合成溶瘤lnp复制子rna和用于癌症免疫治疗的用途
1.相关申请
2.根据35 u.s.c.
§
119(e)，本技术要求于2019年3月8日提交的美国临时申请系列号62/815,611的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
3.本公开涉及合成溶瘤病毒，包括包含一种或多种类型脂质的脂质纳米颗粒和包括编码免疫调节分子的序列的自扩增复制子rna。


技术实现要素：

4.本公开至少部分基于以下出乎意料的发现：在肿瘤位点注射后，合成的溶瘤病毒成功地触发局部肿瘤的抗癌免疫反应并且实现了针对远端肿瘤的全身性免疫。
5.相应地，本公开的一个方面提供了合成溶瘤病毒，其包括包含一种或多种类型脂质的脂质纳米颗粒和包括编码白细胞介素(il)-12分子的序列的自扩增复制子rna。脂质纳米颗粒能够触发免疫原性细胞死亡。il-12分子由自扩增复制子rna表达。
6.合成的溶瘤病毒包括脂质纳米颗粒。脂质纳米颗粒包括一种或多种类型脂质。在一些实施方式中，一种或多种类型脂质包括阳离子脂质。在一些实施方式中，阳离子脂质是n1,n3,n5-三(3-(双十二烷基氨基)丙基)苯-1,3,5-三甲酰胺(tt3)。在一些实施方式中，脂质纳米颗粒包括tt3、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(dope)、胆固醇和c14-peg2000。
7.进一步，合成的溶瘤病毒包括自扩增复制子rna。在一些实施方式中，自扩增子rna源自甲病毒或其他iv组病毒(正单链rna病毒，比如丙肝病毒(hcv))。在一些实施方式中，甲病毒可为委内瑞拉马脑炎病毒(venezuela equine encephalitis virus)、塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)或辛德毕斯病毒(sindbis virus)。
8.在一些实施方式中，自扩增复制子rna包括编码il-12分子的序列。在一些实施方式中，编码il-12分子的序列位于自扩增复制子rna的亚基因组区域中。
9.在一些实施方式中，自扩增复制子rna包括与具有seq id no:1序列的野生型(wt)复制子rna至少90％相同的核苷酸序列。在一些实施方式中，自扩增复制子rna与seq id no:1不同，并且与包括seq id no:1的自扩增复制子rna相比，能够以更高水平表达il-12分子。在一些实施方式中，能够表达更高水平的il-12分子包括seq id no:1的g3936c和/或a4758g的点突变。
10.在一些实施方式中，自扩增复制子rna进一步包括血清白蛋白编码序列。在一些实施方式中，自扩增复制子rna进一步包括内腔蛋白编码序列。
11.在一些方面，自扩增复制子rna包括编码il-12分子的序列。在一些实施方式中，il-12分子选自由下述组成的组中：il-12、il-12亚基或保留免疫调节功能的突变il-12分子。在一些进一步的实施方式中，il-12分子包括il12α亚基和/或il12β亚基。
12.在一些实施方式中，脂质纳米颗粒具有约100nm-120nm的直径。在一些实施方式中，脂质纳米颗粒具有约3mv-6mv的ζ电位。
13.在一些实施方式中，脂质和自扩增复制子rna具有约1:2至2:1的质量比。
14.本公开至少部分涉及一种药物组合物，其包括合成的溶瘤病毒和药学上可接受的载体。
15.在一些实施方式中，药物组合物被配制为用于瘤内注射。
16.本公开至少部分涉及在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向受试者施用有效量的任何合成溶瘤病毒或含有合成溶瘤病毒的药物组合物。
17.在一些实施方式中，受试者是患有或疑似患有癌症的人类患者。示例性靶癌包括但不限于黑素瘤、乳腺癌和结肠癌。
18.在一些实施方式中，将药物组合物以单一剂量施用至受试者。在一些实施方式中，通过瘤内注射向受试者施用药物组合物。
19.本公开内容进一步包括本文所述的任何含合成溶瘤病毒的药物组合物用于治疗本文公开的任何靶疾病(例如，癌症)的用途，以及包括合成溶瘤寡核苷酸的药物组合物用于制造治疗癌症的药物的用途。
20.在以下描述中阐述本发明的一个或多个实施方式的细节。本发明的其他特征或优势将从以下附图和几个实施方式的详细描述中以及从所附权利要求中是显而易见的。
附图说明
21.图1a-图1h是显示用dotap、脂质体(lipo)、tt3纳米颗粒(tt3)、突变复制子rna(rna)、dotap、lipo和tt3纳米颗粒封装突变复制子rna(dotap-mtrep、lipo-mtrep和tt3-mtrep)、电穿孔(electro)和用突变复制子rna(electro-mtrep)电穿孔转染b16f10细胞的效果的图表。图1a是显示转染后3天b16f10细胞活力的图表。图1b是显示用封装有突变或死亡复制子rna(derep)的脂质纳米颗粒转染的b16f10细胞中gfp表达的图表。图1c是显示用脂质纳米颗粒或用复制子rna封装的脂质纳米颗粒转染的pi+膜联蛋白v+死亡b16f10细胞百分比的图表。由脂质纳米颗粒或用复制子rna封装的脂质纳米颗粒诱导的免疫原性细胞死亡由钙网蛋白+(crt+)细胞(图1d)、细胞外atp(图1e)和hmgb1释放(图1f)的百分比显示。图1g显示了脂质纳米颗粒和加载有突变复制子rna的脂质纳米颗粒的直径。图1h显示了脂质纳米颗粒和加载有突变复制子rna的脂质纳米颗粒的ζ电位。
22.图2a-图2j是显示mtrep和derep触发tlr3信号传导并且诱导isgf3复合物导致坏死细胞死亡的图表。lnp-复制子rna触发tlr3信号传导(图2b和图2e)并且激活干扰素刺激的基因stat 1、stat2、irf9、irf3和cgas的表达(图2f-2j)，但不激活tlr2(图2a)、tlr7(图2c)或tlr9(图2d)。
23.图3a-图3k是显示tt3-mtrep募集免疫细胞并且使肿瘤生长退化的图表。图3a显示mtrep在注射后3天募集更多ly6clo ly6g+粒细胞。图3b显示注射后3天用tt3-mtrep注射的肿瘤中cd45+和cd45-细胞中mcherry+细胞的百分比。图3c显示了在tt3-mtrep注射后1天isgf3复合物(stat1/stat2/irf9)以及irf3和cgas的表达。图3d-图3f显示了注射tt3-mtrep后第1天(图3d)和第3天(图3e)和第3天顺序注射后第1天(图3f)的免疫细胞(粒细胞、m-mdsc、单核细胞、巨噬细胞、cd4t、cd8t、nk、nkt、常规dc1(cdc1)和常规dc2(cdc2))浸润到肿瘤中的tt3-mtrep。图3g-3h显示在3次连续注射tt3-mtrep后的第1天诱导更多的细胞死亡(图3g)、更多的免疫细胞浸润(图3h)、减少的肿瘤重量(图3i)、肿瘤面积(图3j)和增加的
ccl5表达(图3k)。
24.图4a-图4g是显示编码il12-msa或il12-msa-内腔蛋白的tt3-mtrep有效调节肿瘤微环境和免疫细胞浸润的图表。图4a和图4b显示了在tt3-mtrep注射后一天和三天通过elisa在肿瘤(图4a)和血清(图4b)中对ifnα2的量化。图4c显示用mtrep-il12-msa和mtrep-il12-msa-内腔蛋白转染的b16f10细胞可以产生il-12。图4d显示单次注射tt3-mtrep、tt3-mtrep-il12-msa或tt3-mtrep-il12-msa-lumican后的一天和三天肿瘤中的il-12水平。图4e-图4f显示单次注射tt3-mtrep、tt3-mtrep-il12-msa或tt3-mtrep-il12-msa-内腔蛋白后的一天(图4e)和三天(图4f)肿瘤中的免疫细胞浸润。图4g显示单次注射tt3-mtrep、tt3-mtrep-il12-msa或tt3-mtrep-il12-msa-内腔蛋白后的一天和三天在肿瘤引流淋巴结中常规dc1(cdc1)的数量。
25.图5a-图5e是显示免疫调节性il12和由tt3-mtrep诱导的免疫原性细胞死亡的体内协同抗癌作用的图表。通过体重(图5a)、血清中的ifnr(图5b)、肿瘤面积(图5c)和存活曲线(图5d)的变化来评估协同抗癌作用。图5e显示tt3-mtrep-il12治疗可以防止治愈小鼠的肿瘤复发。
具体实施方式
26.本公开至少部分基于以下出乎意料的发现：在肿瘤位点注射后，合成溶瘤病毒包括包含一种或多种类型脂质的脂质纳米颗粒以及包括编码il-12分子的序列的自扩增复制子rna，成功触发了局部肿瘤的抗癌免疫应答并且实现了针对远端肿瘤的全身性免疫。
27.i.合成的溶瘤病毒
28.本公开至少部分涉及合成的溶瘤病毒。如本文使用的，术语“合成的”指如本文公开的非天然或工程化溶瘤病毒，其包括脂质纳米颗粒和包括编码il-12分子的序列的自扩增复制子rna。
29.在一些方面，本公开涉及利用能够自身诱导免疫原性细胞死亡的脂质纳米颗粒(lnp)，以促进生物活性剂(例如，编码il-12分子的自扩增复制子rna)递送至肿瘤细胞中。
30.(i)脂质纳米颗粒
31.本公开至少部分涉及使用脂质纳米颗粒将生物活性分子递送至细胞。具体而言，本发明涉及一种合成溶瘤病毒，其包括被脂质纳米颗粒封装的表达il-12的自扩增复制子rna、其组合物、以及使用该合成溶瘤病毒及其组合物治疗患有癌症或疑似患有癌症的受试者的方法。
32.如本文使用的，脂质纳米颗粒(lnp)指具有连续脂质双层的囊泡，比如球形囊泡。脂质纳米颗粒可用于将药物治疗递送至靶位置的方法。lnp的非限制性示例包括脂质体、双头双亲分子、固体脂质纳米颗粒(sln)、纳米结构脂质载体(nlc)和单层膜结构(例如，古细菌和胶束)。
33.如本文使用的，脂质纳米颗粒包括一种或多种类型脂质。如本文使用的，脂质指一组有机化合物，包括但不限于脂肪酸酯，并且在一些实施方式中其特征在于不溶于水，但可溶于许多有机溶剂。它们通常至少分为三类：(1)“简单脂质”，包括脂肪和油以及蜡；(2)“复合脂质”，包括磷脂和糖脂；(3)“衍生脂质”，比如类固醇。脂质的非限制性示例包括甘油三酯(例如三硬脂酸甘油酯)、甘油二酯(例如二十二酸甘油酯)、单甘酯(例如单硬脂酸甘油
酯)、脂肪酸(例如硬脂酸)、类固醇(例如胆固醇)和蜡(例如十六烷基棕榈酸酯)。在一些实施方式中，lnp中的一种或多种类型脂质包括阳离子脂质。
34.如本文使用的，阳离子脂质指在选定的ph，比如生理ph下携带净正电荷的多种脂质种类中的任一种。这种脂质包括但不限于n1,n3,n5-三(3-(双十二烷基氨基)丙基)苯-1,3,5-三甲酰胺(tt3)、n-(2,3-二油酰氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotap)；脂质体；1,2-二亚油氧基-n,n-二甲氨基丙烷(dlindma)、1,2-二亚油烯氧基-n,n-二甲氨基丙烷(dlendma)、双十八烷基二甲基铵(dodma)、二硬脂基二甲基铵(dsdma)、n,n-二烯基-n,n-二甲基氯化铵(dodac)；n-(2,3-二烯氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)；n,n-二硬脂基-n,n-二甲基溴化铵(ddab)；3-(n-(n’,n
’‑
二甲氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(dc-chol)和n-(1,2-二肉豆蔻氧基丙酯-3-基)-n,n-二甲基-n-羟乙基溴化铵(dmrie)。
35.在一些实施方式中，阳离子脂质是tt3。如本文使用的，tt3能够形成用于将各种生物活性剂递送至细胞中的脂质纳米颗粒。此外，本公开还表明了卸载的tt3-lnp可在体内和体外诱导癌细胞中的免疫原性细胞死亡(icd)。如本文所述，免疫原性细胞死亡指可通过激活树突细胞(dc)和随后激活特定t细胞应答来诱导有效免疫应答的细胞死亡形式。在一些实施方式中，经历免疫原性细胞死亡(icd)的细胞是肿瘤细胞。免疫原性肿瘤细胞死亡可触发有效的抗肿瘤免疫应答。在一些实施方式中，合成溶瘤病毒包括封装仅编码报告基因的自扩增复制子rna(tt3-lnp-复制子rna)的tt3-lnp。与单独使用tt3-lnp相比，自扩增复制子rna可以与tt3-lnp协同工作，以在肿瘤细胞中诱导更高水平的icd。在其他实施方式中，合成的溶瘤病毒包括封装编码il-12分子的自扩增复制子rna的tt3-lnp。il-12是一种免疫调节细胞因子，可引发针对局部肿瘤的有效免疫应答。此外，tt3-lnp、自扩增复制子rna和il-12表达的结合，不仅能有效协同抑制原位肿瘤细胞，还能引发全身性抗肿瘤免疫应答，杀死远端肿瘤细胞并且预防肿瘤的复发。
36.在一些实施方式中，阳离子脂质是dotap。如本文使用的，dotap也能够形成脂质纳米颗粒。dotap可用于将包括酵母人工染色体(yac)在内的dna高效转染到真核细胞中进行瞬时或稳定的基因表达，也适用于其他带负电荷分子的有效转移，比如rna、寡核苷酸、核苷酸、核糖核蛋白(rnp)复合物和蛋白质进入哺乳动物细胞的研究样本。
37.在其他实施方式中，阳离子脂质是脂质体。如本文使用的，脂质体是一种常见的转染试剂，由invitrogen生产和销售，用于分子和细胞生物学。它用于通过脂质转染提高rna(包括mrna和sirna)或质粒dna转染到体外细胞培养物中的效率。脂质体含有脂质亚基，可在水性环境中形成脂质体或脂质纳米颗粒，从而捕获转染有效载荷，例如，自扩增复制子rna。由于中性共脂质介导脂质体与细胞膜的融合，含有rna的脂质体(在其表面带正电荷)可以与带负电荷的活细胞质膜融合，从而允许核酸货物分子穿过细胞膜进行复制或表达。
38.在一些实施方式中，lnp主要由阳离子脂质连同其他脂质组分组成。这些通常包括属于但不限于磷脂酰胆碱(pc)类别的其他脂质分子(例如，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(dope)、甾醇(例如胆固醇)和聚乙二醇(peg)-脂质缀合物(例如，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-n-[叶酸(聚乙二醇)-2000(dspe-peg2000)和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000(c14-peg2000)。表1显示了两种lnp、tt3-lnp和dotap-lnp的配方。
[0039]
表1：
[0040][0041]
脂质纳米颗粒的粒径可影响药物释放速率、生物分布、粘膜粘附、细胞对水的吸收和纳米颗粒内部的缓冲液交换以及蛋白质扩散。在一些实施方式中，lnp的直径范围30nm至150nm。在一些实施方式中，lnp的直径范围为100nm-120nm。在一些实施方式中，lnp的直径可为30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、101nm、102nm、103nm、104nm、105nm、106nm、107nm、108nm、109nm、110nm、111nm、112nm、113nm、114nm、115nm、116nm、117nm、11nm、119nm或120nm。
[0042]
ζ电位是脂质纳米颗粒表面有效电荷的量度。ζ电位的大小提供了有关颗粒稳定性的信息。在一些实施方式中，lnp的ζ电位范围从-10毫伏(mv)到25mv。在一些实施方式中，lnp的ζ电位范围为3mv-6mv。在一些实施方式中，lnp的ζ电位可为3mv、3.1mv、3.2mv、3.3mv、3.4mv、3.5mv、3.6mv、3.7mv、3.8mv、3.9mv、4mv、4.1mv、4.2mv、4.3mv、4.4mv、4.5mv、4.6mv、4.7mv、4.8mv、4.9mv、5mv、5.1mv、5.2mv、5.3mv、5.4mv、5.5mv、5.6mv、5.7mv、5.8mv、5.9mv和6mv。
[0043]
本公开至少部分涉及用脂质纳米颗粒封装复制子rna。在一些实施方式中，lnp与复制子rna之间的质量比在1:2至2:1的范围内。在一些实施方式中，lnp与复制子rna之间的质量比可为1:2、1:1.5、1:1.2、1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1和2:1。在一些实施方式中，lnp与复制子rna之间的质量比可为1:1。
[0044]
(ii)自扩增复制子rna
[0045]
在本公开中，在亚基因组启动子下编码il-12分子的自扩增复制子rna代替病毒复制所需的结构蛋白，在癌症免疫治疗中具有重要意义。如本文使用的，术语“自扩增复制子rna”指包括从一个复制起点复制的rna的自复制遗传元件。术语“复制子rna”和“自扩增复制子rna”在本文中可互换使用。在一些实施方式中，自扩增复制子rna是病毒复制子。
[0046]
病毒是一种小病原体，其只能在活宿主细胞(例如，原核和真核细胞)内复制。在活细胞之外，病毒作为独立的颗粒(例如，病毒颗粒或毒粒)存在，其包括dna或rna形式的遗传物质，后者可为单链或双链。带有dna的病毒称为dna病毒，带有rna的病毒称为rna病毒。在一些情况下，病毒包括核酸相关蛋白并且病毒和核酸相关蛋白的组合被称为核蛋白。除了遗传物质外，病毒还具有单层或双层蛋白质外壳，也称为衣壳，可促进病毒在感染过程中附着在活宿主细胞的受体上，并保护病毒的遗传物质免遭酶促降解。核蛋白和衣壳的组合被称为核衣壳。在一些情况下，病毒有一个脂质双层包膜，上面布满了病毒编码的糖基化(反式)膜相关蛋白。一旦病毒感染了活的宿主细胞，病毒就依赖于活的宿主细胞为其复制和繁殖提供机制。病毒基因组编码一些结构蛋白和非结构调节蛋白。
[0047]
如本文使用的，术语“亚基因组”或“亚基因组的”指整个复制子基因组的较小部分。因此，如本文使用的，亚基因组转录指复制子基因组中一种或多种基因的转录，而不是构成复制子基因组的所有基因的转录。在一个实施方式中，亚基因组转录指在本文别处描述的具有实验或治疗意义的基因的转录。
[0048]
如在本文病毒的上下文中使用的术语“结构蛋白”指构成成熟组装的病毒颗粒或毒粒的结构组分的蛋白质。类结构蛋白的非限制性示例包括核衣壳核心蛋白(例如，gag蛋白)、包装在病毒颗粒内的酶(例如，pol蛋白)和膜组分(例如，env蛋白)。相反，在本文病毒的上下文中使用的术语“非结构蛋白”指在宿主细胞内表达但不构成病毒颗粒或毒粒的结构组分的蛋白。非结构蛋白的一些作用包括但不限于复制子形成、免疫调节和结构蛋白基因的反式激活。
[0049]
在一些实施方式中，自扩增复制子rna源自甲病毒。与宿主mrna不同的是，甲病毒复制子rna编码一组四种非结构蛋白(nsps 1-4)，它们负责基因组复制，并且当被设计为包括编码非病毒产物(比如il-12分子)的基因时，提供在亚基因组启动子下转录这种非病毒产物。甲病毒属iv组披膜病毒科病毒家族的一部分，具有正义单链rna基因组，并以二十面体核衣壳为特征。iv组病毒的其他非限制性示例可为星状病毒科、杯状病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、小核糖核酸病毒科、动脉病毒科和披膜病毒科。甲病毒属包括26种感染真核生物的包膜病毒。甲病毒具有广泛的宿主范围，可通过蚊子和食血节肢动物传播。甲病毒的非限制性示例包括委内瑞拉马脑炎病毒(vee)、塞姆利基森林病毒(sf)、辛德毕斯病毒(sin)、东方马脑炎病毒(eee)、西方马脑炎病毒(wee)、大沼泽地病毒(eve)、mucambo病毒(muc)、pixuna病毒(pix)、塞姆利基森林病毒(sf)、米德尔堡病毒(mid)、基孔肯雅病毒(chik)、奥尼永-尼永病毒(onn)、罗斯河病毒(rr)、巴马森林病毒(bf)、盖塔病毒(get)、sagiyama病毒(sag)、bebaru病毒(beb)、mayaro病毒(may)、una病毒(una)、aura病毒(aura)、babanki病毒(bab)、highlands j病毒(hj)和摩根堡病毒(fm)。
