修饰的肽，或者它们的混合物。此类修饰可以是改变氨基酸(例如，异变(heteroclitic)肽)或任何其他修饰。一种或多种额外的wt1肽可通过wt1递送剂施用于受试者，或者可以施用针对表达wt1的癌症和已经被一种或多种额外的wt1肽诱导的ctl。
11.任选地，在施用wt1递送剂和/或ctl之前、期间或之后，可向受试者施用一种或多种检查点抑制剂。一种或多种检查点抑制剂(也称为免疫检查点抑制剂)是阻断或抑制免疫检查点蛋白的化合物或试剂。作为检查点抑制剂的化合物或试剂的非限制性实例包括小分子、肽和抗体。抗体的非限制性实例包括纳武利尤单抗(nivolumab)(opdivo)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)(keytruda)、匹地利珠单抗(pidilizumab)(ct-011)、medi0680(amp-514)、amp-224、aunp-12、bms 936559、阿替利珠单抗(atezolizumab)(mpdl3280a)、度伐利尤单抗(durvalumab)(medi4736)、阿维鲁单抗(avelumab)(msb0010718c)、bms935559(mdx-1105)、rhigm12b7、bms-986016、gsk2831781、imp321、利丽单抗(lirilumab)(bms-986015)、iph2101(1-7f9)、吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂(indoximod)(nlg 9189)、nlg 919、incb024360、pf-05082566、乌洛单抗(urelumab)(bms-663513)和medi6469。
12.在一个实施方案中，根据最大有益于受试者的方案，公开了将其中一种或多种wt1递送剂或ctl以及一种或多种检查点抑制剂各自施用至受试者的方法。因此，一种或多种wt1递送剂或ctl和一种或多种检查点抑制剂不一定同时施用或甚至在相同的组合物中，或每种持续相同的时间或每种施用的途径相同。每种wt1肽都可按照特定的方案施用，每种检查点抑制剂也是如此。在一个实施方案中，至少一种wt1肽和至少一种检查点抑制剂的给药方案是并行的(concurrent)。在一个实施方案中，至少一种wt1肽和至少一种检查点抑制剂的给药方案重叠。在一个实施方案中，至少一种wt1递送剂或ctl和至少一种检查点抑制剂存在于同一组合物中。在一个实施方案中，与单独使用wt1递送剂或ctl和检查点抑制剂相比，本文所公开的方法提供了增强或增加的治疗表达wt1的癌症、降低表达wt1的癌症的发生率和诱导针对表达wt1的癌症的免疫应答的能力。在一个实施方案中，通过本文描述的方法提供的治疗表达wt1的癌症、降低表达wt1的癌症的发生率和诱导针对表达wt1的癌症的免疫应答的能力大于单独的wt1递送剂或ctl与单独的检查点抑制剂的效果的组合。
13.wt1递送剂或ctl的剂量水平和给药方案以及检查点抑制剂的剂量水平和给药方案、给药途径和给药的其他方面都经过优化，以实现最大有益于受试者。本文的实施方案提供了治疗表达wt1的癌症、降低表达wt1的癌症的发生率和诱导针对表达wt1的癌症的免疫应答的改善的方法，以及用于相同目的的改善的组合物。
14.适用于本文所公开的方法的癌症是任何表达wt1蛋白或其片段的癌症。在一个实
施方案中，癌症是卵巢癌。在另一个实施方案中，癌症是乳腺癌。在另一个实施方案中，癌症是结肠癌或结肠直肠癌。在另一个实施方案中，癌症是间皮瘤。在另一个实施方案中，癌症是白血病。在其他实施方案中，癌症是肾母细胞瘤(wilms’tumor)、急性髓性白血病(aml)、多发性骨髓瘤、慢性粒细胞白血病(cml)、骨髓增生异常综合征(mds)、黑色素瘤、间皮瘤(例如恶性胸膜间皮瘤)、胃癌、前列腺癌、胆管癌、泌尿系统癌、胶质母细胞瘤、软组织肉瘤、骨肉瘤或非小细胞肺癌(nsclc)。
具体实施方式
15.本发明提供了治疗表达wt1的癌症、降低表达wt1的癌症的发生率和诱导针对表达wt1的癌症的免疫应答的方法，以及包括用于相同目的的免疫原性组合物的组合物。在一个实施方案中，本发明提供了用于此类用途的方法，其包括向需要其的受试者施用至少七种wt1肽或其细胞毒性t细胞(ctl)的组合，其中所述组合包括下述各项中的每一种：ymfpnapyl(seq id no:124；也称为wt1-a1)、rsdelvrhhnmhqrnmtkl(seq id no:1；也称为长wt1-427)、pgcnkryfklshlqmhsrkhtg(seq id no:2；也称为长wt1-331)、sgqaymfpnapylpscles(seq id no:125；也称为长wt1-122a1)、nlmnlgatl(seq id no:21；也称为短nlm)、wnlmnlgatlkgvaa(seq id no:26；也称为wnlm或长nlm)和wnymnlgatlkgvaa(seq id no:205；也称为wnym或长nym)。七种wt1肽的组合可在有或没有一种或多种检查点抑制剂的情况下施用。在一些实施方案中，免疫治疗组合物用于治疗表达wt1的肿瘤或在体外(in vitro)、离体(ex vivo)或体内(in vivo)诱导对表达wt1的癌症具有特异性的t细胞的形成和增殖，并且其中该组合对前述一种或多种具有协同效应。
16.可通过向受试者施用一种或多种试剂来向受试者施用至少七种wt1肽的组合，从而引起至少七种wt1肽的组合的递送和针对表达wt1的癌症的免疫应答的诱导(即，一种或多种wt1递送剂)。至少七种wt1肽中的每一种可在一种或多种相同或不同的wt1递送剂中，并且以其一种或多种组合递送。可使用的这些wt1递送剂的实例包括：(i)单独的wt1肽，(ii)编码至少一种wt1肽的核酸，和(iii)包含或呈递至少一种wt1肽的免疫细胞，或者包含或呈递编码至少一种wt1肽的核酸的免疫细胞。因此，在一些实施方案中，至少七种wt1肽的组合以七种单独的wt1肽的形式施用。在一些实施方案中，向受试者施用组合物，并且该组合物包括所有七种单独的wt1肽。
17.任选地，替代地或除了wt1递送剂(肽、编码肽的核酸和免疫细胞)之外，可向受试者施用针对表达wt1的癌症的细胞毒性t细胞(ctl)，其中ctl通过以下至少七种单独的肽的组合被诱导：ymfpnapyl(seq id no:124)、rsdelvrhhnmhqrnmtkl(seq id no:1)、pgcnkryfklshlqmhsrkhtg(seq id no:2)、sgqaymfpnapylpscles(seq id no:125)、nlmnlgatl(seq id no:21)、wtlvangangan1g(seq id no:26)和wnymnlgatlkgvaa(seq id no:205)。ctl包括体外或离体制备的wt1特异性ctl，或者它们可以在供体体内制备并从供体获得。
18.wt1递送剂或ctl可以在与载体、赋形剂或稀释剂(其中可以是佐剂)形成的组合物中被提供。下文描述了用于本文所提供的方法和组合物中的肽组分的非限制性选择。
19.卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，也是美国女性癌症死亡的第五大常见原因。每年诊断出超过22,000例病例，估计每年有15,500例死亡[1]。大多数患者就诊时具有
广泛的疾病[2]。晚期疾病的5年生存率仍然低于30％[1]。尽管可以预期许多患者在初始化疗后临床症状得到彻底缓解，但对经常作为常规护理而进行的二次剖腹手术的回顾表明，事实上只有不到50％的患者显示无疾病困扰[3]。此外，近一半的二次检查结果为阴性的患者会复发，并且需要额外的治疗[4]。许多患者将通过额外的化疗获得第二次彻底的临床反应。然而，几乎所有患者都会在9-11个月的短暂缓解间隔后复发[5]。需要采取有效的策略来延长缓解或防止复发，因为随后的缓解持续时间逐渐缩短，直到广泛出现化疗抗性[2]。
[0020]
抗体和t细胞效应物都已被证明对卵巢癌模型有益。已经注意到抗体可减少早期组织侵袭[6]。临床前模型还证明了通过使用被动给药和疫苗诱导的抗体清除循环肿瘤细胞和消除全身微转移。关于t细胞效应物，已证明全面激活的免疫应答与改善晚期卵巢癌患者的临床结果有关。zhang等人表明，肿瘤细胞胰岛内肿瘤浸润性t细胞的存在与改善无进展生存期和总生存期有关[7]。相反，t调节细胞的浸润赋予更差的预后[8]。
[0021]
经历二次或更多次缓解的卵巢癌患者的数据证实他们以可预测的方式复发[9]。近年来，卵巢癌已成为各种基于免疫的新方法的目标。抗体疗法包括奥戈伏单抗(oregovomab)[10]，其为靶向ca125抗原的单克隆抗体疗法；阿巴伏单抗(abagovomab)[11]，其为靶向ca-125的抗独特型抗体；和曲妥珠单抗(trastuzumab)[12]，其为单克隆人源化的抗her2抗体。其他策略包括细胞因子疗法，例如干扰素γ[13,14]和il-2[15]。还评估了其他抗原的主动免疫，其他抗原例如lewis y[16]、muc1[17]、hla限制性肽ny-eso-1b[18]和kh-1-klh缀合物。先前的策略一直无效，因此需要新的治疗方式来提高卵巢癌以及许多其他用当前可用疗法治疗无效的癌症的疗效。
[0022]
wt1是指肾母细胞瘤1或wt1基因的基因产物。肾母细胞瘤抑制基因——wt1——首次在儿童肾脏肿瘤中被鉴定，但wt1在多种其他血液系统恶性肿瘤和实体瘤(包括间皮瘤)中也高度表达[19,20]。wt1最初是通过cdna定位到染色体11p13的区域来鉴定的。wt1 cdna编码含有四个kruppel型锌指的蛋白，并含有复杂的可变剪接模式，其可导致四种不同的转录因子。每个wt1亚型具有不同的dna结合和转录活性[21]，并且可正向或负向调节参与细胞增殖、分化、凋亡、器官发育和性别决定的各种基因。wt1通常在胚胎发生过程中在中胚层起源的组织中表达，其包括肾脏、生殖腺、心脏、间皮和脾[22]。在正常成人组织中，wt1表达仅限于正常cd34+造血干细胞、肌上皮祖细胞、肾足细胞以及睾丸和卵巢中的一些细胞的细胞核中的低水平[23]。wt1在小鼠和人类中高度同源(氨基酸水平为96％)，并且具有相似的组织分布和功能[24,25]。虽然最初被描述为肿瘤抑制基因，但wt1蛋白似乎参与肿瘤发生。
[0023]
wt1蛋白在卵巢癌中的强表达及其提出的作用机制使其在许多其他也表达wt1蛋白的癌症中成为免疫治疗的合理靶点，其中其他也表达wt1蛋白的癌症例如但不限于间皮瘤、白血病、肾母细胞瘤、急性髓系白血病(aml)、慢性粒细胞白血病(cml)、骨髓增生异常综合征(mds)、黑色素瘤、胃癌、前列腺癌、胆管癌、泌尿系统癌、胶质母细胞瘤、软组织肉瘤、骨肉瘤和非小细胞肺癌(nsclc)。在卵巢癌中，该表达非常频繁，以至于病理学家通常对wt1使用免疫组织化学染色(使用标准化惯例来描述表达并确定为“阳性”或“阴性”，以帮助区分上皮性卵巢癌与其他肿瘤)。wt1是对浆液性卵巢癌的特别敏感和特异性的标记物[26]。卵巢组织微阵列表明70-80％的浆液性卵巢癌表达wt1，因此大多数患者将具有靶标并有资格参与研究。
[0024]
可用于与七种wt1肽组合使用的一种或多种额外的wt1肽可以是其为wt1蛋白的片
id no:163)、twnqmnlga(seq id no:164)、mtwnqmnlg(seq id no:165)、cmtwnlmnlgatlkgva(seq id no:166)、wnlmnlgat(seq id no:167)、mnlgatlkg(seq id no:168)、mtwnqmnlg(seq id no:169)、cmtwnymnlgatlkgva(seq id no:170)、mnlgatlkg(seq id no:171)、mtwnqmnlg(seq id no:172)、galrnptac(seq id no:173)、gylrnptac(seq id no:174)、galrnptal(seq id no:175)、yalrnptac(seq id no:176)、gllrnptac(seq id no:177)、rqrphpgal(seq id no:178)、ryrphpgal(seq id no:179)、yqrphpgal(seq id no:180)、rlrphpgal(seq id no:181)、rirphpgal(seq id no:182)、galrnptac(seq id no:183)、galrnptal(seq id no:184)、rqrphpgal(seq id no:185)、rlrphpgal(seq id no:186)、rirphpgal(seq id no:187)、qfpnhsfkhedpmgq(seq id no:188)、qfpnhsfkhedpmgq(seq id no:189)、hsfkhedpm(seq id no:190)、hsfkhedpy(seq id no:191)、hsfkhedpk(seq id no:192)、krpfmcaypgcykry(seq id no:193)、sekrpfmcaypgcnk(seq id no:194)、krpfmcaypgcnk(seq id no:195)、fmcaypgcn(seq id no:196)、fmcaypgcy(seq id no:197)或fmcaypgck(seq id no:198)。
[0033]
在另一个实施方案中，wt1肽是wo2005053618、wo2007047763、wo2007047764、wo2007120673、us20060084609、wo2014113490和wo2013106834中记载的任何修饰的wt1肽。前述内容通过引用整体并入本文。
[0034]
在另一个实施方案中，wt1肽是us20110070251a1、us7063854b1、us7063854、us7901693、us7662386、7,063,854、us7115272、us7368119、us7329410、us7144581、us7323181、us7655249、us7,553,494、us7608685、us7380871、us7030212、us7807792、us7517950、us2010/0166738、us2011/0070251、us2009/0143291和wo2003037060中记载的任何修饰的wt1肽。前述内容通过引用整体并入本文。
[0035]
在另一个实施方案中，wt1肽是us7666985b2、us20080070835a1、us20070128207a1、us7915393b2、us20110136141a1、us7598221b2、us20100111986a1、us20100092522a1、us20030082194a1和wo2001025273a2中记载的任何修饰的wt1肽。前述内容通过引用整体并入本文。
[0036]
可用于本文所述目的的一种或多种额外的wt1肽可以是单一的肽或肽的组合。一种或多种额外的wt1肽中的每一种可以是天然的wt1肽或修饰的wt1肽。如果使用两种或更多种的肽，每一种都可以单独施用(在不同的制剂中)或与另一种或多种肽组合施用(在相同的制剂中)。一种或多种肽可与载体、稀释剂或赋形剂组合施用。在一个实施方案中，肽与佐剂组合施用。每种肽可与不同的佐剂或佐剂的组合一起施用，或者肽可以以两种或更多种肽的组合与多种佐剂组合的佐剂一起施用。在本文中，含有一种或多种肽的免疫原或组合物可称为疫苗、肽疫苗、wt1疫苗等。
[0037]
佐剂可以是任何类别，例如明矾盐和其他矿物佐剂、细菌制品或细菌衍生的佐剂、表面活性剂(tensoactive agents)(例如皂苷)、水包油(o/w)和油包水(w/o)乳剂、脂质体佐剂、细胞因子(例如，il-2、gm-csf、il-12和ifn-γ)和α-半乳糖苷神经酰胺类似物。佐剂的非限制性实例包括montanide乳剂、qs21、弗氏(freund’s)完全或不完全佐剂、磷酸铝、氢氧化铝、卡介苗(bcg)和明矾。在一个实施方案中，佐剂是增强针对wt1肽的免疫系统的ctl应答的试剂，例如含有源自橄榄油的植物级(vg)油酸(montanide isa 51vg w/o乳剂)的表面活性剂甘露醇单油酸酯(mannide monooleate)。佐剂可在与一种或多种wt1肽相同的组
合物中施用，或在与一种或多种检查点抑制剂相同的组合物中施用，或在与一种或多种wt1肽和一种或多种检查点抑制剂相同的组合物中施用，或在与一种或多种wt1肽和一种或多种检查点抑制剂分开的组合物中施用。
[0038]
在另一个实施方案中，在hla i类结合基序的一级或二级锚定残基中，上述任何肽(七种wt1肽的组合和任选地一种或多种额外的wt1肽)具有一个或多个点突变。在一个实施方案中，肽在i类结合基序的第2或9位，或在i类结合基序的二级锚定残基的第1、3、4、5、6、7或8位处具有点突变。在一个实施方案中，肽为以下肽：hla i类结合基序的第1位变为甘氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；在一个实施方案中，hlai类结合基序的第2位变为亮氨酸或异亮氨酸；在一个实施方案中，hlai类结合基序的第6位变为缬氨酸、谷氨酰胺或组氨酸；或在一个实施方案中，hla i类结合基序的第9位变为缬氨酸、丙氨酸、苏氨酸、异亮氨酸或半胱氨酸。
[0039]
任选地，七种wt1肽的组合进一步包括wo2014113490中所公开的一种或多种天然或修饰的wt1肽，例如nqmnlgatl(seq id no:147)、nlmnlgatl(seq id nymnlgatl(seq id no:149)、cmtwnqmnlgatlkg(seq id no:150)、cmtwnlmnlgatlkg(seq id no:151)、wnqmnlgatlkgvaa(seq id no:152)、mtwnqmnlgatlkgv(seq id no:154)、twnqmnlgatlkgva(seq id no:155)、cmtwnlmnlgatlkg(seq id no:156)、mtwnlmnlgatlkgv(seq id no:157)、twnlmnlgatlkgva(seq id no:158)、wnlmnlgatlkgvaa(seq id no:159)、mtwnymnlgatlkgv(seq id no:1260)、twnymnlgatlkgva(seq id no:161)、cmtwnqmnlgatlkgva(seq id no:162)、wnqmnlgat(seq id no:163)、twnqmnlga(seq id no:164)、mtwnqmnlg(seq id no:165)、cmtwnlmnlgatlkgva(seq id no:166)、wnlmnlgat(seq id no:167)、mnlgatlkg(seq id no:168)、mtwnqmnlg(seq id no:169)、cmtwnymnlgatlkgva(seq id no:170)、mnlgatlkg(seq id no:171)、mtwnqmnlg(seq id no:172)、galrnptac(seq id no:173)、gylrnptac(seq id no:174)、galrnptal(seq id no:175)、yalrnptac(seq id no:176)、gllrnptac(seq id no:177)、rqrphpgal(seq id no:178)、ryrphpgal(seq id no:179)、yqrphpgal(seq id no:180)、rlrphpgal(seq id no:181)、rirphpgal(seq id no:182)、galrnptac(seq id no:183)、galrnptal(seq id no:184)、rqrphpgal(seq id no:185)、rlrphpgal(seq id no:186)、rirphpgal(seq id no:187)、qfpnhsfkhedpmgq(seq id no:188)、qfpnhsfkhedpmgq(seq id no:189)、hsfkhedpm(seq id no:190)、hsfkhedpy(seq id no:191)、hsfkhedpk(seq id no:192)、krpfmcaypgcykry(seq id no:194)、sekrpfmcaypgcnk(seq id no:194)、krpfmcaypgcnk(seq id no:195)、fmcaypgcn(seq id no:196)、fmcaypgcy(seq id no:197)或fmcaypgck(seq id no:198)。
[0040]
组合的每种肽可在其本身的制剂中单独施用，或者组合的两种、三种、四种、五种、六种或七种或更多种肽可在同一制剂中一起施用。在一个实施方案中，至少七种wt1肽的组合在同一制剂中施用。
[0041]
可根据患者的临床表现、疾病的持续时间或病程、合并症以及临床护理的其他方面来优化每种肽的剂量水平、每个个体的施用频率或多达七种或更多种的肽的任何一种或多种组合、施用持续时间和用七种或更多种wt1肽免疫的其他方面。本发明对于本文所公开的方法的免疫组分的特定方面没有如此限制。
[0042]
在一个实施方案中，所述多价免疫治疗组合物包含280mcg的以上七种肽中的每一
种：ymfpnapyl(seq id no:124)、rsdelvrhhnmhqrnmtkl(seq id no:1)、pgcnkryfklshlqmhsrkhtg(seq id no:2)、sgqaymfpnapylpscles(seq id no:125)、nlmnlgatl(seq id no:21)、wnlmnlgatlkgvaa(seq id no:26)和wnymnlgatlkgvaa(seq id no:205)。在一个实施方案中，该组合物进一步包含一种或多种额外的wt1肽。在一个实施方案中，该组合物不包括其他的wt1肽。在一个实施方案中，该组合物不包括其他的肽。
[0043]
