1.本发明属于多肽纯化技术领域，具体涉及一种棕榈酰三肽-5的纯化方法。
背景技术：
2.棕榈酰三肽-5是应用最早、最广泛的美容胜肽。棕榈酰三肽-5属于信号类胜肽，能够通过增加基质细胞活动来促进胶原蛋白(i型、ii型和iv型)的合成和细胞外基质蛋白的生成，让皮肤看起来更显年轻和富有弹性。因此能够作为皮肤胶原蛋白缺失的补充从而使肌肤更加年轻，可以减少任何类型的皱纹。该成分被我国2015年已使用化妆品原料名称目录收录，可以合法添加。
技术实现要素：
3.本发明的目的在于提供一种可用于纯化多肽并且纯化效果好的棕榈酰三肽-5的纯化方法。
4.本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种棕榈酰三肽-5的纯化方法，包括：由功能化聚乙氧基硅烷经乙醇溶液处理、老化处理后焙烧得到多孔硅胶；功能化聚乙氧基硅烷由功能化硅烷与四乙氧基硅烷在稳定剂、催化剂和致孔剂作用下反应得到，功能化硅烷由三乙氧基硅烷于含有烯丙基苯胺和己酸丙烯酯的功能化溶液中处理制备得到；功能化硅烷制备中向功能化溶液中加入引发剂；多孔硅胶酸化后与十八烷基二甲基甲氧基硅烷反应后并封端处理得到反相色谱填料；将反相色谱填料装载于层析柱中后，将棕榈酰三肽-5粗液上样于层析柱中进行洗脱纯化。多孔硅胶具有良好的机械强度、容易控制的孔结构和比表面积、较好的化学稳定性和热稳定性以及专一的表面化学反应等优点，因此可以采用硅胶对多肽进行分离纯化，为了得到性能优异的多孔硅胶，本发明采用功能化聚硅氧烷用于制备多孔硅胶，其关键在于功能化硅烷的制备，采用烯丙基苯胺与己酸丙烯酯在引发剂作用下使双键与三乙氧基硅烷中的硅氢反应得到功能化硅烷，然后再与四乙氧基硅烷制备得到功能化聚硅氧烷，再然后用于制备多孔硅胶，制备多孔硅胶中采用了焙烧处理，功能化聚硅氧烷内部含有烯丙基苯胺与己酸丙烯酯在焙烧处理后，形成特异炭结构被包覆于多孔硅胶中，提高了多孔硅胶的比表面积，提高多孔硅胶的孔径，最后由此制备形成的反相色谱填料，对棕榈酰三肽-5具有优异的纯化效果。
5.优选地，功能化溶液中含有2-8wt%的烯丙基苯胺和2-8wt%的己酸丙烯酯。
6.优选地，稳定剂为环己烷，催化剂为硝酸，致孔剂为peg600。
7.优选地，引发剂为偶氮二异丁腈。
8.优选地，棕榈酰三肽-5粗液由棕榈酰三肽-5粗产品加入甲醇中超声制备。
9.优选地，封端采用的试剂为三甲基氯硅烷。
10.优选地，功能化硅烷的制备中，氮气保护下，将三乙氧基硅烷加入thf中，加入偶氮二异丁腈，在65-75℃回流处理10-60min，处理完成后，加入功能化溶液，在65-75℃回流反应9-36h，反应完成后，蒸去溶剂，加入dmf沉淀，加入正己烷搅拌处理10-30min后，离心除去上清液，然后加入甲醇搅拌处理10-30min后，离心除去上清液，干燥，得到功能化硅烷。
11.更优选地，三乙氧基硅烷的使用量为thf的3-9wt%。
12.更优选地，偶氮二异丁腈的使用量为thf的0.2-0.8wt%。
13.更优选地，功能化溶液的溶剂为thf，功能化溶液中含有烯丙基苯胺和己酸丙烯酯，功能化溶液中含有2-8wt%的烯丙基苯胺，功能化溶液中含有2-8wt%的己酸丙烯酯。
14.更优选地，功能化溶液的使用量为thf的15-40wt%。
