1.本发明涉及微藻培养技术领域，尤其涉及去除微藻共生细菌的方法。


背景技术：

2.随着对海洋微藻研究的深入，发现其在多个领域扮演着不同的角色，在生物能源、医药、食品和化妆品领域的生产，以及废水处理、大气co2减排及生物肥料等方面也有应用，其应用价值正日益引起人们注意。
3.微藻是一类光能自养型单细胞生物，能有效利用光能将水、二氧化碳、无机盐转化为有机资源，是海洋生态系统中的最主要初级生产者，在某些海域的初级生产力贡献值甚至可达80％以上，微藻遍布地球的每一个角落，其中很多种类具有很高的经济价值。海洋微藻也是海洋生物资源的重要组成部分，具有种类多、数量大、繁殖快等特点，在海洋生态系统的物质循环和能量流动中起着极其重要的作用。同时，微藻本身营养丰富，富含人类必须的蛋白质，氨基酸、不饱和脂肪酸、多糖、类胡萝卜素等生物活性物质，在基础生物学研究、水产养殖、新能源的开发、药物研制等领域具有重要开发价值。微藻的分子生物学研究也如火如荼的进行着。大量的功能基因被克隆，转基因的工程微藻也在试验中，全世界掀起了一股微藻研究的热潮。我国海洋微藻资源丰富，已记录的近2000种。近年来，随着陆地资源的衰竭，丰富的海洋微藻资源成了人们关注的热点，从海洋中获取更多高值的微藻品种成为一项重要的基础性工作。海洋微藻的分离纯化是藻类研究的基础，也一直是较为困难的课题之一。
4.藻类作为海洋生态系统中主要的初级生产者，在其生长过程中不断地向周围环境释放有机营养物质。海洋细菌跟藻类在时空上紧密联系在一起，而这些聚集在周围的微生物叫藻际细菌，也称共生细菌。藻类分泌的有机物以供给共生细菌生长，共生细菌能够合成多种多样的代谢物，而这些代谢物可以促进或抑制藻类的生长。因为不同种属的藻类的胞外分泌物各不相同，因此其共生细菌的组成也各不相同。共生细菌对藻的抑制作用主要包括营养竞争和溶藻作用。在藻际环境中，当没有外源营养物质补充下，细菌和藻类会互相竞争营养物质。有些共生细菌可以分泌毒素、胞外酶破坏藻类细胞壁，光合系统和抑制胞囊的形成等。迄今为止，己发现了多种细菌可以通过不同方式抑制藻类的生长和溶解藻类，这些细菌能够分泌各种各样的产物来抑制藻类的生长，如蛋白质、多肽、氨基酸、含氮化合物。因此我们迫切地需要一种技术达到去除共生细菌，达到分离纯化海洋微藻的目的。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供有效去除微藻共生细菌的方法。
6.本发明提供的去除微藻共生细菌的方法包括，在藻液中加入抗生素；所述抗生素包括氨苄青霉素、硫酸链霉素、硫酸卡那霉素和利福平中至少一种。
7.本发明中，所述抗生素的加入顺序为氨苄青霉素、硫酸链霉素、硫酸卡那霉素和利福平。
8.本发明对去除共生细菌的抗生素进行筛选，结果表明，抗生素的种类和处理顺序、添加浓度对除菌效果存在显著影响。本发明选择氨苄青霉素、硫酸链霉素、硫酸卡那霉素和利福平对微藻中的细菌进行去除，其中氨苄青霉素是一类β内酰胺类抗生素，可以抑制细菌细胞壁中肽聚糖的合成；硫酸链霉素、硫酸卡那霉素是一类氨基糖苷类抗生素，对革兰氏阴性杆菌有很好的抑制杀菌效果；利福平主要通过作用于细菌的遗传物质，比如影响酶与dna的连接，从而阻断rna转录过程，使dna和蛋白的合成停止。以上不同种类的抗生素分别针对于不同的细菌，或者通过不同的途径都能达到去除细菌的目的。相对于同类或其他类型抗生素的组合，本发明提供的除菌方案的除菌效果更显著。划线培养后未见细菌生长。
9.一些实施例中，所述加入抗生素具体包括：
10.向培养至对数生长期的微藻培养液中加入氨苄青霉素，继续培养；
11.接种至新鲜培养液培养至对数生长期后加入硫酸链霉素，继续培养；
12.再接种至新鲜培养液培养至对数生长期后加入硫酸卡那霉素，继续培养；
13.再接种至新鲜培养液培养至对数生长期后加入利福平，继续培养。
14.一些实施例中，所述加入氨苄青霉素至其浓度为8～12μg/ml；所述加入硫酸链霉素至其浓度为8～12μg/ml；所述加入硫酸卡那霉素至其浓度为8～12μg/ml；所述加入利福平至其浓度为8～12μg/ml。
15.一些具体实施例中，所述加入氨苄青霉素至其浓度为10μg/ml；所述加入硫酸链霉素至其浓度为10μg/ml；所述加入硫酸卡那霉素至其浓度为10μg/ml；所述加入利福平至其浓度为10μg/ml。
16.本发明中，所述微藻的培养液为f/2培养基。
17.本发明中，所述接种的接种量为10vol％。
18.在藻液中加入4种抗生素并继续培养后，还包括将藻液扩大培养的步骤。
19.本发明中，所述培养至对数期的条件包括：温度25℃，光照5000lx，时间为5天。
20.本发明中，所述继续培养的条件包括：温度25℃，光照5000lx，时间为3天。
21.本发明中，所述扩大培养的条件包括：温度25℃，光照5000lx，时间为5天。