在一个实施方案中，在每个剂量(0.5ml)下，施用200mcg的每种肽。在一个实施方案中，在每个剂量下，施用100至2000mcg的每种肽。在一个实施方案中，前述剂量在10周的疗程中每隔一周施用一次(即，施用6次)。在一个实施方案中，施用是皮下的。在一个实施方案中，佐剂在施用前与疫苗混合(乳化)。在一个实施方案中，0.5ml免疫治疗组合物(即每种肽200mcg)在施用前用1.0ml佐剂乳化。在另一个实施方案中，在注射免疫治疗组合物之前或之后，在与疫苗相同的部位注射佐剂。在一个实施方案中，佐剂是乳剂。在一个实施方案中，乳剂是montanide乳剂。在一个实施方案中，montanide乳剂是免疫佐剂montanide isa 51vg。任选地，在本发明的实施中，如下文进一步描述的，还将一种或多种检查点抑制剂与免疫治疗组合物一起施用至受试者。
[0044]
如上所述，包含或由七种wt1肽的组合组成的免疫治疗组合物可以作为免疫原性组合物进行施用，以引发针对表达wt1的癌症的免疫应答，或者在另一个实施方案中，wt1肽的组合使用体外或离体方法可用于制备wt1特异性ctl，所述ctl一旦施用至患者将直接针对表达wt1的癌症。在一个实施方案中，至少七种wt1肽的组合被用于在体外诱导ctl的产生，例如使用来自细胞系的细胞。在另一个实施方案中，至少七种wt1肽的组合被用于在取自患者的细胞样品中诱导ctl的产生，其中将离体诱导的ctl输回至需要其的同一患者体内。在另一个实施方案中，至少七种wt1肽的组合被用于在取自供体的细胞样品中诱导ctl的产生，其中将离体诱导的ctl输注至需要其的非供体的患者中。在另一个实施方案中，将本文所述的七种或更多种wt1肽的组合施用至受试者(其不是需要治疗的患者)以诱导ctl的形成，然后将ctl从供体转移至患者。上述实施方案中的每一个都是本发明的其他方面，并且其为如本文所述的可用于治疗癌症或降低癌症发生率或其复发的wt1特异性细胞的来源。在前述任一实施方案中，至少七种wt1肽中的每一种的ctl可单独或组合制备。单独制备的ctl可分别施用至受试者，或者可在施用至受试者之前组合。
[0045]
在上述任一方法中，无论是对患者进行免疫治疗以诱导针对表达wt1的癌症的ctl应答，还是从供体获得wt1特异性ctl，使用来自细胞系、患者或非患者供体的免疫细胞的来自体外或离体的方法，检查点抑制剂的组合使用可任选地被本文公开，无论用于治疗、降低癌症发生率或其复发的方法是通过用七种或更多种wt1肽的组合对需要其的受试者进行免疫，还是在体外或离体或在供体受试者中产生ctl。在这些方法中的任一种中，一种或多种检查点抑制剂的组合使用可任选地被本文公开。一种或多种检查点抑制剂可施用至正在用一种或多种wt1肽免疫的患者。检查点抑制剂可用于体外或离体以增强随后注入到患者体内的wt1特异性ctl的形成。可在供体受试者中使用一种或多种检查点抑制剂以增强之后将被转移到患者体内的wt1特异性ctl的形成。检查点抑制剂可用于接受在体外、离体或供体中制备的ctl的患者，无论体外、离体或供体是否也被施用检查点抑制剂。在后面的实施方案中，一种或多种相同或不同的检查点抑制剂可用于体外、离体或供体受试者以及患者中。
[0046]
在免疫系统中，免疫检查点调控t细胞的功能。t细胞在细胞介导的免疫中发挥核
心作用。检查点蛋白与特定配体相互作用，这些配体将信号发送到t细胞并基本上关闭或抑制t细胞的功能。癌细胞通过驱动其表面检查点蛋白的高水平表达来利用该系统，从而引起对在进入肿瘤微环境的t细胞表面上表达检查点蛋白的t细胞的控制，从而抑制抗癌免疫应答。因此，检查点蛋白的抑制将导致t细胞功能的恢复和对癌细胞的免疫应答。免疫检查点抑制剂(或检查点抑制剂)是阻断或抑制免疫检查点蛋白(即阻断或抑制检查点受体或检查点受体配体)的化合物或试剂。检查点蛋白的实例包括但不限于ctla-4、pd-l1、pd-l2、pd1、b7-h3、b7-h4、btla、hvem、tim3、gal9、lag3、vista、ido、kir、2b4(属于cd2分子家族，且在所有nk细胞和记忆cd8
+
t细胞上表达)、cd160(也称为by55)、cgen-15049、chk1和chk2激酶、a2ar和各种b-7家族配体。程序性死亡1(pd-1)是参与调控t细胞激活的分子的免疫球蛋白超家族(igsf)的成员。pd-1在1992年被鉴定为在经历细胞死亡的t细胞杂交瘤中上调的基因时，因此获得了“程序性死亡”的名称。pd-1的结构由一个igsf结构域、跨膜结构域和含有免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(itim)和免疫受体基于酪氨酸的转换基序(itsm)的细胞内结构域组成[38]。pd-1有两个结合伴侣：pd-l1(b7-h1、cd274)和pd-l2(b7-dc、cd273)。pd-l1在造血和非造血谱系中广泛表达[39,40]。其存在于t细胞、b细胞、巨噬细胞、nk细胞、dc和肥大细胞以及外周组织中[41,42]。pd-1参与代表了一种方式，通过该方式肿瘤逃逸免疫监视和清除[43]。纳武利尤单抗已被证明可阻断pd-1通路，其可在免疫活性小鼠癌症模型中显示出活性[44]。
[0047]
检查点抑制剂的非限制性实例包括小分子、肽和抗体。抗体的非限制性实例包括纳武利尤单抗(opdivo)、帕博利珠单抗(keytruda)、匹地利珠单抗(ct-011)、medi0680(amp-514)、amp-224、aunp-12、bms 936559、阿替利珠单抗(mpdl3280a)、度伐利尤单抗(medi4736)、阿维鲁单抗(msb0010718c)、bms935559(mdx-1105)、rhigm12b7、bms-986016、gsk2831781、imp321、利丽单抗(bms-986015)、iph2101(1-7f9)、吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂(nlg 9189)、nlg 919、incb024360、pf-05082566、乌洛单抗(bms-663513)和medi6469。
[0048]
纳武利尤单抗(opdivo)是一种全人源igg4单克隆抗体，其靶向激活的t和b淋巴细胞上的pd-1受体[47]。帕博利珠单抗(keytruda)是靶向pd-1的抗体的另一个非限制性实例。阻断、抑制或靶向检查点蛋白的其他化合物和试剂包括正在进行试验但尚未在市场上销售的化合物。本发明不受特定检查点抑制剂的限制。可使用的检查点抑制剂的非限制性实例列于表1中。
[0049]
表1.检查点抑制剂的实例
[0050]
[0051]
[0052][0053]
在一个实施方案中，向受试者施用两种或更多种检查点抑制剂的组合。在一个实施方案中，检查点抑制剂的组合选自上述表1中的那些。两种或更多种检查点抑制剂可以相对于彼此并且相对于一种或多种wt1肽同时或连续施用。在其他实施方案中，两种或更多种检查点抑制剂的组合靶向两种不同的检查点蛋白，例如pd-1(例如，纳武利尤单抗或其他pd-1抑制剂)和ctla-4(例如，易普利单抗或其他ctla-4抑制剂)相对于彼此并且相对于一种或多种wt1肽同时或连续地向受试者施用。在一个实施方案中，两种或更多种检查点抑制剂的组合靶向以下两种或更多种不同的检查点蛋白：ctla-4、pd-l1、pd-l2、pd1、b7-h3、b7-h4、btla、hvem、tim3、gal9、lag3、vista、kir、2b4、cd160、cgen-15049、chk1激酶、chk2激酶、a2ar和b-7家族配体。在一个实施方案中，靶向两种或更多种不同的检查点蛋白的两种或更多种检查点抑制剂的组合选自上述表1中的那些。
[0054]
可根据患者的临床表现、疾病的持续时间或病程、合并症以及临床护理的其他方面来优化检查点抑制剂的剂量水平、给药频率、给药持续时间和施用的其他方面。本发明对于本文所公开的方法的检查点抑制剂组分的特定方面没有如此限制。
[0055]
在一个实施方案中，选择纳武利尤单抗剂量和方案为3mg/kg，每2周一次，疗程为12周。在一个实施方案中，施用是静脉的。在一个实施方案中，检查点抑制剂的施用疗程与wt1疫苗的施用疗程是并行的。在一个实施方案中，检查点抑制剂的施用疗程与wt1疫苗的施用疗程是重叠的。在一个实施方案中，检查点抑制剂的施用疗程大约与wt1疫苗的施用疗程同时开始。
[0056]
在一个实施方案中，免疫治疗组合物包含200mcg的每一种肽：ymfpnapyl(seq id no:124)、rsdelvrhhnmhqrnmtkl(seq id no:1)、pgcnkryfklshlqmhsrkhtg(seq id no:2)、sgqaymfpnapylpscles(seq id no:125)、nlmnlgatl(seq id no:21)、wnlmnlgatlkgvaa(seq id no:26)和wnymnlgatlkgvaa(seq id no:205)，其与1.0ml montanide isa 51vg乳化的总体积为0.5ml组合，并且每2周皮下施用一次，共6次施用；和纳武利尤单抗，3mg/kg，每两周通过60分钟输注静脉内施用，共7次施用，与wt1免疫疗法同时开始。
[0057]
在一个实施方案中，本文公开了这样的方法：其中根据最大有益于患者的方案，将七种或更多种wt1肽的组合和任选地一种或多种检查点抑制剂各自施用至受试者。因此，一种或多种wt1肽和一种或多种检查点抑制剂不一定同时施用，或甚至在同一组合物中或各自持续相同的时间。每种wt1肽或wt1肽的组合可按照特定的方案施用，每种检查点抑制剂也可按照特定的方案施用。在一个非限制性的实施方案中，七种或更多种wt1肽的组合和一种或多种检查点抑制剂存在于同一组合物中。
[0058]
如本文所述，针对最大有益于患者受试者，优化了wt1肽或肽(单独或一起施用)和一种或多种检查点抑制剂(单独或一起施用)的剂量水平和给药方案(其包括频率和持续时间)、施用途径和施用的其他方面。当供体受试者是wt1肽或肽和检查点抑制剂或抑制剂的接受者时，也考虑这些相同的方面，以便产生wt1特异性ctl以向患者施用。
[0059]
在一个实施方案中，提供了含有至少七种wt1肽的组合和至少一种检查点抑制剂的组合物。在一个实施方案中，组合物中的wt1肽或肽属于本文公开的那些。在一个实施方案中，检查点抑制剂属于本文公开的那些。在一个实施方案中，组合物包含检查点抑制剂纳武利尤单抗、帕博利珠单抗或其组合。该组合物还可包含赋形剂、稀释剂或载体。该组合物还可包含一种或多种佐剂。
[0060]
前述实施方案提供了治疗表达wt1的癌症、降低表达wt1的癌症的发生率和诱导针对表达wt1的癌症的免疫应答的改善的方法，以及用于相同目的的组合物。下面进一步描述本发明的其他方面。
[0061]
在一个实施方案中，修饰的wt1肽具有一个或多个改变的氨基酸，在本文中称为突变的wt1肽。在一个实施方案中，突变的wt1肽包含：(a)人类白细胞抗原(hla)ii类分子的结合基序；(b)hla i类分子的结合基序，其在hla i类分子的结合基序的一个或多个锚定残基中包含点突变。在另一个实施方案中，肽的长度为11个或以上的氨基酸。在某些其他实施方案中，肽的长度为11-22、11-30、16-22或16-30个氨基酸。在另一个实施方案中，点突变在hla i类分子结合基序的1-3个锚定残基中。在另一个实施方案中，点突变在hla i类分子结合基序的1个锚定残基中。在另一个实施方案中，点突变在hla i类分子结合基序的2个锚定残基中。在另一个实施方案中，点突变在hla i类分子结合基序的1-2个锚定残基中。在另一个实施方案中，点突变在hla i类分子结合基序的2-3个锚定残基中。在另一个实施方案中，点突变在hla i类分子结合基序的1-4个锚定残基中。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0062]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗患有表达wt1的癌症的受试者的方法，该方法包括：向受试者施用至少七种wt1肽的组合和任选地至少一种检查点抑制剂，从而治疗患有表达wt1的癌症的受试者。
[0063]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种降低受试者表达wt1的癌症的发生率或其复发的方法，该方法包括：向受试者施用至少七种wt1肽的组合和任选地至少一种检查点抑制剂，从而降低受试者表达wt1的癌症或其复发的发生率。
[0064]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种诱导wt1蛋白特异性ctl的形成和增殖的方法，该方法包括：使淋巴细胞群与至少七种wt1肽的组合和任选地至少一种检查点抑制剂接触，从而诱导wt1蛋白特异性ctl的形成和增殖。
[0065]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种诱导(a)wt1蛋白特异性cd8
+
淋巴细胞；和(b)对wt1蛋白具有特异性的cd4
+
淋巴细胞的形成和增殖的方法，该方法包括：将淋巴细胞群与至少七种wt1肽的组合和任选地至少一种检查点抑制剂接触，从而诱导(a)wt1蛋白特异性cd8
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淋巴细胞；和(b)对wt1蛋白具有特异性的cd4
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淋巴细胞的形成和增殖。
[0066]
在一个实施方案中，使用上述用于治疗表达wt1的癌症、降低表达wt1的癌症的发生率或诱导wt1蛋白特异性t细胞应答的形成和增殖的方法会比若仅单独使用至少七种wt1肽的组合或单独使用检查点抑制剂的此类方法获得更大的效果。在一个实施方案中，wt1免疫治疗的施用疗程和一种或多种检查点抑制剂的施用疗程是并行的、重叠的或同时发生的，使得对疫苗的生物应答通过施用一种或多种检查点抑制剂而增强。同时施用包括一个疗程的wt1免疫治疗以诱导wt1特异性ctl，以及施用一种或多种检查点抑制剂以增强ctl对癌症的活性。在一个实施方案中，wt1疫苗的施用疗程可以在检查点抑制剂的治疗疗程开始
之前结束，只要检查点抑制剂治疗增强了由wt1免疫治疗施用所引起的ctl的有效性。在一个实施方案中，检查点抑制剂治疗的第一次施用与最后一次wt1免疫治疗施用在同一天。在一个实施方案中，wt1免疫治疗的结束和检查点抑制剂治疗的开始相隔1-7天或1-4周。
[0067]
如本文所述，一种或多种额外的wt1肽可以是wt1蛋白的天然片段或连续的氨基酸序列，或者它们可以具有一个或多个修饰的氨基酸序列以增强对肽的免疫原性或任何其他有益的特性和对表达wt1的癌症的免疫力的发展。在某些实施方案中，改变一个或多个氨基酸以增强免疫原性。在一个实施方案中，使用单独的、突变的wt1肽的方法，其包括：(a)人类白细胞抗原(hla)ii类分子的结合基序；和(b)hla i类分子的结合基序，其在hla i类分子的结合基序的一个或多个锚定残基中具有点突变。在另一个实施方案中，肽的长度为11个或更多个氨基酸。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0068]
在另一个实施方案中，“点突变”表示该片段相对于蛋白质的天然序列发生突变，从而产生hla i类分子结合基序。在另一个实施方案中，“点突变”增强了天然序列中所存在的hla i类分子结合基序的结合能力。每种可能性代表本发明的使用方法的单独的实施方案。
[0069]
在另一个实施方案中，点突变在hla i类分子结合基序的1-3个锚定残基中。在另一个实施方案中，点突变在hla i类分子结合基序的1个锚定残基中。在另一个实施方案中，点突变在hla i类分子结合基序的2个锚定残基中。在另一个实施方案中，点突变在hla i类分子结合基序的1-2个锚定残基中。在另一个实施方案中，点突变在hla i类分子结合基序的2-3个锚定残基中。在另一个实施方案中，点突变在hla i类分子结合基序的1-4个锚定残基中。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0070]
在另一个实施方案中，本发明的肽的长度为11-453个氨基酸(aa)。在另一个实施方案中，长度为12-453 aa。在另一个实施方案中，长度为13-453 aa。在另一个实施方案中，长度为14-453 aa。在另一个实施方案中，长度为15-453 aa。在另一个实施方案中，长度为16-453 aa。在另一个实施方案中，长度为17-453 aa。在另一个实施方案中，长度为18-453 aa。在另一个实施方案中，长度为19-453 aa。在另一个实施方案中，长度为20-453 aa。
[0071]
在另一个实施方案中，长度为11-449 aa。在另一个实施方案中，长度为12-449 aa。在另一个实施方案中，长度为13-449 aa。在另一个实施方案中，长度为14-449 aa。在另一个实施方案中，长度为15-449 aa。在另一个实施方案中，长度为16-449 aa。在另一个实施方案中，长度为17-449 aa。在另一个实施方案中，长度为18-449aa。在另一个实施方案中，长度为19-449 aa。在另一个实施方案中，长度为20-449 aa。
[0072]
在另一个实施方案中，长度为11-30 aa。在另一个实施方案中，长度为16-22 aa。在另一个实施方案中，长度为19 aa。在另一个实施方案中，长度为15-23 aa。在另一个实施方案中，长度为15-24 aa。在另一个实施方案中，长度为15-25 aa。在另一个实施方案中，长度为15-26 aa。在另一个实施方案中，长度为15-27 aa。在另一个实施方案中，长度为15-28 aa。在另一个实施方案中，长度为14-30 aa。在另一个实施方案中，长度为14-29 aa。在另一个实施方案中，长度为14-28 aa。在另一个实施方案中，长度为14-26 aa。在另一个实施方案中，长度为14-24 aa。在另一个实施方案中，长度为14-22 aa。在另一个实施方案中，长度为14-20 aa。在另一个实施方案中，长度为16-30 aa。在另一个实施方案中，长度为16-28 aa。在另一个实施方案中，长度为16-26 aa。在另一个实施方案中，长度为16-24 aa。在另一
个实施方案中，长度为16-22 aa。在另一个实施方案中，长度为18-30 aa。在另一个实施方案中，长度为18-28 aa。在另一个实施方案中，长度为18-26 aa。在另一个实施方案中，长度为18-24 aa。在另一个实施方案中，长度为18-22 aa。在另一个实施方案中，长度为18-20 aa。在另一个实施方案中，长度为20-30 aa。在另一个实施方案中，长度为20-28 aa。在另一个实施方案中，长度为20-26 aa。在另一个实施方案中，长度为20-24 aa。在另一个实施方案中，长度为22-30 aa。在另一个实施方案中，长度为22-28 aa。在另一个实施方案中，长度为22-26 aa。在另一个实施方案中，长度为24-30 aa。在另一个实施方案中，长度为24-28 aa。在另一个实施方案中，长度为24-26 aa。
[0073]
在另一个实施方案中，可用于本发明的方法和组合物中的肽长于与hla ii类分子结合的最小长度，在另一个实施方案中，肽的长度为约12 aa。在另一个实施方案中，增加hla ii类结合肽的长度使其能够结合多于一个hla ii类分子。在另一个实施方案中，增加长度使其能够与结合基序未知的hla ii类分子结合。在另一个实施方案中，增加长度使其能够结合hla i类分子。在另一个实施方案中，hla i类分子的结合基序是已知的。在另一个实施方案中，hla i类分子的结合基序是未知的。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0074]
上述肽的长度中的每一个代表本发明的单独的实施方案。
[0075]
hla分子(在另一个实施方案中称为主要组织相容性复合物(mhc)分子)结合肽并将它们呈递给免疫细胞。因此，在另一个实施方案中，肽的免疫原性部分由其对hla分子的亲和力决定。hla i类分子与cd8分子相互作用，cd8分子通常存在于细胞毒性t淋巴细胞(ctl)上。hla ii类分子与cd4分子相互作用，cd4分子通常存在于辅助性t淋巴细胞上。
[0076]
在另一个实施方案中，本发明的肽是免疫原性的。在另一个实施方案中，术语“免疫原性”是指刺激、引发或参与免疫应答的能力。在另一个实施方案中，引发的免疫应答是细胞介导的免疫应答。在另一个实施方案中，免疫应答是细胞介导和体液应答的组合。
[0077]
在另一个实施方案中，与hla分子-肽复合物结合的t细胞被激活并被诱导增殖和裂解表达包含该肽的蛋白质的细胞。t细胞最初通常由“专业的”抗原呈递细胞(“apc”；例如树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞)激活，此类细胞呈递促进t细胞激活的共刺激分子而非无反应性或凋亡的共刺激分子。在另一个实施方案中，应答是异变的，如本文所述，使得ctl裂解表达蛋白质的肿瘤细胞，该蛋白质具有与本发明的肽同源的aa序列，或是与用于最初刺激t细胞的肽不同的肽。
[0078]
在另一个实施方案中，t细胞与本发明的肽接触，并诱导其分化为效应t细胞和/或记忆t细胞。效应t细胞或记忆t细胞与相同的肽之间的后续接触，或者在另一个实施方案中，与本发明的异变肽之间的接触导致更快和更强烈的免疫应答。在另一个实施方案中，通过测量暴露于肽的t细胞群的增殖程度来测量此类应答。在另一个实施方案中，通过下文列举的任何方法来测量此类应答。
[0079]
在另一个实施方案中，如本文所述，受试者被暴露于肽或包含本发明的肽的组合物/细胞群，其与表达的天然蛋白质不同，其中随后，宿主免疫应答与天然蛋白质/抗原发生交叉反应。
[0080]
在另一个实施方案中，本发明的肽、组合物和疫苗刺激导致肿瘤细胞裂解的免疫应答。在所有前述实施方案中，检查点抑制剂的并行使用增强了针对肿瘤的免疫应答。
[0081]
在另一个实施方案中，本发明的肽的hla i类分子结合基序被包含在肽的hla ii类分子结合基序内。在另一个实施方案中，hla i类分子结合基序与hla ii类分子结合基序重叠。在另一个实施方案中，hla i类分子结合基序与hla ii类分子结合基序不重叠。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0082]