15.优选地，功能化聚乙氧基硅烷的制备中，将四乙氧基硅烷和功能化硅烷加入无水乙醇中，在20-40℃的温度下低速搅拌20-60min，加入稳定剂、催化剂和致孔剂，搅拌混合均匀，在80-90℃的温度下处理3-12h，然后通氮气保护，搅拌处理2-6h后，在130-150℃的温度下蒸干，得到功能化聚乙氧基硅烷。
16.更优选地，四乙氧基硅烷的使用量为无水乙醇的20-40wt%。
17.更优选地，功能化硅烷的使用量为无水乙醇的10-20wt%。
18.更优选地，稳定剂为环己烷，稳定剂的使用量为无水乙醇的0.5-5wt%。
19.更优选地，催化剂为硝酸，催化剂的使用量为无水乙醇的0.1-2.1wt%。
20.更优选地，致孔剂为peg600，致孔剂的使用量为无水乙醇的1-8wt%。
21.更优选地，功能化聚乙氧基硅烷的制备中可以加入甲基丙烯酸三甲基硅酯，甲基丙烯酸三甲基硅酯的使用量为无水乙醇的0.3-2.1wt%。在制备聚乙氧基硅烷的过程中，甲基丙烯酸三甲基硅酯的进一步使用，提高了后续处理制备得到的多孔硅胶的比表面积和孔径。
22.优选地，多孔硅胶酸化处理中，将多孔硅胶加入硝酸溶液中，在20-40℃的温度下超声2-6h，抽滤，洗涤至中性，干燥，得到酸化多孔硅胶。
23.更优选地，硝酸溶液中含有0.1-2.1wt%的硝酸。
24.更优选地，多孔硅胶的使用量为硝酸溶液的2-6wt%。
25.优选地，反相色谱填料的制备中，将酸化多孔硅胶加入甲苯中，在110-130℃的条件下回流1-6h，加入催化剂搅拌混合，加入十八烷基二甲基甲氧基硅烷，在110-130℃的条件下回流4-16h，冷却至室温，甲苯洗涤，甲醇洗涤，真空干燥，封端试剂封端处理，得到反相色谱填料。
26.更优选地，酸化多孔硅胶的使用量为甲苯的2-5wt%。
27.更优选地，催化剂为对甲苯磺酸钠，催化剂的使用量为甲苯的0.2-0.8wt%。
28.更优选地，十八烷基二甲基甲氧基硅烷的使用量为甲苯的0.2-0.6wt%。
29.更优选地，封端处理中，将反相色谱填料加入甲苯中，在110-130℃的条件下回流1-6h，加入三甲基氯硅烷，在110-130℃的条件下回流2-8h，冷却至室温，二氯甲烷洗涤，真空干燥。
30.更进一步优选地，三甲基氯硅烷的使用量为反相色谱填料的30-40wt%。
31.优选地，将棕榈酰三肽-5粗产品加入甲醇中超声至液体澄清，经滤膜过滤后，收集滤液得到棕榈酰三肽-5粗液。甲醇的使用量以棕榈酰三肽-5粗产品可以溶解为宜。
32.优选地，棕榈酰三肽-5的纯化中，将棕榈酰三肽-5粗液上样至层析柱，洗脱液洗脱，紫外分光光度计检测，收集目标多肽溶液，冷冻干燥，得到纯化后的棕榈酰三肽-5。
33.优选地，流动相a为含有0.08-0.12wt％三氟乙酸的乙腈，流动相b为含有0.08-0.12wt％三氟乙酸的水。流动相a与流动相b以质量比1：0.3-1的比例使用。
34.本发明的目的在于提供一种比表面积大、孔径大的多孔硅胶的制备方法。
35.本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种多孔硅胶的制备方法，包括：三乙氧基硅烷加入thf后再与引发剂、功能化溶液混合反应得到功能化硅烷；功能化溶液中含有烯丙基苯胺和己酸丙烯酯，引发剂为偶氮二异丁腈；功能化硅烷与四乙氧基硅烷在稳定剂、催化剂和致孔剂存在下制备得到功能化聚乙氧基硅烷；稳定剂为环己烷，催化剂为硝酸，致孔剂为peg600；功能化聚乙氧基硅烷经乙醇溶液处理、老化处理后焙烧得到多孔硅胶。
36.优选地，三乙氧基硅烷的使用量为thf的3-9wt%。
