专利名称：具有2′-醚基的核苷和寡核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及其中2′—OH被羟乙基或氟代烷基醚化的核苷类似物，其制备方法，含有这些核苷的寡核苷酸，以及这些核苷用于制备分子中含相同或不同核苷单元的寡核苷酸的用途。
核苷和寡核苷酸都可作为抗病毒有效成分，并因为它们与核酸(“反义”寡核苷酸)相互作用的能力和与此相关的生物活性，已引起人们的极大兴趣；例如见Uhlman，E.，Peyman，A.，Chemical Reviews90543—548(1990)。为了得到具有新特性的核苷或改进反义寡核苷酸与天然核酸的相互作用并提高它们对核酸酶的稳定性，对核苷(或寡核苷酸中的核苷单元)的糖残基、已对寡核苷酸中核苷间的磷酸酯键进行了各种修饰；例如见Marquez，V.E.，Lim，M.I.，Medicinal Re-search Reviews 61—40(1986)，Helene，C.Toulme，J.J.，Biochimica etBiophysica Acta 104999—125(1990)，Englisch，U.，Gauss，D.H.，Angewandte Chemie 103629—646(1991)，Matleucci，M.D.，Bischof-berger，N.，Annual Reports in Medicinal Chemistry 2687—296(1991)在Cook，P.D.，Anti—Cancer Drug Design 6585—607(1991)和WO91/06556中，描述了在糖的2′—OH上已被修饰的核苷。所述的这些修饰使核酸酶耐受性提高；烷基越长，核酸酶耐受性越高。据观察用短链烷基如甲基、乙基或丙基，结合亲合力稍有提高，而用长链则结合亲合力大幅度下降。迄今为止还没有过将以羟乙基或氟代烷基作为2′—OH的侧链的核苷掺入到寡核苷酸中。令人惊奇地是，与使用等长的未取代烷基相比，本发明的修饰提高了对互补的RNA的结合亲合力。在公开的现有文献基础上无法预计到该结果。与2′—OH修饰的寡核苷酸相似，本发明的化合物用标记的核酸酶耐受性来区别。另外，包含本发明核苷的寡核苷酸显示其细胞摄取率提高，并因此提高了生物利用度和体内活性。
本发明涉及式I化合物 其中R1和R2互相独立，各自为氢或保护基，或R1同上所定义，并且R2为形成含磷核苷酸桥基的残基；B为嘌呤或嘧啶残基或其类似基团；及R3为OH、F或(CF2)nCF3，其中n为0—7的数。
当R3为OH时，该羟基可被R1和R2中定义的基团保护。
优选n为0。
优选R1和R2为氢。
保护基和用这样的保护基衍生羟基的方法在糖和核苷酸化学中是普遍已知的，并在下述文献中有述例如Greene，B.T.的ProtectiveGroups in Organic Synthesis，Wiley Interscience，New York(1991)，Son-veaux，E.的Bioorganic Chemistry 14274—325(1986)或Beaucage，S.L，Iyer，R.的Tetrahedron 482223—2311(1992)。这类保护基的例子有苄基、甲基苄基、二甲基苄基、甲氧基苄基、二甲氧基苄基、溴苄基、2，4—二氯苄基；二苯基甲基、二(甲基苯基)甲基、二(二甲基苯基)甲基、二(甲氧苯基)甲基、二(二甲氧苯基)甲基、三苯甲基、三—4，4′，4″—叔丁基苯基甲基、二-对茴香基苯基甲基、三(甲基苯基)甲基、三(二甲基苯基)甲基、甲氧苯基(二苯基)甲基、二(甲氧苯基)苯基甲基、三(甲氧苯基)甲基、三(二甲氧苯基)甲基；三苯基甲硅烷基、烷基二苯基甲硅烷基、二烷基苯基甲硅烷基和三烷基甲硅烷基，其中烷基含1—20个，优选1—12个，最优选1—8个碳原子，如三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三正丙基甲硅烷基、异丙基二甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、正辛基二甲基甲硅烷基、(1，1，2，2—四甲基乙基)—二甲基甲硅烷基；—(C1—C8烷基)2Si—O—Si(C1—C8烷基)2—，其中烷基为如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基；C2—C12—酰基，特别是C2—C8—酰基，如乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、苯甲酰基、甲基苯甲酰基、甲氧基苯甲酰基、氯代苯甲酰基和溴代苯甲酰基；Rs1—SO2，其中Rs1为C1—C12烷基，特别是C1—C6烷基、C5—或C6—环烷基、苯基、苄基、C1—C12烷基苯基特别是C1—C4烷基苯基、或C1—C12—特别是C1—C4烷基苄基、或卤代苯基或卤代苄基，例如甲基—、乙基—、丙基—、丁基—、苯基—、苄基—、对溴苯基—、对甲氧苯基—及对甲基苯基—磺酰基；被F、Cl、Br、C1—C4烷氧基、三—(C1—C4烷基)甲硅烷基或被C1—C4烷基磺酰基取代或未取代的C1—C12—，优选C1—C8—烷氧羰基，例如甲氧基—、乙氧基—、正丙氧基—、异丙氧基—、正丁氧基—、异丁氧基—或叔丁氧基—羰基、2—三甲基甲硅烷基乙氧基羰基、2—甲基磺酰基乙氧基羰基、烯丙氧基羰基、或各自被烷氧羰基的上述取代基取代或未取代的苯氧基羰基或苄氧基羰基，例如甲基—或甲氧基—或氯—苯氧基羰基或—苄氧基羰基，及9—芴基甲氧羰基。当R1和/或R2为烷基时，它可被F、Cl、Br、C1—C4烷氧基、甲氧基、氯苯氧基、甲氧苯氧基、苄氧基、甲氧苄氧基或被氯苯氧基取代。式I中R1和R2可为相同或不同的保护基。
特别优选作为保护基的R1和R2为苄基、甲基苄基、二甲基苄基、甲氧基苄基、二甲氧基苄基、卤化苄基(特别是溴代苄基)；二苯基甲基、二(甲基苯基)甲基、二(二甲基苯基)甲基、二(甲氧苯基)甲基、二(甲氧苯基)(苯基)甲基、三苯基甲基、三—4，4′，4″—叔丁基苯基甲基、二—对茴香基苯基甲基、三(甲基苯基)甲基、三(二甲基苯基)甲基、三(甲氧苯基)甲基、三(二甲氧苯基)甲基；三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三正丙基甲硅烷基、异丙基—二甲基甲硅烷基、叔丁基—二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、正辛基—二甲基甲硅烷基、(1，1，2，2—四甲基乙基)—二甲基甲硅烷基、—(CH3)2Si—O—Si(CH3)2—、—(i—C3H7)2Si—O—Si(i—C3H7)2—；乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、苯甲酰基、甲基苯甲酰基、甲氧基苯甲酰基、氯苯甲酰基和溴苯甲酰基；甲基—、乙基—、丙基—、丁基—、苯基—、苄基—、对溴苯基—、对甲氧苯基—和对甲基苯基—磺酰基；甲氧基—、乙氧基—、正或异丙氧基—或正或异或叔丁氧基羰基、或苯氧基羰基、苄氧基羰基、甲基—、或甲氧基—或氯—苯氧基羰基或—苄氧基羰基或9—芴基甲氧基羰基。