在另一个实施方案中，其结合基序包含在本发明的肽中的hla ii类分子是hla-dr分子。在另一个实施方案中，hla ii类分子是hla-dp分子。在另一个实施方案中，hla ii类分子是hla-dq分子。
[0083]
在另一个实施方案中，hla ii类分子是hla-drb分子。在另一个实施方案中，hla ii类分子是drb101。在另一个实施方案中，hla ii类分子是drb301。在另一个实施方案中，hla ii类分子是drb401。在另一个实施方案中，hla ii类分子是drb701。在另一个实施方案中，hla ii类分子是drb1101。在另一个实施方案中，hla ii类分子是drb1501。在另一个实施方案中，hla ii类分子是本领域已知的任何其他hla-drb分子。在另一个实施方案中，hla ii类分子是hla-dra分子。在另一个实施方案中，hla ii类分子是hla-dqa1分子。在另一个实施方案中，hla ii类分子是hla-dqb1分子。在另一个实施方案中，hla ii类分子是hla-dpa1分子。在另一个实施方案中，hla ii类分子是hla-dpb1分子。在另一个实施方案中，hla ii类分子是hla-dma分子。在另一个实施方案中，hla ii类分子是hla-dmb分子。在另一个实施方案中，hla ii类分子是hla-doa分子。在另一个实施方案中，hla ii类分子是hla-dob分子。在另一个实施方案中，hla ii类分子是本领域已知的任何其他hla ii类分子。
[0084]
在另一个实施方案中，本发明的肽结合2个不同的hla ii类分子。在另一个实施方案中，肽结合三个不同的hla ii类分子。在另一个实施方案中，肽结合四个不同的hla ii类分子。在另一个实施方案中，肽结合五个不同的hla ii类分子。在另一个实施方案中，肽结合六个不同的hla ii类分子。在另一个实施方案中，肽结合超过六个不同的hla ii类分子。
[0085]
在另一个实施方案中，与本发明的肽结合的hla ii类分子在给定的hla ii类基因座处由两个或更多个不同的等位基因编码。在另一个实施方案中，hla ii类分子在基因座处由三个不同的等位基因编码。在另一个实施方案中，hla ii类分子在基因座处由四个不同的等位基因编码。在另一个实施方案中，hla ii类分子在基因座处由五个不同的等位基因编码。在另一个实施方案中，hla ii类分子在基因座处由六个不同的等位基因编码。在另一个实施方案中，hla ii类分子在基因座处由超过六个不同的等位基因编码。
[0086]
在另一个实施方案中，与肽结合的hla ii类分子在两个不同的基因座处由hla ii类基因编码。在另一个实施方案中，hla ii类分子在2个或更多个不同的基因座处由hla ii类基因编码。在另一个实施方案中，hla ii类分子在3个不同的基因座处由hla ii类基因编码。在另一个实施方案中，hla ii类分子在3个或更多个不同的基因座处由hla ii类基因编码。在另一个实施方案中，hla ii类分子在4个不同的基因座处由hla ii类基因编码。在另一个实施方案中，hla ii类分子在4个或更多个不同的基因座处由hla ii类基因编码。在另一个实施方案中，hla ii类分子在5个不同的基因座处由hla ii类基因编码。在另一个实施方案中，hla ii类分子在5个或更多个不同的基因座处由hla ii类基因编码。在另一个实施方案中，hla ii类分子在6个不同的基因座处由hla ii类基因编码。在另一个实施方案中，hla ii类分子在6个或更多个不同的基因座处由hla ii类基因编码。在另一个实施方案中，hla ii类分子在超过6个不同的基因座处由hla ii类基因编码。每种可能性代表本发明的
单独的实施方案。
[0087]
在另一个实施方案中，本发明的肽结合2个不同的hla-drb分子。在另一个实施方案中，肽结合三个不同的hla-drb分子。在另一个实施方案中，肽结合四个不同的hla-drb分子。在另一个实施方案中，肽结合五个不同的hla-drb分子。在另一个实施方案中，肽结合六个不同的hla-drb分子。在另一个实施方案中，肽结合超过六个不同的hla-drb分子。
[0088]
在另一个实施方案中，与wt1肽结合的hla ii类分子在2个不同的基因座处由hla ii类基因编码。在另一个实施方案中，结合的hla分子在2个或更多个不同的基因座处由hla ii类基因编码。在另一个实施方案中，结合的hla分子在3个不同的基因座处由hla ii类基因编码。在另一个实施方案中，结合的hla分子在3个或更多个不同的基因座处由hla ii类基因编码。在另一个实施方案中，结合的hla分子在4个不同的基因座处由hla ii类基因编码。在另一个实施方案中，结合的hla分子在4个或更多个不同的基因座处由hla ii类基因编码。在另一个实施方案中，结合的hla分子在超过4个不同的基因座处由hla ii类基因编码。在其他实施方案中，基因座选自hla-drb基因座。在另一个实施方案中，hla ii类结合肽是hla-dra结合肽。在另一个实施方案中，肽是hla-dqa1结合肽。在另一个实施方案中，肽是hla-dqb1结合肽。在另一个实施方案中，肽是hla-dpa1结合肽。
[0089]
在另一个实施方案中，肽是hla-dpb1结合肽。在另一个实施方案中，肽是hla-dma结合肽。在另一个实施方案中，肽是hla-dmb结合肽。在另一个实施方案中，肽是hla-doa结合肽。在另一个实施方案中，肽是hla-dob结合肽。在另一个实施方案中，肽可与本领域已知的任何其他hla ii类分子结合。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0090]
在另一个实施方案中，本发明的肽与hla-drb分子结合，所述hla-drb分子由选自以下的2个不同的hla-drb等位基因编码：drb101、drb 301、drb 401、drb 701、drb 1101和drb 1501。在另一个实施方案中，肽与hla-drb分子结合，所述hla-drb分子由选自以下的3个不同的hla-drb等位基因编码：drb 101、drb 301、drb 401、drb 701、drb 1101和drb 1501的。在另一个实施方案中，肽与hla-drb分子结合，所述hla-drb分子由选自以下的4个不同的hla-drb等位基因编码：drb 101、drb 301、drb 401、drb 701、drb 1101和drb 1501。在另一个实施方案中，肽与hla-drb分子结合，所述hla-drb分子由选自以下的5个不同的hla-drb等位基因编码：drb 101、drb 301、drb 401、drb 701、drb 1101和drb 1501。在另一个实施方案中，肽与hla-drb分子结合，所述hla-drb分子由下述每个hla-drb等位基因编码：drb 101、drb 301、drb 401、drb 701、drb 1101和drb 1501。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0091]
上述hla ii类分子、类型、类别及其组合中的每一个代表本发明的单独的实施方案。
[0092]
在另一个实施方案中，其结合基序包含在本发明的肽中的hla i类分子是hla-a分子。在另一个实施方案中，hla i类分子是hla-b分子。在另一个实施方案中，hla i类分子是hla-c分子。在另一个实施方案中，hla i类分子是hla-a0201分子。在另一个实施方案中，分子是hla a1。在另一个实施方案中，hla i类分子是hla a2。在另一个实施方案中，hla i类分子是hla a2.1。在另一个实施方案中，hla i类分子是hla a3。在另一个实施方案中，hla i类分子是hla a3.2。在另一个实施方案中，hla i类分子是hla a11。在另一个实施方案中，hla i类分子是hla a24。在另一个实施方案中，hla i类分子是hla b7。在另一个实施方案
中，hla i类分子是hla b27。在另一个实施方案中，hla i类分子是hla b8。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0093]
在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的hla i类分子结合wt1肽与hla i类分子的超家族结合。在另一个实施方案中，超家族是a2超家族。在另一个实施方案中，超家族是a3超家族。在另一个实施方案中，超家族是a24超家族。在另一个实施方案中，超家族是b7超家族。在另一个实施方案中，超家族是b27超家族。在另一个实施方案中，超家族是b44超家族。在另一个实施方案中，超家族是c1超家族。在另一个实施方案中，超家族是c4超家族。在另一个实施方案中，超家族是本领域已知的任何其他超家族。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0094]
在另一个实施方案中，相对于肽的未突变对应物，本发明肽的hla i类分子结合基序对hla i类分子表现出增加的亲和力。在另一个实施方案中，点突变增加了单独的、突变的wt1肽对hla i类分子的亲和力。在另一个实施方案中，亲和力的增加是相对于单独的、未突变的wt1肽的亲和力(对于同一hla i类分子)的，单独的、突变的wt1肽衍生自单独的、未突变的wt1肽。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0095]
在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的hla i类分子结合wt肽的长度为9-13 aa。在另一个实施方案中，长度为8-13 aa。在另一个实施方案中，肽具有本文列举的本发明的肽的任何长度。
[0096]
在另一个实施方案中，hla i类分子结合wt肽的长度为8 aa。在另一个实施方案中，肽的长度为9 aa。在另一个实施方案中，肽的长度为10 aa。如本文所提供的，9-10 aa的天然和异变肽表现出与hla i类分子大量的结合以及通过ctl引起细胞因子分泌和细胞溶解的能力。
[0097]
在另一个实施方案中，嵌入本发明的wt1肽内的hla i类分子结合wt1肽具有上述长度之一。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在一个实施方案中，wt1肽是一种比hla i类分子结合wt1肽长度更长的肽。较长长度的肽被细胞降解为合适的长度，以由hla i类分子呈递。
[0098]
在另一个实施方案中，由hla i类分子结合wt1肽中所结合的hla i类分子为hla-a分子。在另一个实施方案中，hla i类分子为hla-a2分子。在另一个实施方案中，hla i类分子为hla-a3分子。在另一个实施方案中，hla i类分子为hla-a11分子。在另一个实施方案中，hla i类分子为hla-b8分子。在另一个实施方案中，hla i类分子为hla-0201分子。在另一个实施方案中，hla i类分子结合本领域已知的任何其他hla i类分子。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0099]
在另一个实施方案中，本发明的肽保留了结合多个hla ii类分子的能力，正如由单独的wt1肽所展示的，本发明的肽衍生自单独的wt1肽。
[0100]
在本文的所有方面，本文公开了一种或多种wt1肽可用于本文的疫苗或用于在体外、离体或在供体中产生ctl，选择肽或肽序列，无论是天然的还是修饰的，以匹配患者或供体的hla类型。
[0101]
在另一个实施方案中，可衍生出本发明的肽的wt1分子具有以下序列：
[0102]
mgsdvrdlnallpavpslgggggcalpvsgaaqwapvldfappgasaygslggpapppappppppppphsfikqepswggaepheeqclsaftvhfsgqftgtagacrygpfgppppsqassgqarmfpnapylpsclesqpai
rnqgystvtfdgtpsyghtpshhaaqfpnhsfkhedpmgqqgslgeqqysvpppvygchtptdsctgsqalllrtpyssdnlyqmtsqlecmtwnqmnlgatlkgvaagssssvkwtegqsnhstgyesdnhttpilcgaqyrihthgvfrgiqdvrrvpgvaptlvrsasetsekrpfmcaypgcnkryfklshlqmhsrkhtgekpyqcdfkdcerrfsrsdqlkrhqrrhtgvkpfqcktcqrkfsrsdhlkthtrthtgktsekpfscrwpscqkkfarsdelvrhhnmhqrnmtklqlal(seq id no:199；genbank登录号ay245105)。
[0103]
在另一个实施方案中，该wt1分子具有以下序列：
[0104]
aaeasaerlqgrrsrgasgsepqqmgsdvrdlnallpavpslgggggcalpvsgaaqwapvldfappgasaygslggpapppappppppppphsfikqepswggaepheeqclsaftvhfsgqftgtagacrygpfgppppsqassgqarmfpnapylpsclesqpairnqgystvtfdgtpsyghtpshhaaqfpnhsfkhedpmgqqgslgeqqysvpppvygchtptdsctgsqalllrtpyssdnlyqmtsqlecmtwnqmnlgatlkghstgyesdnhttpilcgaqyrihthgvfrgiqdvrrvpgvaptlvrsasetsekrpfmcaypgcnkryfklshlqmhsrkhtgekpyqcdfkdcerrfsrsdqlkrhqrrhtgvkpfqcktcqrkfsrsdhlkthtrthtgekpfscrwpscqkkfarsdelvrhhnmhqrnmtklqlal(seq id no:200；genbank登录号nm_000378)。
[0105]
在另一个实施方案中，该wt1分子具有以下序列：
[0106]
mqdpastcvpepasqhtlrsgpgclqqpeqqgvrdpggiwaklgaaeasaerlqgrrsrgasgsepqqmgsdvrdlnallpavpslgggggcalpvsgaaqwapvldfappgasaygslggpapppappppppppphsfikqepswggaepheeqclsaftvhfsgqftgtagacrygpfgppppsqassgqarmfpnapylpsclesqpairnqgystvtfdgtpsyghtpshhaaqfpnhsfkhedpmgqqgslgeqqysvpppvygchtptdsctgsqalllrtpyssdnlyqmtsqlecmtwnqmnlgatlkgvaagssssvkwtegqsnhstgyesdnhttpilcgaqyrihthgvfrgiqdvrrvpgvaptlvrsasetsekrpfmcaypgcnkryfklshlqmhsrkhtgekpyqcdfkdcerrfsrsdqlkrhqrrhtgvkpfqcktcqrkfsrsdhlkthtrthtgekpfscrwpscqkkfarsdelvrhhnmhqrnmtklqlal(seq id no:201；genbank登录号np_077742)。
[0107]
在另一个实施方案中，该wt1分子包含以下序列：
[0108]
mghhhhhhhhhhssghiegrhmrrvpgvaptlvrsasetsekrpfmcaypgcnkryfklshlqmhsrkhtgekpyqcdfkdcerrffrsdqlkrhqrrhtgvkpfqcktcqrkfsrsdhlkthtrthtgekpfscrwpscqkkfarsdelvrhhnmhqrnmtklqlal(seq id no:202)。
[0109]
在其他实施方案中，wt1蛋白包含以下genbank序列条目之一中列出的序列之一：nm_024426、nm_024425、nm_024424、nm_000378、s95530、d13624、d12496、d12497、ah003034或x77549。在其他实施方案中，wt1蛋白具有在上述genbank序列条目之一中列出的序列之一。在另一个实施方案中，wt1蛋白是本领域已知的任何wt1蛋白。在另一个实施方案中，wt1蛋白具有本领域已知的任何其他wt1序列。
[0110]
在另一个实施方案中，可用于本发明目的的肽衍生自wt1蛋白的片段。在另一个实施方案中，衍生过程包含在hla i类分子结合基序的锚定残基中引入点突变。在另一个实施方案中，衍生过程由在hla i类分子结合基序的锚定残基中引入点突变组成。在另一个实施方案中，本发明的肽与wt1蛋白的相应片段的不同之处仅在于hla i类分子结合基序的锚定残基中的点突变。在另一个实施方案中，本发明的肽的hla i类分子结合基序与相应的wt1序列的不同之处仅在于锚定残基中的点突变。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0111]
在另一个实施方案中，本发明的肽的衍生过程还包含一个或多个氨基酸(aa)到aa类似物的修饰。在另一个实施方案中，衍生过程还包含连接两个或更多个aa的一个或多个
肽键的修饰。在另一个实施方案中，aa类似物或肽键修饰是下面列举的aa类似物或肽键修饰之一。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0112]
在另一个实施方案中，wt1蛋白的未突变片段(本发明的肽衍生自wt1蛋白的未突变片段)(野生型序列中的“对应物”)具有序列sgqarmfpnapylpscles(seq id no:5)。在另一个实施方案中，未突变的wt1片段具有序列qarmfpnapylpscl(seq id no:6)。在另一个实施方案中，未突变的wt1片段具有序列lvrhhnmhqrnmtkl(seq id no:3)。在另一个实施方案中，未突变的wt1片段具有序列rsdelvrhhnmhqrnmtkl(seq id no:1)。在另一个实施方案中，未突变的wt1片段具有序列nkryfklshlqmhsr(seq id no:4)。在另一个实施方案中，未突变的wt1片段具有序列pgcnkryfklshlqmhsrkhtg(seq id no:2)。在另一个实施方案中，未突变的wt1片段是含有hla ii类分子结合基序的任何其他wt1片段。在另一个实施方案中，未突变的wt1片段是含有hla-dr分子结合基序的任何其他wt1片段。在另一个实施方案中，未突变的wt1片段含有多个hla-dr分子结合基序。在另一个实施方案中，未突变的wt1片段是含有hla-drb分子结合基序的任何其他wt1片段。在另一个实施方案中，未突变的wt1片段含有多个hla-drb分子结合基序。在另一个实施方案中，本发明的肽与其对应物的不同之处仅在于其含有点突变。在另一个实施方案中，本发明的肽与其对应物的不同之处仅在于hla i类锚定残基的突变。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0113]
在另一个实施方案中，本发明的肽保留了结合hla ii类分子的能力，正如由未突变的wt1片段所展示的，肽衍生自未突变的wt1片段。在另一个实施方案中，本发明的肽保留了结合多个hla ii类分子的能力，正如由未突变的wt1片段所展示的。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0114]
在另一个实施方案中，本发明提供了单独的肽，其包含aa序列gatlkgvaagssssvkwt(seq id no:203)和lkgvaagssssvkwt(seq id no:204)。
[0115]
在本发明的方法和组合物的另一个实施方案中，“肽”是指通过肽键连接亚基aa的化合物。在另一个实施方案中，肽包含aa类似物。在另一个实施方案中，肽是肽模拟物。在另一个实施方案中，本发明的肽包含以下列举的aa类似物之一。在另一个实施方案中，亚基可通过肽键连接。在另一个实施方案中，亚基可通过另一种类型的键(例如酯、醚等)连接。在另一个实施方案中，本发明的肽是以下列举的肽模拟物类型之一。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0116]
在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物中的肽以高亲和力结合其中包含结合基序的hla i类分子。在其他实施方案中，hla i类分子是本文列举的任何hla i类分子。在另一个实施方案中，肽以中等亲和力结合hla i类分子。在另一个实施方案中，肽以显著的亲和力结合hla i类分子。在另一个实施方案中，肽以可测量的亲和力结合hla i类分子。在另一个实施方案中，肽表现出与hla i类分子的稳定结合。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0117]
在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物中的肽以高亲和力结合其中包含结合基序的hla ii类分子。在其他实施方案中，hla ii类分子是本文列举的任何hla ii类分子。在另一个实施方案中，肽以高亲和力结合超过1个的hla ii类分子。在另一个实施方案中，肽以中等亲和力结合hla ii类分子。在另一个实施方案中，肽以中等亲和力结合超过1个的hla ii类分子。在另一个实施方案中，肽以显著的亲和力结合hla ii类分子。在另一个
