1.本发明属于含硒材料技术领域，具体涉及一种含硒咪唑配合物纳米微球及其制备方法和应用。


背景技术：

2.谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)是一种含硒抗氧化酶，在体内它通过催化谷胱甘肽还原氢过氧化物(rooh)来保护机体免受氧化损伤，并且保持了体内活性氧物种(ros)的代谢平衡。此外，进一步的将生物学、超分子科学和纳米科学结合在一起的纳米酶模型进入了人们的视野，将谷胱甘肽过氧化物酶推向了一个新的高度，除了提高模拟酶的活力之外，设计具有“载体”功能的人工酶模型吸引了越来越多的关注。这些具有“载体”功能的人工酶模型可作为其它分子载体，通过对外界条件(包括：温度、ph、atp等)的刺激作出响应性释放。在上述的刺激响应方式之中，ph响应的人工酶作为潜在的药物递送载体拥有光明的未来，因为人体内的不同器官之间、炎症组织与正常组织之间本身就存在着ph值的变化，同时，atp响应也同样有着广泛的应用，因为不同组织，细胞的耗能不同，atp浓度也就不同，这也就让atp响应具有广泛应用价值。因此，将ph响应和atp响应结合到人工硒酶构建中将具有很高的应用价值。
3.纳米酶近年来受到广泛关注，因其与天然酶相比，具有稳定性高，成本低，催化性能可调的优点。在各种报道材料，金属-有机框架具有多孔结构、多催化中心、也有报道称它们有能力通过调整组成模拟天然酶的功能。此外，将这类纳米酶材料作为药物递送载体具有巨大的潜力。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供了一种含硒咪唑配合物纳米微球。本发明提供的含硒咪唑配合物纳米微球，能够作为载体负载蛋白质多肽、小分子化合物及纳米酶等，并且自身具有谷胱甘肽过氧化物酶活性质。
5.本发明含硒咪唑配合物纳米微球，其粒径在100nm～200nm，表面带正电荷；主要包括由锌离子和含硒咪唑席夫碱中n原子配位形成的化合物；其中含硒咪唑席夫碱的结构式如式i或式ii：
[0006][0007]
其中n为自然数，1≤n≤7；r基团独立的选自h、cl、no2、-ch3；
[0008]
作为优选，含硒咪唑席夫碱与锌离子的摩尔比为1～4:1，更优选为2:1；可以通过调节席夫碱与锌离子的比例或调节转速，可获得不同大小的配合物微球；
[0009]
本发明的第二个目的是提供一种含硒咪唑配合物纳米微球的制备方法，具体是：
[0010]
将含硒咪唑席夫碱和配位溶剂配置得到一定浓度的含硒小分子溶液；然后在低温条件下机械搅拌下，在上述含硒小分子溶液中加入锌盐，再搅拌一段时间，获得配合物纳米微球溶液；将上述配合物纳米微球溶液在低温离心后，醇洗、水洗数次烘干，即可得到配合物纳米微球粉末。
[0011]
作为优选，所述含硒咪唑席夫碱的结构式如式i或式ii；
[0012]
具有式i结构的含硒咪唑席夫碱可以由二苯二硒醚，n-boc-溴乙胺和咪唑-2-甲醛为原料制备得到；具有式ii结构的含硒咪唑席夫碱可以由单硒桥乙二胺和咪唑-2-甲醛为原料制备得到；
[0013]
优选的，所述配位溶剂为醇溶剂、水中的一种或两种；其中醇溶剂为乙醇或甲醇。
[0014]
作为优选，所述锌盐采用硝酸锌，醋酸锌，氯化锌，硫酸锌中的一种，更为优选采用硝酸锌。
[0015]
作为优选，配位反应的温度为25℃，搅拌时间为15min，低温离心的温度为4℃。
[0016]
本发明的第三个目的是提供含硒咪唑配合物纳米微球在作为药物载体上的作用。
[0017]
作为优选，所述药物包括但不局限于蛋白质多肽、小分子化合物及纳米酶。
[0018]
作为优选，应用过程具体是将被载药物分子与锌离子配成混合醇或者水溶液加入到一定浓度的含硒小分子溶液中，再搅拌一段时间即可获得装载其它分子的配合物纳米微球溶液，离心洗涤干燥后即可得到装载其它分子的配合物纳米微球粉末。
[0019]
本发明的第四个目的是提供一种联合药物，包括含硒咪唑配合物纳米微球、以及负载在含硒咪唑配合物纳米微球上的药物。
[0020]
作为优选，所述药物的质量含量为0.01～10％。
[0021]
作为优选，所述药物为一种或多种药物。
[0022]
本发明的有益效果是：
[0023]
本发明中，通过在含硒小分子上引入ph敏感的c＝n键，ph变化能够使配合物纳米微球断键解离，使硒酶模拟物暴露发挥催化作用。同样的，该配合物纳米微球也具有生物分子响应能力，由于配合物纳米微球含有由锌离子与n形成的配位键，锌离子可被其它配位作