[0050]
在本公开中，至少部分甲病毒复制子是vee甲病毒复制子。vee病毒是一种病毒病原体，通常由蚊子携带，主要在马物种中引起vee或脑脊髓炎。然而，人类也可能感染vee，免疫系统较弱的人如果感染vee，尤其容易出现严重并发症。vee的毒粒是球形的，具有脂质膜，糖蛋白表面蛋白散布在外表面。通常，vee的基因组约为11.45kb，不包括5
’‑
末端帽和3
’‑
末端poly(a)尾，并且包括4个非结构蛋白(nsp)和5个结构蛋白。非结构蛋白包括nsp1、nsp2、nsp3和nsp4，而结构区域编码蛋白c、e3、e2、6k和e1。在一些情况下，自扩增复制子rna是源自vee的wt复制子rna。vee病毒wt复制子rna的序列在seq id no:1中列出：
[0051]
atgggcggcgcatgagagaagcccagaccaattacctacccaaaatggagaaagttcacgttgacatcgaggaagacagcccattcctcagagctttgcagcggagcttcccgcagtttgaggtagaagccaagcaggtcactgataatgaccatgctaatgccagagcgttttcgcatctggcttcaaaactgatcgaaacggaggtggacccatccgacacgatccttgacattggaagtgcgcccgcccgcagaatgtattctaagcacaagtatcattgtatctgtccgatgagatgtgcggaagatccggacagattgtataagtatgcaactaagctgaagaaaaactgtaaggaaataactgataaggaattggacaagaaaatgaaggagctggccgccgtcatgagcgaccctgacctggaaactgagactatgtgcctccacgacgacgagtcgtgtcgctacgaagggcaagtcgctgtttaccaggatgtatacgcggttgacggaccgacaagtctctatcaccaagccaataagggagttagagtcgcctactggataggctttgacaccaccccttttatgtttaagaacttggctggagcatatccatcatactctaccaactgggccgacgaaaccgtgttaacggctcgtaacatagg
cctatgcagctctgacgttatggagcggtcacgtagagggatgtccattcttagaaagaagtatttgaaaccatccaacaatgttctattctctgttggctcgaccatctaccacgagaagagggacttactgaggagctggcacctgccgtctgtatttcacttacgtggcaagcaaaattacacatgtcggtgtgagactatagttagttgcgacgggtacgtcgttaaaagaatagctatcagtccaggcctgtatgggaagccttcaggctatgctgctacgatgcaccgcgagggattcttgtgctgcaaagtgacagacacattgaacggggagagggtctcttttcccgtgtgcacgtatgtgccagctacattgtgtgaccaaatgactggcatactggcaacagatgtcagtgcggacgacgcgcaaaaactgctggttgggctcaaccagcgtatagtcgtcaacggtcgcacccagagaaacaccaataccatgaaaaattaccttttgcccgtagtggcccaggcatttgctaggtgggcaaaggaatataaggaagatcaagaagatgaaaggccactaggactacgagatagacagttagtcatggggtgttgttgggcttttagaaggcacaagataacatctatttataagcgcccggatacccaaaccatcatcaaagtgaacagcgatttccactcattcgtgctgcccaggataggcagtaacacattggagatcgggctgagaacaagaatcaggaaaatgttagaggagcacaaggagccgtcacctctcattaccgccgaggacgtacaagaagctaagtgcgcagccgatgaggctaaggaggtgcgtgaagccgaggagttgcgcgcagctctaccacctttggcagctgatgttgaggagcccactctggaggcagacgtcgacttgatgttacaagaggctggggccggctcagtggagacacctcgtggcttgataaaggttaccagctacgatggcgaggacaagatcggctcttacgctgtgctttctccgcaggctgtactcaagagtgaaaaattatcttgcatccaccctctcgctgaacaagtcatagtgataacacactctggccgaaaagggcgttatgccgtggaaccataccatggtaaagtagtggtgccagagggacatgcaatacccgtccaggactttcaagctctgagtgaaagtgccaccattgtgtacaacgaacgtgagttcgtaaacaggtacctgcaccatattgccacacatggaggagcgctgaacactgatgaagaatattacaaaactgtcaagcccagcgagcacgacggcgaatacctgtacgacatcgacaggaaacagtgcgtcaagaaagaactagtcactgggctagggctcacaggcgagctggtggatcctcccttccatgaattcgcctacgagagtctgagaacacgaccagccgctccttaccaagtaccaaccataggggtgtatggcgtgccaggatcaggcaagtctggcatcattaaaagcgcagtcaccaaaaaagatctagtggtgagcgccaagaaagaaaactgtgcagaaattataagggacgtcaagaaaatgaaagggctggacgtcaatgccagaactgtggactcagtgctcttgaatggatgcaaacaccccgtagagaccctgtatattgacgaagcttttgcttgtcatgcaggtactctcagagcgctcatagccattataagacctaaaaaggcagtgctctgcggggatcccaaacagtgcggtttttttaacatgatgtgcctgaaagtgcattttaaccacgagatttgcacacaagtcttccacaaaagcatctctcgccgttgcactaaatctgtgacttcggtcgtctcaaccttgttttacgacaaaaaaatgagaacgacgaatccgaaagagactaagattgtgattgacactaccggcagtaccaaacctaagcaggacgatctcattctcacttgtttcagagggtgggtgaagcagttgcaaatagattacaaaggcaacgaaataatgacggcagctgcctctcaagggctgacccgtaaaggtgtgtatgccgttcggtacaaggtgaatgaaaatcctctgtacgcacccacctcagaacatgtgaacgtcctactgacccgcacggaggaccgcatcgtgtggaaaacactagccggcgacccatggataaaaacactgactgccaagtaccctgggaatttcactgccacgatagaggagtggcaagcagagcatgatgccatcatgaggcacatcttggagagaccggaccctaccgacgtcttccagaataaggcaaacgtgtgttgggccaaggctttagtgccggtgctgaagaccgctggcatagacatgaccactgaacaatggaacactgtggattattttgaaacggacaaagctcactcagcagagatagtattgaaccaactatgcgtgaggttctttggactcgatctggactccggtctattttctgcacccactgttccgttatccattaggaataatcactgggataactccccgtcgcctaacatgtacgggctgaataaagaagtggtccgtcagctctctcgcaggtacccacaactgcctcgggcagttgccactggaagagtctatgacatgaacactggtacactgcgcaattatgatccgcgcataaacctagtacctgtaaacagaagactgcctcatgctttagtcctccaccataatgaacacccacagagtgacttttcttcattcgtcagcaaattgaagggcagaactgtcctggtggtcggggaaaagttgtccgtcccaggcaaaatggttgactggttgtcagaccggcctgaggctaccttcagagctcggctgga
tttaggcatcccaggtgatgtgcccaaatatgacataatatttgttaatgtgaggaccccatataaataccatcactatcagcagtgtgaagaccatgccattaagcttagcatgttgaccaagaaagcttgtctgcatctgaatcccggcggaacctgtgtcagcataggttatggttacgctgacagggccagcgaaagcatcattggtgctatagcgcggcagttcaagttttcccgggtatgcaaaccgaaatcctcacttgaagagacggaagttctgtttgtattcattgggtacgatcgcaaggcccgtacgcacaattcttacaagctttcatcaaccttgaccaacatttatacaggttccagactccacgaagccggatgtgcaccctcatatcatgtggtgcgaggggatattgccacggccaccgaaggagtgattataaatgctgctaacagcaaaggacaacctggcggaggggtgtgcggagcgctgtataagaaattcccggaaagcttcgatttacagccgatcgaagtaggaaaagcgcgactggtcaaaggtgcagctaaacatatcattcatgccgtaggaccaaacttcaacaaagtttcggaggttgaaggtgacaaacagttggcagaggcttatgagtccatcgctaagattgtcaacgataacaattacaagtcagtagcgattccactgttgtccaccggcatcttttccgggaacaaagatcgactaacccaatcattgaaccatttgctgacagctttagacaccactgatgcagatgtagccatatactgcagggacaagaaatgggaaatgactctcaaggaagcagtggctaggagagaagcagtggaggagatatgcatatccgacgactcttcagtgacagaacctgatgcagagctggtgagggtgcatccgaagagttctttggctggaaggaagggctacagcacaagcgatggcaaaactttctcatatttggaagggaccaagtttcaccaggcggccaaggatatagcagaaattaatgccatgtggcccgttgcaacggaggccaatgagcaggtatgcatgtatatcctcggagaaagcatgagcagtattaggtcgaaatgccccgtcgaagagtcggaagcctccacaccacctagcacgctgccttgcttgtgcatccatgccatgactccagaaagagtacagcgcctaaaagcctcacgtccagaacaaattactgtgtgctcatcctttccattgccgaagtatagaatcactggtgtgcagaagatccaatgctcccagcctatattgttctcaccgaaagtgcctgcgtatattcatccaaggaagtatctcgtggaaacaccaccggtagacgagactccggagccatcggcagagaaccaatccacagaggggacacctgaacaaccaccacttataaccgaggatgagaccaggactagaacgcctgagccgatcatcatcgaagaggaagaagaggatagcataagtttgctgtcagatggcccgacccaccaggtgctgcaagtcgaggcagacattcacgggccgccctctgtatctagctcatcctggtccattcctcatgcatccgactttgatgtggacagtttatccatacttgacaccctggagggagctagcgtgaccagcggggcaacgtcagccgagactaactcttacttcgcaaagagtatggagtttctggcgcgaccggtgcctgcgcctcgaacagtattcaggaaccctccacatcccgctccgcgcacaagaacaccgtcacttgcacccagcagggcctgctcgagaaccagcctagtttccaccccgccaggcgtgaatagggtgatcactagagaggagctcgaggcgcttaccccgtcacgcactcctagcaggtcggtctcgagaaccagcctggtctccaacccgccaggcgtaaatagggtgattacaagagaggagtttgaggcgttcgtagcacaacaacaatgacggtttgatgcgggtgcatacatcttttcctccgacaccggtcaagggcatttacaacaaaaatcagtaaggcaaacggtgctatccgaagtggtgttggagaggaccgaattggagatttcgtatgccccgcgcctcgaccaagaaaaagaagaattactacgcaagaaattacagttaaatcccacacctgctaacagaagcagataccagtccaggaaggtggagaacatgaaagccataacagctagacgtattctgcaaggcctagggcattatttgaaggcagaaggaaaagtggagtgctaccgaaccctgcatcctgttcctttgtattcatctagtgtgaaccgtgccttttcaagccccaaggtcgcagtggaagcctgtaacgccatgttgaaagagaactttccgactgtggcttcttactgtattattccagagtacgatgcctatttggacatggttgacggagcttcatgctgcttagacactgccagtttttgccctgcaaagctgcgcagctttccaaagaaacactcctatttggaacccacaatacgatcggcagtgccttcagcgatccagaacacgctccagaacgtcctggcagctgccacaaaaagaaattgcaatgtcacgcaaatgagagaattgcccgtattggattcggcggcctttaatgtggaatgcttcaagaaatatgcgtgtaataatgaatattgggaaacgtttaaagaaaaccccatcaggcttactgaagaaaacgtggtaaattacattaccaaattaaaaggaccaaaagctgctgctctttttgcgaagacacataatttgaatatgttgcaggacataccaatggacaggtttgtaatggacttaaagagagacgtgaaagtgactccaggaacaaaaca
tactgaagaacggcccaaggtacaggtgatccaggctgccgatccgctagcaacagcgtatctgtgcggaatccaccgagagctggttaggagattaaatgcggtcctgcttccgaacattcatacactgtttgatatgtcggctgaagactttgacgctattatagccgagcacttccagcctggggattgtgttctggaaactgacatcgcgtcgtttgataaaagtgaggacgacgccatggctctgaccgcgttaatgattctggaagacttaggtgtggacgcagagctgttgacgctgattgaggcggctttcggcgaaatttcatcaatacatttgcccactaaaactaaatttaaattcggagccatgatgaaatctggaatgttcctcacactgtttgtgaacacagtcattaacattgtaatcgcaagcagagtgttgagagaacggctaaccggatcaccatgtgcagcattcattggagatgacaatatcgtgaaaggagtcaaatcggacaaattaatggcagacaggtgcgccacctggttgaatatggaagtcaagattatagatgctgtggtgggcgagaaagcgccttatttctgtggagggtttattttgtgtgactccgtgaccggcacagcgtgccgtgtggcagaccccctaaaaaggctgtttaagcttggcaaacctctggcagcagacgatgaacatgatgatgacaggagaagggcattgcatgaagagtcaacacgctggaaccgagtgggtattctttcagagctgtgcaaggcagtagaatcaaggtatgaaaccgtaggaacttccatcatagttatggccatgactactctagctagcagtgttaaatcattcagctacctgagaggggcccctataactctctacggctaacctgaatggactacgacatagtctagtccgccaagtctagcatatgggcgcgccctcagcatcgattgaattggccaccatggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtaggaattggcaagctgcttacatagaactcgcggcgattggcatgccgccttaaaatttttattttatttttcttttcttttccgaatcggattttgtttttaatatttcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacgcgtcgaggggaattaattcttgaagacgaaagggccaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttga
taatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcgagctctaatacgactcactatag(seq id no:1)
[0052]
如本文所述，自扩增复制子rna包括与seq id no:1至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的核苷酸序列。在一些实施方式中，自扩增复制子rna与seq id no:1至少90％相同。
[0053]
自扩增rna(复制子)是一种很有前景的基因治疗新平台，但其应用仍然受到某些细胞类型表达持续时间短和体内转基因表达水平低的限制。体外进化合成复制子rna为在体外和体内修饰和增强复制子表达提供了一种潜在的强大策略。使用体外进化的方法，在委内瑞拉马脑炎(vee)复制子的nsp2和nsp3中发现了促进人类细胞亚基因组表达的突变。