实施方案中，肽以显著的亲和力结合超过1个的hla ii类分子。在另一个实施方案中，肽以可测量的亲和力结合hla ii类分子。在另一个实施方案中，肽以可测量的亲和力结合超过1个的hla ii类分子。在另一个实施方案中，肽表现出与hla ii类分子的稳定结合。在另一个实施方案中，肽表现出与超过1个的hla ii类分子的稳定结合。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0118]
在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物中的肽以显著的亲和力结合hla i类分子和hla ii类分子。在另一个实施方案中，肽以高亲和力结合hla i类分子和hla ii类分子。在另一个实施方案中，肽以中等亲和力结合hla i类分子和hla ii类分子。在另一个实施方案中，肽以可测量的亲和力结合hla i类分子和hla ii类分子。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0119]
在另一个实施方案中，“片段”是指长度为11个或更多个aa的肽。在另一个实施方案中，本发明的肽片段的长度为16个或更多个aa。在另一个实施方案中，该片段的长度为12个或更多个aa。在另一个实施方案中，该片段为13个或更多个aa。在另一个实施方案中，该片段为14个或更多个aa。在另一个实施方案中，该片段为15个或更多个aa。在另一个实施方案中，该片段为17个或更多个aa。在另一个实施方案中，该片段为18个或更多个aa。在另一个实施方案中，该片段为19个或更多个aa。在另一个实施方案中，该片段为22个或更多个aa。在另一个实施方案中，该片段为8-12 aa。在另一个实施方案中，该片段为约8-12 aa。在另一个实施方案中，该片段为16-19 aa。在另一个实施方案中，该片段为约16-19 aa。在另一个实施方案中，该片段为10-25 aa。在另一个实施方案中，该片段为约10-25aa。在另一个实施方案中，该片段具有任何其他长度。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0120]
在一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含：
[0121]
(a)至少七种单独的肽的组合，其由以下组成：
[0122]
ymfpnapyl(seq id no:124)，
[0123]
rsdelvrhhnmhqrnmtkl(seq id no:1)，
[0124]
pgcnkryfklshlqmhsrkhtg(seq id no:2)，
[0125]
sgqaymfpnapylpscles(seq id no:125)，
[0126]
nlmnlgatl(seq id no:21)，
[0127]
wnlmnlgatlkgvaa(seq id no:26)和
[0128]
wnymlgatlgvaa(seq id no:205)；
[0129]
(b)核酸，其编码(a)的至少七种单独的肽的组合；或
[0130]
(c)免疫细胞，其包含编码(a)的至少七种肽的组合的核酸和/或包含或呈递(a)的至少七种肽；或
[0131]
(d)细胞毒性t细胞(ctl)，其由(a)的至少七种单独的肽的组合诱导而成；或
[0132]
(e)(a)、(b)、(c)和(d)中的两种、三种或全部四种的组合。
[0133]
在一个实施方案中，组合物包含wt1肽的组合，所述组合包含以下wt1肽中的每一种：ymfpnapyl(seq id no:124；也称为wt1-a1)、rsdelvrhhnmhqrnmtkl(seq id no:1；也称为长wt1-427)、pgcnkryfklshlqmhsrkhtg(seq id no：2；也称为长wt1-331)、sgqaymfpnapylpscles(seq id no：125；也称为长wt1-122a1)、nlmlgatl(seq id no：21；也称为短nlm)、wnlmnlgatlkgvaa(seq id no:26；也称为wnlm或长nlm)和wnymnlgatlkgvaa
(seq id no:205；也称为wnym或长nym)。任选地，该组合物进一步包含至少一种额外的wt1肽。在某些实施方案中，提供了包含至少2种不同的本发明的单独的肽的组合物。在某些实施方案中，提供了包含至少3种或至少4种不同的本发明的单独的肽的组合物。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在某些实施方案中，本发明的组合物是疫苗。
[0134]
在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物中的每种肽以显著的亲和力独立地结合hla ii类分子，而衍生自原始肽的每种肽以显著的亲和力独立地结合hla i类分子，并且独立地属于每个包含该组合的肽。
[0135]
在另一个实施方案中，“亲和力”是指将标准肽与指定mhc分子的结合抑制50％所需的肽浓度。在另一个实施方案中，“高亲和力”是指这样的亲和力，该亲和力使得标准肽结合的50％抑制需要约500纳摩尔(nm)或更低浓度的肽的亲和力。在另一个实施方案中，需要约400nm或更低浓度的肽。在另一个实施方案中，结合亲和力为300nm。在另一个实施方案中，结合亲和力为200nm。在另一个实施方案中，结合亲和力为150nm。在另一个实施方案中，结合亲和力为100nm。在另一个实施方案中，结合亲和力为80nm。在另一个实施方案中，结合亲和力为60nm。在另一个实施方案中，结合亲和力为40nm。在另一个实施方案中，结合亲和力为30nm。在另一个实施方案中，结合亲和力为20nm。在另一个实施方案中，结合亲和力为15nm。在另一个实施方案中，结合亲和力为10nm。在另一个实施方案中，结合亲和力为8nm。在另一个实施方案中，结合亲和力为6nm。在另一个实施方案中，结合亲和力为4nm。在另一个实施方案中，结合亲和力为3nm。在另一个实施方案中，结合亲和力为2nm。在另一个实施方案中，结合亲和力为1.5nm。在另一个实施方案中，结合亲和力为1nm。在另一个实施方案中，结合亲和力为0.8nm。在另一个实施方案中，结合亲和力为0.6nm。在另一个实施方案中，结合亲和力为0.5nm。在另一个实施方案中，结合亲和力为0.4nm。在另一个实施方案中，结合亲和力为0.3nm。在另一个实施方案中，结合亲和力小于0.3nm。
[0136]
在另一个实施方案中，“亲和力”是指对mhc分子的结合强度的量度。在另一个实施方案中，使用本领域已知的测量竞争性结合亲和力的方法测量亲和力。在另一个实施方案中，使用本领域已知的测量相对结合亲和力的方法测量亲和力。在另一个实施方案中，该方法是竞争性结合测定法。在另一个实施方案中，该方法是放射免疫测定法或ria。在另一个实施方案中，该方法是biacore分析。在另一个实施方案中，该方法是本领域已知的任何其他方法。在另一个实施方案中，该方法产生与已知亲和力的参考肽的ic50相关的ic50。
[0137]
每种类型的亲和力和测量亲和力的方法代表本发明的单独的实施方案。
[0138]
在另一个实施方案中，“高亲和力”是指0.5-100nm的ic50。在另一个实施方案中，ic50为1-100nm。在另一个实施方案中，ic50为1.5-200nm。在另一个实施方案中，ic50为2-100nm。在另一个实施方案中，ic50为3-100nm。在另一个实施方案中，ic50为4-100nm。在另一个实施方案中，ic50为6-100nm。在另一个实施方案中，ic50为10-100nm。在另一个实施方案中，ic50为30-100nm。在另一个实施方案中，ic50为3-80nm。在另一个实施方案中，ic50为4-60nm。在另一个实施方案中，ic50为5-50nm。在另一个实施方案中，ic50为6-50nm。在另一个实施方案中，ic50为8-50nm。在另一个实施方案中，ic50为10-50nm。在另一个实施方案中，ic50为20-50nm。在另一个实施方案中，ic50为6-40nm。在另一个实施方案中，ic50为8-30nm。在另一个实施方案中，ic50为10-25nm。在另一个实施方案中，ic50为15-25nm。每个亲和力和亲和力的范围均代表本发明的单独的实施方案。
[0139]
在另一个实施方案中，“中等亲和力”是指100-500nm的ic50。在另一个实施方案中，ic50为100-300nm。在另一个实施方案中，ic50为100-200nm。在另一个实施方案中，ic50为50-100nm。在另一个实施方案中，ic50为50-80nm。在另一个实施方案中，ic50为50-60nm。每个亲和力和亲和力的范围均代表本发明的单独的实施方案。
[0140]
在另一个实施方案中，“显著亲和力”是指足以介导由携带识别mhc分子-肽复合物的t细胞受体(tcr)的t细胞识别靶细胞的亲和力。在另一个实施方案中，该术语是指足以介导由携带识别mhc分子-肽复合物的tcr的t细胞识别癌细胞的亲和力。在另一个实施方案中，该术语是指足以通过呈递肽的树突状细胞介导原始t细胞激活的亲和力。在另一个实施方案中，该术语是指足以通过呈递肽的apc介导原始t细胞激活的亲和力。在另一个实施方案中，该术语是指足以通过呈递肽的树突状细胞介导记忆t细胞再激活的亲和力。在另一个实施方案中，该术语是指足以通过呈递肽的apc介导记忆t细胞再激活的亲和力。在另一个实施方案中，该术语是指足以通过呈递肽的体细胞介导记忆t细胞再激活的亲和力。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0141]
在另一个实施方案中，“可测量的亲和力”是指足以通过免疫测定法进行测量的亲和力。在另一个实施方案中，免疫测定法是本文列举的任何测定方法。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0142]
在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物中的肽与hla分子的超家族结合。hla分子的超家族共有非常相似或相同的结合基序。在另一个实施方案中，超家族是hla i类超家族。在另一个实施方案中，超家族是hla ii类超家族。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0143]
在另一个实施方案中，术语“hla结合肽”、“hla i类分子结合肽”和“hla ii类分子结合肽”是指以可测量的亲和力结合hla分子的肽。在另一个实施方案中，该术语是指以高亲和力结合hla分子的肽。在另一个实施方案中，该术语是指以显著的亲和力结合hla分子以激活t细胞前体的肽。在另一个实施方案中，该术语是指以显著的亲和力结合hla分子以介导由t细胞识别的肽。在其他实施方案中，hla分子是本文列举的任何hla分子。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0144]
在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物中的肽是异变的。在另一个实施方案中，“异变的”是指产生免疫应答的肽，该免疫应答识别原始肽，异变肽衍生自原始肽(例如不含锚定残基突变的肽)。在另一个实施方案中，“原始肽”是指wt1蛋白的片段。例如，具有序列sgqaymfpnapylpscles(seq id no:124)的称为“wt1 122a1”的肽是通过将残基5突变为精氨酸而从野生型wt1肽sgqarmfpnapylpscles(seq id no:5)中产生的。引入cd8
+
wt1肽rmfpnapyl(seq id no:7)肽的异变突变产生ymfpnapyl(seq id no:124)，wt1a1肽。在另一个实施方案中，“异变的”是指产生识别原始肽的免疫应答的肽，异变肽衍生自原始肽，其中通过接种异变肽产生的免疫应答大于通过接种原始肽产生的免疫应答。在另一个实施方案中，“异变的”免疫应答是指识别原始肽的免疫应答，改善的肽衍生自原始肽(例如不含锚定残基突变的肽)。在另一个实施方案中，“异变的”免疫应答是指识别原始肽的免疫应答，异变肽衍生自原始肽，其中通过接种异变肽产生的免疫应答大于通过接种原始肽产生的免疫应答。在另一个实施方案中，通过用异变肽接种所产生的免疫应答的强度大于免疫应答，该免疫应答基本上相等于用原始肽接种所产生的应答。在另一个实施方案中，通过用异变
肽接种所产生的免疫应答的强度大于免疫应答，该免疫应答小于用原始肽接种所产生的应答。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0145]
在另一个实施方案中，相对于wt1肽(“天然肽”)，异变肽衍生自wt1肽，本发明的异变肽诱导的免疫应答增加了至少2倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加了3倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加了5倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加了7倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加了10倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加了15倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加了20倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加了30倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加了50倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加了100倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加了150倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加了200倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加了300倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加了500倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加了1000倍。在另一个实施方案中，相对于天然肽增加了超过1000倍。每种可能性代表本发明的单独的实施方案，并且独立地属于组合中的每种异变肽和从其衍生的天然肽。
[0146]
在另一个实施方案中，本发明的异变肽是hla i类异变肽。在另一个实施方案中，本发明的异变肽是hla ii类异变肽。在另一个实施方案中，本发明的ii类异变肽在ii类结合残基中发生突变。在另一个实施方案中，以类似于鉴定和测试hla i类异变肽的方式来鉴定和测试本发明的ii类异变肽，如本文所示例的。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0147]
在另一个实施方案中，“锚定基序”或“锚定残基”是指hla结合序列中特定位置的一个或一组优选的残基。例如，将1、2、3、6和9位的残基用作锚定残基。在另一个实施方案中，hla结合序列是hla ii类结合序列。在另一个实施方案中，hla结合序列是hla i类结合序列。在另一个实施方案中，对应于锚定基序的位置是在结合hla分子中起重要作用的那些位置。在另一个实施方案中，锚定残基是一级锚定基序。在另一个实施方案中，锚定残基是二级锚定基序。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0148]
在另一个实施方案中，“锚定残基”是hla i类结合基序的第1、3、6和9位上的残基。在另一个实施方案中，该术语是指hla i类结合基序的第1、2、6和9位。在另一个实施方案中，该术语是指hla i类结合基序的第1、6和9位。在另一个实施方案中，该术语是指hla i类结合基序的第1、2和9位。在另一个实施方案中，该术语是指hla i类结合基序的第1、3和9位。在另一个实施方案中，该术语是指hla i类结合基序的第2和9位。在另一个实施方案中，该术语是指hla i类结合基序的第6和9位。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0149]
鉴定mhc ii类表位的方法是本领域众所周知的。在另一个实施方案中，使用tepitope(meister ge,roberts cg等人,vaccine 1995 13:581-91)预测mhc ii类表位。在另一个实施方案中，使用epimatrix(de groot as,jesdale bm等人,aids res hum retroviruses 1997 13:529-31)鉴定mhc ii类表位。在另一个实施方案中，使用预测方法(yu k,petrovsky n等人,mol med.2002 8:137-48)鉴定mhc ii类表位。在另一个实施方案中，使用syfpeithi表位预测算法鉴定mhc ii类表位。syfpeithi是一个数据库，该数据库包含4500多个已知可结合i类和ii类mhc分子的肽序列。syfpeithi根据沿着mhc结合沟(groove)的某些位置上某些氨基酸的存在情况提供评分。理想氨基酸锚定值为10分，异常锚定值为6-8分，辅助锚定值为4-6分，优选的残基值为1-4分；具有负面影响的氨基酸的结
合评分介于-1和-3之间。hla-a*0201的最高分为36。
[0150]
在另一个实施方案中，使用rankpep鉴定mhc ii类表位。rankpep使用位置特定性得分矩阵(pssm)或来自已知与给定mhc分子结合的对齐肽组的配置文件(profile)作为mhc肽结合的预测因子。rankpep包括肽的得分以及预测肽相对于产生最大得分的共有序列的最佳百分比或百分位得分的信息，以及选定的配置文件。rankpep包括102和80个pssm的选项，分别用于预测肽与mhc i和mhc ii分子的结合。对于每个mhc i分子，通常有几种pssm可用于预测不同大小的肽结合物。
[0151]
在另一个实施方案中，使用svmhc(donnes p,elofsson a.prediction of mhc class i binding peptides,using svmhc.bmc bioinformatics.2002sep11；3:25)鉴定mhc ii类表位。在另一个实施方案中，使用本领域已知的任何其他方法鉴定mhc ii类表位。在另一个实施方案中，利用上述方法鉴定mhc ii类结合，该mhc ii类结合通过将mhc i类锚定残基突变引入到wt1序列将被干扰。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0152]
鉴定mhc i类表位的方法是本领域众所周知的。在另一个实施方案中，使用bimas软件预测mhc i类表位。bimas得分基于mhc-i/β
2-微球蛋白/肽复合物的理论半衰期来计算，这是肽结合亲和力的量度。该程序使用有关长度为8-10个氨基酸的hla-i肽的信息。肽与mhc的结合亲和力越高，该肽代表表位的可能性就越大。bimas算法假定肽中的每个氨基酸都独立地有助于与i类分子的结合。对结合至关重要的优势锚定残基在表中的系数显著高于1。不利氨基酸的正系数小于1。如果不知道氨基酸是有利的有助于结合还是不利的有助于结合，则将其赋值为1。将所有分配给氨基酸的数值相乘得到运行分数，再将运行分数乘以一个常数得到解离半衰期的估计值。
[0153]
在另一个实施方案中，使用syfpeithi鉴定mhc i类表位。在另一个实施方案中，使用svmhc(donnes p,elofsson a.prediction of mhc class i binding peptides,using svmhc.bmc bioinformatics.2002 sep 11；3:25)鉴定mhc i类表位。在另一个实施方案中，使用netmhc-2.0(sensitive quantitative predictions of peptide-mhc binding by a'query by committee'artificial neural network approach.buus s,lauemoller sl,worning p,kesmir c,frimurer t,corbet s,fomsgaard a,hilden j,holm a,brunak s.tissue antigens.,62:378-84,2003)鉴定mhc i类表位。在另一个实施方案中，使用本领域已知的任何其他方法鉴定mhc i类表位。在另一个实施方案中，利用上述方法鉴定mhc i类表位，该mhc i类表位可通过将锚定残基突变引入到wt1序列而产生。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0154]
在另一个实施方案中，增强mhc结合的突变位于hla i类结合基序的第1位残基处。在另一个实施方案中，残基变为酪氨酸。在另一个实施方案中，残基变为甘氨酸。在另一个实施方案中，残基变为苏氨酸。在另一个实施方案中，残基变为苯丙氨酸。在另一个实施方案中，残基变为本领域已知的任何其他残基。在另一个实施方案中，第1位的置换(例如置换为酪氨酸)稳定了第2位锚定残基的结合。
[0155]
在另一个实施方案中，突变位于hla i类结合基序的第2位。在另一个实施方案中，残基变为亮氨酸。在另一个实施方案中，残基变为缬氨酸。在另一个实施方案中，残基变为异亮氨酸。在另一个实施方案中，残基变为甲硫氨酸。在另一个实施方案中，残基变为本领域已知的任何其他残基。
[0156]
在另一个实施方案中，突变位于hla i类结合基序的第6位。在另一个实施方案中，残基变为缬氨酸。在另一个实施方案中，残基变为半胱氨酸。在另一个实施方案中，残基变为谷氨酰胺。在另一个实施方案中，残基变为组氨酸。在另一个实施方案中，残基变为本领域已知的任何其他残基。