37.优选地，功能化聚乙氧基硅烷制备中使用的溶剂为无水乙醇。
38.优选地，多孔硅胶的制备中，将功能化聚乙氧基硅烷在140-160℃的条件下处理1-5h，冷却至20-40℃，加入乙醇溶液，在20-70℃的条件下搅拌反应2-8h，反应结束后，抽滤，洗涤，沉降，在20-40℃的条件下老化6-24h，干燥，在400-600℃的条件下焙烧3-12h，得到多孔硅胶。
39.更优选地，乙醇溶液中乙醇的含量为20-40wt%。
40.更优选地，功能化聚乙氧基硅烷的使用量为乙醇溶液的30-60wt%。
41.本发明公开了上述方法制备得到的多孔硅胶。
42.本发明由于采用了三乙氧基硅烷与烯丙基苯胺与己酸丙烯酯制备得到功能化硅烷，然后利用上述功能化硅烷与四乙氧基硅烷共同制备得到功能化聚乙氧基硅烷，以功能化聚乙氧基硅烷作为原料制备得到多孔硅胶，并经处理最终制成反相色谱填料，用以纯化棕榈酰三肽-5，因而具有如下有益效果：制备得到的多孔硅胶的比表面积大，比表面积为250-320m2/g；多孔硅胶的孔径大，孔径为6-10nm；用以制备的反相色谱填料对棕榈酰三肽-5的纯化效果好，纯度为96%以上。因此，本发明是一种可用于纯化多肽并且纯化效果好的棕榈酰三肽-5的纯化方法。
附图说明
43.图1为功能化硅烷的红外图；图2为多孔硅胶的比表面积图；图3为多孔硅胶的孔径图；图4为经纯化处理后棕榈酰三肽-5的纯度图。
具体实施方式
44.以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：实施例1：一种棕榈酰三肽-5的纯化方法，
功能化硅烷的制备：氮气保护下，将三乙氧基硅烷加入thf中，加入偶氮二异丁腈，在70℃回流处理20min，处理完成后，加入功能化溶液，在70℃回流反应24h，反应完成后，蒸去溶剂，加入dmf沉淀，加入正己烷搅拌处理20min后，离心除去上清液，然后加入甲醇搅拌处理20min后，离心除去上清液，干燥，得到功能化硅烷。三乙氧基硅烷的使用量为thf的6wt%，偶氮二异丁腈的使用量为thf的0.5wt%，功能化溶液的溶剂为thf，功能化溶液中含有烯丙基苯胺和己酸丙烯酯，功能化溶液中含有6wt%的烯丙基苯胺，功能化溶液中含有6wt%的己酸丙烯酯，功能化溶液的使用量为thf的30wt%。
45.功能化聚乙氧基硅烷的制备：将四乙氧基硅烷和功能化硅烷加入无水乙醇中，在30℃的温度下低速搅拌40min，加入稳定剂、催化剂和致孔剂，搅拌混合均匀，在90℃的温度下处理8h，然后通氮气保护，搅拌处理4h后，在140℃的温度下蒸干，得到功能化聚乙氧基硅烷。四乙氧基硅烷的使用量为无水乙醇的30wt%，功能化硅烷的使用量为无水乙醇的15wt%，稳定剂为环己烷，稳定剂的使用量为无水乙醇的2.5wt%，催化剂为硝酸，催化剂的使用量为无水乙醇的1.4wt%，致孔剂为peg600，致孔剂的使用量为无水乙醇的4wt%。
46.多孔硅胶的制备：将功能化聚乙氧基硅烷在150℃的条件下处理3h，冷却至30℃，加入乙醇溶液，在50℃的条件下搅拌反应6h，反应结束后，抽滤，洗涤，沉降，在30℃的条件下老化12h，干燥，在500℃的条件下焙烧9h，得到多孔硅胶。乙醇溶液中乙醇的含量为30wt%，功能化聚乙氧基硅烷的使用量为乙醇溶液的40wt%。
47.多孔硅胶酸化处理：将多孔硅胶加入硝酸溶液中，在30℃的温度下超声4h，抽滤，洗涤至中性，干燥，得到酸化多孔硅胶。硝酸溶液中含有1.5wt%的硝酸，多孔硅胶的使用量为硝酸溶液的4wt%。