用力更强的分子夺取，如atp，gsh等。因此，此配合物纳米微球也具有atp响应能力，在遇到atp时可解散，释放出硒酶模拟物起到催化作用。
[0024]
本发明中，配合物纳米微球可作为其它分子的载体，在形成配合物纳米微球的过程中，将被载分子与锌离子配成混合醇或者水溶液加入到一定浓度的含硒小分子溶液中，再搅拌一段时间即可获得装载其它分子的配合物纳米微球溶液，离心洗涤干燥后即可得到装载其它分子的配合物纳米微球粉末。
[0025]
本发明中，担载其它分子的配合物纳米微球仍具有ph、atp等响应能力。发生刺激响应纳米微球解散释放出装载分子，这对于药物的输送与药物泄漏和延长药物作用时间具有重要的意义。
[0026]
本发明采用的含硒小分子与锌离子具有良好的生物相容性和生物可降解性，其降解周期为1周左右，有利于其作为药物载体在体内的进一步应用，而且降解得到的产物为锌离子和咪唑衍生物以及含硒小分子，可被机体吸收或者通过体内代谢排出体外，对人体基本无害；因此，该配合物纳米微球具有广阔的应用前景。
[0027]
本发明提供的含硒咪唑席夫碱配位纳米微球具有多种调节手段，使得形成的纳米粒子的可调节性好，有利于该类型谷胱甘肽过氧化物纳米酶作为载体的进一步的应用。
附图说明
[0028]
图1为本发明式i含单硒小分子的核磁共振氢谱图；
[0029]
图2为本发明式ii含单硒小分子的核磁共振氢谱图；
[0030]
图3为本发明实施例2-1获得含硒咪唑配合物纳米微球sem图；
[0031]
图4为本发明实施例2-2获得含硒咪唑配合物纳米微球sem图；
[0032]
图5为本发明实施例2-3获得含硒咪唑配合物纳米微球sem图；
[0033]
图6为实施例2-1改变含硒咪唑配合物与锌离子摩尔比例获得含硒咪唑配合物纳米微球sem图；
[0034]
图7为实施例2-1改变配位搅拌速度获得含硒咪唑配合物纳米微球sem图；
[0035]
图8为实施例3获得罗丹明b负载的含硒咪唑配合物纳米微球sem图；
[0036]
图9为实施例2-1获得含硒咪唑配合物纳米微球放置1周的降解sem图；
[0037]
图10为实施例1-1式i含单硒小分子的gpx酶活性测试；
[0038]
图11为本发明实施例2-1获得含硒咪唑配合物纳米微球对ph或atp响应后的gpx酶活性测试；
[0039]
图12为本发明实施例3获得含硒咪唑配合物纳米微球对ph或atp响应后的罗丹明b释放行为。
具体实施方式
[0040]
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
[0041]
本发明提供了式i、式ii含硒咪唑席夫碱以及含硒咪唑配合物纳米微球。含硒咪唑配合物纳米微球主要包括由锌离子和含硒咪唑席夫碱中n原子配位形成的化合物
[0042][0043]
所述r基团独立的选自h、cl、no3、-ch3；
[0044]
n为-ch
2-个数1≤n≤7。
[0045]
本发明提供了纳米微球制备方法。具体而言，将式i、式ii硒咪唑席夫碱和配位溶剂配置得到一定浓度的含硒小分子溶液；然后在低温条件下机械搅拌下，在上述含硒小分子溶液中加入锌盐，再搅拌一段时间，获得配合物纳米微球溶液；将上述配合物纳米微球溶液在低温离心后，醇洗、水洗数次烘干，即可得到配合物纳米微球粉末。
[0046]
本发明在ph或atp条件下的响应，罗丹明b作为模型分子制备罗丹明b负载的含硒配合物纳米微球，包含上述技术方案所述的纳米微球。但应当指出的是，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明专利所用药物进行的限制。
[0047]
本发明所制备的ph、atp敏感型罗丹明b负载含硒配合物纳米微球可以通过下列方法和步骤制备：
[0048]
首先通过溶媒配制一定浓度的含硒小分子溶液，将罗丹明b溶液加入到含硒小分子溶液，通过搅拌一定时间，再加入适当摩尔比锌离子溶液，再搅拌一定时间获得载罗丹明b含硒配合物纳米微球溶液，该溶液可放于4℃冰箱保存备用，可保存数周。负载其它治疗药物时，将上述方法制备的溶液震荡或机械搅拌后，在37℃放置一段时间或在注射入体内。当然如果条件允许，在载药含硒配合物纳米微球配制一周以内使用更佳。
[0049]
优选的，罗丹明b浓度为0.5mg/ml。
[0050]