[0157]
在另一个实施方案中，突变位于hla i类结合基序的第9位。在另一个实施方案中，突变改变其c端位置处的残基。在另一个实施方案中，残基变为缬氨酸。在另一个实施方案中，残基变为苏氨酸。在另一个实施方案中，残基变为异亮氨酸。在另一个实施方案中，残基变为亮氨酸。在另一个实施方案中，残基变为丙氨酸。在另一个实施方案中，残基变为半胱氨酸。在另一个实施方案中，残基变为本领域已知的任何其他残基。
[0158]
在另一个实施方案中，点突变在一级锚定残基中。在另一个实施方案中，hla i类一级锚定残基是第2和9位。在另一个实施方案中，点突变在二级锚定残基中。在另一个实施方案中，hla i类二级锚定残基是第1和8位。在另一个实施方案中，hla i类二级锚定残基是第1、3、6、7和8位。在另一个实施方案中，点突变的位置选自第4、5和8位。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0159]
在另一个实施方案中，点突变在选自hla i类结合基序残基的第1、2、8和9位的位置中的1个或多个残基中。在另一个实施方案中，点突变在选自第1、3、6和9位的位置中的1个或多个残基中。在另一个实施方案中，点突变在选自第1、2、6和9位的位置中的1个或多个残基中。在另一个实施方案中，点突变在选自第1、6和9位的位置中的1个或多个残基中。在另一个实施方案中，点突变在选自第1、2和9位的位置中的1个或多个残基中。在另一个实施方案中，点突变在选自第1、3和9位的位置中的1个或多个残基中。在另一个实施方案中，点突变在选自第2和9位的位置中的1个或多个残基中。在另一个实施方案中，点突变在选自第6和9位的位置中的1个或多个残基中。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在另一个实施方案中，突变位于hla i类结合基序的第4位。在另一个实施方案中，突变位于hla i类结合基序的第5位。在另一个实施方案中，突变位于hla i类结合基序的第7位。在另一个实施方案中，突变位于hla i类结合基序的第8位。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0160]
上述每一个锚定残基和置换均代表本发明的单独的实施方案。
[0161]
在另一个实施方案中，本发明的肽中的hla ii类结合位点通过hla ii类基序锚定残基的突变而产生或改善。在另一个实施方案中，被修饰的锚定残基位于p1位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于p2位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于p6位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于p9位置。在另一个实施方案中，锚定残基选自p1、p2、p6和p9位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于p3位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于p4位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于p5位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于p6位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于p8位置。在另一个实施方案中，锚定残基在p10位置。在另一个实施方案中，锚定残基在p11位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于p12位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于p13位置。在另一个实施方案中，锚定残基位于本领域已知的hla ii类分子的任何其他锚定残基处。在另一个实施方案中，p1、p2、p6和p9以外的残基用作二级锚定残基；因此，突变他们可改善hla ii类结合。在另一个实施方案中，上述残基的任何组合被突变。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0162]
在另一个实施方案中，本发明提供了在受试者中诱导表达抗wt1的癌症的免疫应
答的方法，该方法包括向受试者施用本文公开的免疫治疗组合物的步骤，任选地与至少一种检查点抑制剂一起施用，从而在受试者中诱导表达抗wt1的癌症的免疫应答。
[0163]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗患有表达wt1的癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用本文公开的免疫治疗组合物的步骤，任选地与至少一种检查点抑制剂一起施用，从而治疗患有表达wt1的癌症的受试者。
[0164]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种降低受试者表达wt1的癌症或其复发的发生率的方法，该方法包括向受试者施用本文公开的免疫治疗组合物的步骤，任选地与至少一种检查点抑制剂一起施用，从而降低受试者表达wt1的癌症或其复发的发生率。
[0165]
当提及任何蛋白或肽时，在另一个实施方案中，术语“同源性”、“同源的”等是指候选序列中与相应的天然多肽的残基相同的aa残基的百分比，在比对序列并引入空位之后，如有必要，以实现最大同源性百分比并且不考虑任何保守替换作为序列同一性的一部分。用于比对的方法和计算机程序是本领域众所周知的。
[0166]
在另一个实施方案中，当提及任何核酸序列时，术语“同源性”类似地表示候选序列中与相应的天然核酸序列的核苷酸相同的核苷酸的百分比。
[0167]
在另一个实施方案中，同源性是通过用于序列比对的计算机算法、通过本领域中充分记载的方法来确定的。在其他实施方案中，核酸序列同源性的计算机算法分析包括利用任何数量的可用软件包，例如blast、domain、beauty(blast增强的比对实用程序(enhanced alignment utility))、genpept和trembl软件包。
[0168]
两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置数的函数(即，同一性％＝相同位置数#/位置的总数#
×
100)，同时考虑到空位数和每个空位的长度，其需要被引入以实现两个序列的最佳比对。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可使用序列分析软件中的数学算法来完成。蛋白质分析软件使用分配给各种置换、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸置换)的相似性的量度来匹配相似序列。
[0169]
可通过以下方法确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，例如，使用needleman和wunsch(j.mol.biol.48:444-453(1970))算法，该算法已被并入gcg软件包中的gap程序(可在www.gcg.com上获得)，使用blossum 62矩阵或pam250矩阵，并且空位权重为16、14、12、10、8、6或4，和长度权重为1、2、3，4、5或6。也可使用fasta比较多肽序列，应使用默认或推荐的参数。gcg 6.1版中的程序，fasta(例如，fasta2和fasta3)提供查询和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(pearson,methods enzymol.1990年；183:第63-98页；pearson,methods mol.biol.2000；132:185-219)。两个氨基酸序列之间的同一性百分比也可使用e.meyers和w.miller的算法(comput.appl.biosci.,1988；11-17)来确定，该算法已并入align程序(2.0版)，使用pam120权重残差表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。
[0170]
将序列与包含于数据库中的其他序列进行比较的另一种算法是计算机程序blast，尤其是blastp，使用默认参数。参见，例如altschul等人,j.mol.biol.1990年；215:403-410；altschul等人,nucleic acids res.1997年；25:3389-402(1997年)；均以引用方式并入本文。本发明的蛋白质序列可用作“查询序列”以对公共数据库执行搜索，例如，识别相关序列。可以使用altschul等人，1990年(同上)中的xblast程序(2.0版)来执行此类搜索。blast蛋白质可用xblast程序、分数＝50、字长＝3进行搜索，以获得与本发明的wt1肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可利用如altschul等人，1997年(同
上)中所记载的gapped blast。当利用blast和gapped blast程序时，可使用相应程序(例如xblast和nblast)的默认参数。
[0171]
在另一个实施方案中，关于同源序列的“同源性”是指与本文所公开的序列的同一性百分比大于70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0172]
在另一个实施方案中，本发明提供了包含一种或多种wt1递送剂(以递送至少七种wt1肽的组合或由至少七种wt1肽诱导的ctl)和至少一种检查点抑制剂的组合物。在另一个实施方案中，该组合物进一步包含药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，该组合物进一步包含佐剂。在另一个实施方案中，该组合物包含2种或更多种本发明的肽。在另一个实施方案中，该组合物进一步包含本文下文列出的任何添加剂、化合物或赋形剂。在另一个实施方案中，佐剂是明矾盐或其他矿物佐剂、细菌制品或细菌衍生的佐剂、表面活性剂(例如皂苷)、水包油(o/w)或油包水(w/o)乳剂、脂质体佐剂、细胞因子(例如il-2、gm-csf、il-12和ifn-γ)或α-半乳糖神经酰胺类似物。在另一个实施方案中，佐剂是qs21、弗氏完全或不完全佐剂、磷酸铝、氢氧化铝、bcg或明矾。在其他实施方案中，载体是本文列举的任何载体。在其他实施方案中，佐剂是本文列举的任何佐剂。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0173]
在另一个实施方案中，本发明提供了包含一种或多种wt1递送剂(以递送至少七种wt1肽的组合或ctl)和至少一种检查点抑制剂的疫苗。在另一个实施方案中，该疫苗进一步包含载体。在另一个实施方案中，该疫苗进一步包含佐剂。在另一个实施方案中，该疫苗进一步包含载体和佐剂的组合。在另一个实施方案中，该疫苗进一步包含apc。在另一个实施方案中，该疫苗进一步包含apc和载体或佐剂的组合。在另一个实施方案中，该疫苗是基于细胞的组合物。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0174]
在另一个实施方案中，本发明提供了包含本发明的肽和至少一种检查点抑制剂的免疫原性组合物。在另一个实施方案中，该免疫原性组合物进一步包含载体。在另一个实施方案中，该免疫原性组合物进一步包含佐剂。在另一个实施方案中，该免疫原性组合物进一步包含载体和佐剂的组合。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0175]
在另一个实施方案中，术语“疫苗”是指一种材料或组合物，当其被引入到受试者体内时，其提供针对特定疾病、病症或相同症状的预防或治疗的应答。在另一个实施方案中，本发明包含基于肽的疫苗，其中所述肽包含本文所列的任何实施方案，任选地进一步包含免疫调节化合物，例如细胞因子、佐剂等。
[0176]
在其他实施方案中，本发明的方法和组合物的组合物或疫苗还包含佐剂。在另一个实施方案中，佐剂是montanide isa 51。montanide isa 51含有天然可代谢油和精制乳化剂。在另一个实施方案中，佐剂是gm-csf。在另一个实施方案中，佐剂是钥孔血蓝蛋白(klh)，其可与肽抗原缀合或可与肽一起施用。在另一个实施方案中，重组gm-csf是在酵母(酿酒酵母(s.cerevisiae))载体中生长的人蛋白。gm-csf促进造血祖细胞、apc、树突状细胞和t细胞的克隆扩增和分化。
[0177]
在另一个实施方案中，佐剂是细胞因子。在另一个实施方案中，佐剂是生长因子。在另一个实施方案中，佐剂是细胞群。在另一个实施方案中，佐剂是qs21。在另一个实施方
案中，佐剂是弗氏不完全佐剂。在另一个实施方案中，佐剂是磷酸铝。在另一个实施方案中，佐剂是氢氧化铝。在另一个实施方案中，佐剂是bcg。在另一个实施方案中，佐剂是明矾。在另一个实施方案中，佐剂是白介素。在另一个实施方案中，佐剂是趋化因子。在另一个实施方案中，佐剂是本领域已知的任何其他类型的佐剂。在另一个实施方案中，wt1疫苗包含上述佐剂中的两种。在另一个实施方案中，wt1疫苗包含超过两种的上述佐剂。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0178]
在另一个实施方案中，在本发明方法中使用的wt1疫苗可以是编码本发明的一种或多种wt1肽的一种或多种核酸分子(dna或rna)。在该实施方案的实施中，向患者施用包含编码一种或多种wt1肽的核酸分子的疫苗(核酸疫苗)，并向患者施用一种或多种检查点抑制剂。在本发明的所有其他实施方案中，可使用核酸疫苗代替肽疫苗。核酸可作为病毒载体的一部分单独引入，或可能作为质粒将其引入至细胞内部或将其整合到细胞的核酸中。细胞载体可以是从患者体内取出的患者细胞，或来自供体或细胞系的细胞。细胞可以是抗原呈递细胞，例如树突状细胞或单核细胞/巨噬细胞谱系细胞。细胞载体选自细胞，例如自体细胞、同种异体细胞、细胞系、树突状细胞或抗原呈递细胞，或将上述任何细胞融合成的杂交细胞。
[0179]
本文所述的wt1肽或编码其的核酸，或任何形式的其载体可在离体或体内暴露于ctl。如果在体外或离体，该细胞可生长或扩增，然后将其引入到患者体内。
[0180]
如本文可互换使用的，术语“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”包括单链或双链形式的多于一个核苷酸的rna、dna或rna/dna杂合序列。该术语包括“修饰的核苷酸”，其包含至少一种修饰，例如包括但不限于：(a)可替代的连接基团，(b)嘌呤的类似形式，(c)嘧啶的类似形式，或(d)糖的类似物。对于类似连接基团、嘌呤、嘧啶和糖的实例，参见例如pct公开号wo 95/04064。本发明的核酸序列可通过任何已知的方法制备，包括合成、重组、离体产生或其组合，以及利用本领域已知的任何纯化方法。如本文所使用的，术语“核酸疫苗”包括dna疫苗和rna疫苗，以及包含病毒或非病毒载体的疫苗。
[0181]
在另一个实施方案中，本发明的用途提供了包含核酸分子(dna或rna)的载体。在其他实施方案中，用于实施的本发明的组合物或疫苗可包含本发明的wt1肽的任何实施方案及其组合。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0182]
在另一个实施方案中，用于实施的本发明的疫苗或本发明的组合物包含源自同一wt1片段的两种肽，每种肽含有不同的hla i类异变肽。在另一个实施方案中，两种hla i类异变肽在不同的hla i类分子锚定残基中含有突变。在另一个实施方案中，两种hla i类异变肽在同一锚定残基中含有不同的突变。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0183]
在另一个实施方案中，用于本发明的组合物中的肽结合两种不同的hla ii类分子。在另一个实施方案中，该肽结合三种不同的hla ii类分子。在另一个实施方案中，该肽结合四种不同的hla ii类分子。在另一个实施方案中，该肽结合五个不同的hla ii类分子。在另一个实施方案中，该肽结合超过五种不同的hla ii类分子。在另一个实施方案中，组合物中的肽结合相同的hla ii类分子。
[0184]
在另一个实施方案中，本发明的组合物或使用方法中的每种肽结合一组hla ii类分子。在另一个实施方案中，每种肽结合一组不同的hla ii类分子。在另一个实施方案中，组合物中的肽结合相同组的hla ii类分子。在另一个实施方案中，两种肽结合一组不同但
重叠的hla ii类分子。在另一个实施方案中，两种或更多种肽结合相同组的hla ii类分子，而另一种肽结合不同组。在另一个实施方案中，两种或更多种肽结合一组重叠的hla ii类分子，而另一种肽结合不同组。
[0185]
在另一个实施方案中，用于实施本发明或本发明的组合物中的肽结合两种不同的hla i类分子。在另一个实施方案中，该肽结合三种不同的hla i类分子。在另一个实施方案中，该肽结合四种不同的hla i类分子。在另一个实施方案中，该肽结合五种不同的hla i类分子。在另一个实施方案中，该肽结合超过五种不同的hla i类分子。在另一个实施方案中，组合物中的肽结合相同的hla i类分子。
[0186]
在另一个实施方案中，用于实施本发明或本发明的组合物中的每种肽结合一组hla i类分子。在另一个实施方案中，每种肽结合一组不同的hla i类分子。在另一个实施方案中，组合物中的肽结合相同组的hla i类分子。在另一个实施方案中，两种肽结合一组不同但重叠的hla i类分子。在另一个实施方案中，两种或更多种肽结合相同组的hla i类分子，而另一种肽结合不同组。在另一个实施方案中，两种或更多种肽结合一组重叠的hla i类分子，而另一种肽结合不同组。
[0187]
在另一个实施方案中，“一组hla ii类分子”或“一组hla i类分子”是指由特定基因座处的不同等位基因编码的hla分子。在另一个实施方案中，该术语是指具有特定结合特异性的hla分子。在另一个实施方案中，该术语是指具有特定肽共有序列的hla分子。在另一个实施方案中，该术语是指hla ii类分子的超家族。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0188]
上述每种组合物和组合物类型代表本发明的单独的实施方案。
[0189]
本文描述的关于本发明的肽、核酸、组合物和疫苗的任何实施方案可用于本发明的任何方法中。肽、核酸、组合物或疫苗与方法的每种组合代表其单独的实施方案。
[0190]
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有表达wt1的癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的wt1免疫治疗组合物，和任选地检查点抑制剂，从而治疗患有表达wt1的癌症的受试者。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有表达wt1的癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用本发明的组合物，该组合物包含至少用于递送至少七种wt1肽的组合的wt1递送剂，或由至少七种肽诱导的ctl，和任选地至少一种检查点抑制剂，从而治疗患有表达wt1的癌症的受试者。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有表达wt1的癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用免疫原性组合物(例如疫苗)，和任选地检查点抑制剂，从而治疗患有表达wt1的癌症的受试者。
[0191]
在另一个实施方案中，本发明提供了抑制或阻止受试者中表达wt1的癌症的进展的方法，该方法包括向受试者施用一种或多种wt1递送剂以递送至少七种wt1肽的组合或由至少七种wt1肽诱导的ctl，和任选地至少一种检查点抑制剂，从而抑制或阻止表达wt1的癌症的进展。在另一个实施方案中，本发明提供了抑制或阻止受试者中表达wt1的癌症的进展的方法，该方法包括向受试者施用组合物，该组合物包含至少七种wt1肽的组合，和任选地至少一种检查点抑制剂，从而抑制或阻止表达wt1的癌症的进展。在另一个实施方案中，本发明提供了抑制或阻止受试者中表达wt1的癌症的进展的方法，该方法包括向受试者施用免疫原性组合物(例如本发明的免疫治疗组合物)，该免疫原性组合物包含至少七种wt1肽的组合，和任选地至少一种检查点抑制剂，从而抑制或阻止表达wt1的癌症的进展。
[0192]
在另一个实施方案中，本发明提供了降低受试者中表达wt1的癌症的发生率的方法，该方法包括向受试者施用一种或多种wt1递送剂以递送至少七种wt1肽的组合或由至少七种肽诱导的ctl，和任选地至少一种检查点抑制剂，从而降低受试者中表达wt1的癌症的发生率。在另一个实施方案中，本发明提供了降低受试者中表达wt1的癌症的发生率的方法，该方法包括向受试者施用本发明的组合物，该组合物包含一种或多种wt1递送剂以递送至少七种wt1肽的组合或由至少七种肽诱导的ctl，和任选地至少一种检查点抑制剂，从而降低受试者中表达wt1的癌症的发生率。在另一个实施方案中，本发明提供了降低受试者中表达wt1的癌症的发生率的方法，该方法包括向受试者施用本发明的组合物，该组合物包含至少七种wt1肽的组合，和任选地至少一种检查点抑制剂，从而降低受试者中表达wt1的癌症的发生率。
[0193]