48.反相色谱填料的制备：将酸化多孔硅胶加入甲苯中，在120℃的条件下回流3h，加入催化剂搅拌混合，加入十八烷基二甲基甲氧基硅烷，在120℃的条件下回流12h，冷却至室温，甲苯洗涤，甲醇洗涤，真空干燥，封端试剂封端处理，得到反相色谱填料。酸化多孔硅胶的使用量为甲苯的4wt%，催化剂为对甲苯磺酸钠，催化剂的使用量为甲苯的0.5wt%，十八烷基二甲基甲氧基硅烷的使用量为甲苯的0.4wt%。
49.封端处理步骤：将反相色谱填料加入甲苯中，在120℃的条件下回流4h，加入三甲基氯硅烷，在120℃的条件下回流6h，冷却至室温，二氯甲烷洗涤，真空干燥。三甲基氯硅烷的使用量为反相色谱填料的36wt%。
50.样品处理：将棕榈酰三肽-5粗产品加入甲醇中超声至液体澄清，经孔径为0.45μm滤膜过滤后，收集滤液得到棕榈酰三肽-5粗液。甲醇的使用量以棕榈酰三肽-5粗产品可以溶解为宜。
51.棕榈酰三肽-5的纯化：将棕榈酰三肽-5粗液上样至层析柱中，洗脱液洗脱，紫外分光光度计检测，收集目标多肽溶液，冷冻干燥，得到纯化后的棕榈酰三肽-5。层析柱中装有反相色谱填料。
52.流动相a为含有0.10wt％三氟乙酸的乙腈，流动相b为含有0.10wt％三氟乙酸的水。流动相a与流动相b以质量比1：0.7的比例使用。
53.实施例2：一种棕榈酰三肽-5的纯化方法，本实施例与实施例1相比，不同之处仅在于，多孔硅胶的制备中，功能化聚乙氧基
硅烷的使用量为乙醇溶液的50wt%。
54.实施例3：一种棕榈酰三肽-5的纯化方法，功能化硅烷的制备：氮气保护下，将三乙氧基硅烷加入thf中，加入偶氮二异丁腈，在70℃回流处理20min，处理完成后，加入功能化溶液，在70℃回流反应24h，反应完成后，蒸去溶剂，加入dmf沉淀，加入正己烷搅拌处理20min后，离心除去上清液，然后加入甲醇搅拌处理20min后，离心除去上清液，干燥，得到功能化硅烷。三乙氧基硅烷的使用量为thf的6wt%，偶氮二异丁腈的使用量为thf的0.5wt%，功能化溶液的溶剂为thf，功能化溶液中含有烯丙基苯胺和己酸丙烯酯，功能化溶液中含有6wt%的烯丙基苯胺，功能化溶液中含有6wt%的己酸丙烯酯，功能化溶液的使用量为thf的30wt%。
55.功能化聚乙氧基硅烷的制备：将四乙氧基硅烷和功能化硅烷加入无水乙醇中，在30℃的温度下低速搅拌40min，加入稳定剂、催化剂、功能剂和致孔剂，搅拌混合均匀，在90℃的温度下处理8h，然后通氮气保护，搅拌处理4h后，在140℃的温度下蒸干，得到功能化聚乙氧基硅烷。四乙氧基硅烷的使用量为无水乙醇的30wt%，功能剂为甲基丙烯酸三甲基硅酯，功能剂的使用量为无水乙醇的0.5wt%，功能化硅烷的使用量为无水乙醇的15wt%，稳定剂为环己烷，稳定剂的使用量为无水乙醇的2.5wt%，催化剂为硝酸，催化剂的使用量为无水乙醇的1.4wt%，致孔剂为peg600，致孔剂的使用量为无水乙醇的4wt%。
56.多孔硅胶的制备：将功能化聚乙氧基硅烷在150℃的条件下处理3h，冷却至30℃，加入乙醇溶液，在50℃的条件下搅拌反应6h，反应结束后，抽滤，洗涤，沉降，在30℃的条件下老化12h，干燥，在500℃的条件下焙烧9h，得到多孔硅胶。乙醇溶液中乙醇的含量为30wt%，功能化聚乙氧基硅烷的使用量为乙醇溶液的50wt%。