作为形成核苷酸桥基的含磷残基的R2可为式P1或P2 其中Ya为氢、C1—C12烷基、C6—C12芳基、C7—C20芳烷基、C7—C20烷芳基、—ORb、-SRb、—NH2、伯氨基、仲氨基、O_M_或S_M_；Xa为氧或硫；Ra为氢、M_、C1—C12烷基、C2—C12链烯基、C6—C12芳基、或RaO—基团为具有含1—3个N原子的5之环的N—杂芳基—N—基；Rb为氢、C1—C12烷基或C6—C12芳基；及M_为Na_、K_、Li_、NH4_或伯、仲、叔或季铵离子；Ya、Ra和Rb中的烷基、芳基、芳烷基和烷芳基被烷氧基、烷硫基、卤原子、—CN、-NO2、苯基、硝基苯基或被卤代苯基取代或未取代。
作为伯氨基，Ya优选含1—12个碳原子、最优选含1—6个碳原子，作为仲氨基，Ya优选含2—12个碳原子，优选含2—6个碳原子。
例如，伯氨基和仲氨基可为式RcRdN的残基，其中Rc为H，或独立地同Rd的定义，及Rd为C1—C20—，优选C1—C12—，最优选C1—C6—烷基，C1—C20—，优选C1—C12—，最优选C1—C6—氨基烷基，C1—C20—，优选C1—C12—，最优选C1—C6-羟基烷基；羧基烷基或烷氧羰基烷基，其中烷氧羰基含2—8个碳原子，烷基含1—6个，优选1—4个碳原子；C2—C20—，优选C2—C12，最优选C2—C6—链烯基；苯基，单—或二—(C1—C4—烷基—或烷氧基)苯基、苄基、单—或二—(C1—C4烷基—或—烷氧基)苄基；或1，2—、1，3—或1，4—咪唑基—C1—C6烷基，或Rc和Rd一起为四亚甲基或五亚甲基，3—氧杂—1，5—亚戊基，—CH2NRc—CH2CH2—或—CH2CH2NR19—CH2CH2—，其中Rc为H或C1—C4烷基。氨基烷基中的氨基可被一个或两个C1—C4—烷基或C1—C4—羟烷基取代。羟烷基中的羟基可被C1—C4烷基醚化。
在上文M_的定义中Ya代表的伯、仲、叔和季铵离子应理解为式RfRgRhRiN(+)的离子，其中Rf为C1—C20—、优选C1—C12、最优选C1—C6—烷基、—氨基烷基或—羟烷基；羧基烷基或烷氧羰基烷基，其中烷氧羰基含2—8个碳原子，烷基含1—6个、优选1—4个碳原子；C2—C20—、优选C2—C12、最优选C2—C6—链烯基；苯基，单—或二—(C1—C4—烷基—或—烷氧基)苯基，苄基，单—或二—(C1—C4—烷基—或—烷氧基)苄基；或1，2—、1，3—或1，4—咪唑基—C1—C6烷基，及Rg、Rh和Ri各自相互独立地为氢或如Rf的定义，或Rf和Rg一起为四亚甲基或五亚甲基、3—氧杂—1，5—亚戊基，—CH2NRc—CH2CH2—或—CH2CH2NRe—CH2CH2，其中Rc为H或C1—C4烷基，及Rh和Ri各自相互独立地具有Rf的定义。
氨基烷基中的氨基可被一个或两个C1—C4—烷基或—羟烷基所取代。羟烷基中的羟基可被C1—C4烷基醚化。
羧基烷基的例子有羧甲基、羧乙基、羧丙基和羧丁基，烷氧羰基烷基的例子为以上羧基烷基被甲基或乙基酯化。链烯基的例子有烯丙基，丁—1—烯—3—基或—4—基，或—3—或—4—烯—1—基或—2—基，己—3—或—4—或—5—烯—1—基或—2—基。烷基—和烷氧基—苯基和—苄基的例子有甲基苯基、二甲基苯基、乙基苯基、二乙基苯基、甲基苄基、二甲基苄基、乙基苄基、二乙基苄基、甲氧苯基、二甲氧苯基和乙氧苯基、二乙氧苯基、甲氧基苄基、二甲氧基苄基、乙氧基苄基、二乙氧基苄基。咪唑基烷基(其中烷基优选含2—4个碳原子)的例子有1，2—、1，3—或1，4—咪唑基—乙基或—正丙基或—正丁基。R19优选为H、甲基或乙基。
伯氨基和仲氨基的优选实例为甲基—、乙基—、二甲基—、二乙基—、二异丙基、单—或二—(1—羟基乙—2—基)—、苯基—和苄基—氨基，乙酰氨基和苯甲酰氨基，还有哌啶基、哌嗪基和吗啉基。
伯和仲铵的优选实例为甲基—、乙基—、二甲基—、二乙基—、二异丙基—、单—或二—(1—羟基—乙—2—基)—、苯基—和苄基—铵。
作为烷基的Ya、Ra和Rb的实例为甲基、乙基以及丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基的异构体；作为芳基的Ya、Ra和Rb的实例为苯基和萘基；作为链烯基的Ra的实例为烯丙基和(C1—C4烷基)CH＝CH—CH2—；作为芳烷基Ya的实例为苯基Cnh2n—，其中n为1—6的数，特别是苄基；作为烷芳基的Ya的实例为单—、二—或三—(C1—C4—烷基)苯基。优选的取代基为氯、溴、甲氧基、—NO2、—CN、2，4—二氯苯基和4—硝基苯基。Rb的实例为2，2，2—三氯乙基、4—氯苯基、2—氯苯基和2，4—二氯苯基；及RbO—作为N—杂芳基的例子为吡咯—N—基、三唑—N—基和苯并三唑—N—基。
特别优选Ra为β—氰基乙基和Ya为二(异丙基氨基)。
当B为嘌呤残基或其类似物时，它可为式II、IIa、IIb、IIc、IId、IIe或Hf的残基； 其中Rb1为H、Cl、Br、OH或—O—C1—C12烷基，及Rb2、Rb3和Rb5各自相互独立地为H，OH，SH，NH2，NHNH2，NHOH，NHO—C1—C12烷基，—N＝CH—N(C1—C12烷基)2，—N＝CH—氮杂环烷基，F，Cl，Br，C1—C12烷基，羟基—C1—C12烷基，氨基—C1—C12烷基，C1—C12烷氧基，苄氧基或C1—C12烷硫基，被保护基取代或未取代的羟基和氨基，苯基，苄基，C1—C20伯氨基或C2—C30仲氨基，Rb4为氢、CN或—C≡C—Rb7，及Rb6和Rb7为氢或C1—C4烷基。
以上已提及了适当的保护基。优选的保护基为C1—C8酰基，如乙酰基、丙酰基、丁酰基和苯甲酰基。Rb6优选为H或甲基。
伯氨基优选含1—12个碳原子，最优选含1—6个碳原子，仲氨基优选含2—12个碳原子，最优选含2—6个碳原子。
优选含1—6个碳原子的烷基、烷氧基、烷硫基、羟烷基和氨基烷基的一些实例有甲基、乙基和丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基的异构体，及相应的烷氧基、烷硫基、羟烷基和氨基烷基。烷基、烷氧基、烷硫基、羟烷基和氨基烷基最优选含1—4个碳原子。优选的烷基、烷氧基、烷硫基、羟烷基和氨基烷基为甲基、乙基、正和异丙基、正、异和叔丁基、甲氧基、乙氧基、甲硫基和乙硫基、氨基甲基、氨基乙基、羟甲基和羟乙基。