在另一个实施方案中，本发明提供了降低受试者中表达wt1的癌症的复发率的方法，该方法包括向受试者施用组合物，该组合物包含一种或多种wt1递送剂以递送至少七种wt1肽的组合或由至少七种wt1肽诱导的ctl，和任选地至少一种检查点抑制剂，从而降低受试者中表达wt1的癌症的复发率。在另一个实施方案中，本发明提供了降低受试者中表达wt1的癌症的复发率的方法，该方法包括向受试者施用本发明的组合物，该组合物包含至少七种wt1肽的组合，和任选地至少一种检查点抑制剂，从而降低受试者中表达wt1的癌症的复发率。
[0194]
在另一个实施方案中，本发明提供了克服受试者对表达wt1的癌症的t细胞耐受性的方法，该方法包括向受试者施用一种或多种wt1递送剂以递送至少七种wt1肽的组合或由至少七种wt1肽诱导的ctl，和任选地至少一种检查点抑制剂，从而克服对表达wt1的癌症的t细胞耐受性。在另一个实施方案中，本发明提供了克服受试者对表达wt1的癌症的t细胞耐受性的方法，该方法包括向受试者施用本发明的组合物，该组合物包含至少七种wt1肽的组合，和任选地至少一种检查点抑制剂，从而克服对表达wt1的癌症的t细胞耐受性。在另一个实施方案中，本发明提供了克服受试者对表达wt1的癌症的t细胞耐受性的方法，该方法包括向受试者施用免疫原性组合物(例如本发明的免疫治疗组合物)，该免疫原性组合物包含至少七种wt1肽的组合，和任选地至少一种检查点抑制剂，从而克服对表达wt1的癌症的t细胞耐受性。
[0195]
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有表达wt1的癌症的受试者的方法，其包括(a)通过本发明的方法在供体中诱导识别癌症的恶性细胞的人细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的形成和增殖；和(b)将人ctl输注到受试者体内，从而治疗患有癌症的受试者。在一个实施方案中，向供体施用至少七种wt1肽的组合，并且将来自所述供体的ctl输注到受试者体内，并且任选地向受试者施用检查点抑制剂，从而治疗患有癌症的受试者。在一个实施方案中，向供体施用至少七种wt1肽的组合，和任选地至少一种检查点抑制剂，并且将来自所述供体的ctl输注到受试者体内，从而治疗患有癌症的受试者。在一个实施方案中，向供体施用至少七种wt1肽的组合，和任选地至少一种检查点抑制剂，并且将来自所述供体的ctl输注到受试者体内，并且任选地向受试者施用检查点抑制剂，从而治疗患有癌症的受试者。
[0196]
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有表达wt1的癌症的受试者的方法，其包括(a)通过本发明的方法诱导识别癌症的恶性细胞的人ctl的离体形成和增殖，其中人类
免疫细胞是从供体获得的；和(b)将人ctl输注到受试者体内，从而治疗患有癌症的受试者。在一个实施方案中，在离体步骤中包括检查点抑制剂。在另一个实施方案中，向受试者施用检查点抑制剂。在另一个实施方案中，离体步骤不仅包括检查点抑制剂，而且还包括向受试者施用检查点抑制剂。
[0197]
用于离体免疫治疗的方法是本领域众所周知的，并且记载在例如davisid等人(blood dendritic cells generated with flt3 ligand and cd40ligand prime cd8+t cells efficiently in cancer patients.j immunother.2006sep-oct；29(5):499-511)和mitchell ms等人(the cytotoxic t cell response to peptide analogs of the hla-a*0201-restricted muc1 signal sequence epitope,m1.2.cancer immunol immunother.2006jul 28)。每种方法代表本发明的单独的实施方案。
[0198]
在另一个实施方案中，本发明提供了诱导wt1蛋白特异性ctl的形成和增殖的方法，该方法包括将淋巴细胞群与免疫原性组合物(例如本发明的免疫治疗组合物)，任选地至少一种检查点抑制剂一起接触，从而诱导wt1蛋白特异性ctl的形成和增殖。在另一个实施方案中，免疫原性组合物包含与本发明的肽相关的抗原呈递细胞(apc)和检查点抑制剂。在另一个实施方案中，本发明提供了诱导wt1蛋白特异性ctl的形成和增殖的方法，该方法包括将淋巴细胞群与本发明的肽或组合物以及至少一种检查点抑制剂一起接触，从而诱导wt1蛋白特异性ctl的形成和增殖。在另一个实施方案中，本发明提供了诱导wt1蛋白特异性ctl的形成和增殖的方法，该方法包括将淋巴细胞群与本发明的疫苗以及至少一种检查点抑制剂一起接触，从而诱导wt1蛋白特异性ctl的形成和增殖。在另一个实施方案中，ctl对表达wt1的细胞具有特异性。在另一个实施方案中，靶细胞是表达wt1的癌症的细胞。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0199]
在另一个实施方案中，本发明提供了在受试者中诱导wt1蛋白特异性ctl的形成和增殖的方法，该方法包括将受试者与免疫原性组合物(例如本发明的免疫治疗组合物)，任选地至少一种检查点抑制剂一起接触，从而在受试者中诱导wt1蛋白特异性ctl的形成和增殖。在另一个实施方案中，免疫原性组合物包含与本发明的至少七种wt1肽的混合物相关的apc，其与至少一种检查点抑制剂一起施用。在另一个实施方案中，本发明提供了在受试者中诱导wt1蛋白特异性ctl的形成和增殖的方法，该方法包括将受试者与至少七种wt1肽的组合以及至少一种检查点抑制剂，或本发明的组合物一起接触，从而在受试者中诱导wt1蛋白特异性ctl的形成和增殖。在另一个实施方案中，本发明提供了在受试者中诱导wt1蛋白特异性ctl的形成和增殖的方法，该方法包括将受试者与本发明的疫苗以及至少一种检查点抑制剂一起接触，从而在受试者中诱导wt1蛋白特异性ctl的形成和增殖。在另一个实施方案中，靶细胞是表达wt1的癌症的细胞。在另一个实施方案中，受试者患有表达wt1的癌症。在另一个实施方案中，ctl对表达wt1的细胞具有特异性。
[0200]
在另一个实施方案中，本发明提供了在受试者中产生异变的免疫应答的方法，其中异变的免疫应答针对表达wt1的癌症，该方法包括向受试者施用至少七种wt1肽的组合，任选地一起施用至少一种检查点抑制剂或本发明的组合物，从而产生异变的免疫应答。在另一个实施方案中，本发明提供了在受试者中产生异变的免疫应答的方法，其中异变的免疫应答针对表达wt1的癌症，该方法包括向受试者一起施用免疫原性组合物(例如本发明的疫苗)以及至少一种检查点抑制剂，从而产生异变的免疫应答。在另一个实施方案中，本发
明提供了在受试者中产生异变的免疫应答的方法，其中异变的免疫应答针对表达wt1的癌症，该方法包括向受试者一起施用本发明的疫苗以及至少一种检查点抑制剂，从而产生异变的免疫应答。
[0201]
每种方法代表本发明的单独的实施方案。
[0202]
在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是急性髓性白血病(aml)。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是慢性骨髓性白血病(cml)。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症与骨髓增生异常综合征(mds)相关。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是mds。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是非小细胞肺癌(nsclc)。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是食道鳞状细胞癌。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是急性淋巴细胞白血病(all)。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是骨或软组织肉瘤。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是肾母细胞瘤。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是白血病。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是血液学癌症。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是淋巴瘤。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是促纤维增生性小圆细胞肿瘤。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是间皮瘤。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是恶性间皮瘤。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是胃癌。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是结肠癌。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是肺癌。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是乳腺癌。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是生殖细胞肿瘤。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是恶性胸膜间皮瘤。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是多发性骨髓瘤。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是髓性白血病。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是星形细胞癌。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是胶质母细胞瘤(例如，多形性胶质母细胞瘤)。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是结直肠腺癌。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是卵巢癌(例如，浆液性癌、上皮癌或子宫内膜癌)。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是乳腺癌。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是黑色素瘤。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是头颈部鳞状细胞癌。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是胰腺导管细胞癌。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是神经母细胞瘤。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是子宫癌。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是甲状腺癌。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是肝癌。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是肾癌(例如，肾细胞癌)。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是卡波西肉瘤(kaposi’s sarcoma)。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是肉瘤。在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是任何其他癌或肉瘤。
[0203]
在另一个实施方案中，表达wt1的癌症是实体瘤。在另一个实施方案中，实体瘤与表达wt1的癌症相关。在另一个实施方案中，实体瘤与骨髓增生异常综合征(mds)相关。在另一个实施方案中，实体瘤与非小细胞肺癌(nsclc)相关。在另一个实施方案中，实体瘤与肺癌相关。在另一个实施方案中，实体瘤与乳腺癌相关。在另一个实施方案中，实体瘤与结肠直肠癌相关。在另一个实施方案中，实体瘤与前列腺癌有关。在另一个实施方案中，实体瘤与卵巢癌相关。在另一个实施方案中，实体瘤与肾癌相关。在另一个实施方案中，实体瘤与胰腺癌相关。在另一个实施方案中，实体瘤与脑癌相关。在另一个实施方案中，实体瘤与胃肠癌相关。在另一个实施方案中，实体瘤与皮肤癌相关。在另一个实施方案中，实体瘤与黑色素瘤相关。
[0204]
在另一个实施方案中，怀疑通过本发明的方法治疗的癌症或肿瘤表达wt1。在另一
个实施方案中，wt1的表达尚未通过测试实际的肿瘤样品得到证实。在另一个实施方案中，癌症或肿瘤是在许多情况下已知表达wt1的类型的癌症或肿瘤。在另一个实施方案中，该类型在大多数情况下表达wt1。
[0205]
表达wt1的癌症或肿瘤的每种类型以及怀疑表达wt1的癌症或肿瘤代表本发明的单独的实施方案。
[0206]
可使用本发明的组合物和方法治疗的癌症类型的非详尽列表提供于表2中。
[0207]
表2.癌症类型的实例
[0208]
[0209]
[0210]
[0211]
[0212][0213]
在另一个实施方案中，本发明的多种肽与至少一种检查点抑制剂一起用于刺激本发明方法中的免疫应答。
[0214]
如本文所提供的，可使用本发明的方法产生引发抗原特异性cd8
+
t细胞应答的异变肽。可鉴定引发cd4
+
t细胞对多种hla ii类分子产生应答的wt1肽。cd4
+
t细胞识别与apc上的hla ii类分子结合的肽。在另一个实施方案中，抗原特异性cd4
+
t细胞应答有助于诱导和维持cd8
+
细胞毒性t细胞(ctl)应答。
[0215]
在另一个实施方案中，由于本发明的肽具有结合hla i类和hla ii类分子的能力，因此与至少一种检查点抑制剂一起施用的本发明的肽表现出增强的引发ctl应答的能力。在另一个实施方案中，由于检查点抑制剂增加wt1特异性ctl的存活和增殖的能力，因此与至少一种检查点抑制剂一起施用的本发明的肽表现出增强的引发ctl应答的能力。在另一个实施方案中，与至少一种检查点抑制剂一起施用的本发明的疫苗具有激活或引发识别wt1抗原的cd4
+
和cd8
+
t细胞的优点。在另一个实施方案中，相对于单独激活任一群体，激活或引发cd4
+
和cd8
+
t细胞将提供协同抗wt1的免疫应答。在另一个实施方案中，由于本发明的肽具有结合多种hla ii类亚型的能力，因此本发明的肽在多种hla ii类亚型的个体中表现出增强的免疫原性。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0216]
在另一个实施方案中，活化的cd4
+
细胞通过许可树突状细胞而增强免疫，从而维持细胞毒性t细胞的活化和存活。在另一个实施方案中，活化的cd4
+
t细胞通过与肿瘤细胞直接接触或通过凋亡途径的激活来诱导肿瘤细胞死亡。例如，间皮瘤肿瘤细胞能够在hla i类和ii类分子均存在的背景下处理和呈递抗原。
[0217]
本领域技术人员将理解本文所公开的方法能设计出能够结合hla i类和hla ii类分子的其他wt1衍生的肽。该方法还能设计出结合本发明的wt1衍生的肽的免疫原性组合物和疫苗。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0218]
在另一个实施方案中，与本发明的至少一种检查点抑制剂一起施用的方法、肽、疫苗和/或免疫原性组合物具有激活或引发含有多种不同的hla ii类等位基因的wt1特异性cd4
+
t细胞的优点。在另一个实施方案中，疫苗具有在相当大比例的群体中激活或引发wt1
特异性cd4
+
t细胞的优点。在另一个实施方案中，肽在10％的群体中激活wt1特异性cd4
+
t细胞。在另一个实施方案中，肽在15％的群体中激活wt1特异性cd4
+
t细胞。在另一个实施方案中，肽在20％的群体中激活wt1特异性cd4
+
t细胞。在另一个实施方案中，肽在25％的群体中激活wt1特异性cd4
+
t细胞。在另一个实施方案中，肽在30％的群体中激活wt1特异性cd4
+
t细胞。在另一个实施方案中，肽在35％的群体中激活wt1特异性cd4
+
t细胞。在另一个实施方案中，肽在40％的群体中激活wt1特异性cd4
+
t细胞。在另一个实施方案中，肽在45％的群体中激活wt1特异性cd4
+
t细胞。在另一个实施方案中，肽在50％的群体中激活wt1特异性cd4
+
t细胞。在另一个实施方案中，肽在55％的群体中激活wt1特异性cd4
+
t细胞。在另一个实施方案中，肽在60％的群体中激活wt1特异性cd4
+
t细胞。在另一个实施方案中，肽在70％的群体中激活wt1特异性cd4
+
t细胞。在另一个实施方案中，肽在75％的群体中激活wt1特异性cd4
+
t细胞。在另一个实施方案中，肽在80％的群体中激活wt1特异性cd4
+
t细胞。在另一个实施方案中，肽在85％的群体中激活wt1特异性cd4
+
t细胞。在另一个实施方案中，肽在90％的群体中激活wt1特异性cd4
+
t细胞。在另一个实施方案中，肽在95％的群体中激活wt1特异性cd4
+
t细胞。在另一个实施方案中，肽在大于95％的群体中激活wt1特异性cd4
+
t细胞。在另一个实施方案中，疫苗在相当大比例的特定群体(例如美国白种人)中激活或引发wt1特异性cd4
+
t细胞。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0219]
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了对受试者已经产生的免疫应答的改善。在另一个实施方案中，本发明的方法包括将肽、组合物或疫苗与至少一种检查点抑制剂一起再施用一次或两次。在另一个实施方案中，肽在其组合物中、浓度或其组合是变化的。在另一个实施方案中，与至少一种检查点抑制剂一起施用的肽在受试者中提供针对目的抗原的免疫应答的启动，其中针对目的抗原的免疫应答尚未启动。在另一个实施方案中，为响应肽在apc或癌细胞上的呈递，被诱导的ctl会增殖。在其他实施方案中，提及免疫应答的调节涉及免疫系统的体液和细胞介导的分支arms)之一或两者，其分别伴随有th2和th1 t辅助性细胞的存在，或在另一个实施方案中，每个分支单独地。
[0220]
在其他实施方案中，影响肿瘤生长的方法导致(1)直接抑制肿瘤细胞分裂，或(2)免疫细胞介导的肿瘤细胞裂解，或(1)和(2)两者，这导致抑制肿瘤细胞的净扩增(net expansion)。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。与至少一种检查点抑制剂一起施用的肽或疫苗的使用增加了对肿瘤细胞分裂、免疫细胞介导的细胞裂解或前述两者的直接抑制，其抑制效果大于不使用检查点抑制剂。
[0221]
本领域普通技术人员可基于多种熟知的方法容易地确定上述两种机制中的任一种对肿瘤生长的抑制。在另一个实施方案中，通过测量一段时间内的实际肿瘤大小来确定肿瘤的抑制。在另一个实施方案中，可利用本领域技术人员熟知的方法估计肿瘤的大小(在一段时间内)来确定肿瘤的抑制。更具体而言，可利用多种放射成像方法(例如，单光子和正电子发射计算机断层扫描；一般参见"nuclear medicine in clinical oncology,"winkler,c.(ed.)springer-verilog,new york,1986)来评估肿瘤的大小。此类方法还可利用多种显像剂(包括例如常规显像剂(例如，柠檬酸镓-67))以及用于代谢物显像、受体显像或免疫学显像的专门试剂(例如，放射性标记的单克隆抗体特异性肿瘤标记物)。此外，还可利用如超声波(参见"ultrasonic differential diagnosis of tumors",kossoff和fukuda,(eds.),igaku-shoin,new york,1984)的非放射性方法来评估肿瘤的大小。
[0222]
除了上述讨论的用于确定抑制肿瘤的体内方法之外，可利用各种体外方法来确定体内肿瘤的抑制。代表性实例包括淋巴细胞介导的抗肿瘤细胞溶解活性，例如，通过
51
cr释放试验测定肿瘤依赖性淋巴细胞增殖(ioannides等人,j.immunol.146(5):1700-1707,1991)、体外生成肿瘤特异性抗体(herlyn等人,j.immunol.meth.73:157-167,1984)、细胞(例如，ctl、辅助性t细胞)或体液(例如，抗体)介导的细胞体外生长抑制(gazit等人,cancer immunol immunother 35:135-144,1992)，并且对于这些试验中的任一种，可测定细胞前体频率(vose,int.j.cancer 30:135-142(1982))以及其他测定试验。
[0223]
在另一个实施方案中，抑制肿瘤生长的方法表明，与未与本发明的至少一种检查点抑制剂一起施用的肽接触或暴露的生长相比，生长状态被缩减。可通过本领域已知的任何方式评估肿瘤细胞生长，包括但不限于测量肿瘤大小、使用3h-胸腺嘧啶核苷渗入试验确定肿瘤细胞是否增殖或对肿瘤细胞计数。在其他实施方案中，“抑制”肿瘤细胞生长是指减缓、延迟或停止肿瘤的生长，或指肿瘤的缩小。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0224]