57.多孔硅胶酸化处理：将多孔硅胶加入硝酸溶液中，在30℃的温度下超声4h，抽滤，洗涤至中性，干燥，得到酸化多孔硅胶。硝酸溶液中含有1.5wt%的硝酸，多孔硅胶的使用量为硝酸溶液的4wt%。
58.反相色谱填料的制备：将酸化多孔硅胶加入甲苯中，在120℃的条件下回流3h，加入催化剂搅拌混合，加入十八烷基二甲基甲氧基硅烷，在120℃的条件下回流12h，冷却至室温，甲苯洗涤，甲醇洗涤，真空干燥，封端试剂封端处理，得到反相色谱填料。酸化多孔硅胶的使用量为甲苯的4wt%，催化剂为对甲苯磺酸钠，催化剂的使用量为甲苯的0.5wt%，十八烷基二甲基甲氧基硅烷的使用量为甲苯的0.4wt%。
59.封端处理步骤：将反相色谱填料加入甲苯中，在120℃的条件下回流4h，加入三甲基氯硅烷，在120℃的条件下回流6h，冷却至室温，二氯甲烷洗涤，真空干燥。三甲基氯硅烷的使用量为反相色谱填料的36wt%。
60.样品处理：将棕榈酰三肽-5粗产品加入甲醇中超声至液体澄清，经孔径为0.45μm滤膜过滤后，收集滤液得到棕榈酰三肽-5粗液。甲醇的使用量以棕榈酰三肽-5粗产品可以溶解为宜。
61.棕榈酰三肽-5的纯化：将棕榈酰三肽-5粗液上样至层析柱中，洗脱液洗脱，紫外分光光度计检测，收集目标多肽溶液，冷冻干燥，得到纯化后的棕榈酰三肽-5。层析柱中装有反相色谱填料。
62.流动相a为含有0.10wt％三氟乙酸的乙腈，流动相b为含有0.10wt％三氟乙酸的
水。流动相a与流动相b以质量比1：0.7的比例使用。
63.实施例4：一种棕榈酰三肽-5的纯化方法，本实施例与实施例3相比，不同之处仅在于，聚乙氧基硅烷的制备中，功能剂的使用量为无水乙醇的1.2wt%。
64.对比例1：本对比例与实施例2相比，不同之处仅在于，功能化硅烷的制备中，功能化溶液中未使用烯丙基苯胺。
65.对比例2：本对比例与实施例2相比，不同之处仅在于，功能化硅烷的制备中，功能化溶液中未使用己酸丙烯酯。
66.对比例3：本对比例与实施例2相比，不同之处仅在于，功能化硅烷的制备中，功能化溶液中未使用烯丙基苯胺和己酸丙烯酯。
67.试验例：1.红外光谱分析测试样品：实施例2制备得到的功能化硅烷。
68.上述样品采用kbr压片法制样。扫描波数范围为4000-600cm-1
，分辨率为2cm-1
。
69.本发明制备得到的功能化硅烷的红外光谱图如图1所示，其中，2800-3000cm-1
之间为甲基和亚甲基的红外吸收峰，2100-2200cm-1
之间为硅氢的红外吸收峰，1702cm-1
处为羰基的红外吸收峰，1400-1600cm-1
之间为苯环的红外吸收峰，1382cm-1
处为与苯相连的碳氮的红外吸收峰，1118cm-1
处为酯的碳氧碳的红外吸收峰，表明成功制备得到功能化硅烷。
70.2.多孔硅胶表面积及孔径分析测试样品：各实施例和对比例制备得到的多孔硅胶。
71.上述样品的孔径和比表面积采用比表面积及孔径分析仪进行表征。
72.本发明制备得到的多孔硅胶的比表面积如图2所示，a为实施例1，b为实施例2，c为实施例3，d为实施例4，e为对比例1，f为对比例2，g为对比例3，其中，实施例1的方法中制备的多孔硅胶的比表面积为274.26 m2/g，实施例2的方法中制备的多孔硅胶的比表面积为280.67 m2/g，对比例3的方法中制备的多孔硅胶的比表面积为211.70 