例如，伯氨基和仲氨基可为式Ra1Ra2N的残基，其中Ra1为H或独立地为Ra2的定义，及Ra2为C1—C20、优选C1—C12—、最优选C1—C6—烷基、—氨基烷基或—羟烷基；羧烷基或烷氧羰基烷基，其中烷氧羰基含2—8个碳原子，烷基含1—6个、优选1—4个碳原子；C2—C20、优选C2—C12、最优选C2—C6—链烯基，苯基，单—或二—(C1—C4—烷基—或—烷氧基)苯基、苄基、单—或二—(C1—C4—烷基—或—烷氧基)苄基；或1，2—、1，3—或1，4—咪唑基—C1—C6—烷基，或Ra1和Ra2一起为四亚甲基或五亚甲基，3—氧杂—1，5—亚戊基，—CH2—NRa3—CH2CH2—或—CH2CH2NRa3—CH2CH2—其中Ra3为H或C1—C4烷基。
氨基烷基中的氨基可被一个或两个C1—C4—烷基或—羟基烷基所取代。羟烷基中的羟基可被C1—C4烷基醚化。
以上已给出了烷基的实例。氨基烷基的实例为氨基甲基，氨基乙基，1—氨基—丙—2—基或—3—基，1—氨基—丁—2—基或—3—基或—4—基，N—甲基或N，N—二甲基—或N—乙基—或N，N—二乙基—或N—2—羟乙基—或N，N—二—2—羟乙基—氨基乙基或—氨基乙基或—氨基丙基或—氨基丁基。羟烷基的实例为羟甲基，1—羟—乙—2—基，1—羟—丙—2—或—3—基，1—羟—丁—2—基，—3—基或—4—基。羧烷基的实例为羧甲基、羧乙基、羧丙基和羧丁基，烷氧羰基烷基的例子为被甲基或乙基酯化的上述羧烷基。链烯基的实例为烯丙基，丁—1—烯—3—基或—4—基，戊—3—或—4—烯—1—基或—2—基，己—3—或—4—或—5—烯—1—基或—2—基。烷基—和烷氧基—苯基和—苄基的实例为甲基苯基、二甲基苯基、乙基苯基、二乙基苯基、甲基苄基、二甲基苄基、乙基苄基、二乙基苄基、甲氧基苯基、二甲氧基苯基、乙氧基苯基、二乙氧基苯基、甲氧基苄基、二甲氧基苄基、乙氧基苄基和二乙氧基苄基。其中烷基优选含2—4个碳原子的咪唑基烷基的例子为1，2—、1，3—或1，4—咪唑基—乙基或—正丙基或—正丁基。Ra3优选为H、甲基、或乙基。
伯氨基和仲氨基的优选实例为甲基—、乙基—、二甲基—、二乙基—、烯丙基—、单—或二—(1—羟基—乙—2—基)—、苯基—和苄基—氨基、乙酰氨基，异丁酰氨基和苯甲酰氨基。
优选Rb1为氢。在另一优选方案中Rb5为氢。另一优选方案中Rb2和Rb3各自独立地为H、F、Cl、Br、OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、甲氨基、二甲氨基、苯甲酰氨基、异丁酰氨基、甲氧基、乙氧基或甲硫基。
嘌呤系列的类似物的一些实例除嘌呤外，还有黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、N—甲基腺嘌呤、N—苯甲酰基腺嘌呤、2—甲硫基腺嘌呤、2—氨基腺嘌呤、6—羟基嘌呤、2—氨基—6—氯嘌呤、2—氨基—6—甲硫基嘌呤、鸟嘌呤和N—异丁酰基鸟嘌呤。特别优选腺嘌呤、2—氨基腺嘌呤和鸟嘌呤，及其碱基被保护的衍生物。
当式I中B为嘧啶残基时，它优选为式III、IIIa、IIIb和IIIc的尿嘧啶、胸腺嘧啶或胞嘧啶或式III、IIIa、IIIb或IIIc残基的二氢衍生物 其中Rb6为H或C1—C4烷基，及Rb8为H，OH，SH，NH2，NHNH2，NHOH，NHO—C1—C12烷基，—N＝CH—N(C1—C12烷基)2，—N＝CH—氮杂环烷基，F，Cl，Br，C1—C12烷基，羟基—C1—C12烷基，氨基—C1—C12烷基，C1—C12烷氧基，苄氧基或C1—C12烷硫基，被保护基取代或未取代的羟基和氨基，苯基，苄基，C1—C20伯氨基，C2—C30仲氨基，C1—C12链烯基或C1—C12炔基，及式IIIb中的NH2被C1—C6烷基、苯甲酰基或被保护基取代或未取代。
优选，式III中Rb8为H，C1—C6—烷基或—羟烷基，C2—C6—链烯基或—炔基，F，Cl，Br，NH2，苯甲酰氨基，或单—或二—C1—C6烷基氨基。式IIIb和IIIc中Rb8优选为H，C1—C6—烷基—或—烷氧基或—羟烷基，C2—C6—链烯基或—炔基，F，Cl、Br，NH2，苯甲酰氨基，或单—或二—C1—C6烷基氨基。
Rb6优选为H或甲基。式III中Rb8优选为H，F，Cl，Br，NH2，NHCH3，N(CH3)2，C1—C4烷基，C2—C4链烯基或C2—C4炔—1—基。式IIIb和IIIc中Rb8优选为H，C1—C4烷基，特别是甲基，C2—C4链烯基，特别是乙烯基或C2—C4炔—1—基，特别是1—丙炔—1—基，或NH2，NHCH3或(CH3)2N。
嘧啶类似物的一些实例为尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5—氟尿嘧啶、5—氯尿嘧啶、5—溴尿嘧啶、二氢尿嘧啶、5—甲基胞嘧啶、5—丙炔胸腺嘧啶和5—丙炔胞嘧啶。
本发明还涉及式I化合物的制备方法 其中R1和R2各自相互独立地为氢或保护基；B为嘌呤或嘧啶残基或其类似物；及(a)R3为OH，该方法包括式IVa化合物 其中R14和R15为相同或不同的保护基，B为嘌呤或嘧啶残基或其类似物，碱基B中的官能团用保护基保护，在惰性溶剂中与式A化合物反应A—CH2—COOR4(A)其中R4为C1—C4烷基，X为Cl、Br、I、甲苯磺酰基—O—或甲磺酰基—O；然后用NaBH4或LiAlH4还原酯官能团，可以用R1中定义的基团临时保护生成的OH；(b)R3为F，该方法包括其中R3为OH的式I化合物与式B化合物反应 (c)R3为—(CF2)n—CF3，其中n为0—7的数，该方法包括式IVa化合物与式C、D或E的化合物反应CH≡C-(CF2)n-CF3(C)CH2＝CH-(CF2)n-CF3(D) 然后将双键或氯代双键催化还原，可形成CH2CH2(CF)nCF3基团；(d)R3为OH、F或—(CF2)n—CF3，该方法包括式IVb化合物 其中R14和R15如上所定义，A为离去基团，优选为烷氧基、酰氧基、甲磺酰—O、甲苯磺酰—O，最优选OCH3、OCOCH3或苯甲酰氧基，按(a)到(c)中描述的方法之一在2′—OH上进行取代，然后按本身已知的方法通过取代引入碱基B〔E.Lukevics，A.Zablocka，NucleosideSynthesis，Ellis Horwood，New York(1991)〕；及必要时脱去保护基R14和R15。
式IVa和IVb、A、B、C、D和E化合物为已知化合物，其中某些有市售，或可用已知方法或类似方法制备。
惰性溶剂例如为烃、卤代烃、烷基化羧酰胺和内酰胺、醚、腈如乙腈、二烷基砜或亚砜或环状砜和亚砜。
在方法步骤(a)—(d)中，反应温度为—50—200℃，优选为0—90℃。
除B以外，反应最好在碱存在下进行，碱例如为碱金属氢化物、醇化物、氢氧化物或碳酸盐，三烷基胺或二氮杂双环十一烯。
式I化合物的分离及纯化按照本身为已知的方法进行，如沉淀或结晶、过滤和色谱方法。
从式I化合物可能构建这样的寡核苷酸，由于它们与核酸的相互作用而具有有价值的生物活性，它们可用作药物有效成分或诊断剂。
本发明还涉及式I化合物用于制备寡核苷酸的用途，其中该寡核苷酸含有相同或不同的式I化合物单体单元，但含有与其它天然或合成核苷单体单元结合的至少一个式I化合物单位单元，该寡核苷酸含有2—200个单体单元，优选2—100个，更优选2—50个，最优选4—30个单体单元。优选含相同或不同的式I化合物单体单元的寡核苷酸。还优选另外含有衍生自D—核糖或2—脱氧核糖的合成或天然核苷单体单元的寡核苷酸。
