1.本发明涉及美容医学技术领域，具体涉及一种面部皮肤抗衰老营养液冻干粉的制备方法及其产品和应用，一种面部皮肤抗衰老用营养液。


背景技术：

2.皮肤位于机体的最外层，直接与外界环境接触，能够防止微生物入侵、化学成分危害、紫外线损伤等外部刺激，是机体的第一道防线。由于年龄自然增长，日常护理不到位、化妆品使用不恰当或者过度使用，过渡疲劳和各种意外等因素，很多人出现了皮肤早衰的现象。尤其是面部肌肤，症状包括皮肤干燥粗糙，松弛，皱纹、斑点增加，角质 层变薄，易过敏等，然而目前市面少见有效的抗皮肤衰老产品。
3.干细胞是一类具有自我更新和增殖分化能力的多潜能细胞，可分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞在临床上具有广泛的应用前景，特别是脐带来源的间充质干细胞。干细胞在生长、增殖、分化过程中，细胞内会分泌大量的细胞因子，其中包含多种生长因子，例如表皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、角质细胞生长因子(kgf)、胰岛素样生长因子(igf)、血管内皮生长因子(vegf)、转化生长因子-β(tgf-β)以及一些相关的胶原蛋白等活性物质，而这些因子都会参与不同组织及反应的机制中。
4.细胞因子具有多种功能，对促进成纤维细胞的代谢和胶原蛋白的形成发挥重要作用。细胞因子能促进皮肤组织的生长繁殖；能促进与皮肤损伤有关细胞的快速生长繁殖，并调节细胞间基质的合成、分泌及分解；能促进角质层细胞的再生，加速皮肤角质层和基质层的修复，促进人体皮肤细胞的生长；能增强皮肤细胞的蛋白质的合成和细胞代谢，具有延缓皮肤细胞衰老、促进表皮细胞的修复和生长作用，使皮肤光滑丰润。
5.间充质干细胞的来源广泛，易于分离培养，作为干细胞抗衰老产品的种子细胞极具优势。然而，传统的间充质干细胞培养方法使用的培养基大多含有动物血清，使用时存在不安全因素。传统的间充质干细胞培养方法还存在传代周期长，有效代次低等缺点，例如利用含10％fbs的dmem-f12培养基培养脐带间充质干细胞，传代周期3-5天，传代比例1:2或1:3，有效代次约15代。此外，目前细胞因子大多来自干细胞培养液，而包含细胞因子等其它活性成分在内的细胞内容物未能有效释放到培养液中。目前，以细胞因子为主要活性成分的抗衰老产品大多以液态或乳液形式存在，不利于存储，亟需开发适于长期保存的新剂型。


技术实现要素：

6.本发明目的在于提供一种面部皮肤抗衰老营养液冻干粉的制备方法。
7.本发明的再一目的在于：提供一种上述方法制备的面部皮肤抗衰老营养液冻干粉产品。
8.本发明的又一目的在于：提供一种上述产品的应用。
9.本发明目的通过下述方案实现：一种面部皮肤抗衰老营养液冻干粉的制备方法，
包括以下步骤：（1）脐带来源的间充质干细胞进行体外培养；（2）收集培养得到的脐带间充质干细胞，进行细胞裂解，得到细胞裂解液；细胞裂解液经离心得到上清液，作为干细胞因子提取液；（3）将干细胞因子提取液与营养液按比例混合，得原液；（4）将原液与冻干保护剂按比例混合，冷冻干燥；（5）所述营养液为：维生素c10-50ug/ml、透明质酸钠1-5mg/ml和人转铁蛋白1-10ug/ml； 所述冻干保护剂为：甘露醇50-150g/l、海藻糖1-10g/l和右旋糖酐40 5-15g/l。
10.其中，步骤（1）中使用的细胞培养基为：含有重组人胰岛素1-100ug/ml、人转铁蛋白1-50ug/ml和亚硒酸1-80ug/ml的dmem培养基；培养条件为：36.5～37.5℃，5％co2；脐带间充质干细胞采用贴壁培养，待细胞长满至85％～90％，消化并收集细胞；脐带间充质干细胞选用p3～p20代中的至少一种。
11.步骤（2）包括：收集培养得到的脐带间充质干细胞，向1000万iu细胞中加入0.1-1ml生理盐水重悬，置于离心管内，再放入-60℃～-80 ℃冰箱中反复冻融，然后超声破碎细胞，得到的细胞裂解液经筛网过滤，所得滤液于4℃， 10000rpm离心15min，收集上清液；优选地，超声功率为400-650w，频率为20-25khz，每次超声5-10s，共超声5次；和/或 筛网孔径为20-40um。