[0054]
在一些实施方式中，自扩增复制子rna包括的突变使得复制子rna与包括seq id no:1的复制子rna相比能够以更高水平表达il-12分子。在一些实施方式中，自扩增复制子rna，在seq id no:1的wt复制子的核酸位置3936和/或4758中包括至少一个点突变。在一些实施方式中，自扩增复制子rna包括以下点突变中的至少一种：在seq id no:1的wt复制子序列的位置3936(g3936c)处鸟嘌呤变为胞嘧啶并且位置4758(a4758g)处的腺嘌呤变为鸟嘌呤。g3936c突变将导致氨基酸残基1309(g1309r)处的甘氨酸变为精氨酸。a4758g突变将导致氨基酸残基1583(s1583g)处丝氨酸变为甘氨酸。在一些实施方式中，突变的自扩增复制子rna(mtreplicon rna)的序列在seq id no:2中列出，其中突出显示突变(粗体、带下划线的文本)：
[0055]
[0056]
[0057]
[0058][0059]
在其他实施方式中，自扩增复制子rna源自丙肝病毒(hcv)。hcv是四组黄病毒科病毒家族的一部分，具有正极性的单分体、线性、单链rna基因组，长度为9.6至12.3千碱基。黄病毒的5
’‑
末端带有一个甲基化的核苷酸帽，而该家族的其他成员没有帽，并且编码一个内部核糖体进入位点。
[0060]
在其他实施方式中，甲病毒是sf病毒。sf病毒是一种病毒病原体，通常由蚊子携带，引起脑炎。塞姆利基森林病毒是一种正链rna病毒，其基因组大约有13,000个碱基对，可编码九种蛋白质。基因组的5’三分之二编码四种与rna合成有关的非结构蛋白，结构蛋白在3’三分之一处编码。在结构蛋白中，c蛋白构成了二十面体衣壳，衣壳由来自宿主细胞的脂质双层包裹。病毒的最外表面几乎完全被糖蛋白e1和e2的异源二聚体覆盖，以相互连接的三聚体排列，形成外壳。三聚体通过与核衣壳相关的e2细胞质结构域锚定在膜中。
[0061]
在其他实施方式中，甲病毒是sin病毒。该病毒通过蚊子传播。sin病毒引起人类的辛德毕斯热，并且症状包括关节痛、皮疹和不适。辛德毕斯病毒是带有二十面体衣壳的包膜颗粒。它的基因组是一个约11.7kb长的单链rna。它具有5’帽和3’多聚腺苷酸化尾，因此在宿主细胞中直接充当信使rna(mrna)。基因组在5’端编码四种非结构蛋白，在3’端编码衣壳和两种包膜蛋白。这是所有披膜病毒的特征。复制是细胞质的并且快速的。基因组rna在5’端部分翻译以产生非结构蛋白，然后参与基因组复制以及新基因组rna和较短的亚基因组
rna链的产生。该亚基因组链被翻译成结构蛋白。病毒在宿主细胞表面组装并通过出芽获得包膜。已发现非编码rna元件对于辛德毕斯病毒基因组复制是至关重要的。
[0062]
病毒复制子rna能够通过toll样受体(tlr)刺激免疫应答。tlrs、tlr3、tlr7/8和tlr9的一个子集，通过触发抗病毒细胞因子如i型干扰素(ifn)的产生参与抗病毒应答。tlr3响应双链rna，这是许多病毒的复制中介。tlr7/8识别病毒单链rna，而tlr9识别病毒dna中未甲基化的cpg基序。参与病毒识别的tlrs在内体膜上表达，可以根据它们对接头蛋白myd88的要求进行分离：tlr3活性不依赖于myd88，而tlrs7/8/9依赖于myd88。tlr3的激活导致i型干扰素(ifn)的产生。通过isgf3(stat1/stat2/irf9)复合物的i型干扰素信号传导是持续的rip3激活和坏死性凋亡所必需的。
[0063]
在一些实施方式中，lnp-复制子rna能够刺激肿瘤细胞中的tlr3信号传导，这导致肿瘤细胞的坏死性细胞死亡。在一些实施方式中，lnp-复制子rna可增强由lnp诱导的免疫原性细胞死亡(icd)。在一些实施方式中，tt3-lnp-复制子rna可通过协同诱导肿瘤细胞中的icd来发挥肿瘤抑制作用并触发抗肿瘤免疫应答(例如，募集免疫细胞，比如粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、髓源性抑制细胞、树突状细胞细胞、t细胞和nk细胞)。在一些实施方式中，合成的溶瘤病毒包括tt3-lnp-mtreplicon rna。
[0064]
在一些实施方式中，复制子rna包括亚基因组区域中可检测分子的编码序列。在一些实施方式中，可检测分子是核酸或多肽。在一些实施方式中，多肽为荧光蛋白。荧光蛋白是本领域已知的，并且是荧光团的一个亚类，其是具有在激发时重新发光的能力的荧光化合物。荧光团将吸收第一个特定波长的激发光能，然后将在第二个更长的特定波长重新发射光能。每种类型的荧光团都会响应并发射不同波长的光，具体取决于其化学结构和环境的性质。在一些实施方式中，荧光蛋白包括但不限于wt-gfp、绿色荧光蛋白(例如egfp、emerald、superfolder gfp、azami green、mwasabi、taggfp、turbogfp、acgfp、zsgreen、t-sapphire等)、蓝色荧光蛋白(例如ebfp、ebfp2、azurite、mtagbfp等)、青色荧光蛋白(例如ecfp、mecfp、cerulean、mturquoise、cypet、amcyan1、midori-ishi cyan、tagcfp、mtfp1(teal)等)、黄色荧光蛋白(例如eyfp、topaz、venus、mcitrine、ypet、tagyfp、phiyfp、zsyellow1、mbanana等)、橙色荧光蛋白(例如kusabira orange、kusabira orange2、morange、morange2、dtomato、dtomato-tandem、tagrfp、tagrfp-t、dsred、dsred2、dsred-express(t1)、dsred-monomer、mtangerine等)，或红色荧光蛋白(例如，mruby、mapple、mstrawberry、asred2、mrfp1、jred、mcherry、hcred1、mraspberry、dkeima-tandem、hcred-tandem、mplum、aq143等)。
[0065]
在一些方面，如本文所述，自扩增复制子rna包括用于在亚基因组区域中表达il-12的编码序列。il-12的示例性编码序列在seq id no:3中列出：
[0066]
atgagggtccccgctcagctcctggggctcctgctgctctggctcccaggtgcacgatgtgccatgtgggagctggagaaagacgtttatgttgtagaggtggactggactcccgatgcccctggagaaacagtgaacctcacctgtgacacgcctgaagaagatgacatcacctggacctcagaccagagacatggagtcataggctctggaaagaccctgaccatcactgtcaaagagtttctagatgctggccagtacacctgccacaaaggaggcgagactctgagccactcacatctgctgctccacaagaaggaaaatggaatttggtccactgaaattttaaaaaatttcaaaaacaagactttcctgaagtgtgaagcaccaaattactccggacggttcacgtgctcatggctggtgcaaagaaacatggacttgaagttcaacatcaagagcagtagcagttcccctgactctcgggcagtgacatgtggaatggcgtctctgtctgcagagaa
ggtcacactggaccaaagggactatgagaagtattcagtgtcctgccaggaggatgtcacctgcccaactgccgaggagaccctgcccattgaactggcgttggaagcacggcagcagaataaatatgagaactacagcaccagcttcttcatcagggacatcatcaaaccagacccgcccaagaacttgcagatgaagcctttgaagaactcacaggtggaggtcagctgggagtaccctgactcctggagcactccccattcctacttctccctcaagttctttgttcgaatccagcgcaagaaagaaaagatgaaggagacagaggaggggtgtaaccagaaaggtgcgttcctcgtagagaagacatctaccgaagtccaatgcaaaggcgggaatgtctgcgtgcaagctcaggatcgctattacaattcctcatgcagcaagtgggcatgtgttccctgcagggtccgatccggaggttccggtggtggatccggaggtggctccggcggcggatccagggtcattccagtctctggacctgccaggtgtcttagccagtcccgaaacctgctgaagaccacagatgacatggtgaagacggccagagaaaaactgaaacattattcctgcactgctgaagacatcgatcatgaagacatcacacgggaccaaaccagcacattgaagacctgtttaccactggaactacacaagaacgagagttgcctggctactagagagacttcttccacaacaagagggagctgcctgcccccacagaagacgtctttgatgatgaccctgtgccttggtagcatctatgaggacttgaagatgtaccagacagagttccaggccatcaacgcagcacttcagaatcacaaccatcagcagatcattctagacaagggcatgctggtggccatcgatgagctgatgcagtctctgaatcataatggcgagactctgcgccagaaacctcctgtgggagaagcagacccttacagagtgaaaatgaagctctgcatcctgcttcacgccttcagcacccgcgtcgtgaccatcaacagggtgatgggctatctgagctccgcctga(seq id no:3)
[0067]
结构上，il-12属于i型细胞因子，并且具有四个α-螺旋束结构。il-12以异源二聚体蛋白(il-12-p70；il-12-p30/p40)的形式起作用，该蛋白由两个共价连接的p30和p40亚基组成。与异二聚体形式相反，il-12-p40/p40同源二聚体主要作为il-12-p70作用的竞争性抑制剂。il-12是一种多效性细胞因子，其作用在先天免疫和适应性免疫之间建立了联系。il-12最初被描述为一种从pma诱导的ebv转化的b细胞系分泌的因子。基于其作用，il-12最初被命名为“细胞毒性淋巴细胞成熟因子”和“自然杀伤细胞刺激因子”。由于桥接先天免疫和适应性免疫并有效刺激ifn-γ(一种协调抗癌防御自然机制的细胞因子)的产生，il-12似乎是人类肿瘤免疫治疗的理想候选者。然而，在临床研究中与全身施用il-12相关的严重副作用和这种细胞因子的非常窄的治疗指数显著降低了在癌症患者中使用这种细胞因子的热情。
[0068]
在发现il-12之后，il-12家族中还添加了其他三个成员(il-23、il-27和il-35)，并且显示它们在th1细胞功能中发挥关键作用。il-12是受体的配体，由两条氨基酸链il-12r-β1和il-12r-β2组成。il-12受体在多种免疫细胞(包括nk细胞、t和b淋巴细胞)中以组成型(例如b细胞中的il-12r-β1)或诱导型(il-12r-β2)方式表达。配体结合的il-12r-β2在酪氨酸上被磷酸化，为两种激酶jak2和tyk2提供停留位点。在stat转录因子家族中，stat4被认为是il-12引发的细胞应答的最特异性介质。il-12作用的主要要素如下：增加nk细胞和t细胞中ifn-γ的产生，ifn-γ是il-12作用的最有效介质；刺激活化的nk细胞、cd8+和cd4+t细胞的生长和细胞毒性，将cd4+th0细胞的分化转变为th1表型；增强对肿瘤细胞的抗体依赖性细胞毒性(adcc)；以及诱导igg和抑制b细胞产生ige。人体内il-12的主要来源是活化的抗原呈递细胞，例如树突状细胞，尤其是cd1c+表型的细胞，以及造血吞噬细胞(单核细胞、巨噬细胞和嗜中粒细胞)，但il-12也可由其他细胞类型产生。虽然il-12作用于多种免疫细胞，但il-12的整体生理作用似乎是协调针对某些病原体的th1型免疫应答。
[0069]
在一些方面，本公开描述了通过lnp封装的病毒复制子rna局部递送il-12，该复制子rna在其亚基因组区域中编码il-12分子。除了由lnp-复制子rna诱导的协同肿瘤细胞免
疫原性细胞死亡(icd)外，在一些实施方式中，il12在肿瘤微环境中的表达可导致进一步的免疫刺激并导致抗肿瘤免疫应答的增强。在一些实施方式中，lnp-复制子rna-il-12在肿瘤微环境中的组合能够诱导全身性抗肿瘤免疫应答。在其他实施方式中，lnp-复制子rna-il-12在肿瘤微环境中的组合能够根除肿瘤细胞并防止肿瘤复发。在一些实施方式中，合成溶瘤病毒包括tt3-lnp-mtreplicon rna-il12。
[0070]
在一些实施方式中，复制子rna-il12进一步包括血清白蛋白的编码序列。生物环境(例如血清、肿瘤微环境)中肽和蛋白质(例如细胞因子)的半衰期受多种因素的影响，包括尺寸、电荷、蛋白水解敏感性、其生物学性质、它们结合的蛋白质的周转率，以及其他因素。在一些情况下，蛋白质在生物环境中的半衰期与它们的尺寸大致相关。小于约70kda的肽和蛋白质(例如细胞因子)可以通过肾脏过滤消除，因此它们通常具有非常短的半衰期。然而，较大的蛋白质可能会持续数天。三种类型的蛋白质，igg、血清白蛋白和转铁蛋白，持续时间比仅通过其尺寸预测的时间长得多。在一些实施方式中，血清白蛋白是人血清白蛋白。在一些实施方式中，血清白蛋白是小鼠血清白蛋白(msa)。复制子rna-il12-msa的示例性编码序列在seq id no:4中列出：
[0071]
atgggcggcgcatgagagaagcccagaccaattacctacccaaaatggagaaagttcacgttgacatcgaggaagacagcccattcctcagagctttgcagcggagcttcccgcagtttgaggtagaagccaagcaggtcactgataatgaccatgctaatgccagagcgttttcgcatctggcttcaaaactgatcgaaacggaggtggacccatccgacacgatccttgacattggaagtgcgcccgcccgcagaatgtattctaagcacaagtatcattgtatctgtccgatgagatgtgcggaagatccggacagattgtataagtatgcaactaagctgaagaaaaactgtaaggaaataactgataaggaattggacaagaaaatgaaggagctggccgccgtcatgagcgaccctgacctggaaactgagactatgtgcctccacgacgacgagtcgtgtcgctacgaagggcaagtcgctgtttaccaggatgtatacgcggttgacggaccgacaagtctctatcaccaagccaataagggagttagagtcgcctactggataggctttgacaccaccccttttatgtttaagaacttggctggagcatatccatcatactctaccaactgggccgacgaaaccgtgttaacggctcgtaacataggcctatgcagctctgacgttatggagcggtcacgtagagggatgtccattcttagaaagaagtatttgaaaccatccaacaatgttctattctctgttggctcgaccatctaccacgagaagagggacttactgaggagctggcacctgccgtctgtatttcacttacgtggcaagcaaaattacacatgtcggtgtgagactatagttagttgcgacgggtacgtcgttaaaagaatagctatcagtccaggcctgtatgggaagccttcaggctatgctgctacgatgcaccgcgagggattcttgtgctgcaaagtgacagacacattgaacggggagagggtctcttttcccgtgtgcacgtatgtgccagctacattgtgtgaccaaatgactggcatactggcaacagatgtcagtgcggacgacgcgcaaaaactgctggttgggctcaaccagcgtatagtcgtcaacggtcgcacccagagaaacaccaataccatgaaaaattaccttttgcccgtagtggcccaggcatttgctaggtgggcaaaggaatataaggaagatcaagaagatgaaaggccactaggactacgagatagacagttagtcatggggtgttgttgggcttttagaaggcacaagataacatctatttataagcgcccggatacccaaaccatcatcaaagtgaacagcgatttccactcattcgtgctgcccaggataggcagtaacacattggagatcgggctgagaacaagaatcaggaaaatgttagaggagcacaaggagccgtcacctctcattaccgccgaggacgtacaagaagctaagtgcgcagccgatgaggctaaggaggtgcgtgaagccgaggagttgcgcgcagctctaccacctttggcagctgatgttgaggagcccactctggaagccgatgtcgacttgatgttacaagaggctggggccggctcagtggagacacctcgtggcttgataaaggttaccagctacgatggcgaggacaagatcggctcttacgctgtgctttctccgcaggctgtactcaagagtgaaaaattatcttgcatccaccctctcgctgaacaagtcatagtgataacacactctggccgaaaagggcgttatgccgtggaaccataccatggtaaagtagtggtgccagagggacatgcaatacccgtccaggac