本发明还涉及式V寡核苷酸5′-U-(O-Y-O-V-)xO-Y-O-W-3′(V)，其中X为0—200的数，及Y为核苷酸桥基，U、V和W各自独立地为相同或不同的天然或合成核苷残基，并且U、V和/或W残基中至少一个为式VI的残基 B和R3的定义、优选定义和实例如式I化合物下所定义。
优选的桥基Y为天然寡核苷酸中存在的—P(O)O_基团。桥基的其它实例为—P(O)S_—、—P(S)S_—、—P(O)R16—、—P(O)NR17R18及—CH2—，其中R16为H或C1—C6烷基，及R17和R18每个相互独立地同R16的定义。在式V中，X优选为0—100，更优选为1—50，最优选为3—29的数。式VI残基可连结在核苷酸序列末端或序列中，全部或几个(如2—5个)式VI残基可以依次连结，或式VI残基连结在天然或合成苷核之间，或以混合形式分布在核苷酸序列中。
一种特别优选的方案是这样的式V寡核苷酸，其中X为2—50，优选2—30的数，Y为—P(O)O(-)—基团，U、V和W每个独立地为相同或不同的天然核苷残基，且U、V和W的至少一种相当于式VI。
适合的天然核苷为腺苷、胞苷、鸟苷、尿苷、2—氨基腺苷、5—甲基胞苷、2′—脱氧腺苷、2′—脱氧胞苷、2′—脱氧鸟苷和胸苷。提及的天然核苷碱基特别是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。式VI残基可连结在核苷酸序列末端或序列中，全部或12个(比2—5个)或VI残基可以依次连结，或式VI残基连结在天然核苷残基之间，或以混合形式分布在核苷酸序列中。在式V的寡核苷酸的另一优选形式中，所有U，V和W残基相当于相同或不同的式VI残基。X优选为3—29的数，式V残基的总数优选为1—12个。
本发明的寡核苷酸可用本身已知的各种方法在DNA合成仪中制备，DNA合成仪可为自动化或非自动化的，带有操作说明的这种仪器可购得。对于桥基—P(O)O(-)—，例如可用本领域技术人员熟悉的磷酸三酯法、亚磷酸三酯法或H—膦酸酯法。在亚磷酸三酯法中可采用的步骤，例如包括其中R1和R2各自为H的式I核苷与保护基式剂如4，4′—二甲氧基三苯基甲基氯反应，形成式F的核苷 再将式F化合物通过“连接于”如琥珀酸酐连结到固体载体上如含有长链烷基氨基的可控多孔玻璃(CPG)上。在单独的步骤中，例如用R′OP〔N(异丙基)2)〕2将式F化合物的羟基衍生化为磷亚酰胺，形成式G化合物 其中R′为如β—氰基乙基。
在去除连结于载体的物质的保护基如DMT后，与式F化合物进行偶联，同时脱去—N(异—C3H7)2，将存在的任何游离羟基封闭(加帽)，然后将生成的亚磷酸酯氧化为磷酸酯。将二聚物脱保护后，用式G化合物重复反应循环，直到合成了具有所需数目的单体单元的寡聚体为止，使产物从载体上脱离。以此方式，得到了这样的寡核苷酸，其中所有根据式V的残基U、V和W由式VI的残基组成。根据具体反应循环中所使用的本发明的核苷单元和合成及天然核苷单元，以此方法还可以制备在任何所需的序列中含有任何所需的单体的寡核苷酸。
其中R1和R2各自为H的本发明式I化合物具有抗病毒和抗增殖特性，因此可用作药物。另外，本发明的寡核苷酸对核酸酶降解具有高稳定性。特别令人惊奇的是它们与互补核酸链(特别是RNA型的互补核酸链)的优异的配对能力。另外，它们具有意外高的细胞摄取率。本发明的寡核苷酸因此特别适合于反义技术，即通过与mRNA的适当互补核苷酸序列结合，抑制不良蛋白产物的表达(EP 266099，WO87/07300和WO89/08146)。它们可用于治疗感染和疾病，例如在核酸阶段阻断生物活性蛋白质的表达(如致癌基因)。本发明的寡核苷酸还适于作为诊断剂，可作为基团探针通过在单链或双链核酸阶段选择性相互作用。用于病毒感染和遗传病的检测。特别是由于其对核酸酶的稳定性提高，它们不仅可在体外而且可在体内(如组织样品、血浆和血清)用于诊断。这些可能的应用在如WO91/06556中有所描述。
本发明还涉及本发明的寡核苷酸作为病毒感染或遗传病检测的诊断剂的用途。
本发明还涉及本发明的式I核苷和式V寡核苷酸用于通过使体内核苷酸序列失活来治疗恒温动物(包括人)的疾病的治疗方法中。给重约70kg的恒温动物施用的日剂量为如0.01—1000mg。优选的药物组合物的形式经非胃肠道途径，如静脉内或腹膜内给药。
本发明还涉及药物组合物，它含有有效量的式I核苷或式V寡核苷酸，或还有其它活性成分，优选有效量的药物载体及适当时含有赋形剂。
本发明的药理有效的核苷和寡核苷酸可以非肠胃给药组合物形式或滴注液形式使用。这种溶液优选是等渗水溶液或悬液，它可在使用前从例如含有效成分本身或与载体如甘露糖醇结合的冻干组合物制备。该药物组合物可被灭菌和/或可含有赋形剂如防腐剂、稳定剂、湿润剂和/或乳化剂、增溶剂、调节渗透压的盐和/或缓冲液。该药物组合物必要时可含有其它药理活性物质如抗生素，可以本身已知的方法如常规溶解或冷冻干燥方法制备，它含有约0.1％—90％，特别是约0.5％—30％，例如1％—5％的有效成分。
下列实施例说明本发明。1H—NHR谱是基于下列环状碳结构中的碳原子编号。起始化合物 核苷(示例) 在本文中和式中使用的缩写DMF 二甲基甲酰胺ClBnCl22，4—二氯苄基氯Bn 苄基Ac 乙酰基φ 苯基BSA N，N—双三甲基甲硅烷基乙酰胺
DBU二氮杂双环〔5.4.0〕十一—7—烯。
BOH—Cl 苄氧基甲基氯DMTCl 4，4′二甲氧基三苯甲基氯THF四氢呋喃A)核苷类似物的制备实施例A1将28.0g 1—甲基核糖于60℃滴加到13.5gNaH在130mlDMF中的沸合物中。当不再产生H2时，滴加110.0g ClBnCl2。在25℃再搅拌反应混合物16小时。为了破坏残余的NaH，小心滴加甲醇，再将反应混合物倾入冰/水中。滤出块状沉淀，用乙腈彻底洗涤。得到化合物(Al)。 1H—NMR(250MHz，CDCl3)H—C(1)质子出现在5.0ppm处，单峰。MS638(M+)实施例A2将实施例A1中制备的65.9g产物溶解在600ml二氯甲烷中，将此溶液冷却至0℃。然后滴加800ml二氯甲烷中的121mlSnCl4，在3℃静置。26小时后再加入2mlSnCl4。总共35小时后，将反应溶液小心倾入700mlNaHCO3饱和溶液中。用400ml二氯甲烷稀释后，滤去含Sn沉淀。滤液的有机相用MgSO4干燥，蒸发浓缩，得到化合物(A2)。 1H—NMR(250MHz，CDCl3)H—C(1)质子出现在4.90ppm处，为双峰，J＝5Hz。实施例A3将125.9g实施例A2中得到的产物溶解在1升吡啶中。20℃下加入25.5g乙酸酐和1g4—二甲氨基吡啶。然后搅拌反应混合物17小时，再用浸溶于1升水中，用浓盐酸酸化，用乙酸乙酯萃取。萃取液用MgSO4干燥，并蒸发浓缩。最后，残余物用己烷结晶。