12.步骤（3）将干细胞因子提取液与营养液按2-3:2-3的体积比混合。
13.步骤（4）将原液与冻干保护剂按0.8-1.2: 8.5-9.5的体积比混合；冷冻干燥的温度为-60℃～-80℃，冻干机预冻4h-8h，然后真空冷冻48h-72h。
14.步骤（2）还包括对培养得到的脐带间充质干细胞进行干细胞标志物鉴定；步骤（2）还包括对干细胞因子提取液中的细胞因子进行检测。
15.本发明提供一种面部皮肤抗衰老营养液冻干粉，根据上述任一项所述方法制备得到。
16.本发明提供一种面部皮肤抗衰老营养液冻干粉，溶于0.9%生理盐水，制备抗衰老营养液。
17.本发明提供一种抗衰老营养液，其特征在于，通过纳米晶或纳米针导入肌肤。
18.步骤（1）中使用的细胞培养基为：含有重组人胰岛素1-100ug/ml、人转铁蛋白1
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50ug/ml和亚硒酸1-80ug/ml的dmem培养基。优选地，所用细胞培养基为：dmem+重组人胰岛素5ug/ml+人转铁蛋白5ug/ml+亚硒酸7ug/ml。
19.培养条件为：36.5～37.5℃(优选37.0℃)，5％co2。
20.脐带间充质干细胞采用贴壁培养，待细胞长满至85％～90％(优选90％左右)，消化并收集细胞。
21.脐带间充质干细胞选用p3～p20代(优选p8-p12代，更优选p9代)中的至少一种。
22.步骤（2）包括：收集培养得到的脐带间充质干细胞，向1000万iu细胞中加入0.5-1ml 生理盐水重悬，置于离心管内。再放入-80℃冰箱中反复冻融(冻1小时后，置于37℃恒温水浴锅解冻，重复3次)，然后超声破碎细胞，得到的细胞裂解液经筛网(筛网孔径20-40um)过滤，所得滤液于保存于4℃，10000rpm离心15min，收集上清液。
23.优选地，步骤（2）还包括采用流式细胞术对培养得到的脐带间充质干细胞进行干
细胞标志物鉴定。所述干细胞标志物包括阳性标志物：cd105、cd73和cd90以及阴性标志物cd45、cd34和cd14等。
24.优选地，步骤（2）还包括对干细胞因子提取液中的细胞因子进行检测(质控)。
25.使用时，用0.9％生理盐水将所述抗衰老组合物冻干粉溶解，均匀滴在皮肤上，使用纳米晶或纳米针进行导入操作，多余的残留液可继续按摩至完全吸收。
26.抗衰老营养液冻干粉是将脐带来源的间充质干细胞因子提取液与营养成分复配后冻干制得的。所述干细胞因子提取液是将培养获得的脐带间充质干细胞进行细胞裂解，离心收集上清液所得，包含多种细胞因子，可发挥抗衰老及美容护肤效果。本发明使用无动物源血清培养基对脐带间充质干细胞扩增培养后收集细胞裂解物质，在保证了有效性的前提下，提升了产品的安全性。
27.借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果： (一)本发明使用无动物源血清培养基对脐带间充质干细胞扩增培养后收集细胞裂解物质用于面部年轻化产品，保证了产品使用安全性。
[0028] (二)采用本发明的间充质干细胞培养方法，传代周期2-3天，传代比例1:10，有效代次20代，代次效率高。
[0029]
(三)脐带间充质干细胞通过冻融、超声破碎得到细胞裂解原液，其内容物种类丰富，操作简单高效。
附图说明
[0030]
附图1，脐带来源间充质干细胞正常生长的形态示意图；附图2，采用流式细胞仪对间充质干细胞标志物鉴定结果。
具体实施方式
[0031]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0032]
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0033]