m2/g，实施例2与对比例3相比，实施例2的方法中制备的多孔硅胶的比表面积提高了32.58%，表明在使用烯丙基苯胺和己酸丙烯酯对三乙氧基硅烷进行处理，得到功能化硅烷后，将功能化硅烷与四乙氧基硅烷用于合成得到功能化聚乙氧基硅烷，最后由功能化聚乙氧基硅烷制备得到多孔硅胶后，可以提高多孔硅胶的比表面积，在制备过程中保持相对条件不变，而仅保留烯丙基苯胺和己酸丙烯酯中任一种，可以发现相对于对比例3中的多孔硅胶的比表面积均有所提高，例如，对比例1的方法中制备的多孔硅胶的比表面积为230.58 m2/g，对比例2的方法中制备的多孔硅胶的比表面积为228.08 m2/g，相对于对比例3，对比例1的方法中制备的多孔硅胶的比表面积提高了7.97%，对比例2的方法中制备的多孔硅胶的比表面积提高了5.85%，表明将烯丙基苯胺与己酸丙烯酯共同使用的效果最佳；实施例3的方法中制备的多孔硅胶的比表面积为298.21 m2/g，实施例4的方法中制备的多孔硅胶的比表面积为307.93 m2/g，实施例4
与实施例2相比，表明在按实施例2的方法中的功能化聚乙氧基硅烷制备中，使用甲基丙烯酸三甲基硅酯后，可以提高得到的多孔硅胶的比表面积，相对于实施例2，实施例4的方法中制备的多孔硅胶的比表面积提高了9.71%。
73.本发明制备得到的多孔硅胶的孔径如图3所示，a为实施例1，b为实施例2，c为实施例3，d为实施例4，e为对比例1，f为对比例2，g为对比例3，其中，实施例1的方法中制备的多孔硅胶的孔径为7.16 nm，实施例2的方法中制备的多孔硅胶的孔径为7.81 nm，对比例3的方法中制备的多孔硅胶的孔径为5.02 nm，实施例2与对比例3相比，实施例2的方法中制备的多孔硅胶的孔径提高了55.58%，表明在使用烯丙基苯胺和己酸丙烯酯对三乙氧基硅烷进行处理，得到功能化硅烷后，将功能化硅烷与四乙氧基硅烷用于合成得到功能化聚乙氧基硅烷，最后由功能化聚乙氧基硅烷制备得到多孔硅胶后，可以提高多孔硅胶的孔径，在制备过程中保持相对条件不变，而仅保留烯丙基苯胺和己酸丙烯酯中任一种，可以发现相对于对比例3中的多孔硅胶的孔径均有所提高，例如，对比例1的方法中制备的多孔硅胶的孔径为5.37 nm，对比例2的方法中制备的多孔硅胶的孔径为5.48 nm，相对于对比例3，对比例1的方法中制备的多孔硅胶的孔径提高了6.97%，对比例2的方法中制备的多孔硅胶的孔径提高了9.16%，表明将烯丙基苯胺与己酸丙烯酯共同使用的效果最佳；实施例3的方法中制备的多孔硅胶的孔径为8.34 nm，实施例4的方法中制备的多孔硅胶的孔径为9.55 nm，实施例4与实施例2相比，表明在按实施例2的方法中的功能化聚乙氧基硅烷制备中，使用甲基丙烯酸三甲基硅酯后，可以提高得到的多孔硅胶的孔径，相对于实施例2，实施例4的方法中制备的多孔硅胶的孔径提高了22.28%。
74.本发明方法制备得到的多孔硅胶的比表面积为270-310 m2/g，孔径为5-10 nm。
75.3.纯度测试测试样品：各实施例和对比例的方法得到的纯化后的棕榈酰三肽-5。
76.经本发明中各实施例的方法对棕榈酰三肽-5均有较好的纯化的效果，如图4所示，a为实施例1，b为实施例2，c为实施例3，d为实施例4，e为对比例1，f为对比例2，g为对比例3，经本发明方法纯化后的棕榈酰三肽-5的纯度达到了96%以上。本明本发明方法可以用于纯化棕榈酰三肽-5，为棕榈酰三肽-5的纯化提供了一种新的技术方案。
77.以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。