得到化合物(A3)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)5.15[d，J＝4.5Hz，H-C(1)]；3.50(s，OCH3)；2.17(s，OCOCH3)；MS522(M+)[α]Na(D)＝87.4±1.0°，CHCl3(0.998％)实施例A4将24g胸腺嘧啶在100ml1，2—二氯乙烷中制成浆状。加入116.4gBSA后，回流直至得到澄清溶液。将该溶液冷却到50℃，加入50g实施例A3制得的产物和27.5g三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯。混合物在70℃下搅拌20小时，然后倾入300mlNaHCO3溶液中，过滤。用二氯乙烷萃取后，萃取液用MgSO4干燥，蒸发浓缩。最后，残余物用甲醇结晶。得到化合物(A4)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)8.25(s，NH)；6.10[d，J＝4.5Hz，H-C(1’)]；2.13(s，OCOCH3)；1.66(s，CH3)MS616(M+)实施例A5将85g实施例A4制得的产物悬浮在850ml乙腈中。在室温下滴加24.2gDBU和24.9gbOM—Cl。搅拌20小时后，将反应混合物倾入水中，用乙酸乙酯萃取。萃取液用MgSO4干燥，蒸发浓缩。得到化合物(A5)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)6.05[d，J＝4.5Hz，H-C(1’)]；5.5(AB，CH2)；5.37[dd，H-C(2’)]；2.13(S，OCOCH3)；1.55(s，CH3)MS736(M+)实施例A6将106g实施例A5中制备的产物悬浮在1升THF中。滴加26g30％NaOCH3/CH3OH。搅拌2.5小时后，将反应溶液倾入水中，加入氯化钠饱和水溶液，用乙酸乙酯萃取。用MgSO4干燥后，蒸发浓缩萃取液。得到化合物(A6)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)5.93[d，J＝5Hz，H-C(l)’)]；5.5(AB，CH2)；3.03(d，J＝6.5Hz，OH)；1.72(s，CH3)MS694(M+)实施例7将79.4g实施例A6中制得的产物溶解在800mlTHF中。加入3.3gNaH后，将混合物迅速加热至沸腾，然后于40℃下滴加21g溴乙酸甲酯。反应混合物于60℃共搅拌27小时，在此期间16小时后加入1gNaH和2ml溴乙酸甲酯，20小时后再次加入。最后，将反应混合物倾入水中，用乙酸乙酯萃取。萃取物用MgSO4干燥，蒸发浓缩，得到化合物(A7)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)7.70[s，H-C(6)]；5.92[s，H-C(1’)]；5.48(AB，CH2)；3.75(s，OCH3)；1.58(s，CH3).MS766(M+).实施例A8将37g实施例A7中得到的产物溶解在400mlTHF中。于20℃分批加入1.5gLiBH4，搅拌反应混合物1小时。将其小心倾入500ml水中，用32m12N盐酸水溶液中和。用乙酸乙酯萃取后，蒸发浓缩，得到化合物(A8)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)7.65[s，H-C(6)]；5.96[s，H-C(1’)]；5.50(AB，CH2)；2.57(broad s，OH)；1.60(s，CH3).MS738(M+).实施例A9将20.0g实施例A8中制得的产物溶解在200mlTHF中，用2gPd/C(5％)于25℃和常压下氢化4.5小时(H2吸收102％)。过滤并蒸发浓缩滤液后，将残余物溶解在170ml甲醇中，用30％NaOCH3/CH3OH溶液调pH至11。24小时后，将混合物倾入250ml水中，用2N盐酸水溶液酸化，用乙酸乙酯萃取。萃取物用MgSO4干燥，蒸发浓缩。得到化合物(A9)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)9.24(s，NH)；7.90[s，H-C(6)]；5.99[s，H-C(1，)]；2.68(t，OH)；1.60(s，CH3).MS618(M+).实施例A10将4.2g实施例A9中制备的产物溶解在50ml吡啶中，加入2.4g乙酸酐后，于室温下搅拌19小时。将溶液倾入100ml2NHCl中，用乙酸乙酯萃取。萃取液用2NHCl和水洗涤，用MgSO4干燥，蒸发浓缩。制得化合物(A10)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)9.28(s，NH)；7.67[s，H-C(6)]；5.95[s，H-C(1’)]；2.00(s，CH3)；1.60(s，CH3).MS663(M＋H)+.实施例A114.2g实施例A10中制得的产物在50ml甲醇中在2.09g无水醋酸钠存在下，用0.8gPd/C(5％)于35℃和常压下氢化。58小时后，过滤氢化混合物，蒸发浓缩。为了除去盐，残余物用硅胶在小玻璃柱上层析(乙酸乙酯/甲醇9∶1)。得到化合物(A11)。 1H-NMR(250MHz，DMSO)10.1(s，NH)；7.61[s，H-C(6)]；5.64[d，J＝6Hz，H-C(1’)]；1.70(s，CH3)；1.57.MS379(M＋Cl)-.实施例Al22.27g实施例A11中制备的产物浸溶于吡啶中两次，蒸发浓缩。残余物再溶解在30ml吡啶中，向其中加入2.57gDMTCl。室温搅拌20小时后，反应混合物用250ml乙酸乙酯稀释，并倾入50ml水中。有机相用MgSO4干燥。并浓缩。残余物在硅胶上层析(甲苯/乙酸乙酯/三乙胺49∶49∶2)。得到化合物(A12)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)9.22(s，NH)；7.70[s，H-C(6)]；5.94[d，J＝1.5Hz，H-C(1’)]；3.78(s，OCH3)；2.19(s，CH3)；1.36(s，CH3).MS706(M＋NH4)+.实施例A13将2.70g实施例A12中得到的产物加入0.93g二异丙基铵四唑化物、1.15g2—氰基乙基—N，N，N′，N′—四异丙基磷二亚酰胺及30ml二氯甲烷的混合物中。室温搅拌反应混合物17小时，然后倾入NaHCO3饱和水溶液中。有机相用MgSO4干燥，蒸发浓缩。残余物在硅胶上层析(乙醇/乙酸乙酯1∶1，加入2％三乙胺)。形成的泡沫溶解在1ml甲基叔丁基醚中，于0℃滴加到戊烷中。