同时本发明含硒配合物纳米微球材料不仅可以负载罗丹明b，亦可担载其他类型的药物，如：铂类药物、烷化剂类、蛋白多肽类药物等。应当说，该含硒配合物纳米微球材料是一个可用于通用的药物担载平台，能够根据调整药物种类、降解时间、适应症等。
[0051]
含硒配合物纳米微球在ph、atp作用下具有的释放行为，能将负载的药物释放出来，在不同ph或不同浓度atp下调控药物的释放行为。
[0052]
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的式i、式ii含硒咪唑席夫碱、含硒配合物纳米微球及其制备方法进行详细描述。
[0053]
首先制备含硒咪唑席夫碱；具体如下：
[0054]
实施例1-1：式i含硒咪唑席夫碱的制备
[0055]
将硼氢化钠0.35可与二苯二硒醚1.5克在n2保护下，在四氢呋喃中加入少量甲醇反应30分钟至溶液无色，再加入n-boc-溴乙胺1.8克在40℃下反应12小时，除去溶剂，二氯甲烷100ml溶解并用水50ml洗三次除去钠盐，之后用无水硫酸镁干燥过夜，再用石油醚：二氯甲烷＝5:1柱层析提纯，得到产物在30％三氟乙酸二氯甲烷溶液中脱保护，除去溶剂得到淡黄色油状液体产物(1)1.3克；将产物(1)与咪唑-2-甲醛摩尔比＝1:1在二氯甲烷50ml中搅拌3小时，除去溶解甲醇重结晶得到式i含硒咪唑席夫碱；其具体结构式如下：
[0056][0057]
图1为本发明式i含单硒小分子的核磁共振氢谱图；
[0058]
实施例1-2：式ii含硒咪唑席夫碱的制备
[0059]
在n2保护下将se粉1.6克与nabh47.5克混合均匀，加入10ml水引发反应，反应15分钟后得到无色透明液体，，马上将n-boc-溴乙胺8.96克四氢呋喃溶液加入到反应液中，n2保护下40℃反应12小时，石油醚：二氯甲烷＝5:1柱层析提纯，得到产物用30％三氟乙酸的二氯甲烷溶液脱保护，除去溶剂和三氟乙酸即可得到黄色油状产物(2)3.2克；将产物(2)与咪唑-2-甲醛摩尔比＝1:2在二氯甲烷中搅拌3小时，重结晶即可得到式ii，n＝2；其具体结构式如下：
[0060][0061]
图2为本发明式ii含单硒小分子的核磁共振氢谱图；
[0062]
然后利用实施例1-1至1-2制备得到的含硒咪唑席夫碱制备含硒咪唑配合物纳米微球；具体如下：
[0063]
实施例2-1：含硒咪唑配合物纳米微球的制备
[0064]
将14mg实施例1-1式i所示含硒咪唑席夫碱溶于5ml乙醇，再加入5ml去离子水，搅拌10min，制得含硒小分子溶液；将7.4mg六水硝酸锌溶于100μl去离子水制得锌离子溶液，在转速300rpm下搅拌，常温条件下将锌离子溶液加到含硒小分子溶液中，搅拌15min，于4℃下10000rpm离心10min，乙醇洗涤3次，将沉淀物重新分散到超纯水中，得到含硒配合物纳米微球水溶液(图3)。
[0065]
实施例2-2：含硒咪唑配合物纳米微球的制备
[0066]
将16.3mg实施例1-2式ii所示含硒咪唑席夫碱溶于5ml乙醇，再加入5ml去离子水，搅拌10min，制得含硒小分子溶液；将4.0mg硫酸锌溶于100μl去离子水制得锌离子溶液，在转速300rpm下搅拌，常温条件下将锌离子溶液加到含硒小分子溶液中，搅拌15min，于4℃下1000rpm离心10min，乙醇洗涤3次，将沉淀物重新分散到超纯水中，得到含硒配合物纳米微球水溶液(图4)。
[0067]
实施例2-3：含硒咪唑配合物纳米微球的制备
[0068]
将14mg实施例1-1式i所示含硒咪唑席夫碱溶于5ml乙醇，再加入5ml去离子水，搅拌10min，制得含硒小分子溶液；将4.6mg醋酸锌溶于100μl去离子水制得锌离子溶液，在转速300rpm下搅拌，常温条件下将锌离子溶液加到含硒小分子溶液中，搅拌15min，于4℃下10000rpm离心10min，乙醇洗涤3次，将沉淀物重新分散到超纯水中，得到含硒配合物纳米微球水溶液(图5)。
[0069]
实施例2-4：含硒咪唑配合物纳米微球的制备
[0070]
将28mg实施例1-1式i所示含硒咪唑席夫碱溶于5ml乙醇，再加入5ml去离子水，搅拌10min，制得含硒小分子溶液；将7.4mg六水硝酸锌溶于100μl去离子水制得锌离子溶液，
atp下的罗丹明b释放曲线(图12)。
[0083]
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。