tttcaagctctgagtgaaagtgccaccattgtgtacaacgaacgtgagttcgtaaacaggtacctgcaccatattgccacacatggaggagcgctgaacactgatgaagaatattacaaaactgtcaagcccagcgagcacgacggcgaatacctgtacgacatcgacaggaaacagtgcgtcaagaaagaactagtcactgggctagggctcacaggcgagctggtggatcctcccttccatgaattcgcctacgagagtctgagaacacgaccagccgctccttaccaagtaccaaccataggggtgtatggcgtgccaggatcaggcaagtctggcatcattaaaagcgcagtcaccaaaaaagatctagtggtgagcgccaagaaagaaaactgtgcagaaattataagggacgtcaagaaaatgaaagggctggacgtcaatgccagaactgtggactcagtgctcttgaatggatgcaaacaccccgtagagaccctgtatattgacgaagcttttgcttgtcatgcaggtactctcagagcgctcatagccattataagacctaaaaaggcagtgctctgcggggatcccaaacagtgcggtttttttaacatgatgtgcctgaaagtgcattttaaccacgagatttgcacacaagtcttccacaaaagcatctctcgccgttgcactaaatctgtgacttcggtcgtctcaaccttgttttacgacaaaaaaatgagaacgacgaatccgaaagagactaagattgtgattgacactaccggcagtaccaaacctaagcaggacgatctcattctcacttgtttcagagggtgggtgaagcagttgcaaatagattacaaaggcaacgaaataatgacggcagctgcctctcaagggctgacccgtaaaggtgtgtatgccgttcggtacaaggtgaatgaaaatcctctgtacgcacccacctcagaacatgtgaacgtcctactgacccgcacggaggaccgcatcgtgtggaaaacactagccggcgacccatggataaaaacactgactgccaagtaccctgggaatttcactgccacgatagaggagtggcaagcagagcatgatgccatcatgaggcacatcttggagagaccggaccctaccgacgtcttccagaataaggcaaacgtgtgttgggccaaggctttagtgccggtgctgaagaccgctggcatagacatgaccactgaacaatggaacactgtggattattttgaaacggacaaagctcactcagcagagatagtattgaaccaactatgcgtgaggttctttggactcgatctggactccggtctattttctgcacccactgttccgttatccattaggaataatcactgggataactccccgtcgcctaacatgtacgggctgaataaagaagtggtccgtcagctctctcgcaggtacccacaactgcctcgggcagttgccactggaagagtctatgacatgaacactggtacactgcgcaattatgatccgcgcataaacctagtacctgtaaacagaagactgcctcatgctttagtcctccaccataatgaacacccacagagtgacttttcttcattcgtcagcaaattgaagggcagaactgtcctggtggtcggggaaaagttgtccgtcccaggcaaaatggttgactggttgtcagaccggcctgaggctaccttcagagctcggctggatttaggcatcccaggtgatgtgcccaaatatgacataatatttgttaatgtgaggaccccatataaataccatcactatcagcagtgtgaagaccatgccattaagcttagcatgttgaccaagaaagcttgtctgcatctgaatcccggcggaacctgtgtcagcataggttatggttacgctgacagggccagcgaaagcatcattggtgctatagcgcggcagttcaagttttcccgggtatgcaaaccgaaatcctcacttgaagagacggaagttctgtttgtattcattcggtacgatcgcaaggcccgtacgcacaattcttacaagctttcatcaaccttgaccaacatttatacaggttccagactccacgaagccggatgtgcaccctcatatcatgtggtgcgaggggatattgccacggccaccgaaggagtgattataaatgctgctaacagcaaaggacaacctggcggaggggtgtgcggagcgctgtataagaaattcccggaaagcttcgatttacagccgatcgaagtaggaaaagcgcgactggtcaaaggtgcagctaaacatatcattcatgccgtaggaccaaacttcaacaaagtttcggaggttgaaggtgacaaacagttggcagaggcttatgagtccatcgctaagattgtcaacgataacaattacaagtcagtagcgattccactgttgtccaccggcatcttttccgggaacaaagatcgactaacccaatcattgaaccatttgctgacagctttagacaccactgatgcagatgtagccatatactgcagggacaagaaatgggaaatgactctcaaggaagcagtggctaggagagaagcagtggaggagatatgcatatccgacgactcttcagtgacagaacctgatgcagagctggtgagggtgcatccgaagagttctttggctggaaggaagggctacagcacaagcgatggcaaaactttctcatatttggaagggaccaagtttcaccaggcggccaaggatatagcagaaattaatgccatgtggcccgttgcaacggaggccaatgagcaggtatgcatgtatatcctcggagaaggcatgagcagtattaggtcgaaatgccccgtcgaagagtcggaagcctccacaccacctagcacgctgccttgcttgtgcatccatgccatgactcca
gaaagagtacagcgcctaaaagcctcacgtccagaacaaattactgtgtgctcatcctttccattgccgaagtatagaatcactggtgtgcagaagatccaatgctcccagcctatattgttctcaccgaaagtgcctgcgtatattcatccaaggaagtatctcgtggaaacaccaccggtagacgagactccggagccatcggcagagaaccaatccacagaggggacacctgaacaaccaccacttataaccgaggatgagaccaggactagaacgcctgagccgatcatcatcgaagaggaagaagaggatagcataagtttgctgtcagatggcccgacccaccaggtgctgcaagtcgaggcagacattcacgggccgccctctgtatctagctcatcctggtccattcctcatgcatccgactttgatgtggacagtttatccatacttgacaccctggagggagctagcgtgaccagcggggcaacgtcagccgagactaactcttacttcgcaaagagtatggagtttctggcgcgaccggtgcctgcgcctcgaacagtattcaggaaccctccacatcccgctccgcgcacaagaacaccgtcacttgcacccagcagggcctgctcgagaaccagcctagtttccaccccgccaggcgtgaatagggtgatcactagagaggagctcgaggcgcttaccccgtcacgcactcctagcaggtcggtctcgagaaccagcctggtctccaacccgccaggcgtaaatagggtgattacaagagaggagtttgaggcgttcgtagcacaacaacaatgacggtttgatgcgggtgcatacatcttttcctccgacaccggtcaagggcatttacaacaaaaatcagtaaggcaaacggtgctatccgaagtggtgttggagaggaccgaattggagatttcgtatgccccgcgcctcgaccaagaaaaagaagaattactacgcaagaaattacagttaaatcccacacctgctaacagaagcagataccagtccaggaaggtggagaacatgaaagccataacagctagacgtattctgcaaggcctagggcattatttgaaggcagaaggaaaagtggagtgctaccgaaccctgcatcctgttcctttgtattcatctagtgtgaaccgtgccttttcaagccccaaggtcgcagtggaagcctgtaacgccatgttgaaagagaactttccgactgtggcttcttactgtattattccagagtacgatgcctatttggacatggttgacggagcttcatgctgcttagacactgccagtttttgccctgcaaagctgcgcagctttccaaagaaacactcctatttggaacccacaatacgatcggcagtgccttcagcgatccagaacacgctccagaacgtcctggcagctgccacaaaaagaaattgcaatgtcacgcaaatgagagaattgcccgtattggattcggcggcctttaatgtggaatgcttcaagaaatatgcgtgtaataatgaatattgggaaacgtttaaagaaaaccccatcaggcttactgaagaaaacgtggtaaattacattaccaaattaaaaggaccaaaagctgctgctctttttgcgaagacacataatttgaatatgttgcaggacataccaatggacaggtttgtaatggacttaaagagagacgtgaaagtgactccaggaacaaaacatactgaagaacggcccaaggtacaggtgatccaggctgccgatccgctagcaacagcgtatctgtgcggaatccaccgagagctggttaggagattaaatgcggtcctgcttccgaacattcatacactgtttgatatgtcggctgaagactttgacgctattatagccgagcacttccagcctggggattgtgttctggaaactgacatcgcgtcgtttgataaaagtgaggacgacgccatggctctgaccgcgttaatgattctggaagacttaggtgtggacgcagagctgttgacgctgattgaggcggctttcggcgaaatttcatcaatacatttgcccactaaaactaaatttaaattcggagccatgatgaaatctggaatgttcctcacactgtttgtgaacacagtcattaacattgtaatcgcaagcagagtgttgagagaacggctaaccggatcaccatgtgcagcattcattggagatgacaatatcgtgaaaggagtcaaatcggacaaattaatggcagacaggtgcgccacctggttgaatatggaagtcaagattatagatgctgtggtgggcgagaaagcgccttatttctgtggagggtttattttgtgtgactccgtgaccggcacagcgtgccgtgtggcagaccccctaaaaaggctgtttaagcttggcaaacctctggcagcagacgatgaacatgatgatgacaggagaagggcattgcatgaagagtcaacacgctggaaccgagtgggtattctttcagagctgtgcaaggcagtagaatcaaggtatgaaaccgtaggaacttccatcatagttatggccatgactactctagctagcagtgttaaatcattcagctacctgagaggggcccctataactctctacggctaacctgaatggactacgacatagtctagtccgccaagtctagcatatgggcgcgccctcagcatcgatttgaattggccaccatgagggtccccgctcagctcctggggctcctgctgctctggctcccaggtgcacgatgtgccatgtgggagctggagaaagacgtttatgttgtagaggtggactggactcccgatgcccctggagaaacagtgaacctcacctgtgacacgcctgaagaagatgacatcacctggacctcagaccagagacatggagtcataggctctggaa
agaccctgaccatcactgtcaaagagtttctagatgctggccagtacacctgccacaaaggaggcgagactctgagccactcacatctgctgctccacaagaaggaaaatggaatttggtccactgaaattttaaaaaatttcaaaaacaagactttcctgaagtgtgaagcaccaaattactccggacggttcacgtgctcatggctggtgcaaagaaacatggacttgaagttcaacatcaagagcagtagcagttcccctgactctcgggcagtgacatgtggaatggcgtctctgtctgcagagaaggtcacactggaccaaagggactatgagaagtattcagtgtcctgccaggaggatgtcacctgcccaactgccgaggagaccctgcccattgaactggcgttggaagcacggcagcagaataaatatgagaactacagcaccagcttcttcatcagggacatcatcaaaccagacccgcccaagaacttgcagatgaagcctttgaagaactcacaggtggaggtcagctgggagtaccctgactcctggagcactccccattcctacttctccctcaagttctttgttcgaatccagcgcaagaaagaaaagatgaaggagacagaggaggggtgtaaccagaaaggtgcgttcctcgtagagaagacatctaccgaagtccaatgcaaaggcgggaatgtctgcgtgcaagctcaggatcgctattacaattcctcatgcagcaagtgggcatgtgttccctgcagggtccgatccggaggttccggtggtggatccggaggtggctccggcggcggatccagggtcattccagtctctggacctgccaggtgtcttagccagtcccgaaacctgctgaagaccacagatgacatggtgaagacggccagagaaaaactgaaacattattcctgcactgctgaagacatcgatcatgaagacatcacacgggaccaaaccagcacattgaagacctgtttaccactggaactacacaagaacgagagttgcctggctactagagagacttcttccacaacaagagggagctgcctgcccccacagaagacgtctttgatgatgaccctgtgccttggtagcatctatgaggacttgaagatgtaccagacagagttccaggccatcaacgcagcacttcagaatcacaaccatcagcagatcattctagacaagggcatgctggtggccatcgatgagctgatgcagtctctgaatcataatggcgagactctgcgccagaaacctcctgtgggagaagcagacccttacagagtgaaaatgaagctctgcatcctgcttcacgccttcagcacccgcgtcgtgaccatcaacagggtgatgggctatctgagctccgccggttccggtggcggatccgaagcacacaagagtgagatcgcccatcggtataatgatttgggagaacaacatttcaaaggcctagtcctgattgccttttcccagtatctccagaaatgctcatacgatgagcatgccaaattagtgcaggaagtaacagactttgcaaagacgtgtgttgccgatgagtctgccgccaactgtgacaaatcccttcacactctttttggagataagttgtgtgccattccaaacctccgtgaaaactatggtgaactggctgactgctgtacaaaacaagagcccgaaagaaacgaatgtttcctgcaacacaaagatgacaaccccagcctgccaccatttgaaaggccagaggctgaggccatgtgcacctcctttaaggaaaacccaaccacctttatgggacactatttgcatgaagttgccagaagacatccttatttctatgccccagaacttctttactatgctgagcagtacaatgagattctgacccagtgttgtgcagaggctgacaaggaaagctgcctgaccccgaagcttgatggtgtgaaggagaaagcattggtctcatctgtccgtcagagaatgaagtgctccagtatgcagaagtttggagagagagcttttaaagcatgggcagtagctcgtctgagccagacattccccaatgctgactttgcagaaatcaccaaattggcaacagacctgaccaaagtcaacaaggagtgctgccatggtgacctgctggaatgcgcagatgacagggcggaacttgccaagtacatgtgtgaaaaccaggcgactatctccagcaaactgcagacttgctgcgataaaccactgttgaagaaagcccactgtcttagtgaggtggagcatgacaccatgcctgctgatctgcctgccattgctgctgattttgttgaggaccaggaagtgtgcaagaactatgctgaggccaaggatgtcttcctgggcacgttcttgtatgaatattcaagaagacaccctgattactctgtatccctgttgctgagacttgctaagaaatatgaagccactctggaaaagtgctgcgctgaagccaatcctcccgcatgctacggcacagtgcttgctgaatttcagcctcttgtagaagagcctaagaacttggtcaaaaccaactgtgatctttacgagaagcttggagaatatggattccaaaatgccattctagttcgctacacccagaaagcacctcaggtgtcaaccccaactctcgtggaggctgcaagaaacctaggaagagtgggcaccaagtgttgtacacttcctgaagatcagagactgccttgtgtggaagactatctgtctgcaatcctgaaccgtgtgtgtctgctgcatgagaagaccccagtgagtgagcatgttaccaagtgctgtagtggatccctggtggaaaggcggccatgcttctctgctctgacagttgatgaaacatatgtccccaaagagtttaaagctgagaccttcaccttccactctg
atatctgcacacttccagagaaggagaagcagattaagaaacaaacggctcttgctgagctggtgaagcacaagcccaaggctacagcggagcaactgaagactgtcatggatgactttgcacagttcctggatacatgttgcaaggctgctgacaaggacacctgcttctcgactgagggtccaaaccttgtcactagatgcaaagacgccttagcctgagcgatcgctaaatacagcagcaattggcaagctgcttacatagaactcgcggcgattggcatgccgccttaaaatttttattttatttttcttttcttttccgaatcggattttgtttttaatatttcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacgcgtcgaggggaattaattcttgaagacgaaagggccaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcgagctctaatacgactcactatag(seq id no:4)