在本发明的方法和组合物的另一个实施方案中，在施用治疗之前、施用治疗之后或在施用治疗之前和之后测量wt1的表达。在另一个实施方案中，测量wt1转录物的表达。在另一个实施方案中，测量肿瘤或癌细胞中的wt1蛋白水平。在另一个实施方案中，测量从癌细胞或肿瘤细胞脱落到循环或其他体液(例如但不限于尿液)中的wt1蛋白或肽。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0225]
在本发明的方法和组合物的另一个实施方案中，在施用治疗之前(基线)、在施用治疗之后或在施用治疗之前和之后，在肿瘤或癌细胞、或在全血、血清或血浆中测量被施用于受试者的一种或多种检查点抑制剂所靶向的检查点蛋白的表达(在转录水平或蛋白水平)。在本发明的方法和组合物的一个实施方案中，一种或多种检查点蛋白选自：ctla-4、pd-l1、pd-l2、pd1、b7-h3、b7-h4、btla、hvem、tim3、gal9、lag3、vista、kir、2b4、cd160、cgen-15049、chk 1激酶、chk2激酶、a2ar和b-7家族配体。在本发明的方法和组合物的一个实施方案中，在施用治疗之前、在施用治疗之后或在施用治疗之前和之后，测量pd1、pd2、ctla4或前述两种或更多种的组合的表达。在一个实施方案中，在原发肿瘤部位测量检查点蛋白的表达。在另一个实施方案中，癌症是转移性的并且在转移部位或原发肿瘤部位或前述两者中测量检查点蛋白的表达。
[0226]
在本发明的方法和组合物的另一个实施方案中，在施用治疗之前(基线)、在施用治疗之后或在施用治疗之前和之后，测量一种或多种以下标记物：单核细胞样髓源抑制性细胞(m-mdscs)、c反应蛋白(crp)、绝对淋巴细胞、绝对淋巴细胞和乳酸脱氢酶(ldh)。在另一个实施方案中，本文包括使用一种或多种标记物来预测或识别对检查点调制的响应。
[0227]
确定免疫应答的存在和强度的方法是本领域众所周知的。在另一个实施方案中，淋巴细胞增殖试验，其中t细胞对放射性物质(例如3h-胸腺嘧啶核苷)的摄取作为细胞增殖的功能被测量。在其他实施方案中，检测t细胞的增殖通过测量白细胞介素-2(il-2)产生、ca
2+
通量或摄取的染料(例如3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑)的增加来完成。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0228]
在另一个实施方案中，ctl刺激通过本领域技术人员已知的方式来确定，包括细胞增殖的检测、细胞因子的产生等。对t细胞在接触配体脉冲靶标时分泌的细胞因子的类型和数量的分析可作为功能活性的量度。细胞因子可通过elisa、elispot分析或荧光激活细胞
分选(facs)来测量，以确定细胞因子产生的速率和总量。(fujihashi k.等人(1993)j.immunol.meth.160:181；tanguay s.和killion j.j.(1994)lymphokine cytokine res.13:259)。
[0229]
在另一个实施方案中，ctl活性通过
51
cr释放裂解试验来确定。可将抗原特异性t细胞对肽脉冲
51
cr标记靶标的裂解与用对照肽脉冲的靶细胞进行比较。在另一个实施方案中，用本发明的肽刺激t细胞，并且在mhc的背景下可确定表达天然肽的靶细胞的裂解。在另一个实施方案中，使用裂解动力学以及固定时间点(例如，4小时)的总的靶标裂解来评估配体性能。(ware c.f.等人(1983)j immunol 131:1312)。
[0230]
确定肽对hla分子的亲和力的方法是本领域众所周知的。在另一个实施方案中，亲和力通过tap稳定试验来确定。
[0231]
在另一个实施方案中，亲和力是通过竞争性放射免疫测定法来测定。在另一个实施方案中，利用以下方案：在含有1％牛血清白蛋白(bsa；fisher chemicals,fairlawn,nj)的pbs中将靶细胞洗涤两次。将细胞以107/ml重悬于冰上，在3mg/mlβ2微球蛋白的存在下，使用柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液在0℃下剥离天然细胞表面结合的肽2分钟。在3mg/mlβ2微球蛋白和30mg/ml脱氧核糖核酸酶的存在下，将沉淀(pellet)以5
×
106细胞/ml重悬于pbs/1％bsa中，并于20℃下在存在或不存在hla特异性肽的情况下孵育200ml等分试样10分钟，然后用
125
i标记的肽于20℃下孵育30分钟。在用pbs/2％bsa洗涤两次和用pbs洗涤一次后，测定总的结合
125
i。通过比较测试肽相对于已知结合肽的升高浓度来确定相对亲和力。
[0232]
在另一个实施方案中，进行肽与活细胞(例如skly-16细胞)表面上的hla的结合的特异性分析以确认该结合是与合适的hla分子进行的并表征其限制性。在另一个实施方案中，这包括与已知相同或不同hla分子结合的过量未标记的肽竞争，并且使用表达相同或不同hla类型的靶细胞。在另一个实施方案中，在活的新鲜或0.25％多聚甲醛固定的人pbmc、白血病细胞系和ebv转化的特定hla类型的t细胞系上进行该试验。发现与特定细胞上的mhc分子结合的肽的相对亲合力通过如上所述的针对相关hla分子(例如酪氨酸酶或hbv肽序列)的具有已知高亲和力的
125
i标记肽的竞争试验来测定。
[0233]
在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物中使用的任何wt1肽包含一个或多个非经典氨基酸，例如：1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸盐(kazmierski等人(1991)j.am chem.soc.113:2275-2283)；(2s,3s)-甲基-苯丙氨酸、(2s,3r)-甲基-苯丙氨酸、(2r,3s)-甲基-苯丙氨酸和(2r,3r)-甲基-苯丙氨酸(kazmierski和hruby(1991)tetrahedron lett.32(41):5769-5772)；2-氨基四氢萘-2-羧酸(landis(1989)ph.d.thesis,university of arizona)；羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸盐(miyake等人(1984)j.takeda res.labs.43:53-76)组氨酸异喹啉羧酸(zechel等人(1991)int.j.pep.protein res.38(2):131-138)；和hic(组氨酸环脲)，(dharanipragada等人(1993)int.j.pep.protein res.42(1):68-77)和((1992)acta.cryst.,crystal struc.comm.48(iv):1239-124)。此类非经典氨基酸公开在本发明的修饰肽中。
[0234]
在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物中使用的任何肽包含一种或多种aa类似物或者肽模拟物，其在其他实施方案中诱导或促进特定二级结构。在其他实施方案中，此类肽包含以下：ll-acp(ll-3-氨基-2-丙烯酮-6-羧酸)，诱导β-转角的二肽类似物(kemp等人(1985)j.org.chem.50:5834-5838)；诱导β-折叠的类似物(kemp等人(1988)
tetrahedron lett.29:5081-5082)；诱导β-转角的类似物(kemp等人(1988)tetrahedron left.29:5057-5060)；诱导α-螺旋的类似物(kemp等人(1988)tetrahedron left.29:4935-4938)；诱导γ-转角的类似物(kemp等人(1989)j.org.chem.54:109:115)；由以下参考文献提供的类似物：nagai和sato(1985)tetrahedron left.26:647-650；和dimaio等人(1989)j.chem.soc.perkin trans.p.1687；gly-ala转角类似物(kahn等人(1989)tetrahedron lett.30:2317)；酰胺键等排体(jones等人(1988)tetrahedron left.29(31):3853-3856)；四唑(tretrazol)(zabrocki等人(1988)j.am.chem.soc.110:5875-5880)；dtc(samanen等人(1990)int.j.protein pep.res.35:501:509)；和olson等人在(1990)j.am.chem.sci.112:323-333和garvey等人在(1990)j.org.chem.55(3):936-940所教导的类似物。β转角和β凸起的构象限制模拟物以及含有它们的肽记载于1995年8月8日在kahn发布的美国专利号5,440,013中。
[0235]
在其他实施方案中，本发明的方法中使用的任何肽与各种其他分子之一缀合，如下文所述，其可通过共价或非共价连接(络合的)，其性质不同，在另一个实施方案中，视具体用途而定。在另一个实施方案中，该肽与大分子载体(例如免疫原性载体)共价或非共价络合，包括但不限于天然和合成聚合物、蛋白质、多糖、多肽(氨基酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和脂质。在另一个实施方案中，本发明的肽与底物连接。在另一个实施方案中，该肽与脂肪酸缀合，其用于引入到脂质体中(美国专利号5,837,249)。在另一个实施方案中，本发明的肽与固体支持物共价或非共价络合，其中各种固体支持物是本领域已知的。在另一个实施方案中，肽与载体、底物、脂肪酸或固体支持物的连接用于增加引发的免疫应答。
[0236]
在其他实施方案中，载体是甲状腺球蛋白、白蛋白(例如人血清白蛋白)、破伤风类毒素、聚氨基酸例如聚(赖氨酸：谷氨酸)、流感蛋白、乙型肝炎病毒核心蛋白、钥孔血蓝蛋白、白蛋白、或另一种载体蛋白或载体肽；乙型肝炎病毒重组疫苗或apc。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0237]
在另一个实施方案中，术语“氨基酸”是指天然的，或在另一个实施方案中非天然或合成的aa，并且在其他实施方案中可包括甘氨酸、d-或l旋光异构体、aa类似物、肽模拟物或其组合。
[0238]
在另一个实施方案中，术语“癌症”、“瘤”、“瘤的”或“肿瘤”可互换使用，该术语是指经历了恶性转化的细胞，其使得它们对宿主生物体是病态的。癌症可以是编号分期系统内的任何分期(例如，0期、1期、2期、3期或4期)，以及tnm分期系统中的任何分期。通过成熟的技术，特别是组织学检查，可以很容易地区分原代癌细胞(即从恶性转化部位附近获得的细胞)和非癌细胞。如本文所使用的，癌细胞的定义不仅包括原代癌细胞，还包括源自癌细胞祖先的任何细胞。这包括转移的癌细胞，以及源自癌细胞的体外培养物和细胞系。在另一个实施方案中，基于肿瘤质量可检测出肿瘤；例如，通过诸如cat扫描、磁共振成像(mri)、x射线、超声或触诊之类的步骤，并且在另一个实施方案中，通过生化或免疫学发现来鉴定，后者在其他实施例中也用于鉴定癌细胞。肿瘤可以是实体瘤或非实体瘤。
[0239]
合成肽的方法是本领域众所周知的。在另一个实施方案中，本发明的肽使用合适的固相合成法合成(参见例如steward and young,solid phase peptide synthesis,freemantle,san francisco,calif.(1968)；merrifield(1967)recent progress in hormone res 23:451)。在其他实施方案中，使用如本文所述的测定法测试这些肽的活性。
[0240]
在另一个实施方案中，本发明的肽通过标准方法或通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术来纯化，该标准方法包括层析(例如，离子交换层析、亲和层析和尺寸柱层析)、离心、差异溶解度。在另一个实施方案中，使用免疫亲和层析，由此通过将表位结合到亲和柱上来分离表位，该亲和柱包含针对该肽或本发明的相关肽产生的抗体，并固定到固定支持物上。
[0241]
在另一个实施方案中，亲和标签例如六组氨酸(invitrogen)、麦芽糖结合结构域(new england biolabs)、流感外壳(coat)序列(kolodziej等人(1991)meth.enzymol.194:508-509)、谷胱甘肽-s-转移酶或其他酶连接到本发明的肽上，以允许通过适当的亲和柱容易纯化。在其他实施方案中，还可使用诸如蛋白质水解、核磁共振和x射线晶体学的这类技术对单独的肽进行物理表征。
[0242]
在另一个实施方案中，本发明的肽是通过已知技术经体外翻译产生的，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。在另一个实施方案中，肽在翻译期间或之后被差异修饰，例如通过磷酸化、糖基化、交联、酰化、蛋白水解切割、与抗体分子、膜分子或其他配体的连接，(ferguson等人(1988)ann.rev.biochem.57:285-320)。
[0243]
在另一个实施方案中，本发明的肽进一步包含可检测的标记，其在另一个实施方案中是荧光的，或在另一个实施方案中是发光的，或在另一个实施方案中是放射性的，或在另一个实施方案中是电子致密的。在其他实施方案中，可检测的标记包含例如绿色荧光蛋白(gfp)、ds-red(红色荧光蛋白)、分泌性碱性磷酸酶(seap)、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、
32
p、
125
i、3h和
14
c、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰和伞形酮、萤光素或本领域技术人员已知的任何数量的其他此类标记。所使用的特定标记将取决于所使用的免疫测定法的类型。
[0244]
在另一个实施方案中，本发明的肽与底物连接，该底物在另一个实施方案中用作载体。在另一个实施方案中，肽与底物的连接用于增加引发的免疫应答。
[0245]
在另一个实施方案中，本发明的肽使用常规交联剂(如碳二亚胺)连接到其他分子，如本文所述。碳二亚胺的实例是1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺(cmc)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)和1-乙基-3-(4-氮阳离子-44-二甲基戊基)碳二亚胺。
[0246]
在其他实施方案中，交联剂包含溴化氰、戊二醛和琥珀酸酐。通常，可使用的任何数量的同双官能(homo-bifunctional)试剂，其包括同双官能醛、同双官能环氧化物、同双官能亚胺酸酯、同双官能n-羟基琥珀酰亚胺(n-hydroxysuccinimide)酯、同双官能马来酰亚胺、同双官能烷基卤化物、同双官能吡啶基二硫化物、同双官能芳基卤化物、同双官能酰肼、同双官能重氮衍生物和同双官能光反应化合物。在其他实施方案中，还构想了杂双官能化合物，例如具有胺反应性和巯基反应性基团的化合物、具有胺反应性和光反应性基团的化合物以及具有羰基反应性和巯基反应性基团的化合物。
[0247]
在其他实施方案中，同双官能交联剂包括：双官能n-羟基琥珀酰亚胺酯二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯和酒石酸二琥珀酰亚胺酯；双官能亚胺酯：己二酰亚胺二甲酯、庚二酰亚胺二甲酯和辛二酰亚胺二甲酯；双官能巯基反应性交联剂：1,4-二-[3'-(2'-吡啶基二硫基)丙酰氨基]丁烷、双马来酰亚胺己烷和双-n-马来酰亚胺-1,8-辛烷；双官能芳基卤化物：1,5-二氟-2,4-二硝基苯和4,4'-二氟-3,3'-二硝基苯砜；双官能
光反应剂，例如双-[b-(4-叠氮基水杨酰胺)乙基]二硫化物；双官能醛类：甲醛、丙二醛、丁二醛、戊二醛和己二醛；双官能环氧化物，例如1,4-丁二醇二缩水甘油醚；双官能酰肼：己二酸二酰肼、碳酰肼和琥珀酸二酰肼；双官能重氮化合物：邻甲苯胺、重氮化和双重氮化联苯胺；双官能烷基卤化物：n1n'-亚乙基-双(碘代乙酰胺)、n1n'-六亚甲基-双(碘代乙酰胺)、n1n'-十一亚甲基-双(碘代乙酰胺)，以及苄基卤化物和卤芥，如分别为a1a'-二碘-对二甲苯磺酸和a1a'-二碘-对二甲苯三(2-氯乙基)胺。
[0248]
在其他实施方案中，异双官能交联剂用于将肽连接至其他分子，如本文所述，包括但不限于smcc(琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯)、mbs(间马来酰亚胺苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺酯)、siab(n-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯、smpb(琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯)、gmbs(n-(γ-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯)、mpbh(4-(4-n-马来酰亚胺苯基)丁酸酰肼)、m2c2h(4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基-酰肼)、smpt(琥珀酰亚胺氧基羰基-a-甲基-a-(2-吡啶基二硫基)甲苯)和spdp(n-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯)。
[0249]
在另一个实施方案中，本发明的肽通过离子、吸附的或生物特异性相互作用被配制成单体的非共价连接物。在另一个实施方案中，在低离子强度环境下(例如在去离子水中)通过形成盐桥，可获得具有高度带正电或带负电分子的肽的络合物。在另一个实施方案中，可使用带电聚合物如聚-(l-谷氨酸)或聚-(l-赖氨酸)产生大的络合物，它们分别含有大量的负电荷和正电荷。在另一个实施方案中，肽被吸附到诸如微粒乳胶珠或其他疏水聚合物的表面上，在其他实施方案中形成有效模拟交联或化学聚合蛋白的与非共价缔合的肽-超抗原络合物。在另一个实施方案中，肽通过使用其他分子之间的生物特异性相互作用来非共价连接。例如，利用生物素对蛋白质(如亲和素或链霉亲和素或其衍生物)的强亲和力可用于形成肽络合物。根据这方面，并且在另一个实施方案中，可使用常见的生物素化试剂(例如与可用胺基团反应的d-生物素的n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs-生物素))来修饰肽以具有生物素基团。
[0250]
在另一个实施方案中，本发明的肽与载体连接。在另一个实施方案中，载体是klh。在其他实施方案中，载体是本领域已知的任何其他载体，包括例如甲状腺球蛋白、白蛋白如人血清白蛋白、破伤风类毒素、聚氨基酸如聚(赖氨酸:谷氨酸)、流感病毒、乙型肝炎病毒核心蛋白、乙型肝炎病毒重组疫苗等。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0251]
在另一个实施方案中，本发明的肽与脂质(例如p3 css)缀合。在另一个实施方案中，本发明的肽与珠缀合。
[0252]
在任何前述实施方案中，肽、交联肽、结合肽或任何其他形式的肽与至少一种检查点抑制剂一起用于本发明的方法中。
[0253]
在另一个实施方案中，除了使用至少一种检查点抑制剂之外，本发明的方法和组合物进一步包含免疫调节化合物。在其他实施方案中，免疫调节化合物是细胞因子、趋化因子或补体成分，其增强免疫系统辅助或粘附分子、它们的受体或其组合的表达。在一些实施方案中，免疫调节化合物包括白细胞介素，例如白细胞介素1至15、干扰素α、β或γ、肿瘤坏死因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、趋化因子如中性粒细胞激活蛋白(nap)、巨噬细胞趋化因子和激活因子(mcaf)、rantes、巨噬细胞炎症肽mip-1a和mip-1b、补体成分或其组合。在其他实施方
案中，免疫调节化合物刺激ox40、ox40l(gp34)、淋巴细胞趋化因子、cd40、cd40l、b7.1、b7.2、trap、icam-1、2或3、细胞因子受体或其组合的表达或增强的表达。
[0254]
在另一个实施方案中，免疫调节化合物诱导或增强参与免疫应答的共刺激分子的表达，在一些实施方案中包括。
[0255]
在一个实施方案中，根据本发明施用wt1疫苗和检查点抑制剂的患者还在第一次接种疫苗之前或当天施用gm-csf，或其组合。在一个实施方案中，患者在第一次施用疫苗前两天和当天皮下施用70mcg gm-csf。
[0256]
在另一个实施方案中，组合物包含溶剂，该溶剂包括水、分散介质、细胞培养基、等渗剂等。在另一个实施方案中，溶剂是ph值约为7.0的等渗缓冲水溶液。在另一个实施方案中，组合物包含稀释剂，例如水、磷酸盐缓冲生理盐水或生理盐水。在另一个实施方案中，组合物包含非水性溶剂，例如丙二醇、聚乙二醇和植物油。
[0257]
在另一个实施方案中，组合物被配制用于通过本领域技术人员已知的许多技术中的任一种施用。例如，本发明提供了药物组合物的肠胃外、静脉内、皮下、皮内、粘膜内、局部、口服或通过吸入施用。
[0258]
在另一个实施方案中，在包含一种或多种wt1递送剂以用于递送本发明的至少七种wt1肽的组合或由至少七种wt1肽诱导的ctl的疫苗的用途中，疫苗可进一步包含细胞群，在另一个实施方案中，疫苗可包含淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、内皮细胞、干细胞或其组合，在另一个实施方案中，它们彼此是自体的、同基因的或同种异体的。在另一个实施方案中，细胞群包含本发明的肽。在另一个实施方案中，细胞群摄取肽。在一个实施方案中，细胞是抗原呈递细胞(apc)。在进一步的实施方案中，apc是专业的apc。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0259]