得到化合物(A13)(非对映异构体，1∶1)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)7.74[s，H-C(6)]and 7.68[s，H-C(6)]；6.08[d，J＝4Hz，H-C(1)]；5.97[d，J＝4Hz，H-C(1’)]；31P-NMR(CDCl3)150.174 and 150.038MS847(M＋H)+实施例A14将实施例A8中得到的20.6g产物溶解在200mlCH2Cl2中。于5℃下，滴加4.35g二乙氨基—硫三氟化物(DAST)，5℃下搅拌反应混合物3小时。将此溶液倾入300mlNaHCO3饱和溶液中，用CH2Cl2萃取。萃取液用MgSO4干燥，蒸发浓缩。残余物层析(硅胶，甲苯/乙酸乙酯，1∶1)，得到化合物(A14)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)7.68[s，H-C(6)]；5.92[s，H-C(1’)]；5.50[AB，CH2]1.58(s，CH3).19F-NMR(CDCl3)-223.74(t.CH2F).MS758(M＋NH4)+.实施例A15将1.30g实施例A14中得到的产物溶解在26mlTHF中，用0.65g/Pd/C(5％)于20℃和常压下氢化。0.5小时后，滤出催化剂，蒸发浓缩滤液。残余物溶解在甲醇(15ml)中，用NaOMe/MeOH溶液调pH为11。搅拌20小时后，将混合物倾入20ml水中，用乙酸乙酯萃取。蒸发浓缩后，得到化合物(A15)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)8.99(s，NH)；7.61[s，H-C(6)]；5.88[d，J＝1.5Hz，H-C(1’)]；1.52[s，CH3].MS621(M＋H)+.实施例A16类似于对步骤(A11)、(A12)和(A13)的说明，将化合物(A15)转化成磷亚酰胺(A16)(非对映异构体，1∶1)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)7.75[s，H-C(6)]and 7.68[s，H-C(6)]；6.06[d，J＝4Hz，H-C(1’)]and 6.00[d，J＝4Hz，H-C(1’)].31P-NMR(CDCl3)150.107.实施例A17将20.0g化合物(A6)溶解在200mlTHF中，保持在60℃，加入0.83gNaH(100％)，直至不再产生H2。冷却后，将此溶液在高压釜中加压，将48.0g三氟丙炔和该反应混合物加热至50℃。48小时后，将反应混合物浓缩至一半体积，然后倾入水中，用乙酸乙酯萃取。萃取物用MgSO4干燥，蒸发浓缩。残余物在硅胶上层析(正己烷/乙酸乙酯.4∶1)。得到化合物(A17)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)7.72[s，H-C(6)]；6.80(d，J＝8Hz，CH＝C)；5.82[s，H-C(1’)]；5.48(AB，CH2)；4.85(m，CH＝C)；1.58(s，CH3).MS789(M＋H)+.实施例A18将10.0g化合物(A17)溶解在200mlTHF中，用2gPd/C在室温和常压下氢化。1小时后，滤去催化剂，蒸发浓缩滤液。然后类似于实施例A15，残余物用NaOMe处理，在硅胶上层析(正己烷/乙酸乙酯2∶1)。得到化合物(A18)。 1H-NMR(CDCl3)9.00(s，NH)；7.66[s，H-C(6)]；5.93[d，J＝1.5Hz，H-C(1’)]；1.61(s，CH3).19F-NMR(CDCl3)-65.23.MS705(M＋Cl)-.实施例A19将8.9g化合物(A6)溶解在90mlTHF中，迅速加热至沸，加入0.34gNaH(100％)。当不再产生H2时，于20℃滴加5.1gl，1，2—三氯—3，3，3—三氟丙烯，然后在55℃下搅拌反应混合物5小时。将反应混合物倾入水中，用乙酸乙酯萃取。蒸发浓缩，然后层析(硅胶，甲苯/乙酸乙酯4∶1)。得到顺/反(约1∶1)混合物形式的化合物(A19)。 1H-NMR(CDCl3)7.63 and 7.60[each s，each H-C(6)]；5.91 and 5.87[each s，eachH-C(1’)]；1.61 and 1.57(each s，each CH3).MS891(M＋Cl)-.
实施例A20类似上述实施列，将化合物(A18)或(A19)脱保护并转化成磷亚酰胺，得到化合物(A20)(非对映异构体，1∶1)。 1H-NMR(CDCl3)8.6(broad s，NH)；7.74 and 7.69[each s，each H-C(6)]；5.97 and 5.94[each d，J＝4Hz，each H-C(1’)].31P-NMR(CDCl3)150.287 and 150.035ppm.实施例B寡核苷酸的制备用二甲氧基三苯甲基化、3′—活化的〔3′—(β—氰基乙氧基—二(异丙基氨基)磷亚酰胺)〕本发明核苷和这样的天然活化核苷，将寡核苷酸连结于固体载体(可控多孔玻璃CPG)上，按照制造商的一般性说明〔也见“Oligonucleotide Synthesis，a practical approach”M.J Gait；IRL Press 1984(Oxford—Washington DC)〕在DMA合成仪(AppliedBiosystems，Modell 380B，标准磷亚酰胺化学和磺酰化)中进行合成。在偶联最后一个核苷单元后，使5′—保护的寡核苷酸从固体载体上脱离过夜，同时用浓氨水处理除去所有其它的保护基，然后经反相HPLC用50mM乙酸铵缓冲液(pH7)/乙腈进行纯化。再用80％乙酸水溶液处理20分钟，除去5′—二甲氧基三苯甲基保护基，用乙醇沉淀寡核苷酸，离心分离。用凝胶电脉(聚丙烯酰胺)鉴定此寡核苷酸的纯度，并且借助于基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI—TOFMS)检定其特性。实施例C1亲和性；寡核苷酸(反义)与互补寡核苷酸序列(有意义)的相互作用寡核苷酸与相应的天然核苷酸的碱基互补寡聚体的相互作用，通过记录UV熔化曲线和由其所确定的Tm值来表征。例如由Marky，L.A.〔Breslauer，K.J.，Biopolymers 261601—1620(1987)〕描述了该标准方法。