[0072]
在一些实施方式中，复制子rna-il-12与血清白蛋白编码序列融合。在一些实施方式中，il-12-白蛋白融合分子在肿瘤微环境中具有更长的半衰期。在一些实施方式中，il-12-白蛋白融合蛋白可以在肿瘤微环境中持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天或更长时间。
[0073]
在一些实施方式中，合成溶瘤病毒包括lnp-复制子rna-il-12-血清白蛋白。在其他实施方式中，合成溶瘤病毒包括tt3-lnp-复制子rna-il-12-血清白蛋白。在其他实施方式中，合成溶瘤病毒包括tt3-lnp-mtreplicon rna-il-12-血清白蛋白。il-12在肿瘤微环境中的持续存在可能会延长合成溶瘤病毒发挥的抗肿瘤免疫应答。
[0074]
在一些实施方式中，复制子rna-il12-血清白蛋白进一步包括内腔蛋白的编码序
列。内腔蛋白是皮肤、角膜基质、巩膜、主动脉、肌肉、肺、肾、骨、软骨和椎间盘的间质细胞外基质(ecm)中的主要细胞外蛋白之一。它是小而富含亮氨酸的蛋白聚糖(slrp)家族的成员，其核心蛋白为30kda-50kda，包括信号肽、带负电荷的n端结构域、高度保守的富含亮氨酸的内部结构域和羧基末端结构域。内腔蛋白的蛋白质核心和聚糖链可以与各种细胞效应物相互作用，包括细胞因子、生长因子和细胞表面受体，以调节细胞粘合、增殖和迁移。如本文所述，作为内源性胶原结合蛋白，肿瘤微环境中内腔蛋白的存在将促进il-12的局部保留以增强肿瘤免疫治疗的功效和安全性。在一些实施方式中，复制子rna-il-12-msa包括内腔蛋白的编码序列。在其他实施方式中，mtreplicon rna-il-12-msa(mtrep-il12-msa)包括内腔蛋白的编码序列。mtreplicon rna-il-12-msa-内腔蛋白(mtrep-il12-msa-lumican)的示例性编码序列在seq id no:5中列出：
[0075]
atgggcggcgcatgagagaagcccagaccaattacctacccaaaatggagaaagttcacgttgacatcgaggaagacagcccattcctcagagctttgcagcggagcttcccgcagtttgaggtagaagccaagcaggtcactgataatgaccatgctaatgccagagcgttttcgcatctggcttcaaaactgatcgaaacggaggtggacccatccgacacgatccttgacattggaagtgcgcccgcccgcagaatgtattctaagcacaagtatcattgtatctgtccgatgagatgtgcggaagatccggacagattgtataagtatgcaactaagctgaagaaaaactgtaaggaaataactgataaggaattggacaagaaaatgaaggagctggccgccgtcatgagcgaccctgacctggaaactgagactatgtgcctccacgacgacgagtcgtgtcgctacgaagggcaagtcgctgtttaccaggatgtatacgcggttgacggaccgacaagtctctatcaccaagccaataagggagttagagtcgcctactggataggctttgacaccaccccttttatgtttaagaacttggctggagcatatccatcatactctaccaactgggccgacgaaaccgtgttaacggctcgtaacataggcctatgcagctctgacgttatggagcggtcacgtagagggatgtccattcttagaaagaagtatttgaaaccatccaacaatgttctattctctgttggctcgaccatctaccacgagaagagggacttactgaggagctggcacctgccgtctgtatttcacttacgtggcaagcaaaattacacatgtcggtgtgagactatagttagttgcgacgggtacgtcgttaaaagaatagctatcagtccaggcctgtatgggaagccttcaggctatgctgctacgatgcaccgcgagggattcttgtgctgcaaagtgacagacacattgaacggggagagggtctcttttcccgtgtgcacgtatgtgccagctacattgtgtgaccaaatgactggcatactggcaacagatgtcagtgcggacgacgcgcaaaaactgctggttgggctcaaccagcgtatagtcgtcaacggtcgcacccagagaaacaccaataccatgaaaaattaccttttgcccgtagtggcccaggcatttgctaggtgggcaaaggaatataaggaagatcaagaagatgaaaggccactaggactacgagatagacagttagtcatggggtgttgttgggcttttagaaggcacaagataacatctatttataagcgcccggatacccaaaccatcatcaaagtgaacagcgatttccactcattcgtgctgcccaggataggcagtaacacattggagatcgggctgagaacaagaatcaggaaaatgttagaggagcacaaggagccgtcacctctcattaccgccgaggacgtacaagaagctaagtgcgcagccgatgaggctaaggaggtgcgtgaagccgaggagttgcgcgcagctctaccacctttggcagctgatgttgaggagcccactctggaagccgatgtcgacttgatgttacaagaggctggggccggctcagtggagacacctcgtggcttgataaaggttaccagctacgatggcgaggacaagatcggctcttacgctgtgctttctccgcaggctgtactcaagagtgaaaaattatcttgcatccaccctctcgctgaacaagtcatagtgataacacactctggccgaaaagggcgttatgccgtggaaccataccatggtaaagtagtggtgccagagggacatgcaatacccgtccaggactttcaagctctgagtgaaagtgccaccattgtgtacaacgaacgtgagttcgtaaacaggtacctgcaccatattgccacacatggaggagcgctgaacactgatgaagaatattacaaaactgtcaagcccagcgagcacgacggcgaatacctgtacgacatcgacaggaaacagtgcgtcaagaaagaactagtcactgggctagggctcacaggcgagctggtggatcctcccttccatgaattcgcctacgagagtctgagaacacgaccagccgctccttaccaagtaccaaccatag
gggtgtatggcgtgccaggatcaggcaagtctggcatcattaaaagcgcagtcaccaaaaaagatctagtggtgagcgccaagaaagaaaactgtgcagaaattataagggacgtcaagaaaatgaaagggctggacgtcaatgccagaactgtggactcagtgctcttgaatggatgcaaacaccccgtagagaccctgtatattgacgaagcttttgcttgtcatgcaggtactctcagagcgctcatagccattataagacctaaaaaggcagtgctctgcggggatcccaaacagtgcggtttttttaacatgatgtgcctgaaagtgcattttaaccacgagatttgcacacaagtcttccacaaaagcatctctcgccgttgcactaaatctgtgacttcggtcgtctcaaccttgttttacgacaaaaaaatgagaacgacgaatccgaaagagactaagattgtgattgacactaccggcagtaccaaacctaagcaggacgatctcattctcacttgtttcagagggtgggtgaagcagttgcaaatagattacaaaggcaacgaaataatgacggcagctgcctctcaagggctgacccgtaaaggtgtgtatgccgttcggtacaaggtgaatgaaaatcctctgtacgcacccacctcagaacatgtgaacgtcctactgacccgcacggaggaccgcatcgtgtggaaaacactagccggcgacccatggataaaaacactgactgccaagtaccctgggaatttcactgccacgatagaggagtggcaagcagagcatgatgccatcatgaggcacatcttggagagaccggaccctaccgacgtcttccagaataaggcaaacgtgtgttgggccaaggctttagtgccggtgctgaagaccgctggcatagacatgaccactgaacaatggaacactgtggattattttgaaacggacaaagctcactcagcagagatagtattgaaccaactatgcgtgaggttctttggactcgatctggactccggtctattttctgcacccactgttccgttatccattaggaataatcactgggataactccccgtcgcctaacatgtacgggctgaataaagaagtggtccgtcagctctctcgcaggtacccacaactgcctcgggcagttgccactggaagagtctatgacatgaacactggtacactgcgcaattatgatccgcgcataaacctagtacctgtaaacagaagactgcctcatgctttagtcctccaccataatgaacacccacagagtgacttttcttcattcgtcagcaaattgaagggcagaactgtcctggtggtcggggaaaagttgtccgtcccaggcaaaatggttgactggttgtcagaccggcctgaggctaccttcagagctcggctggatttaggcatcccaggtgatgtgcccaaatatgacataatatttgttaatgtgaggaccccatataaataccatcactatcagcagtgtgaagaccatgccattaagcttagcatgttgaccaagaaagcttgtctgcatctgaatcccggcggaacctgtgtcagcataggttatggttacgctgacagggccagcgaaagcatcattggtgctatagcgcggcagttcaagttttcccgggtatgcaaaccgaaatcctcacttgaagagacggaagttctgtttgtattcattcggtacgatcgcaaggcccgtacgcacaattcttacaagctttcatcaaccttgaccaacatttatacaggttccagactccacgaagccggatgtgcaccctcatatcatgtggtgcgaggggatattgccacggccaccgaaggagtgattataaatgctgctaacagcaaaggacaacctggcggaggggtgtgcggagcgctgtataagaaattcccggaaagcttcgatttacagccgatcgaagtaggaaaagcgcgactggtcaaaggtgcagctaaacatatcattcatgccgtaggaccaaacttcaacaaagtttcggaggttgaaggtgacaaacagttggcagaggcttatgagtccatcgctaagattgtcaacgataacaattacaagtcagtagcgattccactgttgtccaccggcatcttttccgggaacaaagatcgactaacccaatcattgaaccatttgctgacagctttagacaccactgatgcagatgtagccatatactgcagggacaagaaatgggaaatgactctcaaggaagcagtggctaggagagaagcagtggaggagatatgcatatccgacgactcttcagtgacagaacctgatgcagagctggtgagggtgcatccgaagagttctttggctggaaggaagggctacagcacaagcgatggcaaaactttctcatatttggaagggaccaagtttcaccaggcggccaaggatatagcagaaattaatgccatgtggcccgttgcaacggaggccaatgagcaggtatgcatgtatatcctcggagaaggcatgagcagtattaggtcgaaatgccccgtcgaagagtcggaagcctccacaccacctagcacgctgccttgcttgtgcatccatgccatgactccagaaagagtacagcgcctaaaagcctcacgtccagaacaaattactgtgtgctcatcctttccattgccgaagtatagaatcactggtgtgcagaagatccaatgctcccagcctatattgttctcaccgaaagtgcctgcgtatattcatccaaggaagtatctcgtggaaacaccaccggtagacgagactccggagccatcggcagagaaccaatccacagaggggacacctgaacaaccaccacttataaccgaggatgagaccaggactagaacgcctgagccgatcatcatcgaagagg
aagaagaggatagcataagtttgctgtcagatggcccgacccaccaggtgctgcaagtcgaggcagacattcacgggccgccctctgtatctagctcatcctggtccattcctcatgcatccgactttgatgtggacagtttatccatacttgacaccctggagggagctagcgtgaccagcggggcaacgtcagccgagactaactcttacttcgcaaagagtatggagtttctggcgcgaccggtgcctgcgcctcgaacagtattcaggaaccctccacatcccgctccgcgcacaagaacaccgtcacttgcacccagcagggcctgctcgagaaccagcctagtttccaccccgccaggcgtgaatagggtgatcactagagaggagctcgaggcgcttaccccgtcacgcactcctagcaggtcggtctcgagaaccagcctggtctccaacccgccaggcgtaaatagggtgattacaagagaggagtttgaggcgttcgtagcacaacaacaatgacggtttgatgcgggtgcatacatcttttcctccgacaccggtcaagggcatttacaacaaaaatcagtaaggcaaacggtgctatccgaagtggtgttggagaggaccgaattggagatttcgtatgccccgcgcctcgaccaagaaaaagaagaattactacgcaagaaattacagttaaatcccacacctgctaacagaagcagataccagtccaggaaggtggagaacatgaaagccataacagctagacgtattctgcaaggcctagggcattatttgaaggcagaaggaaaagtggagtgctaccgaaccctgcatcctgttcctttgtattcatctagtgtgaaccgtgccttttcaagccccaaggtcgcagtggaagcctgtaacgccatgttgaaagagaactttccgactgtggcttcttactgtattattccagagtacgatgcctatttggacatggttgacggagcttcatgctgcttagacactgccagtttttgccctgcaaagctgcgcagctttccaaagaaacactcctatttggaacccacaatacgatcggcagtgccttcagcgatccagaacacgctccagaacgtcctggcagctgccacaaaaagaaattgcaatgtcacgcaaatgagagaattgcccgtattggattcggcggcctttaatgtggaatgcttcaagaaatatgcgtgtaataatgaatattgggaaacgtttaaagaaaaccccatcaggcttactgaagaaaacgtggtaaattacattaccaaattaaaaggaccaaaagctgctgctctttttgcgaagacacataatttgaatatgttgcaggacataccaatggacaggtttgtaatggacttaaagagagacgtgaaagtgactccaggaacaaaacatactgaagaacggcccaaggtacaggtgatccaggctgccgatccgctagcaacagcgtatctgtgcggaatccaccgagagctggttaggagattaaatgcggtcctgcttccgaacattcatacactgtttgatatgtcggctgaagactttgacgctattatagccgagcacttccagcctggggattgtgttctggaaactgacatcgcgtcgtttgataaaagtgaggacgacgccatggctctgaccgcgttaatgattctggaagacttaggtgtggacgcagagctgttgacgctgattgaggcggctttcggcgaaatttcatcaatacatttgcccactaaaactaaatttaaattcggagccatgatgaaatctggaatgttcctcacactgtttgtgaacacagtcattaacattgtaatcgcaagcagagtgttgagagaacggctaaccggatcaccatgtgcagcattcattggagatgacaatatcgtgaaaggagtcaaatcggacaaattaatggcagacaggtgcgccacctggttgaatatggaagtcaagattatagatgctgtggtgggcgagaaagcgccttatttctgtggagggtttattttgtgtgactccgtgaccggcacagcgtgccgtgtggcagaccccctaaaaaggctgtttaagcttggcaaacctctggcagcagacgatgaacatgatgatgacaggagaagggcattgcatgaagagtcaacacgctggaaccgagtgggtattctttcagagctgtgcaaggcagtagaatcaaggtatgaaaccgtaggaacttccatcatagttatggccatgactactctagctagcagtgttaaatcattcagctacctgagaggggcccctataactctctacggctaacctgaatggactacgacatagtctagtccgccaagtctagcatatgggcgcgccctcagcatcgatttgaattggccaccatgagggtccccgctcagctcctggggctcctgctgctctggctcccaggtgcacgatgtgccatgtgggagctggagaaagacgtttatgttgtagaggtggactggactcccgatgcccctggagaaacagtgaacctcacctgtgacacgcctgaagaagatgacatcacctggacctcagaccagagacatggagtcataggctctggaaagaccctgaccatcactgtcaaagagtttctagatgctggccagtacacctgccacaaaggaggcgagactctgagccactcacatctgctgctccacaagaaggaaaatggaatttggtccactgaaattttaaaaaatttcaaaaacaagactttcctgaagtgtgaagcaccaaattactccggacggttcacgtgctcatggctggtgcaaagaaacatggacttgaagttcaacatcaagagcagtagcagttcccctgactctcgggcagtgacatgtggaatggcgtctctgtctgc
