1.本发明涉及生物医药提取技术领域，具体涉及到一种从大鲵肽中提取乙拉西坦的方法。


背景技术：

2.乙拉西坦(etiracetam)是左乙拉西坦(levetiracetam，lev)的一种外消旋中间体。乙拉西坦具有与左乙拉西坦同样的药理作用活性。左乙拉西坦别名乐凡替拉西坦、利维西坦、左旋乙拉西坦，是一种新型抗癫痫药物(aeds)，独特的抗癫痫作用机制，同时也是一种白色结晶粉末的化学品。其化学名称为(s)-α-乙基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺，分子式为c8h
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n2o2，分子量为170.20900。1999年左乙拉西坦获美国fda批准，用于成人部分性癫痫发作的添加治疗，2005年欧盟批准左乙拉西坦单药治疗癫痫部分性发作伴或不伴继发性全面性发作的16岁以上新诊断的癫痫。2007年3月在我国批准上市，适用于成人及4岁以上儿童癫痫患者部分性发作的添加治疗。左乙拉西坦是较为常用的抗癫痫药物，口服吸收快，生物利用度高，是理想的儿童抗癫痫药物，二者在临床上都有耐受性好、毒副作用小、药物间的相互作用少的特点。
3.中国大鲵属于脊索动物门，两栖纲，现属于我国二类野生保护动物。中国历史长河中关于大鲵的记载有：《山海经》云:“决水有鱼,状如鱼帝,食之己痴疾。性甘淡,能截疟”。《尔雅》又记“鋭之大者谓之鰕，鋭鱼似鲇，四脚，前似称猴，后似狗，声如小儿啼，大者八、九尺”。《史记秦始皇本纪》记载“以人鱼膏为烛，度不灭者久之”。《名医别录》中说：“其膏燃之不消耗，秦始皇山冢中所用人鱼膏是也”。《水经注》记载“鱼龙以秋日为夜，龙秋分而降，势寝于渊，故以秋为夜也”。《本草纲目》“鳞目、四部、大鲵
……
以痴疾”。《本草拾遗》“治痴疾、治牛、治斑疾”。
4.农业部规定养殖大鲵可作为食物资源进行合理开发，随着人工繁殖和育苗等关键技术的突破，大鲵养殖逐渐规模化，大鲵资源出现供大于求的问题。除直接食用或进行粗加工外，对大鲵资源进行深度开发相对较少，因此制约了大鲵产业的发展。目前市场中存在的主要是以大鲵肽为主要原料生产的产品，现代对大鲵医用价值的研究和应用为零。
5.现有技术中，没有文献公开过大鲵中能提取出乙拉西坦，也没有文献公开过从大鲵肽中提取乙拉西坦的提取方法，本发明提出了一种从大鲵肽中提取乙拉西坦的方法，为历史古籍中记载大鲵能治疗精神类疾病提供了佐证。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种从大鲵肽中提取乙拉西坦的方法，用于填补现有技术中大鲵肽中能提取出左乙拉西的技术空白。
7.为达上述目的，本发明的一个实施例中提供了一种从大鲵肽中提取乙拉西坦的方法，包括以下步骤：
8.步骤(1)溶解：将大鲵肽溶解于水，得到大鲵肽水溶液；
9.步骤(2)第一次纯化：去除大鲵肽水溶液中的弱极性有机分子和含有极性基团的分子；
10.步骤(3)第二次纯化：通过色谱洗脱分别流出极性、弱极性以及非极性组分，并且非极性组分最后流出；
11.步骤(4)去除水分：除去步骤(3)中得到的溶液的水分，除去水分后得到乙拉西坦。
12.本发明优选的方案之一，步骤(2)中通过大孔吸附树脂吸附去除大鲵肽水溶液中的弱极性有机分子，去除含有极性基团的分子通过使用洗脱剂进行洗脱实现。
13.本发明优选的方案之一，步骤(3)中非极性组分最后流出通过色谱洗脱实现。
14.本发明优选的方案之一，步骤(4)中通过浓缩除去步骤(3)中得到的溶液的水分。
15.本发明优选的方案之一，大孔吸附树脂为ab-8型大孔吸附树脂，洗脱剂为乙酸乙酯和二氯甲烷的混合液，其中乙酸乙酯和二氯甲烷的体积比为60-80：30。
16.本发明优选的方案之一，色谱洗脱的条件为：色谱柱为c18反相色谱柱，流动相分别为流动相a和流动相b，流动相a为乙腈，流动相b为水相，流速为0.8ml/min-1.2ml/min，柱温为24℃-32℃。