22.所述扩大培养后，还包括对藻液以2216e固体培养基培养的步骤。在该步骤中，通过观察固体平板经培养后是否有细菌生长来验证本发明所述方法的除菌效果。结果表明，以本发明提供的方法培养微藻后，平板上不再有细菌菌落形成。
23.本发明中，所述微藻为琴式菱形藻、派格棍形藻。
24.本发明提供的去除微藻共生细菌的方法包括，在藻液中加入抗生素；所述抗生素包括氨苄青霉素、硫酸链霉素、硫酸卡那霉素和利福平中至少一种。本发明选择的抗生素分别针对于不同的细菌，或者通过不同的途径达到去除细菌的目的。相对于同类或其他类型抗生素的组合，本发明提供的除菌方案的除菌效果更显著。划线培养后未见细菌生长。
附图说明
25.图1示海洋微藻(琴式菱形藻)在f/2固体培养基的培养状态；
26.图2示海洋微藻(琴式菱形藻)在f/2液体培养基的培养状态；
27.图3示海洋微藻(琴式菱形藻)在光学显微镜下的形态；
28.图4示经混合抗生素处理后的琴式菱形藻液涂布在2216e固体培养基上的纯化结
果；
29.图5示海洋微藻(派格棍形藻)在f/2固体培养基的培养状态；
30.图6示海洋微藻(派格棍形藻)在f/2液体培养基的培养状态；
31.图7示海洋微藻(派格棍形藻)在光学显微镜下的形态；
32.图8示经混合抗生素处理后的派格棍形藻藻液涂布在2216e固体培养基上的纯化结果；
33.图9示两种抗生素处理后的藻液涂布在2216e固体培养基上的纯化结果，其中，a为使用氨苄青霉素、硫酸链霉素两种抗生素纯化琴式菱形藻的结果，b为使用氨苄青霉素、硫酸链霉素两种抗生素纯化派格棍形藻的结果。
具体实施方式
34.本发明提供了去除微藻共生细菌的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
35.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
36.实施例1
37.利用f/2固体培养基通过划线培养初步分离琴式菱形藻藻株；
38.用f/2培养基将琴式菱形藻培养至对数期，取藻液用混合抗生素处理，获得无菌藻株藻液。处理方法是：
39.在无菌条件下，向100ml处于对数生长期的琴式菱形藻培养液加入氨苄青霉素(10μg/ml)，培养3天。取10ml经氨苄青霉素处理后的藻液加入90ml新鲜无菌f/2培养基，然后加入硫酸链霉素(10μg/ml)，培养3天。将10ml经上述两种抗生素处理过的藻液加入至90ml新鲜无菌f/2培养基，再加入硫酸卡那霉素(10μg/ml)，培养3天，将10ml经上述三种抗生素处理过的藻液加入至90ml新鲜无菌f/2培养基，再加入利福平(10μg/ml)，培养3天，最后转入250ml无菌的f/2培养基扩大培养5天。在多种抗生素处理后，取100μl藻液均匀涂布于2216e固体培养基检查去除共生细菌情况(图4)。
40.实施例2
41.同样地，利用f/2固体培养基通过划线培养初步分离派格棍形藻藻株；
42.用f/2培养基将派格棍形藻培养至对数期，取藻液用混合抗生素处理，获得无菌藻株藻液。处理方法是：
43.在无菌条件下，向100ml处于对数生长期的派格棍形藻培养液加入氨苄青霉素(10μg/ml)，培养3天。取10ml经氨苄青霉素处理后的藻液加入90ml新鲜无菌f/2培养基，然后加入硫酸链霉素(10μg/ml)，培养3天。将10ml经上述两种抗生素处理过的藻液加入至90ml新鲜无菌f/2培养基，再加入硫酸卡那霉素(10μg/ml)，培养3天，将10ml经上述三种抗生素处理过的藻液加入至90ml新鲜无菌f/2培养基，再加入利福平(10μg/ml)，培养3天，最后转250ml菌的f/2培养基扩大培养5天。在多种抗生素处理后，取100μl藻液均匀涂布于2216e固
体培养基检查去除共生细菌情况(图8)。
44.对比例
45.通过使用氨苄青霉素、硫酸链霉素两种抗生素去除琴式菱形藻、派格棍形藻共生细菌进行对照组实验，具体实施如下：
46.用f/2培养基将琴式菱形藻、派格棍形藻培养至对数期，在无菌条件下，分别向100ml处于对数生长期的琴式菱形藻、派格棍形藻培养液加入氨苄青霉素(10μg/ml)，培养3天。取10ml经氨苄青霉素处理后的两种藻液分别加入90ml新鲜无菌f/2培养基，再分别加入硫酸链霉素(10μg/ml)，培养3天。最后转250ml菌的f/2培养基扩大培养5天。在两种抗生素处理后，取100μl琴式菱形藻、派格棍形藻藻液分别均匀涂布于2216e固体培养基检查去除共生细菌情况(图9)。
47.通过对各组实施例和对比例涂布于2216e固体培养基后，可肉眼观察有无细菌生长直接得出除菌结果。经多种混合抗生素处理的琴式菱形藻、派格棍形藻划线培养后未见细菌生长，而只经两种抗生素处理的琴式菱形藻、派格棍形藻划线培养后仍有细菌生长，除菌效果不佳。除了肉眼观察，也可以对细菌菌落数量计数来表示除菌效果。
48.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。