在另一个实施方案中，本发明的细胞群获自体内来源，例如外周血、白细胞去除术血液制品、单采血制品、外周淋巴结、肠道相关淋巴组织、脾脏、胸腺、脐带血、肠系膜淋巴结、肝脏、免疫损伤部位，例如滑液、胰腺、脑脊液、肿瘤样品、肉芽肿组织或可以获得此类细胞的任何其他来源。在另一个实施方案中，细胞群获自人类来源，在其他实施方案中，人类来源来自人类胎儿、新生儿、儿童或成人来源。在另一个实施方案中，本发明的细胞群获自动物来源，例如猪或猿，或任何其他目的动物。在另一个实施方案中，本发明的细胞群获自正常的受试者，或者在另一个实施方案中，细胞群获自患病的受试者，或者在另一个实施方案中，细胞群获自易患目的疾病的受试者。
[0260]
在另一个实施方案中，本发明的细胞群通过基于亲和力的分离方法进行分离。在其他实施方案中，亲和分离技术包括磁分离、使用抗体包被的磁珠、亲和层析、与单克隆抗体结合或与单克隆抗体结合使用的细胞毒剂(例如补体和细胞毒素)，以及用附着在固体基质(例如平板)上的抗体“淘选(panning)”，或任何其他方便的技术。在其他实施方案中，分离技术包括使用荧光激活细胞分选器，其可以具有不同程度的复杂性，例如多色通道、低角度和钝光散射检测通道、阻抗通道等。在其他实施方案中，可采用能够分离本发明的细胞群的任何技术，并且将其视为本发明的一部分。
[0261]
在另一个实施方案中，树突状细胞来自在各种淋巴组织和非淋巴组织中存在的形态相似细胞类型的多样化群体，因此在本发明中是合适的(steinman(1991)ann.rev.immunol.9:271-296)。在另一个实施方案中，本发明中所使用的树突状细胞分离
自骨髓，或在另一个实施方案中，树突状细胞来源于骨髓祖细胞，或在另一个实施方案中，树突状细胞分离自/来源于外周血，或在另一个实施方案中，树突状细胞来源于或是细胞系。
[0262]
在另一个实施方案中，本文所述的细胞群是从哺乳动物(如鼠、猿或人)的白细胞级分中分离的(参见，例如，wo 96/23060)。在另一个实施方案中，白细胞级分可以从哺乳动物的外周血中分离。
[0263]
分离树突状细胞的方法是本领域众所周知的。在另一个实施方案中，通过包括以下步骤的方法分离dc：(a)通过本领域已知的方法(例如白细胞除去法(leukophoresis))提供了从哺乳动物来源获得白细胞级分；(b)通过逆流离心淘析法将步骤(a)的白细胞级分分离成四个或更多个亚级分；(c)通过使细胞与钙离子载体、gm-csf和il-13或gm-csf和il-4接触，刺激来自步骤(b)的一个或多个级分中的单核细胞转化为树突状细胞，(d)鉴定来自步骤(c)的富含树突状细胞的级分；和(e)收集步骤(d)的富集级分，优选地在约4℃下。
[0264]
在另一个实施方案中，富含树突状细胞的级分通过荧光激活细胞分选来进行鉴定，在另一个实施方案中，其鉴定了至少一种的下面标记物：hla-dr、hla-dq或b7.2，以及同时不存在以下标记物：cd3、cd14、cd16、56、57和cd19、20。
[0265]
在另一个实施方案中，细胞群包含淋巴细胞，在另一个实施方案中，淋巴细胞为t细胞，或在另一个实施方案中，淋巴细胞为b细胞。在其他实施方案中，t细胞被表征为nk细胞、辅助性t细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、til、幼稚t细胞或其组合。应当理解的是，原代t细胞或细胞系、克隆等将被视为本发明的一部分。在另一个实施方案中，t细胞是从肿瘤、炎症或其他浸润物中分离的ctl或ctl系、ctl克隆或ctls。
[0266]
在另一个实施方案中，造血干细胞或早期祖细胞包含本发明中使用的细胞群。在另一个实施方案中，通过白细胞除去法分离或衍生此类群体。在另一个实施方案中，在施用细胞因子之后，对来自骨髓、外周血(pb)或新生儿脐带血使用白细胞除去法。在另一个实施方案中，干细胞或祖细胞的特征在于它们表面抗原标记物(称为cd34+的)的表面表达，并且排除表面谱系抗原标记物lin-的表达。
[0267]
在另一个实施方案中，将本发明的肽、组合物或疫苗与骨髓细胞联合施用至受试者。在另一个实施方案中，与骨髓细胞一起施用的实施方案在受试者的先前辐照之后，作为治疗疗程的一部分，以阻止、抑制或治疗受试者的癌症。
[0268]
在另一个实施方案中，短语“接触细胞”或“接触群体”是指暴露方法，在其他实施方案中，该方法可以是直接或间接的。在另一个实施方案中，这种接触包含通过本领域众所周知的任何方式直接注射细胞，例如显微注射。在另一个实施方案中，还可设想对细胞的提供是间接的，例如通过在细胞周围的培养基中提供，或通过本领域众所周知的和如本文所述的任何途径施用给受试者。
[0269]
在另一个实施方案中，本发明的方法的ctl产生是在体内完成的，并且通过将在体外与本发明的肽接触的抗原呈递细胞引入受试者来实现(参见例如paglia等人(1996)j.exp.med.183:317-322)，与至少一种检查点抑制剂一起施用。
[0270]
在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物中的肽被递送至抗原呈递细胞(apc)。
[0271]
在另一个实施方案中，肽以编码肽的cdna的形式递送至apc。在另一个实施方案
中，术语“抗原呈递细胞”是指树突状细胞(dc)、单核细胞/巨噬细胞、b淋巴细胞或表达必需的mhc/共刺激分子的其他细胞类型，其有效地允许t细胞识别呈递的肽。在另一个实施方案中，apc是癌细胞。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在每个实施方案中，将疫苗或apc或任何形式的肽递送至患者或受试者与至少一种检查点抑制剂一起施用。如本文所述，至少一种检查点抑制剂的施用不需要在wt1疫苗或其替代形式的相同疫苗、制剂、施用部位或施用时间中进行。如本文所提供的，检查点抑制剂与wt1疫苗(以其各种形式中的任一种)的同时施用，增强了需要其的受试者中wt1特异性ctl的形成。
[0272]
在另一个实施方案中，ctl与两种或更多种的抗原呈递细胞群以及至少一种检查点抑制剂一起接触。在另一个实施方案中，两种或更多种抗原呈递细胞群呈递不同的肽。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0273]
在另一个实施方案中，导致抗原在apc(例如dc)的细胞质溶胶中表达的技术用于将肽递送至apc。在apc上表达抗原的方法是本领域众所周知的。在另一个实施方案中，该技术包括(1)将编码本发明的肽的裸dna引入到apc，(2)用表达本发明肽的重组载体感染apc，和(3)使用脂质体将本发明的肽引入到apc的细胞质溶胶中。(参见boczkowski d.等人(1996)j.exp.med.184:465-472；rouse等人(1994)j.virol.68:5685-5689；和nair等人(1992)j.exp.med.175:609-612)。
[0274]
在另一个实施方案中，使用培养抗原呈递细胞，例如源自人类细胞系174xcem.t2的细胞(称为t2)，其抗原处理路径中含有突变，该突变限制了内源性肽与细胞表面mhc i类分子的结合(zweerink等人(1993)j.immunol.150:1763-1771)，如本文所示例的。
[0275]
在另一个实施方案中，本文所述的任何方法用于引发体外引发的ctl。在另一个实施方案中，ctl是离体引发的。在另一个实施方案中，ctl是体外引发的。在另一个实施方案中，将所得的ctl施用至受试者，从而治疗与肽、包含肽的表达产物或其同源物相关的病症，与至少一种检查点抑制剂一起施用。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0276]
在另一个实施方案中，本发明的方法需要引入编码本发明的至少七种wt1肽的组合的基因序列。核酸可包括在一种或多种载体内；因此，在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用包含核苷酸序列的载体，该核苷酸序列编码本发明的肽(tindle，r.w.等人，virology(1994)200:54)。在另一个实施方案中，该方法包括向受试者施用编码肽的裸核酸(dna或rna)，或者在另一个实施方案中，向受试者施用两种或更多种本发明的肽(nabel等人pnas-usa(1990)90:11307)。在另一个实施方案中，利用多表位、基于类似物的癌症疫苗(fikes等人expert opin biol ther.,2003,sep；3(6):985-993)。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。在每一个前述实施方案中，核酸可单独编码每个wt1肽，或多达七个或更多种wt1肽的组合。编码wt1肽的核酸代表了一种形式的wt1递送剂。至少七种wt1肽的组合可通过一种形式的wt1递送剂递送，例如肽或核酸或免疫细胞，或前述两种或三种的任何组合。
[0277]
核酸可编码七种wt1肽中的单个wt1肽，或者核酸可编码七种wt1肽中的多种(例如，两种、三种、四种、五种、六种或所有七种wt1肽)。同样，如果利用的话，核酸可编码一种或多种额外的wt1肽。因此，本发明的组合物和方法可使用单个核酸或多个核酸以作为wt1递送剂。本发明的组合物和方法可使用单个载体来递送至少七种wt1肽或多个载体。
[0278]
核酸(dna或rna)可通过本领域已知的任何方式施用至受试者，包括在肠胃外或静
脉内施用，或者在另一个实施方案中，通过基因枪的方式。在另一个实施方案中，核酸以组合物施用，在其他实施方案中，其对应于本文所列的任何实施方案。dna或rna可作为裸核酸或由载体携带给受试者施用。
[0279]
在另一个实施方案中，根据本发明的方法使用的载体可包含促进或允许在体外细胞中或在受试者体内表达本发明的肽(例如，至少七种wt1肽中的一种或多种)的任何载体。术语“载体”用于指可用于将编码序列信息(例如，编码wt1肽的核酸序列)转移至细胞或受试者的任何分子(例如，核酸、质粒、病毒、颗粒)。几种癌症的核酸疫苗已进入临床试验(wahren b等人“dna vaccines:recent developments and the future,”vaccines,2014,2:785-796；fioretti d.等人,“dna vaccines:developing new strategies against cancer,journal of biomedicine and biotechnology,2010,2010(938):174378)。使用dna疫苗扩增功能性wt1特异性t细胞的策略是已知的(chaise c等人“dna vaccination induces wt1-specific t-cell responses with potential clinical relevance,”blood,2008,112(7):2956-2964)。在一个实施例中，载体是病毒载体。在另一个实施方案中，载体是非病毒载体。在一个实施方案中，非病毒载体是核酸载体，例如质粒dna或mrna载体(参见，例如，weide b.等人“plasmid dna-and messenger rna-based anti-cancer vaccination,”immunol lett,2008,115(1):33-42)；kim h.等人“self-assembled messenger rna nanoparticles(mrna-nps)for efficient gene expression,”sci rep,2015,5:12737)；ulmer j.b.等人“rna-based vaccines”,vaccine,2012,30:4414-4418)。在另一个实施方案中，“载体”包括减毒的病毒，例如记载在如美国专利号4,722,848中的牛痘或鸡痘，其通过引用并入本文。在另一个实施方案中，载体是bcg(bacille calmette guerin)，如stover等人所记载的(nature 351:456-460(1991))。可用于本发明肽的治疗性施用或免疫的其他载体(例如伤寒沙门氏菌载体等)，对于本领域技术人员来说将从本文的描述中显而易见。可用于在体内向受试者和在体外向细胞施用核酸分子的载体的非限制性实例包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、痘病毒、疱疹病毒、病毒样颗粒(vlp)、质粒、阳离子脂质、脂质体和纳米颗粒。
[0280]“编码序列”是转录成mrna和/或翻译成多肽的核酸序列。编码序列的边界由5'-末端的翻译起始密码子和3'-末端的翻译终止密码子决定。编码序列可包括但不限于mrna、cdna和重组多核苷酸序列。变体或类似物可通过删除部分编码序列、通过插入序列和/或通过置换序列内的一个或多个核苷酸来制备。修饰核酸序列的技术(例如定点诱变)是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，sambrook等人molecular cloning:a laboratory manual,第二版,1989；dna cloning,卷i and ii,d.n.glovered.,1985)。任选地，本发明的核酸序列以及利用此类多核苷酸的本发明的组合物和方法可包括非编码序列。
[0281]
术语“可操作地连接”在本文中用于指侧翼控制序列的排列，其中配置或组装如此描述的侧翼序列以执行它们的通常功能。因此，在与控制序列相容的条件下，可操作地连接至编码序列的侧翼控制序列可能能够影响编码序列的复制、转录和/或翻译。例如，当启动子能够指导编码序列的转录时，编码序列与启动子能可操作地连接。侧翼序列不需要与编码序列相邻，只要它正确行使功能即可。因此，例如，插入的未翻译但转录的序列可以存在于启动子序列和编码序列之间，并且启动子序列仍然可被认为与编码序列“可操作地连接”。编码多肽(例如，wt1肽)的每个核酸序列通常具有其自己的可操作连接的启动子序列。
30μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量为20-40μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量为30-60μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量为40-80μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量为50-100μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量为50-150μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量为100-200μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量为200-300μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量为300-400μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量为400-600μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量为500-800μg/肽/剂量。在另一个实施方案中，剂量为800-1000μg/肽/剂量。
[0291]
在另一个实施方案中，每剂量或每天的肽的总量是上述量之一。在另一个实施方案中，每剂量的总肽剂量是上述量之一。
[0292]
上述剂量中的每一个代表本发明的单独的实施方案。
[0293]
在另一个实施方案中，本发明提供包含本发明的肽、组合物或疫苗以及至少一种检查点抑制剂的试剂盒。在另一个实施方案中，试剂盒还包含标签或包装插页。在另一个实施方案中，该试剂盒用于通过延迟型超敏试验来检测wt1特异性cd4应答。在另一个实施方案中，该试剂盒用于本文列举的任何其他方法。在另一个实施方案中，该试剂盒用于本领域已知的任何其他方法。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
[0294]
实施例
[0295]
在卵巢癌患者中一起施用七价wt1免疫治疗组合物与纳武利尤单抗的功效评价
[0296]
符合条件的诊断为卵巢癌的患者将在完成化疗后的4个月内开始疫苗方案。患者最初将在12周内接受6次wt1肽的疫苗，并在14周内接受7次免疫检查点抑制剂纳武利尤单抗的输注。将对每一剂疫苗进行毒性评估，并在完成治疗后3周(即第15周)进行评估。研究人员将在治疗后观察患者长达30分钟。不打算增加剂量。常规毒性评估将在整个试验期间继续进行。
[0297]
在第15周评估时，允许没有疾病进展的患者接受大约每8周注射4种额外的疫苗。该维持疫苗疗程将在第19周开始。
[0298]
将在6个不同的时间点从40ml肝素化血液样本中评估免疫应答：基线(在知情同意时和第一次给药之前，以确定基线变化)、第5和6次接种疫苗之前以及最后一次纳武利尤单抗输注后3周。如果可行的话，将在3个月的随访中进行额外的抽血。
[0299]
使用elisa，将测量针对疫苗中的4种wt1肽产生的抗体水平。抗体通常在第四次疫苗接种完成时出现。将对外周血淋巴细胞进行t细胞增殖反应分析，包括：流式细胞术用于facs表型分析，其在外周血和肿瘤中(如果获得任选的活检)包括白细胞亚群分析、t调节细胞试验(包括cd3、cd4、cd8、foxp3、icos和pd1)和髓源性抑制细胞(mdscs，cd14+hla-drlow细胞)。wt1 t细胞特异性cd4和cd8增殖反应将使用多功能细胞内细胞因子染色(ics)和基于流式细胞术的细胞毒性试验使用meso scale discovery system进行测量，其功能性通过产生的ifn-γ来测量。血液样本处理、t细胞监测、抗体elisa和多功能t细胞试验的详细步骤记载在[29]中。
[0300]
基线值和t细胞应答结果将与临床缓解持续时间相关。
[0301]
如果患者在第15周之前退出研究，将获得用于研究后免疫学研究的血液。ct扫描将在基线和第15周(或如果认为有医学必要，则更早)各进行一次，此后每3个月进行一次，持续长达1年，直到疾病取得进展。可使用mri腹部和骨盆代替ct腹部和骨盆。参考放射科医
生将使用免疫相关应答标准来确定疾病进展[57]。将在基线、第6周和第15周获得ca125，然后每3个月获得一次，持续长达1年，直至疾病取得进展。由于接种疫苗的患者存在炎症的混杂可能性，因此ca125将无法用于确定疾病进展。患者将继续接受研究，直到病情进展、出现不可接受的毒性、完成疫苗序列或患者退出。
[0302]
wt1疫苗：本研究中使用的疫苗含有七种单独的wt1肽：
[0303]
·
ymfpnapyl(seq id no:124；wt1-a1)：具有突变的氨基酸r126y的hla i类肽以刺激cd8+应答。
[0304]
·
sgqaymfpnapylpscles(seq id no:125；长wt1-122a1)：根据临床前和1期研究数据，hla ii类肽在较长的肽中含有嵌入wt1-a1的异变序列，以刺激cd4+和cd8+应答。
[0305]
·
rsdelvrhhnmhqrnmtkl(seq id no:1；长wt1-427)和pgcnkryfklshlqmhsrkhtg(seq id no:2；长wt1-331)：hla ii类肽诱导cd4+应答，其可为长期持续的cd8+t细胞应答提供帮助。
[0306]
·
nlmnlgatl(seq id no:21；短nlm)，
[0307]
·
wnlmnlgatlkgvaa(seq id no:26；长nlm)，和
[0308]
·
wnymnlgatlkgvaa(seq id no:205；长nym)。
[0309]
药物产品：在无菌溶液中，七种肽与磷酸盐缓冲盐水一起提供，以生产疫苗产品(“wt1 vax”)。每个小瓶含有280mcg的每种肽，总体积为0.7ml(每种肽为0.4mg/ml，溢出率为40％)。在gmp条件下装瓶并进行无菌测试。疫苗乳液将在使用前单独制备。这将需要肽溶液与免疫佐剂montanide isa 51vg的混合物。
[0310]
预期剂量：选择每种肽的剂量为200mcg，因为它在其他人使用的安全和有效剂量范围内。肽疫苗在很宽的剂量范围内(注射100-2000mcg)产生了免疫和临床应答，但没有明确的剂量应答关系证据。理论上较高剂量有可能刺激t细胞上亲和力较低的tcr并降低反应[30,33,34]。小瓶尺寸：每个单剂量小瓶含有0.7ml，施用途径为：皮下。
[0311]
纳武利尤单抗：预期剂量：3mg/kg；小瓶尺寸：10ml；施用途径：静脉。纳武利尤单抗将以3mg/kg给药，以60分钟iv输注静脉施用，每2周一次。在输注结束时，用足量的生理盐水冲洗管路。如果受试者的体重与用于计算所需剂量的先前体重相差》10％，则应计算所需剂量、校正剂量。不允许增加或减少纳武利尤单抗的剂量。对于纳武利尤单抗的首次治疗，无推荐的术前用药。
[0312]
受试者可在两次纳武利尤单抗给药之间不少于12天和不超过预定给药日期后3天给药。在3天窗口之后给药的剂量被认为是剂量延迟。治疗可能会从前一次给药最多延迟6周。
[0313]
即使延迟给药，ct或mri的肿瘤评估也应按照方案继续进行。
[0314]
治疗/干预计划
[0315]
·
患者将作为门诊患者接受治疗。
[0316]
·
wt1疫苗将在第0、2、4、6、8和10周施用。
[0317]
·
所有注射都将在四肢之间旋转的部位进行皮下施用。
[0318]
·
所有患者将在第0天和第-2天接受皮下注射沙格司亭(sargramostim)(gm-csf)70mcg。如果患者已接受sq注射施用的适当指导，则他们可以自行施用gm-csf。患者将被告知预期的反应，例如注射部位的刺激。患者将保留一本日志，记录注射的时间和位置。
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