17.本发明优选的方案之一，水相为三氯乙酸和甲酸铵的混合液，其中三氯乙酸和甲酸铵的体积比为1-3:1。
18.本发明优选的方案之一，三氯乙酸的质量分数为0.3％，甲酸铵的浓度为10mol/l。
19.本发明优选的方案之一，浓缩为减压浓缩。
20.综上所述，本发明的有益效果为：
21.1、本发明公开了一种能从大鲵肽中提取出治疗癫痫类精神药物乙拉西坦的方法，填补了现有技术中大鲵肽中能提取出乙拉西坦的空白，同时也为历史古籍中记载大鲵能治疗精神类疾病提供了佐证。
22.2、本发明是在对大鲵医用价值和利用开发的长期奋战过程中的结果，深入发掘大鲵更多更好的价值。
23.3、本发明乙拉西坦的提取方法中采用了洗脱色谱法，洗脱色谱法具有分离效率高、分析速度快、检验灵敏度高、样品用量少、选择性好、多组分同时分析、易于自动化的优点。
附图说明
24.图1为本发明一个实施例提取出的乙拉西坦的一部分质谱图；
25.图2为本发明一个实施例中图1的另一部分质谱图；
26.图3为本发明一个实施例提取出的乙拉西坦的结构式。
具体实施方式
27.实施例1
28.一种从大鲵肽中提取乙拉西坦的方法，包括以下步骤：
29.步骤(1)溶解：将大鲵肽溶解于水，得到大鲵肽水溶液；
30.步骤(2)第一次纯化：将大鲵肽水溶液经ab-8型大孔吸附树脂进行吸附，去除大鲵肽水溶液中的弱极性有机分子，吸附后再用乙酸乙酯和二氯甲烷的混合液进行洗脱，洗脱
的目的在于去除含有极性基团的分子，其中乙酸乙酯和二氯甲烷的体积比为70:30；
31.步骤(3)第二次纯化：将步骤(2)中得到的洗脱液再次进行色谱洗脱，分别流出极性、弱极性以及非极性组分，并且非极性组分最后流出；其中色谱柱为agilentzorbaxeclinp－sexdb－c18反相色谱柱，流动相分别为流动相a和流动相b，流动相a为乙腈，流动相b为水相，水相为三氯乙酸和甲酸铵的混合液，并且三氯乙酸和甲酸铵的体积比为2:1，流速为1.0ml/min，柱温为28℃；
32.步骤(4)去除水分：将步骤(3)中得到的洗脱液进行减压浓缩以去除水分，浓缩后得到乙拉西坦，乙拉西坦的提取率为0.23％。
33.步骤(3)中选用反相色谱的原因在于：反相色谱因其与组分无强烈作用，组分不会长时间滞留污染柱子，且反相色谱用水做底溶剂，掺入其他弱极性、非极性溶剂如乙腈等有机物改变流动相极性达到分离目的，水的紫外吸收遏制波长低，不会干扰检测，且水易得便宜。
34.实施例2
35.一种从大鲵肽中提取乙拉西坦的方法，包括以下步骤：
36.步骤(1)溶解：将大鲵肽溶解于水，得到大鲵肽水溶液；
37.步骤(2)第一次纯化：将大鲵肽水溶液经ab-8型大孔吸附树脂进行吸附，去除大鲵肽水溶液中的弱极性有机分子，吸附后再用乙酸乙酯和二氯甲烷的混合液进行洗脱，洗脱的目的在于去除含有极性基团的分子，其中乙酸乙酯和二氯甲烷的体积比为60:30；
38.步骤(3)第二次纯化：将步骤(2)中得到的洗脱液再次进行色谱洗脱，分别流出极性、弱极性以及非极性组分，并且非极性组分最后流出；其中色谱柱为agilentzorbaxeclinp－sexdb－c18反相色谱柱，流动相分别为流动相a和流动相b，流动相a为乙腈，流动相b为水相，水相为三氯乙酸和甲酸铵的混合液，并且三氯乙酸和甲酸铵的体积比为1:1，流速为0.8ml/min，柱温为24℃；
39.步骤(4)去除水分：将步骤(3)中得到的洗脱液进行减压浓缩以去除水分，浓缩后得到乙拉西坦，乙拉西坦的提取率为0.10％。
40.实施例3
41.一种从大鲵肽中提取乙拉西坦的方法，包括以下步骤：
42.步骤(1)溶解：将大鲵肽溶解于水，得到大鲵肽水溶液；
43.步骤(2)第一次纯化：将大鲵肽水溶液经ab-8型大孔吸附树脂进行吸附，去除大鲵肽水溶液中的弱极性有机分子，吸附后再用乙酸乙酯和二氯甲烷的混合液进行洗脱，洗脱的目的在于去除含有极性基团的分子，其中乙酸乙酯和二氯甲烷的体积比为80:30；