agagaaggtcacactggaccaaagggactatgagaagtattcagtgtcctgccaggaggatgtcacctgcccaactgccgaggagaccctgcccattgaactggcgttggaagcacggcagcagaataaatatgagaactacagcaccagcttcttcatcagggacatcatcaaaccagacccgcccaagaacttgcagatgaagcctttgaagaactcacaggtggaggtcagctgggagtaccctgactcctggagcactccccattcctacttctccctcaagttctttgttcgaatccagcgcaagaaagaaaagatgaaggagacagaggaggggtgtaaccagaaaggtgcgttcctcgtagagaagacatctaccgaagtccaatgcaaaggcgggaatgtctgcgtgcaagctcaggatcgctattacaattcctcatgcagcaagtgggcatgtgttccctgcagggtccgatccggaggttccggtggtggatccggaggtggctccggcggcggatccagggtcattccagtctctggacctgccaggtgtcttagccagtcccgaaacctgctgaagaccacagatgacatggtgaagacggccagagaaaaactgaaacattattcctgcactgctgaagacatcgatcatgaagacatcacacgggaccaaaccagcacattgaagacctgtttaccactggaactacacaagaacgagagttgcctggctactagagagacttcttccacaacaagagggagctgcctgcccccacagaagacgtctttgatgatgaccctgtgccttggtagcatctatgaggacttgaagatgtaccagacagagttccaggccatcaacgcagcacttcagaatcacaaccatcagcagatcattctagacaagggcatgctggtggccatcgatgagctgatgcagtctctgaatcataatggcgagactctgcgccagaaacctcctgtgggagaagcagacccttacagagtgaaaatgaagctctgcatcctgcttcacgccttcagcacccgcgtcgtgaccatcaacagggtgatgggctatctgagctccgccggttccggtggcggatccgaagcacacaagagtgagatcgcccatcggtataatgatttgggagaacaacatttcaaaggcctagtcctgattgccttttcccagtatctccagaaatgctcatacgatgagcatgccaaattagtgcaggaagtaacagactttgcaaagacgtgtgttgccgatgagtctgccgccaactgtgacaaatcccttcacactctttttggagataagttgtgtgccattccaaacctccgtgaaaactatggtgaactggctgactgctgtacaaaacaagagcccgaaagaaacgaatgtttcctgcaacacaaagatgacaaccccagcctgccaccatttgaaaggccagaggctgaggccatgtgcacctcctttaaggaaaacccaaccacctttatgggacactatttgcatgaagttgccagaagacatccttatttctatgccccagaacttctttactatgctgagcagtacaatgagattctgacccagtgttgtgcagaggctgacaaggaaagctgcctgaccccgaagcttgatggtgtgaaggagaaagcattggtctcatctgtccgtcagagaatgaagtgctccagtatgcagaagtttggagagagagcttttaaagcatgggcagtagctcgtctgagccagacattccccaatgctgactttgcagaaatcaccaaattggcaacagacctgaccaaagtcaacaaggagtgctgccatggtgacctgctggaatgcgcagatgacagggcggaacttgccaagtacatgtgtgaaaaccaggcgactatctccagcaaactgcagacttgctgcgataaaccactgttgaagaaagcccactgtcttagtgaggtggagcatgacaccatgcctgctgatctgcctgccattgctgctgattttgttgaggaccaggaagtgtgcaagaactatgctgaggccaaggatgtcttcctgggcacgttcttgtatgaatattcaagaagacaccctgattactctgtatccctgttgctgagacttgctaagaaatatgaagccactctggaaaagtgctgcgctgaagccaatcctcccgcatgctacggcacagtgcttgctgaatttcagcctcttgtagaagagcctaagaacttggtcaaaaccaactgtgatctttacgagaagcttggagaatatggattccaaaatgccattctagttcgctacacccagaaagcacctcaggtgtcaaccccaactctcgtggaggctgcaagaaacctaggaagagtgggcaccaagtgttgtacacttcctgaagatcagagactgccttgtgtggaagactatctgtctgcaatcctgaaccgtgtgtgtctgctgcatgagaagaccccagtgagtgagcatgttaccaagtgctgtagtggatccctggtggaaaggcggccatgcttctctgctctgacagttgatgaaacatatgtccccaaagagtttaaagctgagaccttcaccttccactctgatatctgcacacttccagagaaggagaagcagattaagaaacaaacggctcttgctgagctggtgaagcacaagcccaaggctacagcggagcaactgaagactgtcatggatgactttgcacagttcctggatacatgttgcaaggctgctgacaaggacacctgcttctcgactgagggtccaaaccttgtcactagatgcaaagacgccttagccggcggaggttccggtggcggatcccaatactatgactacgatatacccctgttcatgtacgggcaaatatctccaaactgtgcacc
agaatgtaactgccctcactcataccccactgcaatgtactgtgacgacctgaagttgaaatccgtgccaatggtgcctcctgggattaagtacctgtacctccgcaacaatcagatcgaccatattgacgagaaggcttttgaaaacgtcacagacctccagtggcttatcctggaccataacctgcttgaaaatagtaagataaagggcaaagtattttccaaacttaaacagcttaaaaaactccacatcaactacaataaccttactgaatccgtgggaccattgccaaaatctctccaagatttgcagttgactaacaacaagatatccaaactcggctccttcgatgggctggttaatctgactttcatctacttgcaacacaaccaattgaaggaggatgcagtttcagctagtcttaaaggtctgaaaagccttgagtatcttgatctgtcatttaatcaaatgtccaagctccctgctgggctcccaacaagtctgctgacactctatctcgacaataacaagataagtaacattcccgatgagtactttaaaagatttaccggcctccaatacttgcggctttctcacaacgagttggcagactctggtgtacccggcaactcctttaatataagttctcttctcgagcttgatttgtcctataacaaactgaagagtatccctactgtcaatgaaaatttggagaattactacctcgaagtcaatgagcttgagaagttcgatgttaagtctttctgtaagatactgggtccattgtcatacagcaagattaaacatcttcgcttggatgggaatcccttgactcaaagctcacttccccccgacatgtacgaatgcctgagggtagccaacgaaatcacagtaaacggaggtggctcctgagcgatcgctaaatacagcagcaattggcaagctgcttacatagaactcgcggcgattggcatgccgccttaaaatttttattttatttttcttttcttttccgaatcggattttgtttttaatatttcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacgcgtcgaggggaattaattcttgaagacgaaagggccaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcgagctctaatacgactcactatag(seq id no:5)
[0076]
在一些实施方式中，合成溶瘤病毒包括lnp-复制子rna-il-12-血清白蛋白-内腔蛋白。在其他实施方式中，合成溶瘤病毒包括tt3-lnp-复制子rna-il-12-血清白蛋白-内腔蛋白。在其他实施方式中，合成溶瘤病毒包括tt3-lnp-mtreplicon rna-il-12-血清白蛋白-内腔蛋白。il-12在肿瘤微环境中的保留可提高合成溶瘤病毒的功效和安全性。
[0077]
在一些情况下，复制子rna可包括一种或多种具有实验或治疗意义的基因。在一些实施方式中，具有实验或治疗意义的基因编码除il-12之外的细胞因子、趋化因子或生长因子。细胞因子是本领域已知的，并且该术语本身指由免疫系统内的某些细胞分泌并且对其他细胞有效果的小蛋白质的广义分组。已知细胞因子可增强细胞免疫应答，如本文使用的，可包括但不限于tnfα、ifn-γ、ifn-α、tgf-β、il-1、il-2、il-4、il-10、il-13、il-17、il-18和趋化因子。趋化因子可用于研究感染应答、免疫应答、炎症、创伤、败血症、癌症和生殖等应用。趋化因子是本领域已知的，并且是一类细胞因子，其在附近的响应细胞中诱导趋化性，通常是白细胞，对感染位点。趋化因子的非限制性示例包括ccl14、ccl19、ccl20、ccl21、ccl25、ccl27、cxcl12、cxcl13、cxcl-8、ccl2、ccl3、ccl4、ccl5、ccl11和cxcl10。生长因子是本领域已知的，并且术语本身有时可与术语细胞因子互换。如本文使用的，术语“生长因子”指能够在细胞之间传递信号并刺激细胞生长的天然存在的物质。虽然细胞因子可能是生长因子，但某些类型的细胞因子也可能对细胞生长具有抑制作用，因此将这两个术语区分开来。生长因子的非限制性示例包括肾上腺髓质素(am)、血管生成素(ang)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(bmp)、睫状神经营养因子(cntf)、白血病抑制因子(lif)、白细胞介素-6(il-6))、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、表皮生长因子(egf)、肝配蛋白a1、肝配蛋白a2、肝配蛋白a3、肝配蛋白a4、肝配蛋白a5、肝配蛋白b1、肝配蛋白b2、肝配蛋白b3、促红细胞生成素(epo)、成纤维细胞生长因子1(fgf1)、成纤维细胞生长因子2(fgf2)、成纤维细胞生长因子3(fgf3)、成纤维细胞生长因子4(fgf4)、成纤维细胞生长因子5(fgf5)、成纤维细胞生长因子6(fgf6)、成纤维细胞生长因子7(fgf7)、成纤维细胞生长因子8(fgf8)、成纤维细胞生长因子9(fgf9)、成纤维细胞生长因子10(fgf10))、成纤维细胞生长因子11(fgf11)、成纤维细胞生长因子12(fgf12)、成纤维细胞生长因子13(fgf13)、成纤维细胞生长因子生长因子14(fgf14)、成纤维细胞生长因子15(fgf15)、成纤维细胞生长因子16(fgf16)、成纤维细胞生长因子17(fgf17)、成纤维细胞生长因子18(fgf18)、成纤维细胞生长因子19(fgf19)、成纤维细胞生长因子20(fgf20)、成纤维细胞生长因子21(fgf21)、成纤维细胞生长因子22(fgf22)、成纤维细胞生长因子23(fgf23)、胎牛生长激素(fbs)、胶质细胞系衍生神经营养因子(gdnf)、神经秩蛋白、persephin、artemin、生长分化因子-9(gdf9)、肝细胞生长因子(hgf)、肝癌衍生生长因子(hdgf)、胰岛素、胰岛素样生长因子-1(igf-1)、胰岛素样生长因子-2(igf-2)、白细胞介素-1(il-1)、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、角质细胞生长因子(kgf)、迁移刺激因子(msf)、巨噬细胞刺激蛋白(msp)、肌肉生长抑制素(gdf-8)、神经调节蛋白1(nrg1)、神经调节蛋白2(nrg2)、神经调节蛋白3(nrg3)、神经调节蛋白4(nrg4)、脑源性神经营养因子(bdnf))、神经生长因子(ngf)、神经营养蛋白-3(nt-3)、神经营养蛋白-4(nt-4)、胎盘生长因子(pgf)、血小板衍生生长因子(pdgf)、肾酶(rnls)、t细胞生长因子(tcgf)、血小板生成素(tpo)、转化生长因子α(tgf-α)、转化生长因子β(tgf-β)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)和血管内皮生长因子(vegf)。
[0078]
ii.药物组合物
[0079]
在一些方面，本公开至少部分涉及包括如本文所述的合成溶瘤病毒的药物组合物。本文所述的药物组合物可进一步包括药学上可接受的载体(赋形剂)，以形成用于治疗靶疾病的药物组合物。“可接受的”指载体必须与组合物的活性成分相容(并且优选地，能够稳定活性成分)并且对待治疗的受试者无害。药学上可接受的赋形剂(载体)包括本领域众所熟知的缓冲液。参见，例如，remington:the science and practice of pharmacy 20th ed.(2000)lippincott williams and wilkins,ed.k.e.hoover。
[0080]
用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这很容易通过例如通过无菌过滤膜过滤来实现。可将含合成溶瘤病毒的组合物置于具有无菌入口的容器中，例如具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
[0081]
在一些实施方式中，本文使用的药物组合物可以配制用于瘤内注射。如本文使用的，瘤内注射指将抗肿瘤组合物(例如免疫刺激合成溶瘤病毒)直接注射到肿瘤中。可以原位获得高浓度的组合物，同时使用少量药物。免疫治疗的局部施用允许多种联合治疗，同时防止显著的全身性暴露和脱靶毒性。
[0082]
在其他实施方式中，药物组合物可以配制为用于肌内注射、静脉内注射或皮下注射。
[0083]
用于本方法的药物组合物可包括冻干制剂或水溶液形式的药学上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂、盐或稳定剂。参见，例如，remington:the science and practice of pharmacy 20th ed.(2000)lippincott williams and wilkins,ed.k.e.hoover)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且可以包括缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲铵氯化物；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸酯类，例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂如edta；蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇等糖类；形成盐的反离子，如钠；金属复合物(例如，锌-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如tween
tm
、pluronics
tm
或聚乙二醇(peg)。
[0084]
在一些示例中，本文所述的药物组合物包括脂质纳米颗粒，其可通过本领域已知的方法制备，例如epstein,等,proc.natl.acad.sci.usa 82:3688(1985)；hwang,等,proc.natl.acad.sci.usa 77:4030(1980)；和美国专利号4,485,045和4,544,545中描述的。具有延长循环时间的脂质体公开于美国专利号5,013,556中。特别有用的脂质体可以通过反相蒸发方法用脂质组合物产生，该脂质组合物包括磷脂酰胆碱、胆固醇和peg衍生的磷脂酰乙醇胺(peg-pe)。脂质体通过限定孔径的过滤器挤出，以产生具有所需直径的脂质体。
[0085]
在其他示例中，本文所述的药物组合物可以以缓释形式配制。持续释放制剂的合适示例包括含有合成溶瘤病毒的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质呈成形制品的形式，例如薄膜或微胶囊。缓释基质的示例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利号3,773,919)、l-谷氨酸和7-乙基-l-谷氨酸、不可
降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，比如lupron depot
tm
(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)、异丁酸蔗糖乙酸酯和聚d-(-)-3-羟丁酸。
[0086]
合适的表面活性剂特别包括非离子试剂，比如聚氧乙烯山梨糖醇(例如tween
tm
20、40、60、80或85)和其他山梨糖醇(例如span