本实施例提供了一种用于抗衰老组合物，制备过程包括脐带来源间充质干细胞的培养、冻干粉原液的制备、冻干粉的制备，按以下步骤制备：（1）脐带间充质干细胞的培养：脐带来源的间充质干细胞按照5000-10000个/cm2的密度进行接种，进行常规的体外细胞培养，每次传代比例均为1:10，所述的脐带间充质干细胞选用p3～p20代中的至少一种，在36.5～37.5℃、5％co2细胞培养基中贴壁培养，待细胞长满至85％～90％，消化并收集细胞；其中，细胞培养基为：含有重组人胰岛素1-100ug/ml、人转铁蛋白1-50ug/ml和亚硒酸1-80ug/ml的dmem培养基；对脐带间充质干细胞进行干细胞标志物鉴定，如图1 源间充质干细胞生长过程中形态示意图所示，结果显示保留了原始脐带间充质干细胞的特性；对脐带间充质干细胞进行形态鉴定，结果表明干细胞的形态基本上未发生变化；图1中显示，显微镜下观察，脐带来源间充质干细胞呈梭形或不规则三角生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3 个长短不同的突起，形貌正常，状态良好。
[0034]
（2）、冻干粉原液的制备
ꢀ①
向1000万iu细胞中加入0.5ml生理盐水重悬，放入1.5ml离心管内，再放入-80℃冰箱中反复冻融3次，每次需置于37℃恒温水浴锅解冻，然后超声条件下处理细胞5次，每次超声时长5-10s，分多次进行超声裂解，超声功率600w，频率：20khz，采用孔径20um筛网过滤，收集液体，得到细胞裂解液；
②
收集的细胞裂解液置于高速冷冻离心机内，4℃，10000rpm离心15min，收集上清液，得到干细胞因子提取液(液体a)，并保存于-20℃环境中；对干细胞因子提取液的成分进行检测，结果显示提取液中富含各种生长因子，包括表皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、角质细胞生长因子(kgf)、胰岛素样生长因子(igf)、血管内皮生长因子(vegf)、转化生长因子-β(tgf-β)等；
ꢀ③
向100ml生理盐水中加入4mg维生素c，3g透明质酸钠，0.8mg人转铁蛋白，得到营养液体b；（3）将液体a和液体b混合得到冻干粉原液，即为抗衰老营养液；（4）将原液与冻干保护剂混合，冷冻干燥，得到一种面部皮肤抗衰老营养液冻干粉，其中，所述冻干保护剂为：称取甘露醇70g，海藻糖4g，右旋糖酐40 5g，用500ml去离子水溶解至澄清，加入冻干粉原液，最终定容至1l；其中，将
①
所得溶液在0.22μm的滤器中过滤，收集于无菌容器；将无菌液体进行无菌操作，分装至5ml西林瓶(装量3ml)内，半压塞；冻干机预冻4h，真空冷冻48h，即得抗衰老营养液冻干粉，于-20℃保存。
[0035]
冷冻干燥的温度为-60℃～-80℃，冻干机预冻4h-8h，然后真空冷冻48h-72h。
[0036]
图2所示，收集培养的间充质干细胞，采用流式细胞术对培养得到的脐带间充质干细胞进行干细胞标志物鉴定。阳性标志物包括cd105、cd73和cd90鉴定结果为阳性，阴性标志物包括cd45、cd34和cd14鉴定结果为阴性，表明所得细胞确实为间充质干细胞。
[0037]
所得的面部皮肤抗衰老营养液冻干粉，溶于0.9%生理盐水，制备抗衰老营养液。
[0038]
所得的抗衰老营养液，通过纳米晶或纳米针导入肌肤。
[0039]
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的研发人员理解和使用本发明。熟悉本领域技术的人员显然能对以上实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他 实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，不脱离本发明范畴所做出的变化都应该在本发明的保护范围之内。