制备寡核苷酸和相应的碱基互补天然寡核苷酸在10mM磷酸缓冲液，100mM、NaCl、0.1mMEDTA，pH7.0中的溶液(c＝4·10-6/寡核苷酸)，记录作为温度(15—95℃)函数的260nm处消光值的变化。从熔化曲线测得Tm值(表3)。表3亲和性(a)TTTTtCTCTCTCTCT(vs.RNA) X Tm(℃) ΔTm(℃)H 51.8 0 (h)tCCAGGtGtCCGCAtC(vs.RNA) x Tm(℃) ΔTm(℃)/modH62.3 0 (c)GCGttttttttttGCG(vs.RNA) X Tm(℃)ΔTm(℃)/mod．H50.2 0 实施例C2特异性；寡核苷酸与其中插入了错误核苷(Y)的碱基互补寡核苷酸的相互作用制备了寡核苷酸和序列为r(GGA CCG GAA YGG TAC GAG)的相应碱基互补寡核苷酸在10mM磷酸盐缓冲液、100mM NaCl、0.1mM EDTA，pH7中的溶液(c＝4·10-6M/寡核苷酸)，测定作为温度(15℃到95℃)函数的在200nm处消光值的变化。从该曲线测得Tm值。结果示于表4中。表4特异性有意义3’-GAG CAU GGY AAG GCC AGG-5’(RNA)反义 5’-CTC GTA CCt TTC CGG TCC-3’(DNA)Tm(℃) andΔTm Y＝A63.3 65.0 69.4Y＝C54.5 55.5 55.8(-8.9) (-9.5) (-8.6)Y＝G61.6 59.7 60.5(-1.7) (-5.3) (-4.0)Y＝U55.8 56.2 56.8(-7.5) (-8.8) (-7.7)Y＝无 59.4 56.1 57.4(-3.9) (-8.9) (-7.0)实施例C3核酸酶稳定性；具有序列d(TCC AGG TGT CCG tttC)的各种寡核苷酸的酶促水解。
数批合成的寡核苷酸和相应的天然寡聚体，每批14μg在37℃在200μl 10％热灭活胎牛血清中(c＝70μg/ml)温育。在0.5；1；2；4；6；24和48小时后，每15μl反应溶液通过加入到25μl 9M脲和三硼酸盐缓冲液(pH7)中退火，—20℃下储存，直到进行测定为止。退火反应溶液用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用其磷含量(磷成像方法)鉴别裂解产物。在给定的时间t时完整寡核苷酸的浓度(Cn(t))和从3′末端除去天然C—单元得到的片段的浓度(Cn-1(t))之和，与在t＝0时完整寡核苷酸的原始浓度(Cn(0))之比R—R＝(Cn(t)＋Cn-1(0))/ Cn(0)—对时间作图。测得半衰期τ1/2(即R＝0.5时的时间)为
权利要求
1.式I化合物 其中R1和R2各自相互独立地为氢或保护基，或R1如上所定义和R2为形成含磷核苷酸桥基的残基；B为嘌呤或嘧啶残基或其类似物；及R3为OH，F或(CF2)nCF3，其中n为0—7的数。
2.权利要求1的化合物，其中R1和R2均为氢。
3.权利要求1的化合物，其中R1和R2为相同的保护基。
4.权利要求1的化合物，其中作为嘌呤残基或其类似物的B为式II、IIa、IIb、IIc、IId、IIe和IIf的残基 其中Rb1为H、Cl、Br、OH或—O—C1—C12烷基，及Rb2、Rb3和Rb5各自相互独立地为H，OH，SH，NH2，NHNH2，NHOH，NHO—C1—C12烷基，-N＝CH—N(C1—C12烷基)2，—N＝CH—氮杂环烷基，F，Cl，Br，C1—C12烷基，羟基—C1—C12烷基，氨基—C1—C12烷基，C1—C12烷氧基，苄氧基或C1—C12烷硫基，被保护基取代或未取代的羟基和氨基，苯基，苄基，C1—C20伯氨基或C2—C30仲氨基，Rb4为氢、CN或—C≡C—Rb7，及Rb6和Rb7为氢或C1—C4烷基。
5.权利要求4的化合物，其中羟基和氨基的保护基为C1—C8酰基。
6.权利要求4的化合物，其中伯氨基含有1—12个碳原子，仲氨基含有2—12个碳原子。
7.权利要求4的化合物，其中伯氨基和仲氨基为式Ra1Ra2N的残基，其中Ra1为H，或独立地同Ra2的定义，及Ra2为C1—C26烷基、—氨基烷基或—羟基烷基；羧基烷基或烷氧羰基烷基，其中烷氧羰基含2—8个碳原子，烷基含1—6个碳原子，优选1—4个；C2—C20链烯基；苯基，单—或二—(C1—C4—烷基—或—烷氧基)苯基，苄基，单—或二—(C1—C4—烷基—或—烷氧基)苄基；或1，2—1，3—或1，4—咪唑—C1—C6烷基，或Ra1和Ra2一起为四亚甲基或五亚甲基，3—氧杂—1，5—亚戊基，—CH2—NRa3—CH2CH2—或—CH2CH2—NRa3—CH2CH2—，其中Ra3为H或C1—C4烷基，氨基烷基中的氨基被一个或两个C1—C4烷基或羟基烷基所取代或未取代，及羟基烷基中的羟基为游离的或被C1—C4烷基醚化。
8.权利要求6的化合物，其中伯氨基和仲氨基为甲基—、乙基—、二甲基—、二乙基—、烯丙基—、单或二—(羟基—乙—2—基)—、苯基—和苄基、乙酰基—、异丁酰基—或苯甲酰基—氨基。
9.权利要求4的化合物，其中式II、IIb、IIc、IId和IIe中Rb1为氢。
10.权利要求4的化合物，其中式IId中Rb5为氢。
11.权利要求4的化合物，其中式II、IIa、IIb、IIc、IId和IIf中的Rb2和Rb3各自相互独立地为H、F、Cl、Br、OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、甲氨基、二甲氨基、苯甲酰氨基、甲氧基、乙氧基或甲硫基。
12.权利要求4的化合物，其中B为嘌呤残基或选自下列的嘌呤类似物的残基腺嘌呤、N—甲基腺嘌呤、N—苯甲酰基腺嘌呤、2—甲硫基腺嘌呤、2—氨基腺嘌呤、6—羟基嘌呤、2—氨基—6—氯嘌呤、2—氨基—6—甲硫基嘌呤、鸟嘌呤和N—异丁酰基鸟嘌呤。
13.权利要求1的化合物，其中式I中作为嘧啶残基的B为式III、IIIa、IIIb或IIIc的尿嘧啶、胸腺嘧啶或胞嘧啶残基 其中Rb6为H或C1—C4烷基，及Rb8为H，OH，SH，NH2，NHNH2，NHOH，NHO—C1—C12烷基，—N＝CH—N(C1—C12烷基)2，—N＝CH—氮杂环烷基，F，Cl，Br，C1—C12烷基，羟基—C1—C12烷基，氨基—C1—C12烷基，C1—C12烷氧基，苄氧基或C1—C12烷硫基，被保护基取代或未取代的羟基和氨基，苯基，苄基，C1—C20伯氨基，C2—C30仲氨基，C1—C12链烯基或C1—C12炔基，及及IIIb中的NH2被C1—C6烷基、苯甲酰基或被保护基取代或未取代，或式III、IIIa、IIIb或IIIc残基的二氢衍生物。
14.权利要求13的化合物，其中Rb8为H，C1—C6—烷基或—羟烷基，C2—C6—链烯基或—炔基，F，Cl，Br，NH2，苯甲酰氨基，或单—或二—C1—C6烷基氨基。
15.权利要求13的化合物，其中Rb8为H，C1—C6—烷基或—烷氧基或—羟基烷基，C2—C6—链烯基或—炔基，F，Cl，Br，NH2，苯甲酰氨基，或单—或二—C1—C6烷基氨基。
16.权利要求14的化合物，其中Rb8为H、F、Cl、Br、NH2、NHCH3、N(CH3)2、C1—C4烷基、C2—C4链烯基—(1)或C2—C4炔基—(1)。
17.权利要求15的化合物，其中Rb8为H，C1—C4烷基，C2—C4链烯基—(1)，C2—C4炔基—(1)，NH2，NHCH3或(CH3)2N。