tm
20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物将方便地包括0.05至5％之间的表面活性剂，并且可以在0.1至2.5％之间。应当理解，如果需要，可以添加其他组分，例如甘露醇或其他药学上可接受的载体。
[0087]
本文所述的药物组合物可为单位剂型，比如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液剂或混悬剂，或栓剂，用于口服、肠胃外或直肠施用，或通过吸入或吹入施用。
[0088]
为了制备固体组合物比如片剂，主要活性成分可以与药学载体混合，例如常规压片成分例如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶，以及其他药物稀释剂，例如水，以形成含有本发明化合物或其无毒药学上可接受的盐的均匀混合物的固体预制剂组合物。当将这些预制剂组合物称为均质时，指活性成分均匀地分散在整个组合物中，使得组合物可以容易地细分为同样有效的单位剂型，例如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将该固体预制剂组合物细分为含有0.1至约500mg本发明活性成分的上述类型的单位剂型。新组合物的片剂或丸剂可以被包衣或以其他方式混合以提供具有延长作用优势的剂型。例如，片剂或丸剂可包括内部剂量和外部剂量组分，后者为在前者之上的包膜形式。这两种成分可以被肠溶层隔开，肠溶层用于抵抗胃中的崩解并允许内部成分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料可用于这种肠溶层或包衣，这种材料包括多种聚合酸以及聚合酸与诸如虫胶、十六醇和醋酸纤维素之类的材料的混合物。
[0089]
合适的乳液可以使用商业上可得的脂肪乳液制备，例如intralipid
tm
、liposyn
tm
、infonutrol
tm
、lipofundin
tm
和lipiphysan
tm
。活性成分可以溶解在预先混合的乳液组合物中，或者它可以溶解在油(例如，大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中并与磷脂(例如，鸡蛋磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)水混合形成的乳液中。应当理解，可以添加其他成分，例如甘油或葡萄糖，以调节乳液的张力。合适的乳液通常含有高达20％的油，例如介于5％和20％之间。脂肪乳剂可以包括具有合适尺寸的脂肪滴并且可以具有在5.5至8.0范围内的ph。
[0090]
用于吸入或吹入的药物组合物包括在药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物的溶液或悬浮液，以及粉末。液体或固体组合物可含有如上所述适当的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，组合物通过口腔或鼻呼吸途径施用以获得局部或全身性作用。
[0091]
在优选无菌的药学上可接受的溶剂中的组合物可以通过使用气体雾化。雾化溶液可以直接从雾化装置呼吸，或者雾化装置可以连接到面罩、帐篷或间歇性正压呼吸机。溶液、悬浮液或粉末组合物可以从以适当方式递送制剂的装置施用，优选口服或鼻腔施用。
[0092]
iii.治疗性应用
[0093]
本文公开的包括合成溶瘤病毒的药物组合物可用于治疗癌症，例如癌症免疫治疗。
[0094]
为了实践本文公开的方法，可以通过合适的途径，例如瘤内施用，通过静脉内施用，将本文所述的有效量的任何药物组合物施用至需要治疗的受试者(例如，人)。作为推注或通过在一段时间内连续输注，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、吸入或局部途径。用于液体制剂的商业上可得的雾化器，包括喷射雾化器和超声雾化
器可用于施用。液体制剂可直接雾化，冷冻干燥粉末可复溶后雾化。可选地，可以使用碳氟化合物制剂和定量吸入器将含有合成溶瘤病毒的药物组合物气雾化，或作为冻干和研磨的粉末吸入。在一些示例中，本文所述的药物组合物被配制用于瘤内注射。在特定示例中，药物组合物可通过局部途径施用至受试者(例如，人类患者)，例如注射至局部位点，例如肿瘤位点或感染位点。
[0095]
如本文使用的，“有效量”指单独或与一种或多种其他活性剂组合赋予受试者治疗效果所需的每种活性剂的量。在一些实施方式中，治疗效果是减少肿瘤负荷、减少癌细胞或增加免疫活性。确定一定量的合成溶瘤病毒是否达到治疗效果对于本领域技术人员来说是显而易见的。如本领域技术人员所认识到的，有效量根据所治疗的特定病症、病症的严重程度、个体患者参数(包括年龄、身体状况、体型、性别和体重)、治疗的持续时间、同步治疗的性质(如果有的话)、具体的施用途径以及健康从业者知识和专业知识范围内的类似因素。这些因素是本领域普通技术人员众所周知的，并且可以通过常规实验解决。通常优选使用单个组分或其组合的最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。
[0096]
经验考虑，比如半衰期，通常将有助于确定剂量。可在治疗过程中确定和调整施用频率，并且通常但不一定基于靶疾病/病症的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。可选地，合成溶瘤病毒的持续连续释放制剂可能是适当的。用于实现持续释放的各种制剂和装置是本领域已知的。
[0097]
在一些实施方式中，治疗是单次注射含有合成溶瘤病毒的药物组合物。在一些实施方式中，单次注射对有需要的受试者进行瘤内施用。
[0098]
在一些示例中，本文所述的合成溶瘤病毒的剂量可以在已经给予一次或多次合成溶瘤药物的个体中凭经验确定。给个体增加剂量的合成溶瘤组合物。为了评估合成溶瘤病毒的功效，可以遵循疾病/病症的指标。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗持续直至出现所需的症状抑制或直至达到足够的治疗水平以减轻靶疾病或病症或其症状。
[0099]
在一些实施方式中，施用频率是每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次或每10周一次；或每月一次、每2个月或每3个月或更长时间。这种治疗的进展很容易通过常规技术和试验进行监测。所用合成溶瘤病毒的施用方案可随时间变化。
[0100]
在一些实施方式中，本文所述的方法包括向需要治疗的受试者(例如，人类患者)施用一剂或多剂含合成溶瘤病毒的药物组合物。
[0101]
出于本公开的目的，如本文所述的合适剂量的合成溶瘤病毒将取决于具体的合成溶瘤病毒、疾病/病症的类型和严重程度、合成溶瘤病毒用于预防或治疗目的、先前的治疗、患者的临床病史和对合成溶瘤病毒的应答，以及主治医生的判断。临床医生可以施用合成溶瘤病毒，直到达到预期结果的剂量。在一些实施方式中，期望的结果是肿瘤负荷减少、癌细胞减少或免疫活性增加。确定剂量是否产生所需结果的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。一种或多种合成溶瘤病毒的施用可为连续的或间断的，这取决于例如接受者的生理状况、施用的目的是治疗性的还是预防性的、以及熟练从业者已知的其他因素。合成溶瘤病毒的施用可以在预选的时间段内基本上是连续的，或者可为一系列间隔剂量，例如，在发展靶疾病或病症之前、期间或之后。
[0102]
如本文使用的，术语“治疗”指将包括一种或多种活性剂的组合物应用或施用给患
有靶疾病或病症、疾病/病症的症状或对疾病/病症有倾向的受试者，目的是治愈、痊愈、缓解、减轻、改变、补救、改善、提高或影响病症、疾病的症状或对疾病或病症的倾向。
[0103]
缓解靶疾病/病症包括延迟疾病的发展或进展，或降低疾病的严重程度。缓解疾病并不一定需要治疗结果。如本文使用的，“延迟”靶疾病或病症的发展指推迟、阻碍、减缓、延迟、稳定和/或推迟疾病的进展。这种延迟可为不同的时间长度，这取决于疾病的历史和/或被治疗的个体。“延迟”或缓解疾病发展或延迟疾病发作的方法是与不使用该方法相比在给定时间范围内降低出现疾病的一种或多种症状的可能性和/或减轻症状程度的方法。这种比较通常基于临床研究，使用的受试者数量足以得出统计学上显著的结果。
[0104]
疾病的“发展”或“进展”指疾病的初始表现和/或随后的进展。可以使用本领域熟知的标准临床技术检测和评估疾病的发展。然而，发展也指可能无法检测的进展。出于本公开的目的，发展或进展指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。如本文使用的，靶疾病或病症的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。
[0105]
在一些实施方式中，将如本文所述的含合成溶瘤病毒的药物组合物以足以减少体内肿瘤负荷或癌细胞生长至少5％(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)。在其他实施方式中，如本文所述的含合成溶瘤病毒的药物组合物可以以有效增加免疫活性至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的量施用。
[0106]
待通过本文所述方法治疗的受试者可为哺乳动物，例如人、农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。在一个实施方式中，受试者是人。如本文所述的含合成溶瘤病毒的组合物可用于增强需要治疗的受试者的免疫活性，例如t细胞活性。
[0107]
在一些实施方式中，受试者可为患有、疑似患有癌症或有患癌症的风险的人类患者。癌症的非限制性示例包括黑色素瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、胃癌癌症，以及各种类型的头颈癌，包括鳞状细胞头颈癌。在一些实施方式中，癌症可为黑色素瘤、肺癌、结肠直肠癌、肾细胞癌、尿路上皮癌或霍奇金淋巴瘤。
[0108]
具有靶疾病或病症(例如，癌症)的受试者可以通过常规医学检查，例如实验室测试、器官功能测试、ct扫描或超声来识别。疑似患有任何这种靶疾病/病症的受试者可能表现出该疾病/病症的一种或多种症状。处于疾病/病症风险中的受试者可为具有一种或多种与该疾病/病症相关的风险因素的受试者。这样的受试者也可以通过常规医疗实践来鉴定。
[0109]
在一些实施方式中，含合成溶瘤病毒的药物组合物可以与另一种适当的治疗剂(例如，抗癌剂、抗病毒剂或抗菌剂)和/或用作增强和/或补充合成溶瘤病毒的免疫刺激效果。在这样的联合治疗中，含合成溶瘤病毒的组合物和另外的治疗剂(例如，抗癌治疗剂或本文所述的其他治疗剂)可以顺序方式施用至需要治疗的受试者，即，每种治疗剂在不同时间施用。可选地，这些治疗剂或至少两种试剂以基本上同时的方式施用至受试者。
[0110]
联合治疗还可以包括将本文所述的试剂(例如，含有合成溶瘤病毒的药物组合物和抗癌剂)与其他生物活性成分(例如，不同的抗癌剂)和非药物治疗(例如手术)进一步联合施用。
[0111]
应当理解，含合成溶瘤病毒的组合物和另一种抗癌剂(例如，化疗剂)的任何组合
可以以任何顺序用于治疗癌症。可以基于多种因素来选择本文所述的组合，这些因素包括但不限于减少肿瘤形成或肿瘤生长、减少癌细胞、增加免疫活性和/或缓解至少一种与癌症相关的症状，或缓解另一种组合药物副作用的功效。例如，本文描述的联合治疗可以减少与组合的每个个体成员相关的任何副作用，例如，与抗癌剂相关的副作用。
[0112]
在一些实施方式中，另一种抗癌治疗剂是化疗、放射治疗、外科治疗和/或免疫治疗。化疗剂的示例包括但不限于卡铂或顺铂、多西他赛、吉西他滨、nab-紫杉醇、紫杉醇、培美曲塞和长春瑞滨。放射治疗的示例包括但不限于电离辐射、伽马辐射、中子束放射治疗、电子束放射治疗、质子治疗、近距离放射治疗、全身放射性同位素和放射增敏剂。外科治疗的示例包括但不限于治疗性手术(例如，肿瘤切除手术)、预防性手术、腹腔镜手术和激光手术。免疫疗法的示例包括但不限于过继细胞转移和治疗性癌症疫苗。
[0113]
化学疗法的其他示例包括但不限于铂剂，例如卡铂、奥沙利铂、顺铂、奈达铂、沙铂、洛巴铂、曲铂、四硝酸酯、吡铂、脯氨酰铂、阿罗铂和其他衍生物；拓扑异构酶i抑制剂，如喜树碱、托泊替康、伊立替康/sn38、鲁比替康、贝洛替康等衍生物；拓扑异构酶ii抑制剂，例如依托泊苷(vp-16)、柔红霉素、多柔比星试剂(例如，多柔比星、多柔比星hcl、多柔比星类似物或脂质体中的多柔比星及其盐或类似物)、米托蒽醌、阿柔比星、表柔比星、伊达比星、氨柔比星、安吖啶、吡柔比星、戊柔比星、佐柔比星、替尼泊苷和其他衍生物；抗代谢药，如叶酸家族(甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞、氨蝶呤和相关的药物)；嘌呤拮抗剂(硫鸟嘌呤、氟达拉滨、克拉屈滨、6-巯基嘌呤、喷司他丁、氯法拉滨及相关的药物)和嘧啶拮抗剂(阿糖胞苷、氟尿苷、阿扎胞苷、替加氟、卡莫夫、卡培他滨、吉西他滨、羟基脲、5-氟尿嘧啶(5fu)和相关药物)；烷化剂，例如氮芥(例如，环磷酰胺、左旋溶肉瘤素、苯丁酸氮芥、二氯甲基二乙胺、异环磷酰胺、曲洛磷胺、泼尼莫司汀、苯达莫司汀、乌拉莫司汀、雌莫司汀和相关的药物)；亚硝基脲类(例如，卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、福特莫司汀、尼莫司汀、雷尼莫司汀、链脲佐菌素和相关的药物)；三氮烯(例如，达卡巴嗪、氯胺酮、替莫唑胺和相关药物)；烷基磺酸盐(例如，白消安、甘露舒凡、苏消安和相关的药物)甲基苄肼；二溴甘露醇和氮丙啶(例如，卡波醌、三亚胺醌、thiotepa、三亚乙基丙二胺和相关药物)；抗生素，例如羟基脲、蒽环类抗生素(例如多柔比星剂、柔红霉素、表柔比星和其他衍生物)；蒽二酮类(例如，米托蒽醌和相关药物)；链霉菌属(例如，博莱霉素、丝裂霉素c、放线菌素、普卡霉素)；和紫外光。
[0114]
iii.用于治疗的试剂盒
[0115]
本公开还提供了用于针对癌症(例如，黑色素瘤、肺癌、结肠直肠癌或肾细胞癌)和/或治疗癌症或降低癌症风险的免疫疗法的试剂盒。这种试剂盒可包括一个或多个容器，其包括含合成溶瘤病毒的药物组合物，例如本文所述的任何组合物。
[0116]
在一些实施方式中，试剂盒可包括根据本文所述的任何方法使用的说明书。例如，所包括的说明可以包括对施用含合成溶瘤病毒的组合物以治疗、延迟发作或缓解如本文所描述的那些靶疾病。该试剂盒进一步包括基于坚定个体是否患有靶疾病来选择适合治疗的个体的描述。在其他实施方式中，说明书包括向处于靶疾病风险中的个体施用含合成溶瘤病毒的组合物的描述。
[0117]
与含合成溶瘤病毒的组合物的使用有关的说明通常包括有关剂量、施用方案和用于预期治疗的施用途径的信息。容器可为单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒中提供的说明通常是标签或包装插页上的书面说明(例如，试剂盒中
包括的纸页)，但机器可读的说明(例如，携带在磁盘或光盘上的说明)也是可接受的。
[0118]
标签或包装插页表明该组合物用于治疗、延迟发作和/或缓解与癌症相关的疾病或病症，比如本文所述的那些。可提供用于实践本文所述的任何方法的说明。
[0119]
如本文所述的试剂盒装在适当的包装中。适当的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、软包装(例如密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。还考虑了与特定装置例如吸入器、鼻施用装置(例如雾化器)或输液装置例如微型泵结合使用的包装。试剂盒可以具有无菌入口(例如，容器可为静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。容器还可具有无菌入口(例如，容器可为静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是含合成溶瘤病毒的组合物，例如本文所述的那些。
[0120]
试剂盒可以选择性地提供附加组件，例如缓冲液和解释性信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。在一些实施方式中，本发明提供包括上述试剂盒内容物的制品。
[0121]
iv.常用技术
[0122]
除非另有说明，本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。molecular cloning:a laboratory manual,second edition(sambrook,等,1989)cold spring harbor press；oligonucleotide synthesis(m.j.gait,ed.,1984)；methods in molecular biology,humana press；cell biology:a laboratory notebook(j.e.cellis,ed.,1998)academic press；animal cell culture(r.i.freshney,ed.,1987)；introduction to cell and tissue culture(j.p.mather and p.e.roberts,1998)plenum press；cell and tissue culture:laboratory procedures(a.doyle,j.b.griffiths,and d.g.newell,eds.,1993-8)j.wiley and sons；methods in enzymology(academic press,inc.)；handbook of experimental immunology(d.m.weir and c.c.blackwell,eds.)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.m.miller and m.p.calos,eds.,1987)；current protocols in molecular biology(f.m.ausubel,等,eds.,1987)；pcr:the polymerase chain reaction,(mullis,等,eds.,1994)；current protocols in immunology(j.e.coligan等,eds.,1991)；short protocols in molecular biology(wiley and sons,1999)；immunobiology(c.a.janeway and p.travers,1997)；antibodies(p.finch,1997)；antibodies:a practical approach(d.catty.,ed.,irl press,1988-1989)；monoclonal antibodies:a practical approach(p.shepherd and c.dean,eds.,oxford university press,2000)；using antibodies:a laboratory manual(e.harlow and d.lane(cold spring harbor laboratory press,1999)；the antibodies(m.zanetti and j.d.capra,eds.,harwood academic publishers,1995)。不再赘述，相信本领域技术人员基于以上描述可以最大限度地利用本发明。因此，以下具体实施方式应解释为仅是阐释性的，而不以任何方式限制本公开的其余部分。出于本文引用的目的或主题，本文引用的所有出版物通过引用并入。