44.步骤(3)第二次纯化：将步骤(2)中得到的洗脱液再次进行色谱洗脱，分别流出极性、弱极性以及非极性组分，并且非极性组分最后流出；其中色谱柱为agilentzorbaxeclinp－sexdb－c18反相色谱柱，流动相分别为流动相a和流动相b，流动相a为乙腈，流动相b为水相，水相为三氯乙酸和甲酸铵的混合液，并且三氯乙酸和甲酸铵的体积比为3:1，流速为1.2ml/min，柱温为32℃；
45.步骤(4)去除水分：将步骤(3)中得到的洗脱液进行减压浓缩以去除水分，浓缩后得到乙拉西坦，乙拉西坦的提取率为0.29％。
46.实施例4
47.一种从大鲵肽中提取乙拉西坦的方法，包括以下步骤：
48.步骤(1)溶解：将大鲵肽溶解于水，得到大鲵肽水溶液；
49.步骤(2)第一次纯化：将大鲵肽水溶液经ab-8型大孔吸附树脂进行吸附，去除大鲵肽水溶液中的弱极性有机分子，吸附后再用乙酸乙酯和二氯甲烷的混合液进行洗脱，洗脱的目的在于去除含有极性基团的分子，其中乙酸乙酯和二氯甲烷的体积比为65:30；
50.步骤(3)第二次纯化：将步骤(2)中得到的洗脱液再次进行色谱洗脱，分别流出极性、弱极性以及非极性组分，并且非极性组分最后流出；其中色谱柱为agilentzorbaxeclinp－sexdb－c18反相色谱柱，流动相分别为流动相a和流动相b，流动相a为乙腈，流动相b为水相，水相为三氯乙酸和甲酸铵的混合液，并且三氯乙酸和甲酸铵的体积比为2.5:1，流速为1.1ml/min，柱温为26℃；
51.步骤(4)去除水分：将步骤(3)中得到的洗脱液进行减压浓缩以去除水分，浓缩后得到乙拉西坦，乙拉西坦的提取率为0.35％。
52.实施例5
53.一种从大鲵肽中提取乙拉西坦的方法，包括以下步骤：
54.步骤(1)溶解：将大鲵肽溶解于水，得到大鲵肽水溶液；
55.步骤(2)第一次纯化：将大鲵肽水溶液经ab-8型大孔吸附树脂进行吸附，去除大鲵肽水溶液中的弱极性有机分子，吸附后再用乙酸乙酯和二氯甲烷的混合液进行洗脱，洗脱的目的在于去除含有极性基团的分子，其中乙酸乙酯和二氯甲烷的体积比为75:30；
56.步骤(3)第二次纯化：将步骤(2)中得到的洗脱液再次进行色谱洗脱，分别流出极性、弱极性以及非极性组分，并且非极性组分最后流出；其中色谱柱为agilentzorbaxeclinp－sexdb－c18反相色谱柱，流动相分别为流动相a和流动相b，流动相a为乙腈，流动相b为水相，水相为三氯乙酸和甲酸铵的混合液，并且三氯乙酸和甲酸铵的体积比为1.5:1，流速为0.9ml/min，柱温为30℃；
57.步骤(4)去除水分：将步骤(3)中得到的洗脱液进行减压浓缩以去除水分，浓缩后得到乙拉西坦，乙拉西坦的提取率为0.16％。
58.实验检测：质谱分析
59.质谱分析法是在高真空系统中测定样品的分子离子及碎片离子质量，以确定样品相对分子质量及分子结构的方法。质谱分析的原理使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。
60.将实施例步骤(4)中所得的乙拉西坦放入质谱仪中进行质谱分析，得到的质谱图如图1和图2所示。
61.结合图1以及图2中各种不同强度的峰以及各个特征，并将得到的质谱图与现有公开的质谱图进行对比可得出该物质为乙拉西坦。
62.综上所述，本发明提出了一种从大鲵肽中提取乙拉西坦的方法，填补了现有技术中大鲵肽中能提取出乙拉西坦的空白，同时也为历史古籍中记载大鲵能治疗精神类疾病提供了佐证。本发明乙拉西坦的提取方法中采用了洗脱色谱法，分离效率高，并且提取出的乙拉西坦通过质谱分析得到，分析精确度高。
63.虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可做出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。