18.权利要求1的化合物，其中作为嘧啶类似物的残基B衍生自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5—氟尿嘧啶、5—氯尿嘧啶、5—溴尿嘧啶、二氢尿嘧啶、5—甲基胞嘧啶、5—丙炔胸腺嘧啶和5—丙炔胞嘧啶。
19.权利要求1的化合物，其中作为形成核苷酸桥基的含磷残基R2为式P1或P2 其中Ya为氢、C1—C12烷基、C6—C12芳基、C7—C20芳烷基、C7—C20烷芳基、—ORb、—SRb、—NH2、伯氨基、仲氨基、O(-)M(+)或S(-)M(+)；Xa为氧或硫；Ra为氢、M_、C1—C12烷基、C2—C12链烯基、C6—C12芳基、或RaO—基团为具有含1—3个N原子的5之环的N—杂芳基—N—基；Rb为氢、C1—C12烷基或C6—C12芳基；及M_为Na_、K_、Li_、NH4_或伯、仲、叔或季铵离子；Ya、Ra和Rb中的烷基、芳基、芳烷基和烷芳基被烷氧基、烷硫基、卤原子、—CN、—NO2、苯基、硝基苯基或被卤代苯基取代或未取代。
20.权利要求19的化合物，其中Ra为β—氰基乙基，及Ya为二(异丙基)氨基。
21.权利要求1的化合物，其中R3为OH。
22.权利要求1的化合物，其中R3为F。
23.权利要求1的化合物，其中R3为(CF2)nCF3，且n为0—7的数。
24.权利要求23的化合物，其中n为0。
25.式I化合物的制备方法 其中R1和R2各自相互独立地为氢或保护基；B为嘌呤或嘧啶残基或其类似物；及(a)R3为OH，该方法包括式IVa化合物 其中R14和R15为相同或不同的保护基，B为嘌呤或嘧啶残基或其类似物，碱基B中的官能团用保护基保护，在惰性溶剂中与式A化合物反应X—CH2—COOR4(A)其中R4为C1—C4烷基，X为Cl、Br、I、甲苯磺酰基—O—或甲磺酰基—O；然后用NaBH4或LiAlH4还原酯官能团，可以用R1中定义的基团临时保护生成的OH；(b)R3为F，该方法包括其中R3为OH的式I化合物与式B化合物反应 (c)R3为—(CF2)n—CF3，其中n为0—7的数，该方法包括式IVa化合物与式C、D或E的化合物反应CH≡C-(CF2)n-CF3(C)CH2＝CH-(CF2)n-CF3(D) 然后将双键或氯代双键催化还原，可形成CH2CH2(CF)nCF3基团；(d)R3为OH、F或—(CF2)n—CF3，该方法包括式IVb化合物 其中R14和R15如上所定义，A为离去基团，按(a)到(c)中描述的方法之一在2′—OH上进行取代，然后通过取代引入碱基B；必要时脱去保护基R14和R15。
26.权利要求1的化合物用于制备寡核苷酸的用途，其中寡核苷酸由相同或不同的式1化合物单体单元组成，或含有与一个或多个其它天然或合成的核苷相结合的至少一个式I化合物单位单元，该寡核苷酸为2—200个单体单元组成。
27.权利要求26的用途，是制备含2—100个单体单元的寡核苷酸。
28.权利要求27的用途，是制备含2—50个单体单元的寡核苷酸。
29.权利要求28的用途，是制备含4—30个单体单元的寡核苷酸。
30.权利要求26的用途，是制备相同或不同的式I化合物单体单元的寡核苷酸。
31.权利要求26的用途，是制备相同的式I化合物单体单元和一种或多种天然或合成核苷单体单元的寡核苷酸。
32.式V的寡核苷酸5′-U-(O-Y-O-V-)xO-Y-O-W-3′(V)，其中X为0—200的数，及Y为核苷酸桥基，U、V和W各自独立地为相同或不同的天然或合成核苷，并且U、V和/或W残基中至少一个为式VI的残基 其中B为嘌呤或嘧啶残基或其类似物，及R3为OH、F或(CF2)nCF3，其中n为0—7的数。
33.权利要求32的寡核苷酸，其中n为0。
34.权利要求32的寡核苷酸，其中桥基Y为—P(O)O(-)—、—P(O)S(-)—、—P(S)S(-)—、—P(O)R16—、—P(O)NR17R18—或—CH2—，其中R16为H或C1—C6烷基，及R17和R18各自独立地同R16的定义。
35.权利要求32的寡核苷酸，其中桥基Y为—P(O)O(-)—。
36.权利要求32的寡核苷酸，其中X为0—100的数。
37.权利要求36的寡核苷酸，其中X为1—50的数。
38.权利要求37的寡核苷酸，其中X为3—29的数。
39.权利要求32的寡核苷酸，其中式VI残基键合在末端和/或核苷酸序列中。
40.权利要求32的寡核苷酸，其中式VI残基键合在天然或合成核苷之间。
41.权利要求39或40的寡核苷酸，其中2—5个相同或不同的式VI残基依次相连。
42.权利要求32的寡核苷酸，其中共含4—30个核苷单元和1—12个式VI残基。
43.权利要求32的化合物，其中作为嘌呤残基或其类似物的B为式II、IIa、IIb、IIc、IId、IIe或IIf的残基 其中Rb1为H、Cl、Br、OH或—O—C1—C12烷基，及Rb2、Rb3和Rb5各自相互独立地为H，OH，SH，NH2，NHNH2，NHOH，NHO—C1—C12烷基，—N＝CH—N(C1—C12烷基)2，—N＝CH—N—环烷基，F，Cl，Br，C1—C12烷基，羟基—C1—C12烷基，氨基—C1—C12烷基，C1—C12烷氧基，苄氧基或C1—C12烷硫基，被保护基取代或未取代的羟基和氨基，苯基，苄基，C1—C20伯氨基或C2—C30仲氨基，Rb4为氢、CN或—C≡C—Rb7，及Rb6和Rb7为氢或C1—C4烷基。
44.权利要求32的化合物，其中B为式III、IIIa、IIIb或IIIc的尿嘧啶、胸腺嘧啶或胞嘧啶残基 其中Rb6为H或C1—C4烷基，及Rb8为H，OH，SH，NH2，NHNH2，NHOH，NHO—C1—C12烷基，—N＝CH—N(C1—C12烷基)2，—N＝CH—N—环烷基，F，Cl，Br，C1—C12烷基，羟基—C1—C12烷基，氨基—C1—C12烷基，C1—C12烷氧基，苄氧基或C1—C12烷硫基，被保护基取代或未取代的羟基和氨基，苯基，苄基，C1—C20伯氨基，C2—C30仲氨基，C1—C12链烯基或C1—C12炔基，及及IIIb中的NH2被C2—6烷基、苯甲酰基或被保护基取代或未取代，或式III、IIIa、IIIb或IIIc残基的二氢衍生物。
45.权利要求32的寡核苷酸，其中R3为OH。
46.权利要求32的寡核苷酸，其中R3为F。
47.权利要求32的寡核苷酸，其中R3为(CF2)nCF3。
48.权利要求32的寡核苷酸，其中n为0—3的数。
49.权利要求48的寡核苷酸，其中n为0。
50.式V的寡核苷酸作为检测病毒感染或遗传病的诊断剂的用途。
51.式V的寡核苷酸在通过与体内核苷酸序列相互作用来治疗恒温动物(包括人)的疾病的治疗方法中的用途。
52.含有有效量的式I核苷或式V寡核苷酸，或还含有其它有效成分，药物载体以及适当时含有赋形剂的药物组合物。
全文摘要
本发明公开了式I化合物，式中R
文档编号C07H19/167GK1115320SQ9510424
公开日1996年1月24日 申请日期1995年4月26日 优先权日1994年4月27日
发明者P·马丁 申请人:希巴-盖吉股份公司