[0123]
不再赘述，相信本领域技术人员基于以上描述可以最大限度地利用本发明。因此，以下特定实施方式应被解释为仅是说明性的，而不以任何方式限制本公开的其余部分。出于本文引用的目的或主题，本文引用的所有出版物通过引用并入。
[0124]
实施例
[0125]
材料和方法
[0126]
细胞系和动物
[0127]
按照供应商的说明培养(37℃，5％co2)细胞系b16f10(crl-6475
tm
)、hek-blue-tlr2(invivogen)、hek-blue-tlr3(invivogen)、hek-blue-tlr7(invivogen)、hek-blue-tlr9(invivogen)、raw-lucia isg(invivogen)。购买6-8周龄的雌性c57bl/6j(jax stock no.000664)小鼠并且在麻省理工学院(mit)的动物设施中饲养。所有的物研究和程序均按照联邦、州和地方指导方针进行，并且由麻省理工学院动物护理委员会根据iacuc批准的动物协议进行。
[0128]
抗体，染色和facs分析
[0129]
抗小鼠ly6c(hk1.4)、cd11b(m1/70)、cd11c(n418)、f4/80(bm8)、mhc-ii(m5/114.15.2)、cd45(30-f11)、cd3(17a2)、cd4(gk1.5)、cd8(53-6.7)、nk1.1(pk136)、cd45.2(104)、cd24(30-f1)、xcr1(zet)、cd64(x54-5/7.1)的抗体来自biolegend。抗小鼠ly6g(1a8)、cd16/32(2.4g2)和cd103(m290)的抗体来自biolegend。抗小鼠ly6g(1a8)、cd16/32(2.4g2)和cd103(m290)的抗体来自bd biosciences。抗小鼠钙网蛋白(ab2907)的抗体来自abcam。活/死染料(l34966)来自thermofisher。
[0130]
在麻省理工学院动物护理委员会根据iacuc批准的动物协议下，按照联邦、州和地方指南处死携带b16f10黑色素瘤的小鼠并且进行尸检。然后将肿瘤引流的淋巴结磨碎，并且将肿瘤切片并用胶原酶iv(1mg/ml)消化1小时，以获得单细胞悬液。通过70μm尼龙限制器将单细胞悬液过滤并且按所描述的进行染色
10
。
[0131]
通过来自bd biosciences的facs分析仪(lsr-ii或lsr-ii-fortessa)分析染色的样品。在bd-lsrii fortessa分析仪上进行分析。通过flowjo(flowjo llc)分析所有的流式细胞术数据，并且使用graphpad prism绘制绘图。
[0132]
构建体，体外转录，复制子rna的加帽/甲基化和neon转染
[0133]
突变复制子构建体的骨架来自先前研究(修订中)的体外进化。il12-msa和il12-msa-内腔蛋白是从dane wittrup教授实验室的质粒中扩增而来，并且在突变复制子的亚基因组区域进行工程改造。
[0134]
按照制造商的说明，使用megascript
tm
t7转录试剂盒(thermofisher)从上述线性化vee构建体的模板体外转录(ivt)复制子rna。根据制造商的说明，使用scriptcap
tm
m7g加帽系统和scriptcap
tm2’‑
o-甲基转移酶试剂盒(cellscript)对生成的复制子rna进行加帽和甲基化。通过凝胶电泳评估rna纯度。
[0135]
在1200电压、20毫秒和1个脉冲的条件下，在neon电穿孔试剂盒(thermofisher)的100μl r缓冲液中，每500,000个细胞使用5μg rna进行体外转染。
[0136]
脂质纳米颗粒制剂和复制子rna的封装
[0137]
为了将10μg复制子rna封装到dotap纳米颗粒中，在乙醇中制备摩尔比为40:10:48:2的由16.9375μl dotap(avanti,cat#890890,10mg/ml)、15.965μl dspc(avanti,cat#850365,3mg/ml)、18.7675μl胆固醇(sigma-aldrich,cat#c8667,6mg/ml)、13.6μl dspe-peg2000(avanti cat#880128,2.5mg/ml)组成的脂质混合物，并在n2下蒸发直到剩余总初始体积的三分之一。然后用移液器加入11.8μl 0.1m柠檬酸盐缓冲液(ph6.0)中的10μg复制
子rna(1mg/ml)，然后用移液器再次加入22μl 0.1m柠檬酸盐缓冲液(ph 6.0)。将混合物振摇一小时，并且然后在3,500mwco透析盒中于25℃对pbs再透析一小时。
[0138]
按照lipofectamine
tm
messengermax
tm
转染试剂(thermofisher.com/order/catalog/product/lmrna008)的说明将复制子rna封装到脂质体纳米颗粒中。
[0139]
为了将10μg复制子rna封装到tt3纳米颗粒中，在10.437μl乙醇中制备摩尔比为20:30:40:0.75的由10μl tt3(10mg/ml)
11
、8.04μl dope(avanti，cat#850725，10mg/ml)、5.572μl胆固醇(sigma-aldrich，cat#c8667,10mg/ml)，3.452μl c14-peg2000(avanti cat#880150，2mg/ml)组成的脂质混合物。向混合物中添加4.167μl柠檬酸盐缓冲液(ph 3.0,10mm)。然后通过移液器加入31.667μl柠檬酸盐缓冲液(ph 3.0,10mm)中的10μg复制子rna(1mg/ml)。混合物在3,500mwco透析盒中在25℃下对pbs透析80分钟。
[0140]
将得到的载有复制子的脂质纳米颗粒以适当的剂量等分，用于瘤内注射(10μg/小鼠)和体外转染(5μg/50万个细胞在500μl培养基中)。
[0141]
膜联蛋白v/pi染色、atp试验和elisa
[0142]
膜联蛋白v/pi染色根据biolegend试剂盒(cat#640932)的说明。细胞外atp通过atp assay system(promega)进行分析。hmgb1、ccl5、ifnα2、il12、ifnγ通过来自chondrex(cat#6010,hmgb1)、r&d system(cat#dy478,ccl5)、abcam(cat#ab215409,ifnα2)和biolegend(cat#88-7121-88，il12、cat#88-7314-88，ifnγ)的elisa试剂盒测量并根据他们的手册。
[0143]
rna提取和定量pcr分析
[0144]
为了量化rna转录体的水平，按照指示从用lnp复制子rna转染的细胞或肿瘤中提取总rna，并通过taqman
tm
逆转录试剂盒(abi目录号n8080234)逆转录，然后用sybr green master mix(roche)和stat1(cat#mp215434)、stat2(cat#mp215434)、irf9(cat#mp206708)、irf3(cat#mp206702)、cgas(cat#mp214711)的特异性引物扩增，并由roche lightcycler检测。ct值用管家基因小鼠肌动蛋白b标准化以进行比较。
[0145]
实施例1：用于癌症免疫治疗的合成多合一lnp复制子rna
[0146]
通过封装复制子rna的合成多功能脂质纳米颗粒(lnp)可以简化治疗过程并增强治疗功效，脂质和rna组分各自发挥多种作用：一种脂质制剂，既可促进细胞吸收/细胞溶质递送rna，同时也可直接触发免疫原性细胞死亡。同时，该lnp提供自扩增的复制子rna，它既编码免疫调节治疗蛋白，又直接提供免疫刺激，扩增随后的免疫应答。从功能上讲，该合成的lnp复制子rna应在肿瘤中诱导局部免疫原性细胞死亡，并在转染细胞中适当表达免疫调节。免疫原性细胞死亡可增强免疫细胞对肿瘤的浸润，并且提供肿瘤特异性抗原的储存库，这些抗原可交叉呈递以引发新的t细胞应答。含有阳离子脂质tt3的lnp制剂被确定为与这些目标特别相关：比较了3种阳离子脂质纳米颗粒，每一种都包括一种关键的阳离子脂质——dotap、脂质体(lipo)或tt3。作为rna货物，使用源自委内瑞拉马脑炎病毒的甲病毒复制子，其中其结构蛋白被插入在亚基因组启动子下的感兴趣的货物基因所取代。当用这种自扩增复制子rna(lnp-mtrep)配制时，dotap、脂质和tt3脂质制剂形成平均直径为97nm、46nm和105nm的纳米颗粒，ζ电位分别为+22.9mv、-6.7mv和+4.3mv(图1g-图1h)。通过在体外将每种制剂与b16f10黑色素瘤肿瘤细胞一起孵育来评估“空的”与载有rna(mtrep)lnp的毒性。该测定表明，用tt3lnp处理的细胞的生存力显著降低，并且mtrep与tt3协同促进在转染
后3天进一步杀死肿瘤细胞(图1a)。tt3 lnps在促进肿瘤细胞死亡方面比dotap或lipo更有效。值得注意的是，将复制子直接电穿孔到肿瘤细胞中是相对无毒的，这表明lnp递送促进了细胞杀伤。为了确定tt3lnp递送的复制子是否可以在细胞死亡之前驱动货物基因表达，我们评估了lnp(mtrep)处理后报告基因gfp的表达。tt3-mtrep处理导致～35.4％的b16f10细胞在转染后12小时表达gfp，低于电穿孔(～90％)，但显著优于dotap-mtrep(～0.05％)或lipo-mtrep(～7.6％)处理(图1b)。与图1a一致，用tt3纳米颗粒转染的细胞显示出大量的膜联蛋白v+/pi+死细胞，mtrep再次与这种细胞死亡协同作用(图1c)。
[0147]
为了确定由tt3(mtrep)触发的细胞死亡是否是一种免疫原性细胞死亡(icd)，测量了通常停留在内质网(er)上并在icd1期间作为eat-me信号传输到细胞表面的钙网蛋白(crt)。tt3和mtrep协同促进crt运输到细胞表面(图1d)。在icd期间，细胞外atp激活nlrp3炎症小体2，细胞外hmgb1介导炎症3。tt3、tt3-mtrep和tt3-derep有效诱导atp和hmgb1释放(图1e和1f)。总而言之，tt3-mtrep rna是一种很有前途的溶瘤制剂，可以诱导免疫原性细胞死亡，同时还导致复制子编码的货物基因的瞬时表达。
[0148]
实施例2：复制子rna触发tlr3信号传导并且诱导与坏死细胞死亡相关的isgf3复合物
[0149]
为了确定复制子和tt3 lnp细胞死亡协同作用的机制，将带有或不带有编码报告基因(或封装缺乏功能性基因表达的突变“死”复制子(derep))的封装mtrep的dotap、lipo或tt3纳米颗粒转染到报告细胞hek-tlr2、hek-tlr3、hek-tlr7或hek-tlr9(invivogen.com)。携带mtrep或derep的lipo和tt3 lnp都激活了tlr3信号传导，但其他测试的tlr均未受到刺激(图2a-图2d)。在raw-lucia-isg报告细胞(invivogen.com)上进行测试时，这些相同的lnp制剂显著诱导了干扰素刺激的基因(图2e)。这些数据表明tlr3识别复制子rna并且诱导干扰素应答以响应lnp介导的递送。
[0150]
由于复制子rna通过trif激活tlr3信号传导以产生i型干扰素4，导致isgf3(stat1/stat2/irf9)复合物激活以导致坏死细胞死亡5，因此我们通过qpcr检测了isgf3复合成分stat1、stat2和irf9以及sting通路基因irf3和cgas的mrna转录水平。封装mtrep或derep的tt3纳米颗粒分别比未处理的对照增加了stat1、stat2、irf9水平的～6、～16和～3倍(图2f-图2h)。相反，它对irf3或cgas的转录没有影响(图2i-图2j)。dotap和lipo制剂未能诱导isgf3复合物，可能是因为这些纳米颗粒对复制子rna的转染效率低(图1b)。这些数据表明mtrep和derep可能激活tlr3信号并诱导isgf3复合物以促进坏死细胞死亡，这是一种免疫原性细胞死亡。
[0151]
实施例3：tt3-mtrep募集免疫细胞并使已建立的肿瘤消退
[0152]
tt3-mtrep是否对免疫原性细胞死亡和体内货物基因的表达有影响是令人感兴趣的。ly6c
lo ly6g
+
粒细胞群的绝对数量与对坏死细胞死亡的应答6相关，在肿瘤内注射封装野生型复制子rna(wtrep)和另一种突变复制子rna(mt2rep)以及上面使用的突变复制子(mtrep)的tt3纳米颗粒后3天时在肿瘤中测量)。出乎意料的是，mtrep显示出明显更多(～2倍)该粒细胞群体向肿瘤的募集(图3a)，以及由亚基因组启动子编码的报告基因mcherry的更好表达(图3b)。因此，tt3-mtrep通过适当的货物基因表达诱导免疫原性细胞死亡。随后进行了使用tt3-mtrep的体内研究。
[0153]
测量了复制子的肿瘤内lnp递送后stat1/stat2/irf9以及sting信号传导基因
tumor microenvironment promoting cancer immune control.cell 172,1022-1037e1014,doi:10.1016/j.cell.2018.01.004(2018).
[0168]
8 lasek,w.,zagozdzon,r.&jakobisiak,m.interleukin 12:still a promising candidate for tumor immunotherapy？cancer immunol immunother63,419-435,doi:10.1007/s00262-014-1523-1(2014).
[0169]
9 montoya,m.等type i interferons produced by dendritic cells promote their phenotypic and functional activation.blood 99,3263-3271,doi:doi10.1182/blood.v99.9.3263(2002).
[0170]
10 li,y.等persistent antigen and prolonged akt-mtorc1 activation underlie memory cd8 t cell impairment in the absence of cd4 t cells.j immunol 195,1591-1598,doi:10.4049/jimmunol.1500451(2015).
[0171]
11 li,b.等an orthogonal array optimization of lipid-like nanoparticles for mrna delivery in vivo.nano lett 15,8099-8107,doi:10.1021/acs.nanolett.5b03528(2015).
[0172]
其他实施方式
[0173]
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以被用于相同、等效或类似目的的替代特征替换。因此，除非另有明确说明，所公开的每个特征仅是等效或相似特征的通用系列的示例。
[0174]
由以上描述，本领域技术人员可以很容易地确定本发明的本质特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种变化和修改以适应各种用途和条件。因此，其他实施例也在权利要求内。
[0175]
等效方案
[0176]
虽然这里已经描述和阐释了几个创造性的实施方式，但是本领域的普通技术人员将容易地设想用于实施功能和/或获得本文所述的结果和/或一个或多个优点的各种其他手段和/或结构，并且这种变化和/或修改中的每一个都被认为在本文描述的发明实施方式的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文描述的所有参数、尺寸、材料和配置旨在示例性并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于特定应用使用本发明的教导。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的特定发明实施方式的许多等效物。因此，应当理解，前述实施方式仅通过示例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等价物的范围内，可以以不同于具体描述和要求保护的方式来实践本发明的实施方式。本公开的发明实施方式涉及本文描述的每个单独的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。此外，两个或多个这种特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合，如果这种特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法不相互矛盾，则包括在本公开的发明范围内。
[0177]
如本文所定义和使用的所有定义应理解为控制字典定义、通过引用并入的文档中的定义和/或所定义术语的普通含义。
[0178]
在此公开的所有参考文献、专利和专利申请都通过引用的方式并入每个被引用的主题，在某些情况下可以包括整个文件。
[0179]
在说明书和权利要求中使用的不定冠词“一(a)”和“一个(an)”，除非明确指出相反，否则应理解为“至少一个”。
[0180]
说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为表示如此结合的元件中的“一个或两个”，即在某些情况下结合出现而在其他情况下分离出现的元件。用“和/或”列出的多个元件应以相同的方式解释，即“一个或多个”这样连接的元件。除了由“和/或”子句具体标识的元件之外，可以可选地存在其他元件，无论与那些具体标识的元件相关或不相关。因此，作为非限制性示例，当与诸如“包括”之类的开放式语言结合使用时，对“a和/或b”的引用可以在一个实施方式中仅指a(任选地包括除b之外的元件)；在另一个实施方式中，仅针对b(任选地包括除a之外的元件)；在又一实施方式中，针对a和b两者(任选地包括其他元件)；等等。
[0181]
如本文在说明书和权利要求中使用的，“或”应理解为与如上定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包括性的，即包括至少一个，但也包括多个元件或列表中的多个元件，以及(任选地)其他未列出的项目。只有明确指出相反的术语，例如“仅...元件。一般而言，本文中使用的术语“或”仅应解释为表示排他性的替代方案(即“一个或另一个但不是两者”)，当前面有排他性术语，例如“要么”、“其中之一”、“只有其中之一”或“恰好是其中之一”。“主要由
……
组成”在权利要求中使用时，应具有专利法领域中的普通含义。
[0182]
如本文在说明书和权利要求中所使用的，关于一个或多个元件的列表的短语“至少一个”应被理解为意指选自以下元件列表中任何一个或多个元件中的至少一个元件。但不一定包括元件列表中具体列出的每个元件中的至少一个，并且不排除元件列表中元件的任何组合。该定义还允许除了在短语“至少一个”所指的元件列表中具体标识的元件之外的元件可以可选地存在，无论与那些具体标识的元件相关或不相关。因此，作为非限制性示例，“a和b中的至少一个”(或等效地，“a或b中的至少一个”，或等效地“a和/或b中的至少一个”)可以指在一个实施方式中，至少一个，任选地包括多于一个a，不存在b(并且任选地包括除b之外的元件)；在另一个实施方式中，至少一个，任选地包括多于一个b，不存在a(并且任选地包括除a之外的元件)；在又一实施方式中，至少一个，可选地包括多于一个a，和至少一个，可选地包括多于一个b(和可选地包括其他元件)；等等。
[0183]
还应该理解的是，除非明确指出相反，在本文要求保护的任何方法中，包括一个以上的步骤或动作，该方法的步骤或动作的顺序不一定限于阐述该方法的步骤或动作的顺序。